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Die Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung wird durch Rezeptorproteine arrangiert, die sich in der Plasmamembran befinden. Membranrezeptoren werden durch die Bindung von extrazellulären Liganden, Pathogenen oder Zell-Zell-Interaktionen aktiviert, wodurch die Bildung eines aktiven Zustands gefördert wird, der eine intrazelluläre Reaktion einleitet. Eine Beschreibung auf molekularer Ebene, wie sich Membranrezeptoren in Proteinanordnungen organisieren und wie diese Proteinanordnungen eine spezifische funktionelle Aufgabe ausführen, ist der Ausgangspunkt für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.
Die Fluoreszenzmikroskopie gibt Aufschluss über die Lage von Proteinen in Zellen, und mit der Einführung der höchstauflösenden Mikroskopie wurde der Nachweis einzelner Proteingruppierungen möglich. Eine Einschränkung der meisten Methoden der höchstauflösenden Mikroskopie ist, dass einzelne Komponenten einer Proteingruppierung optisch nicht aufgelöst werden können, was an der geringen Größe und dichten Packung der Bestandteile im Vergleich zur erreichbaren räumlichen Auflösung liegt. Eine Lösung, die für Einzelmolekül-Lokalisierungsmethoden gezeigt wurde, besteht darin, zusätzliche experimentelle Informationen in die Analyse zu implementieren, also „die Aufl sungsgrenze der höchstauflösenden Mikroskopie zu umgehen". Bei der Einzelmolekül-Bildgebung kann diese zusätzliche Information zum Beispiel die Kinetik von mehrfachen und wiederkehrenden
Emissionsereignissen sein, die bei einzelnen Fluorophoren beobachtet werden, was als "Blinken" bezeichnet wird. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer höchstauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethode zur Detektion von Proteinmonomeren und -dimeren in der Plasmamembran von Zellen durch die Verwendung der kinetischen Information.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden photoschaltbare fluoreszierende Proteine als Reporter verwendet, deren photoschaltbare Kinetik mit kinetischen Gleichungen analysiert wurden.
Synthetische, genetische und zelluläre Referenzproteine wurden konstruiert und dienten als Kalibrierungsreferenzen für monomere und dimere Proteine.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das kinetische Modell, das zur Annäherung des Häufigkeitshistogramms von Blinkereignissen einzelner Fluorophore verwendet wird, auf Oligomere höherer Ordnung erweitert. Ein Vergleich mit einem zuvor entwickelten Modell zeigte, dass das erweiterte Modell genauere Ergebnisse für Oligomere höherer Ordnung und Mischungen verschiedener Oligomere liefert. Zusätzlich wird die Anwesenheit von unerkannten Oligomeren berücksichtigt. Die erweiterte Theorie bietet somit die Grundlage, um größere Oligomere und Mischungen unterschiedlicher Stöchiometrie mit besserer Genauigkeit zu untersuchen.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur stöchiometrischen endogenen Markierung von Proteinen verwendet, um zwei Rezeptortyrosinkinasen, MET und EGFR, mit einem photoschaltbaren fluoreszierenden Protein zu markieren. Das Vorkommen von monomerem und dimerem MET-Rezeptor wurde auf der Plasmamembran von HEK293T- Zellen mittels quantitativer höchstauflösender Mikroskopie bestimmt. Der Diffusionskoeffizient und der Diffusionsmodus des MET-Rezeptors in lebenden HEK293T-Zellen wurden mit
Einzelpartikelverfolgung gemessen. Dieser Teil der Arbeit zeigte, dass die Kombination von CRISPR/Cas12a-gestützter endogener Markierung und Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Organisation und Dynamik von Membranproteinen ist.
Im vierten Teil dieser Arbeit wurde die Einzelmoleküldatenanalyse durch ein Softwaretool beschleunigt, das eine automatisierte und unvoreingenommene Detektion von Einzelmolekül-Emissionsereignissen ermöglicht. Der Anteil von Monomeren und Dimeren von fluoreszierenden Reportern wurde durch die Implementierung eines neuronalen Netzwerks bestimmt (die Software wurde von Alon Saguy geschrieben; Gruppe von Prof. Yoav Shechtman, Technion, Israel). Der oligomere Zustand der monomeren und dimeren Referenzproteine CD86 und CTLA-4 wurde erfolgreich bestimmt. Die automatisierte Detektion einzelner Proteingruppierungen ermöglichte die Analyse von MET-mEos4b in einzelnen Zellen, wodurch die Heterogenität zwischen den Zellen bestimmt und das Expressionsniveau des Rezeptors mit der Dimerisierung korreliert werden konnte.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit Ergebnisse zu elementaren Aspekten hin zu einer molekularen Quantifizierung von Proteinzahlen mittels Einzelmolekül-
Lokalisationsmikroskopie generiert, die fluoreszierende Reporter, stöchiometrische Markierung von zellulären Proteinen und Bildanalyse umfassen. Das Potential dieser
Entwicklungen wurde anhand der Beobachtung der Liganden-induzierten Verschiebung von monomeren zu dimeren MET-Rezeptoren in einzelnen HEK293T-Zellen gezeigt.
Unc-51-like kinase 4 (ULK4) is a pseudokinase that has been linked to the development of several diseases. Even though sequence motifs required for ATP binding in kinases are lacking, ULK4 still tightly binds ATP and the presence of the co-factor is required for structural stability of ULK4. Here, we present a high-resolution structure of a ULK4-ATPγS complex revealing a highly unusual ATP binding mode in which the lack of the canonical VAIK motif lysine is compensated by K39, located N-terminal to αC. Evolutionary analysis suggests that degradation of active site motifs in metazoan ULK4 has co-occurred with an ULK4-specific activation loop, which stabilizes the C helix. In addition, cellular interaction studies using BioID and biochemical validation data revealed high confidence interactors of the pseudokinase and armadillo repeat domains. Many of the identified ULK4 interaction partners were centrosomal and tubulin-associated proteins and several active kinases suggesting interesting regulatory roles for ULK4.
Pancreatic cancer is a common malignant tumor with a high incidence and mortality rate. The prognosis of patients with pancreatic cancer is considerably poor due to the lack of effective treatment in clinically. Despite numerous studies have revealed that baicalein, a natural product, is responsible for suppressing multiple cancer cells proliferation, motility and invasion. The mechanism by which baicalein restraining pancreatic cancer progression remains unclear. In this study, we firstly verified that baicalein plays a critical role in inhibiting pancreatic tumorigenesis in vitro and in vivo. Then we analyzed the alteration of microRNAs (miRNAs) expression levels in Panc-1 cells incubated with DMSO, 50 and 100 μM baicalein by High-Throughput sequencing. Intriguingly, we observed that 20 and 39 miRNAs were accordingly up- and down-regulated through comparing Panc-1 cells exposed to 100 μM baicalein with the control group. Quantitative PCR analysis confirmed that miR-139-3p was the most up-regulated miRNA after baicalein treatment, while miR-196b-5p was the most down-regulated miRNA. Further studies showed that miR-139-3p induced, miR-196b-5p inhibited the apoptosis of Panc-1 cells via targeting NOB1 and ING5 respectively. In conclusion, we demonstrated that baicalein is a potent inhibitor against pancreatic cancer by modulating the expression of miR-139-3p or miR-196b-5p.
2D NOESY plays a central role in structural NMR spectroscopy. We have recently discussed methods that rely on solvent-driven exchanges to enhance NOE correlations between exchangeable and non-exchangeable protons in nucleic acids. Such methods, however, fail when trying to establish connectivities within pools of labile protons. This study introduces an alternative that also enhances NOEs between such labile sites, based on encoding a priori selected peaks by selective saturations. The resulting selective magnetization transfer (SMT) experiment proves particularly useful for enhancing the imino–imino cross-peaks in RNAs, which is a first step in the NMR resolution of these structures. The origins of these enhancements are discussed, and their potential is demonstrated on RNA fragments derived from the genome of SARS-CoV-2, recorded with better sensitivity and an order of magnitude faster than conventional 2D counterparts.
Background and Purpose: The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are ubiquitous second messengers regulating numerous biological processes. Malfunctional cNMP signalling is linked to diseases and thus is an important target in pharmaceutical research. The existing optogenetic toolbox in Caenorhabditis elegans is restricted to soluble adenylyl cyclases, the membrane-bound Blastocladiella emersonii CyclOp and hyperpolarizing rhodopsins; yet missing are membrane-bound photoactivatable adenylyl cyclases and hyperpolarizers based on K+ currents.
Experimental Approach: For the characterization of photoactivatable nucleotidyl cyclases, we expressed the proteins alone or in combination with cyclic nucleotide-gated channels in muscle cells and cholinergic motor neurons. To investigate the extent of optogenetic cNMP production and the ability of the systems to depolarize or hyperpolarize cells, we performed behavioural analyses, measured cNMP content in vitro, and compared in vivo expression levels.
Key Results: We implemented Catenaria CyclOp as a new tool for cGMP production, allowing fine-control of cGMP levels. We established photoactivatable membrane-bound adenylyl cyclases, based on mutated versions (“A-2x”) of Blastocladiella and Catenaria (“Be,” “Ca”) CyclOp, as N-terminal YFP fusions, enabling more efficient and specific cAMP signalling compared to soluble bPAC, despite lower overall cAMP production. For hyperpolarization of excitable cells by two-component optogenetics, we introduced the cAMP-gated K+-channel SthK from Spirochaeta thermophila and combined it with bPAC, BeCyclOp(A-2x), or YFP-BeCyclOp(A-2x). As an alternative, we implemented the B. emersonii cGMP-gated K+-channel BeCNG1 together with BeCyclOp.
Conclusion and Implications: We established a comprehensive suite of optogenetic tools for cNMP manipulation, applicable in many cell types, including sensory neurons, and for potent hyperpolarization.
We investigated the folding kinetics of G-quadruplex (G4) structures by comparing the K+-induced folding of an RNA G4 derived from the human telomeric repeat-containing RNA (TERRA25) with a sequence homologous DNA G4 (wtTel25) using CD spectroscopy and real-time NMR spectroscopy. While DNA G4 folding is biphasic, reveals kinetic partitioning and involves kinetically favoured off-pathway intermediates, RNA G4 folding is faster and monophasic. The differences in kinetics are correlated to the differences in the folded conformations of RNA vs. DNA G4s, in particular with regard to the conformation around the glycosidic torsion angle χ that uniformly adopts anti conformations for RNA G4s and both, syn and anti conformation for DNA G4s. Modified DNA G4s with 19F bound to C2′ in arabino configuration adopt exclusively anti conformations for χ. These fluoro-modified DNA (antiTel25) reveal faster folding kinetics and monomorphic conformations similar to RNA G4s, suggesting the correlation between folding kinetics and pathways with differences in χ angle preferences in DNA and RNA, respectively.
The assembly of a specific polymeric ubiquitin chain on a target protein is a key event in the regulation of numerous cellular processes. Yet, the mechanisms that govern the selective synthesis of particular polyubiquitin signals remain enigmatic. The homologous ubiquitin-conjugating (E2) enzymes Ubc1 (budding yeast) and Ube2K (mammals) exclusively generate polyubiquitin linked through lysine 48 (K48). Uniquely among E2 enzymes, Ubc1 and Ube2K harbor a ubiquitin-binding UBA domain with unknown function. We found that this UBA domain preferentially interacts with ubiquitin chains linked through lysine 63 (K63). Based on structural modeling, in vitro ubiquitination experiments, and NMR studies, we propose that the UBA domain aligns Ubc1 with K63-linked polyubiquitin and facilitates the selective assembly of K48/K63-branched ubiquitin conjugates. Genetic and proteomics experiments link the activity of the UBA domain, and hence the formation of this unusual ubiquitin chain topology, to the maintenance of cellular proteostasis.
Extracellular signal-regulated kinase 3 (ERK3), known also as mitogen-activated protein kinase 6 (MAPK6), is an atypical member of MAPK kinase family, which has been poorly studied. Little is known regarding its function in biological processes, yet this atypical kinase has been suggested to play important roles in the migration and invasiveness of certain cancers. The lack of tools, such as a selective inhibitor, hampers the study of ERK3 biology. Here, we report the crystal structure of the kinase domain of this atypical MAPK kinase, providing molecular insights into its distinct ATP binding pocket compared to the classical MAPK ERK2, explaining differences in their inhibitor binding properties. Medium-scale small molecule screening identified a number of inhibitors, several of which unexpectedly exhibited remarkably high inhibitory potencies. The crystal structure of CLK1 in complex with CAF052, one of the most potent inhibitors identified for ERK3, revealed typical type-I binding mode of the inhibitor, which by structural comparison could likely be maintained in ERK3. Together with the presented structural insights, these diverse chemical scaffolds displaying both reversible and irreversible modes of action, will serve as a starting point for the development of selective inhibitors for ERK3, which will be beneficial for elucidating the important functions of this understudied kinase.
Lead-optimization strategies for compounds targeting c-Myc G-quadruplex (G4) DNA are being pursued to develop anticancer drugs. Here, we investigate the structure-activity- relationship (SAR) of a newly synthesized series of molecules based on the pyrrolidine-substituted 5-nitro indole scaffold to target G4 DNA. Our synthesized series allows modulation of flexible elements with a structurally preserved scaffold. Biological and biophysical analyses illustrate that substituted 5-nitroindole scaffolds bind to the c-Myc promoter G-quadruplex. These compounds downregulate c-Myc expression and induce cell-cycle arrest in the sub-G1/G1 phase in cancer cells. They further increase the concentration of intracellular reactive oxygen species. NMR spectra show that three of the newly synthesized compounds interact with the terminal G-quartets (5′- and 3′-ends) in a 2 : 1 stoichiometry.
Adaptormoleküle zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren oder miRNAs an nicht native Bindestellen
(2020)
Die Kontrolle der Genexpression ist eines der großen Ziele der chemischen Biologie. Gemäß dem klassischen Dogma der Molekularbiologe verläuft der Fluss der genetischen Information über die Transkription von DNA zur messenger RNA (mRNA) und durch die Translation von mRNA zu Proteinen. Auch wenn der ursprünglichen Formulierung dieses Dogmas verschiedene Aspekte hinzugefügt wurden, bleibt die Kernaussage unverändert. Eine Störung der Genexpression ist in vielen Fällen die Ursache für schwerwiegende Erkrankungen. Klassische Therapeutika, die im Allgemeinen aus kleinen Molekülen bestehen, können pathogene Proteine spezifisch binden und inhibieren. Allerdings greifen diese Wirkstoffe am Ende der Produktionskette ein und nicht alle Proteine können adressiert werden. Im Gegensatz dazu könnte ein Eingriff auf der Ebene der Transkription oder Translation die Expression der pathogenen Proteine auf ein normales Maß senken oder ganz verhindern. Als entscheidende Regulatoren der Genexpression stellen Transkriptionsfaktoren (TFs) einen interessanten Angriffspunkt zur Kontrolle der Transkription dar. TFs können über den Kontakt zu weiteren Proteinen die RNA Polymerase II rekrutieren und so die Transkription starten. Für die Translation ist die Halbwertszeit der mRNA ein entscheidender Faktor. Die Lebensdauer wird durch eine Vielzahl an Proteinen und micro RNAs (miRNAs) reguliert. MiRNAs sind kurze Oligonukleotide, die in Argonautproteine eingebaut werden können. Die daraus resultierenden RNA-induced silencing complexes (RISCs) sind in der Lage, den Abbau der mRNA einzuleiten. Sowohl TFs als auch RISCs besitzen dabei Nukleinsäure-bindende Untereinheiten, die mit spezifische Sequenzen assoziieren. In gewisser Weise ist die molekulare Erkennung der Nukleinsäuren vergleichbar mit einer Postsendung, die aufgrund der Adresse korrekt zugestellt wird. Um in diesem Bild des täglichen Lebens zu bleiben: Bei einem Wechsel des Wohnorts ist es üblich, einen Nachsendeauftrag zu stellen. Dabei wird die alte Anschrift auf den Postsendungen mit einem neuen Adressetikett überklebt und die Zustellung erfolgt an den neuen Wohnort. Das zentrale Thema dieser Dissertation ist, dieses „Umetikettieren“ auch auf TFs und RISCs zu übertragen. Hierbei ist es notwendig, die Nukleinsäure-bindenden Untereinheiten der Komplexe, also die „alte Adresse“, vollständig zu blockieren und gleichzeitig eine hohe Affinität zu einer neuen Sequenz zu erzeugen. Hierzu könnten bifunktionale Adaptormoleküle verwendet werden.
Die Adaptoren für die Rekrutierung von TFs müssen in der Lage sein, sowohl die doppelsträngige DNA (dsDNA) als auch einen TF zu binden (Abbildung I). Dabei sollte eine Selbstbindung des Adaptors vermieden werden. In dieser Arbeit wurde der TF Sp1 als Ziel gewählt, da er an GC-reiche dsDNAs bindet. Dies ermöglicht die Wahl einer AT- oder GA reichen DNA-Sequenz als Ziel der Umleitung, wodurch eine Selbstbindung des Adaptors minimiert werden sollte. Zur Erkennung der DNA war geplant, Pyrrol-Imidazol-Polyamide (PIPs), triplexbildende Oligonukleotide (TFOs) oder pseudokomplementäre PNAs einzusetzen. Für Letztere war es möglich, eine neue Syntheseroute zu einem Fmoc geschützten Thiouracil-Monomer zu entwerfen. Dabei konnte eine selektive Alkylierung an der N1-Position des Thiouracils durchgeführt werden. Auf Basis der PIPs und der TFOs wurden jeweils verschiedene Adaptoren entworfen, deren Bindung zu ihren Zielen mit Band-Shift-Experimenten und im Fall der PIPs zusätzlich mit fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten gezeigt wurde. Im Rahmen dieser Versuche zeigte sich, dass die PIP-basierten Systeme deutlich besser an die Zielsequenzen banden als die TFO-basierten Adaptoren. Das Konjugat K5a besaß hierbei die besten Eigenschaften. Weiterhin konnte mit diesem Adaptor in Pulldown-Experimenten gezeigt werden, dass Sp1 auf eine nicht kanonische AT-reiche Bindestelle umgeleitet wurde. Im Anschluss konnte das Sp1 in Western-Blots detektiert werden. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass K5a in einem HeLa Lysat über mehrere Stunden stabil war und somit eine Anwendung in Zellkulturexperimenten möglich sein sollte.
Für die Rekrutierung der RISCs war lediglich eine Erkennung zweier einzelsträngiger RNA-Abschnitte notwendig. Hierzu wurden zwei LNAs oder LNA/DNA-Mixmere verwendet, die über einen Linker verknüpft waren (Abbildung I). Als Folge dieses Aufbaus mussten die beiden Adaptorhälften orthogonal sein, da eine Selbstbindung des Adaptors leichter als bei den TF-Adaptoren auftreten konnte. Diese Adaptoren wurden mit Band-Shift- und fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten auf ihre Fähigkeit, eine Cy5-gelabelte miRNA auf eine Ziel-RNA umzuleiten, überprüft. Es konnte beobachtet werden, dass all-LNA Adaptoren sehr viele off-target-Effekt aufwiesen, welche die Umleitung von miRNAs verhinderte. Im Gegensatz dazu konnten mit DNA/LNA-Mixmeren eine vollständige Umleitung von miRNA-Modellen beobachtet werden. Es war ebenfalls möglich, spezifische RISCs aus HeLa-Lysaten mit unterschiedlichen Adaptoren in Pulldown-Experimenten zu isolieren und in nachfolgenden Western-Blots zu detektieren. Nachdem gezeigt war, dass eine Umleitung in vitro gelang, sollte die Funktion der Adaptoren in Zellkulturexperimenten geprüft werden. Allerdings konnten in diesen Versuchen keine eindeutigen Ergebnisse erhalten werden, sodass die biologische Relevanz der RISC-Umleitung bislang noch nicht bestätigt werden konnte.
Medicinal plants represent a big reservoir for discovering new drugs against all kinds of diseases including inflammation. In spite the large number of promising anti-inflammatory plant extracts and isolated components, research on medicinal plants proves to be very difficult. Based on that background this review aims to provide a summarized insight into the hitherto known pharmacologically active concentrations, bioavailability, and clinical efficacy of boswellic acids, curcumin, quercetin and resveratrol. These examples have in common that the achieved plasma concentrations were found to be often far below the determined IC50 values in vitro. On the other hand demonstrated therapeutic effects suggest a necessity of rethinking our pharmacokinetic understanding. In this light this review discusses the value of plasma levels as pharmacokinetic surrogates in comparison to the more informative value of tissue concentrations. Furthermore the need for new methodological approaches is addressed like the application of combinatorial approaches for identifying and pharmacokinetic investigations of active multi-components. Also the physiological relevance of exemplary in vitro assays and absorption studies in cell-line based models is discussed. All these topics should be ideally considered to avoid inaccurate predictions for the efficacy of herbal components in vivo and to unlock the “black box” of herbal mixtures.
Metabolic syndrome (MetS) is a highly prevalent disease cluster worldwide. It requires polypharmacological treatment of the single conditions including type II diabetes, hypertension, and dyslipidemia, as well as the associated comorbidities. The complex treatment regimens with various drugs lead to drug-drug interactions and inadequate patient adherence, resulting in poor management of the disease. Multi-target approaches aim at reducing the polypharmacology and improving the efficacy. This review summarizes the medicinal chemistry efforts to develop multi-target ligands for MetS. Different combinations of pharmacological targets in context of in vivo efficacy and future perspective for multi-target drugs in MetS are discussed.
Therapeutic oligonucleotides interact with a target RNA via Watson-Crick complementarity, affecting RNA-processing reactions such as mRNA degradation, pre-mRNA splicing, or mRNA translation. Since they were proposed decades ago, several have been approved for clinical use to correct genetic mutations. Three types of mechanisms of action (MoA) have emerged: RNase H-dependent degradation of mRNA directed by short chimeric antisense oligonucleotides (gapmers), correction of splicing defects via splice-modulation oligonucleotides, and interference of gene expression via short interfering RNAs (siRNAs). These antisense-based mechanisms can tackle several genetic disorders in a gene-specific manner, primarily by gene downregulation (gapmers and siRNAs) or splicing defects correction (exon-skipping oligos). Still, the challenge remains for the repair at the single-nucleotide level. The emerging field of epitranscriptomics and RNA modifications shows the enormous possibilities for recoding the transcriptome and repairing genetic mutations with high specificity while harnessing endogenously expressed RNA processing machinery. Some of these techniques have been proposed as alternatives to CRISPR-based technologies, where the exogenous gene-editing machinery needs to be delivered and expressed in the human cells to generate permanent (DNA) changes with unknown consequences. Here, we review the current FDA-approved antisense MoA (emphasizing some enabling technologies that contributed to their success) and three novel modalities based on post-transcriptional RNA modifications with therapeutic potential, including ADAR (Adenosine deaminases acting on RNA)-mediated RNA editing, targeted pseudouridylation, and 2′-O-methylation.
Fatty acid and polyketide synthases (FASs and PKSs) synthesize physiologically and pharmaceutically important products by condensation of acyl building blocks. The transacylation reaction catalyzed by acyl transferases (ATs) is responsible for the selection of acyl-CoA esters for further processing by FASs and PKSs. In this study, the AT domains of different multidomain (type I) PKS systems are kinetically described in their substrate selectivity, AT−Acyl carrier protein (ACP) domain-domain interaction and enzymatic kinetic properties. We observe that the ATs of modular PKSs, intricate protein complexes occurring in bacteria and responsible for the biosynthesis of bioactive polyketides, are significantly slower than ATs of mammalian FASs, reflecting the respective purpose of the biosynthetic pathways within the organism and their metabolic context. We further perform a mutational study on the kinetics of the AT−ACP interaction in the modular PKS 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) and find a high plasticity in enzyme properties, which we explain by a high plasticity in AT−ACP recognition. Our study enlarges the understanding of ATs in its molecular properties and is similarly a call for thorough AT-centered PKS engineering strategies.
Mit 71 Millionen chronisch erkrankten Patienten im Jahr 2015 stellt die chronische Hepatitis C-Virusinfektion eine wichtige Ursache für Zirrhose, Leberdekompensation und Leberkrebs dar.
Eine grundlegende Eigenschaft des Hepatitis C-Virus (HCV) ist die Biogenese modifizierter intrazellulärer Membranen. Das dabei aus dem endoplasmatischen Reticulum (ER) gebildete, sogenannte membranöse Netz (MW, membranous web) dient im Rahmen des HCV-Lebenszyklus als Gerüst für die Assemblierung eines Multi-Protein-Replikase-Komplexes. Das MW wird durch virale nicht-strukturelle Proteine wie NS5A induziert.
Das Multidomänen-Metalloprotein NS5A ist über seine verschiedenen Domänen sowohl bei der Replikation am MW als auch bei der viralen Assemblierung und Freisetzung in der Nähe von Lipidtropfen (LD, lipid droplet) maßgeblich beteiligt. Seine N-terminale amphipathische Helix (AH) spielt dabei über die vermittelte Assoziation von NS5A mit Membranen eine wichtige Rolle. Damit verbundene spezifische Lipidinteraktionen von NS5A unterliegen molekularen Umstrukturierungen, die benötigt werden, um NS5A für seine
verschiedenen Aufgaben im viralen Lebenszyklus anzupassen. Es liegen zwar Röntgen-strukturmodelle von Domäne 1-Dimeren und NMR-Strukturen zur AH vor, allerdings keine experimentellen Strukturen des NS5A-Proteins vollständiger Länge (NS5A fl) in seinem natürlichen Lipidmilieu. Trotz der essentiellen Bedeutung von NS5A für den HCV-Lebens-zyklus und langjähriger Forschung ist bisher nur wenig zur molekularen Funktionsweise von NS5A bekannt.
Dennoch konnten durch Screening hochpotente NS5A-Inhibitoren entdeckt und weiterentwickelt werden. NS5A-Inhibitoren tragen als direkt wirkende antivirale Arzneimittel(DAA, direct-acting antiviral) entscheidend zum Therapieerfolg bei der Behandlung der Hepatitis C bei. Trotz ihrer Bedeutung in der Therapie und intensiver Forschung ist der Wirk-mechanismus von NS5A-Inhibitoren bisher ungeklärt. Eine durch NS5A-Inhibitoren
induzierte intrazelluläre Umverteilung von NS5A und das ausschließliche Auftreten von Resistenz-assoziierten Mutationen (RAM) nahe der NS5A-Lipid-Interaktionsbereiche weisen jedoch auf einen Effekt der Inhibitoren auf die Lipid-NS5A-Interaktion hin.
Als grundlegende Hypothese dieser Arbeit wurde somit vermutet, dass abhängig vom NS5A umgebenden Lipidmilieu (MW oder LD) spezifische Lipid-Protein-Interaktionen Einfluss auf die Struktur und Funktion von NS5A nehmen und NS5A-Inhibitoren über eine Inhibition dieser Interaktionen wirken. Polyphosphoinositide (PPI) könnten dabei als Lipidinteraktionspartner eine besondere Rolle spielen, da sie bedeutend für die Membran-Kennzeichnung verschiedener Zellkompartimente sind und auch die Funktion von Membranproteinen regulieren können. Eine Interaktion von NS5A mit PtdIns(4,5)P2 wurde bereits publiziert.
Um basierend auf der postulierten Hypothese die mechanistischen Details im Wechselspiel von NS5A und intrazellulären Membranen sowie den dabei möglichen Effekt von
NS5A-Inhibitoren zu untersuchen, musste zunächst NS5A in ausreichender Menge, Reinheit und Qualität rekombinant hergestellt werden. Hierfür wurde ein entsprechendes Protokoll zur Proteinexpression durch Baculovirus-vermittelte Expression in Sf9-Insektenzellen und Strep-Tactin-Reinigung für das full length Protein und trunkierte Varianten etabliert.
In Kooperation mit einem Partner konnte unter Verwendung von giant unilamellar vesicles (GUVs) und konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass unser full length Protein die Struktur von Membranen verändert (Membran-Remodellierung).
Die Stabilität des gereinigten Proteins und damit Effekte auf die Proteinfaltung wurden mittels Thermal shift assay (TSA) untersucht und dabei auch Effekte des NS5A-Inhibitors
Daclatasvir (DCV) und des Metall-Chelators EDTA überprüft. Die Bindung des Inhibitors hatte einen stabilisierenden Effekt auf die Proteinstruktur zur Folge.
Potentielle Interaktionsmuster mit Membranlipiden wurden mit Hilfe eines Protein lipid overlay assays (PLOA) detektiert. Zusätzlich zum in der Literatur bereits beschriebenen
Interaktionspartner PtdIns(4,5)P2 konnten weitere Lipid-Bindungspartner für NS5A identifiziert werden. Dabei legen die gewonnenen Daten nahe, dass die Interaktion über die Domäne 1 von NS5A vermittelt wird, wobei die Domänen 2 und 3 die Affinität zu den Lipidbindungspartnern erhöht, aber nicht das Phospholipid-Bindungsmuster verändert.
DCV hatte im PLOA keine qualitativen Auswirkungen auf das Lipid-Bindungsmuster. Die Lipidinteraktionen wurden mittels eines Liposomen-Rekonstitutionsmodells validiert.
In silico konnten basierend auf verfügbaren, experimentellen Strukturdaten und einem dynamischen Modell drei Cluster basischer Aminosäuren in NS5A-D1-AH als mögliche
PPI-Bindungsstellen identifiziert werden. Basierend auf dem Strukturmodell wurde eine Mutationsstrategie zur Charakterisierung der potentiellen PPI-Bindungsstellen entwickelt.
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An approach for the comparison of pair distribution functions (PDFs) has been developed using a similarity measure based on cross-correlation functions. The PDF is very sensitive to changes in the local structure, i.e. small deviations in the structure can cause large signal shifts and significant discrepancies between the PDFs. Therefore, a comparison based on pointwise differences (e.g. R values and difference curves) may lead to the assumption that the investigated PDFs as well as the corresponding structural models are not in agreement at all, whereas a careful visual inspection of the investigated structural models and corresponding PDFs may reveal a relatively good match. To quantify the agreement of different PDFs for those cases an alternative approach is introduced: the similarity measure based on cross-correlation functions. In this paper, the power of this application of the similarity measure to the analysis of PDFs is highlighted. The similarity measure is compared with the classical Rwp values as representative of the comparison based on pointwise differences as well as with the Pearson product-moment correlation coefficient, using polymorph IV of barbituric acid as an example.
A method for the ab initio crystal structure determination of organic compounds by a fit to the pair distribution function (PDF), without prior knowledge of lattice parameters and space group, has been developed. The method is called ‘PDF-Global-Fit’ and is implemented by extension of the program FIDEL (fit with deviating lattice parameters). The structure solution is based on a global optimization approach starting from random structural models in selected space groups. No prior indexing of the powder data is needed. The new method requires only the molecular geometry and a carefully determined PDF. The generated random structures are compared with the experimental PDF and ranked by a similarity measure based on cross-correlation functions. The most promising structure candidates are fitted to the experimental PDF data using a restricted simulated annealing structure solution approach within the program TOPAS, followed by a structure refinement against the PDF to identify the correct crystal structure. With the PDF-Global-Fit it is possible to determine the local structure of crystalline and disordered organic materials, as well as to determine the local structure of unindexable powder patterns, such as nanocrystalline samples, by a fit to the PDF. The success of the method is demonstrated using barbituric acid as an example. The crystal structure of barbituric acid form IV solved and refined by the PDF-Global-Fit is in excellent agreement with the published crystal structure data.
Multi-subunit ATPase-dependent chromatin remodelling complexes SWI/SNF (switch/sucrose non-fermentable) are fundamental epigenetic regulators of gene transcription. Functional genomic studies revealed a remarkable mutation prevalence of SWI/SNF-encoding genes in 20–25% of all human cancers, frequently driving oncogenic programmes. Some SWI/SNF-mutant cancers are hypersensitive to perturbations in other SWI/SNF subunits, regulatory proteins and distinct biological pathways, often resulting in sustained anticancer effects and synthetic lethal interactions. Exploiting these vulnerabilities is a promising therapeutic strategy. Here, we review the importance of SWI/SNF chromatin remodellers in gene regulation as well as mechanisms leading to assembly defects and their role in cancer development. We will focus in particular on emerging strategies for the targeted therapy of SWI/SNF-deficient cancers using chemical probes, including proteolysis targeting chimeras, to induce synthetic lethality.
Die vorliegende Arbeit Zeitaufgelöste NMR-spektroskopische Untersuchung konformationeller Dynamiken in DNA G-Quadruplexen befasst sich mit der detaillierten biophysikalischen Untersuchung wichtiger strukturdynamischer Eigenschaften von nicht-kanonischen Nukleinsäure Sekundärstrukturelementen.
Im Genom aller eukaryotischer Lebewesen, insbesondere dem menschlichen Genom finden sich DNA-Sequenzabschnitte, die überdurchschnittlich Guanosin (G)-reich sind. Diese poly-G Abschnitte sind nicht zufällig im Genom verteilt, sondern häufen sich vermehrt in Genabschnitten, die besonders wichtig für die Regulation der Genexpression sind. G-reiche DNA-Sequenzen können unter geeigneten Umständen alternative Sekundärstrukturen ausbilden, die von der doppelsträngigen, kanonischen Watson-Crick Konformation abweichen. In Anwesenheit monovalenter Kationen können sich G-Nukleotide in einer Tetrade über Hoogsteen Interaktionen anlagern. Diese Tetraden können sich stapeln und dadurch sogenannte G-Quadruplexe (G4) ausbilden. Das menschliche cMYC Gen wird typischerweise als proto-Onkogen bezeichnet. Es kodiert für einen unspezifischen Transkriptionsfaktor, der bei einer Vielzahl von systematischen und soliden Tumorerkrankungen stark überexprimiert wird. Die zelluläre Konzentration des Genprodukts kann zu 90% über ein G4 cis-Element in der Promotorregion reguliert werden. Der cMYC G4 hat die Möglichkeit verschiedene Konformationen einzunehmen. Im Falle des cMYC G4 kann man zusätzliche, nicht-konventionelle Formen der konformationellen Isomerie finden. Zum einen gibt es die Möglichkeit, dass bei einem G4, der aus drei Tetraden und vier intramolekularen Strangabschnitten (dreistöckiger G4) besteht, einzelne Strangabschnitte mehr als drei konsekutive G-Nukleotide besitzen. Dadurch können sich Faltungs-Isomere bilden, die sich durch Verschieben des Strangs relativ zum verbleibenden dreistöckigen Tetradengerüst ergeben. Man spricht von G-Register Isomeren. Eine zweite Möglichkeit der Strukturisomerie ergibt sich, wenn in einer Nukleotidsequenz mehr als vier G-reiche Strangabschnitte aufeinander folgen. Jeweils vier dieser Strangabschnitte können in unterschiedlicher Weise kombiniert werden, um ein G4 Isomer auszubilden. In jedem dieser so zustande gekommenen G4 verbleibt ein (oder mehrere) G-reicher Strangabschnitt, der im konkreten Isomer nicht zur Faltung verwendet wird. Diese zusätzlichen G-Stränge werden daher auch Ersatzräder (engl. spare-tires) genannt; man erhält spare-tire Isomere.
Obwohl diese Formen des Polymorphismus, deren biologischer Kontext und die biophysikalischen Konsequenzen in Arbeiten von C. Burrows (2015) und A. Mittermaier (2016) erstmals umfassend beschrieben wurden, gab es bis zum Ausgangspunkt dieser Arbeit keine Kenntnisse über deren strukturelle Dynamik, den Faltungswegen und den zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Zeitaufgelöste Kernspinresonanz (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) Spektroskopie ist eine bestens geeignete Methode, um die Dynamik von Biomakromolekülen mit atomarer Auflösung zu studieren. Um solche Experimente durchführen zu können, braucht es geeignete Herangehensweisen für die Präparation eines Nicht-Gleichgewichtszustands. In dieser Arbeit wird eine neu erarbeitete Strategie vorgestellt, die es erlaubt, Einblick in die Faltungs- und Umfaltungskinetiken eines dynamischen Konformations-Ensembles nicht-konventioneller Strukturisomere der cMYC G4 DNA-Sequenz zu erhalten.
Hierzu wurden photolabile Schutzgruppen (engl. Photocages) positionsspezifisch an bestimmten G-Nukleobasen (O6-(R)-NPE) angebracht. Die Schutzgruppen blockieren die Basenpaar-Interaktionen des Nukleotids, wodurch dieses sich nicht mehr an einer Tetradenbildung beteiligen kann. Die Photocages wurden jeweils an den Nukleotiden eingeführt, die nur in jeweils einem der G-Register Isomere an der Tetradenbildung beteiligt sind. Durch diese gezielte Destabilisierung konnten die Isomere getrennt und im gefalteten Zustand isoliert werden. Die so erhaltenen Konformationen wurden umfassend spektroskopisch charakterisiert. Der Ansatz, das konformationelle Gleichgewicht durch Photocages transient zu stören, wurde daraufhin weiterentwickelt. Mehrere Photocages wurden an Nukleobasen in zentraler Position einzelner G-Strangabschnitte angebracht. Dadurch konnte eine ausreichende Destabilisierung erreicht werden, die die Faltung jedweder G4 Strukturen unterbindet. Somit wurde ein ungefalteter Zustand erzeugt, der unter ansonsten frei wählbaren, physiologischen Bedingungen besteht. Durch in situ Photolyse der Schutzgruppen konnte so die Licht-induzierte G4 Faltung unter konstanten Puffer- und Temperaturbedingungen untersucht werden. Dieser Ansatz wurde auf die Untersuchung der Faltungswege, die zu verschiedenen spare-tire Isomeren führen, fokussiert.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es insgesamt erstmalig gelungen ist, die Kinetiken der wesentlichen Faltungs- und Umfaltungswege entlang der konformationellen Energielandschaft des cMYC G4 Elements zu untersuchen. Das komplexe, dynamische Zusammenspiel aller relevanten, nicht-konventionellen isomeren G4 Strukturen konnte entworren und umfassend experimentell beschrieben werden. Der dafür weiterentwickelte Ansatz über konformationelle Selektion mit Hilfe photolabiler Schutzgruppen hat dabei experimentelle Einblicke erlaubt, die bislang nicht zugänglich waren. Die Strukturen und Faltungszustämde, die mit den chemisch modifizierten Oligonukleotiden erhalten und isoliert wurden, sind umfassend spektroskopisch untersucht worden. Die Anwendung verschiedener spektroskopischer Ansätze und deren Kombination mit weiteren biophysikalischen Methoden hat eine Methoden-unabhängige Validierung der erhaltenen kinetischen und thermodynamischen Daten ermöglicht.
Background and Purpose: Activation of hepatic thyroid hormone receptor β (THR-β) is associated with systemic lipid lowering, increased bile acid synthesis, and fat oxidation. In patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH), treatment with THR-β agonists decreased hepatic steatosis and circulating lipids, and induced resolution of NASH. We chose resmetirom (MGL-3196), a liver-directed, selective THR-β agonist, as a prototype to investigate the effects of THR-β activation in mice with diet-induced obesity (DIO) and biopsy-confirmed advanced NASH with fibrosis.
Experimental Approach: C57Bl/6J mice were fed a diet high in fat, fructose, and cholesterol for 34 weeks, and only biopsy-confirmed DIO-NASH mice with fibrosis were included. Resmetirom was administered at a daily dose of 3 mg·kg−1 p.o., for 8 weeks. Systemic and hepatic metabolic parameters, histological non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity and fibrosis scores, and liver RNA expression profiles were determined to assess the effect of THR-β activation.
Key Results: Treatment with resmetirom did not influence body weight but led to significant reduction in liver weight, hepatic steatosis, plasma alanine aminotransferase activity, liver and plasma cholesterol, and blood glucose. These metabolic effects translated into significant improvement in NAFLD activity score. Moreover, a lower content of α-smooth muscle actin and down-regulation of genes involved in fibrogenesis indicated a decrease in hepatic fibrosis.
Conclusion and Implications: Our model robustly reflected clinical observations of body weight-independent improvements in systemic and hepatic metabolism including anti-steatotic activity.