Institutes
Refine
Year of publication
- 2021 (154)
- 2022 (105)
- 2020 (104)
- 2019 (68)
- 2023 (62)
- 2018 (57)
- 2024 (21)
- 2017 (20)
- 2016 (9)
- 2015 (8)
- 2004 (7)
- 2013 (7)
- 2002 (5)
- 2003 (5)
- 2005 (4)
- 2006 (4)
- 2012 (4)
- 2008 (3)
- 2009 (3)
- 2000 (2)
- 2007 (2)
- 2011 (2)
- 2014 (2)
- 1926 (1)
- 1963 (1)
- 1964 (1)
- 1965 (1)
- 1966 (1)
- 1969 (1)
- 1970 (1)
- 1972 (1)
- 1983 (1)
- 1990 (1)
- 1991 (1)
- 1994 (1)
- 1999 (1)
Document Type
- Doctoral Thesis (311)
- Article (281)
- Preprint (38)
- Contribution to a Periodical (25)
- Book (18)
- Report (2)
Language
- English (520)
- German (154)
- Multiple languages (1)
Has Fulltext
- yes (675)
Is part of the Bibliography
- no (675)
Keywords
- RNA (12)
- SARS-CoV-2 (10)
- NMR spectroscopy (9)
- inflammation (9)
- photochemistry (9)
- NMR (8)
- Biochemistry (7)
- Cell biology (7)
- E2 enzyme (6)
- TRACT (6)
Institute
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (675)
- Präsidium (43)
- Medizin (35)
- Buchmann Institut für Molekulare Lebenswissenschaften (BMLS) (30)
- Zentrum für Biomolekulare Magnetische Resonanz (BMRZ) (30)
- Biowissenschaften (23)
- MPI für Biophysik (15)
- Physik (12)
- Zentrum für Arzneimittelforschung, Entwicklung und Sicherheit (ZAFES) (5)
- Geowissenschaften / Geographie (4)
Currently, due to the misuse of antibiotics, we are facing a major public health problem. The resistance to antibiotics of certain bacterial strains makes the treatment of infections very complex.
In this context, the present thesis project concerns the study of a bacterial efflux complex capable of transporting antibiotics from the cytoplasm to the outside of the cell. This complex is composed of an inner-membrane Major Facilitator Superfamily (MFS) transporter (EmrB, E. coli multidrug resistance), a channel of the outer membrane TolC (Tolerance to Colicin E1) and a periplasmic adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance). Unlike RND-type efflux systems (such as AcrAB-TolC), little is known about the MFS-type EmrAB-TolC system. It is therefore important to study the entire complex on a structural and functional level, to analyse the marked differences between these two types of transport systems. The goal of my thesis project was to study at least one EmrAB-TolC complex from a structural point of view. For my studies the aim was to isolate the complex directly from bacteria overexpressing the three protein partners. In a first step, 15 homologous EmrAB-TolC systems were identified and their corresponding genes amplified from genomic DNA of different Gram-negative bacteria. Among the genes of the 15 systems, the genes coding for the E. coli and V. cholerae systems were further studied. The expression vectors encoded fluorescent markers for the monitoring of the expression levels of different proteins and for studying the formation of complexes. In a first step, the different protein expression levels (EmrB-mRFP1 and EmrA-sfGFP) were studied for several expression strains of E. coli by measuring the red and green fluorescence levels and by Western blot (anti-His, Myc, and Strep for EmrB, EmrA, and TolC). The E. coli strain C41(DE3) was best suited for co-expression of EmrAB-TolC. In a second step, the FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) methodology was used to identify a complex suitable for structural study. Thus this method enabled the observation that the EmrAB-TolC complex of E. coli was produced in higher amount than that of V. cholerae. The final co-purification protocol consists in perfoming a gentle lysis of the bacteria using lysozyme, then after solubilization with DDM, the purification is started by a Ni2+-NTA affinity chromatography step followed by a size exclusion chromatography step. Finally, the fractions containing the three protein partners are used for the detergent-exchange by amphipol A8-35 before the structural study by electron microscopy. Negative stain EM-micrographs displayed elongated objects with a length of 33 nm in side view. An average image of EmrAB-TolC shows similarities to that of the AcrAB-TolC complex observed under similar conditions. Similarities included the characteristic densities of TolC. Whereas differences were found in the lower part of EmrAB which is thinner than the lower part of AcrAB. The densities visible above the amphipol-ring correspond to EmrA, which displays a channel-like structure as in AcrA. The channel however seems to extend further towards the amphipol belt. Since EmrB does not have an extended periplasmic domain as the RND proteins have, these densities are therefore solely assigned to EmrA. EmrA, on the other side, contacts TolC akin to the interaction of AcrA/MexA to their cognate outer membrane channels (TolC/OprM) in a ‘tip-to-tip’ fashion.
Nuclear receptor related 1 (Nurr1) is an orphan ligand-activated transcription factor and considered as neuroprotective transcriptional regulator with great potential as therapeutic target for neurodegenerative diseases. However, the collection of available Nurr1 modulators and mechanistic understanding of Nurr1 are limited. Here, we report the discovery of several structurally diverse non-steroidal anti-inflammatory drugs as inverse Nurr1 agonists demonstrating that Nurr1 activity can be regulated bidirectionally. As chemical tools, these ligands enable unraveling the co-regulatory network of Nurr1 and the mode of action distinguishing agonists from inverse agonists. In addition to its ability to dimerize, we observe an ability of Nurr1 to recruit several canonical nuclear receptor co-regulators in a ligand-dependent fashion. Distinct dimerization states and co-regulator interaction patterns arise as discriminating factors of Nurr1 agonists and inverse agonists. Our results contribute a valuable collection of Nurr1 modulators and relevant mechanistic insights for future Nurr1 target validation and drug discovery.
Atg8-family proteins - structural features and molecular interactions in autophagy and beyond
(2020)
Autophagy is a common name for a number of catabolic processes, which keep the cellular homeostasis by removing damaged and dysfunctional intracellular components. Impairment or misbalance of autophagy can lead to various diseases, such as neurodegeneration, infection diseases, and cancer. A central axis of autophagy is formed along the interactions of autophagy modifiers (Atg8-family proteins) with a variety of their cellular counter partners. Besides autophagy, Atg8-proteins participate in many other pathways, among which membrane trafficking and neuronal signaling are the most known. Despite the fact that autophagy modifiers are well-studied, as the small globular proteins show similarity to ubiquitin on a structural level, the mechanism of their interactions are still not completely understood. A thorough analysis and classification of all known mechanisms of Atg8-protein interactions could shed light on their functioning and connect the pathways involving Atg8-proteins. In this review, we present our views of the key features of the Atg8-proteins and describe the basic principles of their recognition and binding by interaction partners. We discuss affinity and selectivity of their interactions as well as provide perspectives for discovery of new Atg8-interacting proteins and therapeutic approaches to tackle major human diseases.
This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA sci-ence and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mech-anistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI se-quences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strat-egy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
Das Glykoprotein AICL gehört zur Familie der C-Typ Lektin-ähnlichen Rezeptoren und wird nach Aktivierung humaner NK Zellen und Makrophagen auf deren Oberfläche exprimiert. Die Bindung von AICL an den genetisch gekoppelten, aktivierenden NKRezeptor NKp80, der auf allen reifen humanen NK Zellen exprimiert ist, induziert Effektorfunktionen von NK Zellen, wie Zytotoxizität und Zytokinsekretion. AICL Glykoproteine werden in ruhenden NK Zellen intrazellulär zurückgehalten und gelangen erst nach Zellaktivierung an die Oberfläche (Klimosch et al. 2013). Der Mechanismus dieser Regulation ist bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, um weitere Einblicke in die Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares im Rahmen einer Immunantwort zu ermöglichen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Aktivierung von NK Zellen sowohl präformierte im Golgi-Komplex zurückgehaltene als auch de novo synthetisierte AICL Glykoproteine an die Zelloberfläche gelangen. Bei der intrazellulären Retention von AICL handelt es sich um eine intrinsische Eigenschaft von AICL, die auch im ektopen Kontext von Insektenzellen auftritt. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die N-Glykosylierungen von AICL differentiell die AICLOberflächenexpression bestimmen. Die AICL Ektodomäne wird an einer nichtkonventionellen (N-X-C) und an drei konventionellen (N-X-S/T) N-Glykosylierungsstellen glykosyliert, wobei die Glykosylierung an ersterer ineffizient ist, sodass stets zwei Glykoisoformen vorhanden sind. Während die Glykosylierung zumindest einer konventionellen Stelle essenziell für die AICL-Oberflächenexpression ist, und diese mit zunehmender Glykosylierung konventioneller Stellen zunimmt, vermindert die nichtkonventionelle Glykosylierungsstelle die AICL-Oberflächenexpression. Für eine effiziente Oberflächenexpression ist auch die Ausbildung einer nicht-konservierten Disulfidbrücke erforderlich, die im membran-distalen Bereich der C-Typ Lektindomäne AICL-Homodimere miteinander verknüpft. Das Fehlen dieser Disulfidbrücke führt auch zu dem Verlust der NKp80-Bindung. Die intrazelluläre Reifung von AICL Glykoproteinen ist, im Gegensatz zu dem verwandten Glykoprotein KACL, in besonderem Maße abhängig von der Interaktion mit den ER-ständigen Proteinen der Proteinqualitätskontrolle. Insbesondere konnte mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen eine starke Interaktion von AICL mit dem ER Chaperone Calnexin gezeigt werden. Entsprechend ist die zelluläre Expression von AICL in Abwesenheit von Calnexin stark reduziert. Massenspektrometrisch konnte auch eine spezifische Interaktion von AICL mit dem Protein ITM2A gezeigt werden, wobei allerdings eine funktionelle Relevanz in Folgeversuchen nicht bestätigt werden konnte. Schließlich konnte eine zusätzliche Regulation der AICL-Oberflächenexpression durch proteasomale Degradation nachgewiesen werden, die über zwei Lysine im kurzen zytoplasmatischen Bereich von AICL bestimmt wird.
Frühere Untersuchungen hatten eine Bindung von sowohl AICL- als auch NKp80-Ektodomänen an K562 Zellen, eine Erythroleukämie-zelllinie, ergeben. Da K562 Zellen weder NKp80 noch AICL exprimieren, handelt es sich bei der gebundenen Struktur um einen potenziellen weiteren Liganden des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares. Hier konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Bindestruktur um ein Oberflächenprotein der K562 Zellen handelt, das allerdings nicht identifiziert werden konnte.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit mehrere AICL-spezifische, molekulare Mechanismen identifiziert und charakterisiert werden, die die aktivierungsabhängige Oberflächenexpression von AICL regulieren. Offensichtlich unterliegt diese einer strikten Kontrolle auf mehreren Ebenen, was vermutlich mit der Funktion von AICL als Ligand für einen aktivierenden Immunrezeptor auf zytotoxischen NK Zellen erklärbar ist. Weitere Untersuchungen zur AICL-Expressionsregulation und zur Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares in vivo sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Immunbiologie von NK Zellen zu erreichen.
Uncontrolled constitutive activation of Wnt signaling is a hallmark of colorectal cancer (CRC), which is responsible for the initiation of the vast majority of CRC cases (Fearon and Vogelstein, 1990; Morin et al., 1997; Wood et al., 2007). Paneth cells support the small intestinal stem cells by providing them with the required niche factors and especially Wnt3. Although the normal colonic epithelium does not contain Paneth cells, Paneth cell metaplasia is frequently observed in human and mouse adenoma (Joo et al., 2009). The occurrence of Paneth cells suggests the presence of high levels of Wnt ligands with unknown function in the tumor microenvironment of Wnt-independent tumor cells. Tumor progression is recognized as result of evolving crosstalk between tumor cells and their surrounding non-transformed stromal cells (Hanahan and Weinberg, 2011; Wang et al., 2017). Although Wnt signaling has been intensively studied in colorectal cancer (CRC) cells (Zhan et al., 2017), it remains unclear whether Wnt activity in the tumor-associated stroma contributes to the tumor malignancy. The present thesis used the organoid 3D cell culture system, genetically modified mouse models as well as next generation sequencing technology to identify and characterise the role of Wnt signaling in the tumor microenvironment of CRC.
Diese Arbeit etabliert eine nicht-invasive, volloptische Methode zur in-vivo Beobachtung des Membranpotentials in erregbaren Zellen des Fadenwurms C. elegans, die als Ersatz oder komplementär zu invasiven, elektrophysiologischen Methoden verwendet werden kann.
Krebs ist und wird voraussichtlich auch in näherer Zukunft eine der häufigsten Todesursachen weltweit bleiben. Trotz vielversprechenden Fortschritten in Therapeutik und Diagnostik bedarf es noch weiterer Forschung, um die vielfältigen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, welche dem Verlauf von malignen Tumorerkrankungen bestimmen und zu beeinflussen vermögen. Das RNA-Bindeprotein Hu antigen R (HuR) reguliert Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene, indem es durch Bindung an Ziel mRNAs Einfluss auf deren Abbau, Lokalisation oder Translationseffizienz nimmt. Darüber hinaus zeigte sich in den letzten Jahren, dass HuR diese Prozesse auch indirekt durch Interaktion mit regulatorischen RNAs beeinflusst. In Krebszellen lässt sich häufig eine erhöhte Aktivität von HuR beobachten, welche in Verbindung mit verschiedenen tumorigenen Prozessen gebracht wird. Unter anderem trägt HuR zur Deregulation des Zellzyklus bei, indem es die Expression der Cycline A2, B1, D1 und E1 erhöht. Weiterhin unterstützt HuR das Tumorwachstum durch Regulation von proangiogenen Faktoren wie VEGF, IL8 und COX2. Da HuR generell eine prominente Rolle bei der Regulation von Immunantworten, sowohl in Immunzellen selbst als auch in solidem Gewebe einnimmt, wurde HuR in der Vergangenheit häufig auch mit der Ausbildung des inflammatorischen Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, jedoch ist die Datenlage in dieser Hinsicht bis heute uneindeutig. Obwohl eine Großzahl an Zytokinen und inflammatorischen Faktoren prinzipiell als HuR Zielgene beschrieben sind, gibt es nur für die wenigsten dieser Proteine entsprechende Untersuchungen in Tumorzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von HuR in Tumoren auf die Rekrutierung von Makrophagen zu evaluieren. Hierfür bot sich als in vitro Modell die Brustkrebszelllinie MCF-7 an, da diese unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen dreidimensionale Sphäroide bildet. Solch ein Sphäroidmodell bietet sich als Kompromiss zwischen der klassischen zweidimensionalen Zellkultur an, welche zwar höchst artifiziell, jedoch leicht zu handhaben und zu kontrollieren ist, und den physiologischeren, aber gleichzeitig experimentell unzugänglicheren und speziesfremden Tiermodellen. Mittels lentiviraler Transduktion wurde ein small hairpin RNA (shRNA) vermittelter stabiler Knockdown von HuR in MCF-7 erzielt, welcher zu vermindertem Zellwachstum führte, jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden hatte. Um die initiale Suche nach HuR-regulierten, potenziell relevanten Faktoren möglichst breit und unvoreingenommen zu halten, wurde die Expression von 174 Zytokinen in Wildtyp- und HuR-knockdown Sphäroiden mittels eines Protein Arrays untersucht. Überraschenderweise zeigte der Großteil der veränderten Proteins einen negativen Zusammenhang mit HuR, welches eigentlich eher als positiv regulierendes Protein beschrieben ist. Bemerkenswerterweise befand sich unter den mit am stärksten regulierten Faktoren das Chemokin CCL5 (auch RANTES genannt), welches einerseits als einer der beiden zentralen Faktoren für die Makrophageninfiltration in Brustkrebs gilt, andererseits bisher noch nicht in Verbindung mit HuR gebracht wurde.
Im Folgenden untersuchte ich zuerst den mechanistischen Hintergrund dieser Regulation. Da diese sich auch in adhärenten Zellrasen zeigte, wechselte ich für die entsprechenden Experimente zu zweidimensionaler Zellkultur. Eine negative regulatorische Funktion von HuR wird meist in Verbindung mit verminderter Translation von Zielfaktoren gebracht. Da die mRNA Level von CCL5 dem Effekt auf Proteinebene entsprachen, konnten entsprechende Mechanismen als Grund für die veränderten CCL5 Level ausgeschlossen werden. Desweiteren blieb die mRNA Stabilität ungeachtet der HuR Level konstant; dabei zeigte sich zudem, dass mRNA Abbau generell keinen relevanten Einfluss auf die Expression von CCL5 in MCF-7 hatte. Da diese Ergebnisse auf eine transkriptionelle Regulation hindeuteten, untersuchte ich im Folgenden den Einfluss von HuR auf die Promoteraktivität von CCL5. Hierfür isolierte ich zunächst die CCL5-Promoterregion aus genomischer DNA von MCF-7 Zellen und inserierte diese dann in einen zuvor promoterlosen Luciferase-Expressionsvektor. In den folgenden Reporteranalysen zeigte sich, dass HuR tatsächlich einen negativen Einfluss auf die Promoteraktivität von CCL5 ausübt. Durch sukzessive Verkürzung ließ sich der entscheidende DNA-Bereich auf die letzten 140 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt eingrenzen. Dieser Bereich enthält vier prominente und sehr gut charakterisierte regulatorische Abschnitte: zwei benachbarte NF-κB Bindestellen sowie je ein Interferon-stimulated Response Element (ISRE) und ein C/EBPβ Erkennungsmotiv. Während das C/EBP Element keine funktionelle Relevanz in den Reporteranalysen hatte, reduzierte sich durch Deletion sowohl der ISRE als auch der NF-κB Elemente die Promoteraktivität um mehr als 50%, allerdings nur im ISRE-Deletionskonstrukt unter Nivellierung des HuR-abhängigen Unterschiedes. Somit ließ sich der Einfluss von HuR auf die CCL5 Promoteraktivität vollständig und ausschließlich auf das ISRE zurückführen. Im Gegensatz zu dem in Tumorzellen häufig basal überaktiven NF-κB Signalweg sind die kanonischen, ISRE-assoziierten Typ I Interferon Signalkaskaden und ihre vermittelnden Transkriptionsfaktoren, die sogenannten Interferon Regulatory Factors (IRFs) nicht konstitutiv überaktiviert. Eine Sonderstellung nehmen dabei die Faktoren IRF1 und IRF2 ein, da sie, für Proteine abseits der Stimulus-getriebenen ISRE-Interferon Achse, auch als konstitutive Transkriptionsfaktoren beschrieben sind, wobei IRF2 in diesem Kontext als IRF1-Antagonist und somit Transkriptionsrepressor fungiert. Überraschenderweise ließ sich mittels Chromatin Immunopräzipitation eine Assoziation von IRF1 mit dem CCL5 Promoter nur in Wildtyp-, jedoch nicht in HuR-knockdown Zellen nachweisen. Im Gegensatz dazu ergaben mRNA Expressionsanalysen der Tumor-relevanten IRFs, dass die CCL5 Induktion in HuR-depletierten Zellen mit einer allgemeinen, jedoch niedrigschwelligen Erhöhung von Typ I Interferon-assoziierten Signalen einhergeht. Interessanterweise korrelierte Interferon β zwar mit CCL5 auf mRNA Ebene, jedoch hatte eine Blockade des Interferon-α/β Rezeptors in HuR-depletierten Zellen keinen akuten Effekt auf CCL5. Umgekehrt zeigte sich auch keine erhöhten CCL5 Level in Wildtypzellen unter Kokultur mit HuR-knockdown Zellen, wie es bei parakriner Induktion durch Interferon β zu erwarten wäre. Ebenso konnte alternatives ISRE Signaling durch einen Komplex aus unphosphoryliertem Stat1 und IRF9, wie es in vitro unter länger anhaltender Niedriglevel Exposition mit Interferon β beobachtet wurde, ausgeschlossen werden. Um sicher zu stellen, dass diese Erhöhung kein sequenzabhängiges off-target Artefakt ist, wie es in der Vergangenheit für einzelne small hairpin RNAs (shRNAs) beobachtet wurde, wurde eine entsprechende Aktivierung von IRF3 und damit des IRF3/IRF7 Aktivierungsweges untersucht und ausgeschlossen. Zusätzlich konnte durch Tests unterschiedlicher shRNA Sequenzen sowie Zellsysteme demonstriert werden, dass die CCL5 Aktivierung tatsächlich ein spezifischer und in einer größeren Bandbreite an Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft, darunter Brust- und Lungenkarzinom, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien, reproduzierbarer Effekt von HuR-Defizienz ist.
Da CCL5 als eines der zentralen Chemokine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in Tumore beschrieben ist, stellte sich die Frage, ob HuR mit diesem Vorgang in Verbindung zu bringen ist. Brusttumore weisen oft eine hohe Zahl von Tumor-assoziierten Makrophagen auf, welche von eingewanderten Blutmonozyten abstammen. Ein Einfluss von HuR auf diesen Vorgang in vitro konnte mittels einer Kokultur von Sphäroiden mit zuvor frisch aus Humanblut isolierten Primärmonozyten nachgewiesen werden. Hierbei wiesen HuR-knockdown Sphäroide trotz ihres geringeren Durchmessers eine erhöhte Anzahl von Monozyten/Makrophagen auf. Da sich in diesen Zellen weder Proliferation noch relevante Apoptose zeigte, ließ sich die erhöhte Anzahl auf verstärkte Einwanderung in das Sphäroid zurückführen. Hierbei erwies sich der direkte Zellkontakt zwischen Monozyten und Tumorzellen als erforderlich, da Monozyten keine unterschiedliche Chemotaxis gegenüber entsprechenden Sphäroidüberständen zeigten. Dass die erhöhte Infiltration in HuR-defizienten Sphäroiden tatsächlich auf CCL5 zurückzuführen ist, konnte in Kokulturexperimenten durch Inhibierung von CCL5 gezeigt werden. Unterstütztend wurde ein Zusammenhang zwischen HuR, CCL5 und Tumor assoziierten Makrophagen in silico unter Zuhilfenahme des TCGA Datensets für Estrogenrezeptor-positive Brusttumore untersucht. Im Einklang mit meinen Ergebnissen zeigte sich eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5. Außerdem ließ sich ein negativer Zusammenhang zwischen HuR und einer Makrophagensignatur feststellen, während CCL5 wie erwartet mit dieser Signatur positiv korrelierte.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass HuR eine Rolle bei der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Tumor-Mikromilieus spielt. Der Verlust von HuR in Tumorzellen führte zu einer erhöhten Expression des Chemokins CCL5. Dies ließ sich in Brust- und Lungenkarzinom-, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien beobachten. In Brustkrebszellen zeigte sich, dass diese Regulation auf verstärkte Transkription, vermittelt durch ein ISRE innerhalb des CCL5 Promoters, zurückzuführen ist. Funktionell konnte die erhöhte CCL5 Produktion in HuR-defizienten Tumorsphäroiden in Verbindung mit verstärkter Infiltration von Monozyten/Makrophagen gebracht werden. Unterstützend zeigte sich auch bei einer in silico Analyse von Estrogenrezeptor-positiven Brusttumoren eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5, was mit einer entsprechend veränderten Makrophagensignatur einherging. Im Hinblick auf derzeit diskutierte Ansätze, das Wachstum von Tumoren mittels HuR Blockade zu inhibieren, sind meine Ergebnisse potenziell von therapeutischer Relevanz. Basierend auf meiner Arbeit sollte dabei in zukünftigen Studien näher untersucht werden, wie sich Inhibierung von HuR in Tumoren auf die Zusammensetzung und Funktion des Tumormikromilieus auswirkt und daraus resultierende Effekte auf das Tumorwachstum in Relation zu der allgemein wachstumsfördernden Rolle von HuR in Tumorzellen gesetzt werden.
Auswirkung der Chemisorption von Organothiolaten auf den elektrischen Widerstand dünner Goldfilme
(2018)
Hochgeordnete Monolagen von Organothiolaten auf Goldoberflächen bilden sich bei Kontakt einer Goldoberfläche mit einer Lösung eines Thiols oder Thioacetats spontan aus. Die Adsorption auf dünnen Metallfilmen mit Schichtdicken im Bereich von 25 - 100 nm führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes des Films, die an Goldfilmen mit Schichtdicken von 25 - 40 nm über eine einfache Zweipunktmessung verfolgt wurde. Die Proportionalität der Widerstandsänderung mit der Menge an adsorbiertem Material konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Dünnschichtsensoren bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden gleichzeitig Widerstands- und Oberflächenplasmonenresonanzmessungen an 40 nm starken Goldfilmen durchgeführt. In diesen Experimenten zeigt sich die Widerstandsmessung zur Beobachtung der Adsorptionskinetik als die überlegene Technologie.
Die durch Mikrokontaktdrucken und Freiätzen der gedruckten Strukturen hergestellten Sensoren zeigen eine individuelle Signalintensität. Die Normierung auf die maximale, durch Belegung mit Hexadecanthiol (HDT) oder Dodecanthiol erreichte, Signalstärke ermöglichte den Vergleich der maximalen Signalstärke von Thiolatmonolagen, die durch Belegung mit n-Alkanthiolen (CH_3(CH_2)_(n-1)-SH mit n = 12, 16, 19, 22 und 33, Cn), 11-Mercaptoundecyl-hexaethylenglycol (HSC11EG6OH), Adamantan-1-thiol (AdaSH), Triptycenthiol (TrpSH), Anthracen-2-thiol (Ant-0SH), Anthracen-2-alkanthiolen (Ant-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 5 und 10, Ant-nSH), p-Terphenyl-4-thiol (TP0SH), p-Terphenyl-4-alkanthiolen (TP-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 4, TPnSH) und p-Terphenyl-4-ethanthioacetat (TP2SAc) erzeugt wurden. Die Größe der Widerstandsänderung zeigt eine deutliche Abhängigkeit vom organischen Rest des Oberflächenadsorbats. Für die Verstärkung des Signals wurde die folgende Reihenfolge gefunden: Trp > Ada > Ant-0 > Ant-1 > TP0 > TP1 > Ant-2 > TP2 > Cn (n = 12 - 33) = C11EG6OH = Ant-n (n = 3 - 11) = TPn (n = 3, 4). Bei bekannter Verstärkung des Signals durch ein Adsorbat kann unabhängig von der Oberflächenrauigkeit die Oberflächenbedeckung durch Chemisorbate in einer Güte bestimmt werden, die der durch STM- und TEM-Messungen erreichten vergleichbar ist. Die Methode wurde angewendet, um Schichten von TP2SH und TP2SAc, die bei 20 und 60 °C aus ethanolischer Lösung abgeschieden wurden, zu vergleichen. Die Unterschiede in der Oberflächendichte, die durch eine Erhöhung der Abscheidungstemperatur zu beobachten sind, können durch eine Beschleunigung der Reaktion nach Arrhenius erklärt werden. Auch die Temperaturabhängigkeit der Abscheidungsgeschwindigkeit von HDT aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen, die in einem Bereich von -10 °C bis +30 °C betrachtet wurde, ist mit dem Arrhenius'schen Ansatz konform. Die Aktivierungsenergie der Adsorption von HDT auf Gold wurde auf E_a = 23 +-6 kJ/mol bestimmt.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Abscheidung aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen wurde für HDT, AdaSH, TP2SH und TP2SAc untersucht. Um eine Präadsorption der Thiole vor dem eigentlichen Start der Messung zu verhindern, wurde eine Apparatur mit einem Diaphragma aus Aluminium entwickelt, das beim Start der Messung mit dem Sensor durchstoßen wird. Mit Ausnahme von TP2SH zeigen alle Adsorptive ein Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht. Die Adsorptionsisothermen bei 20 °C lassen sich am besten durch die Freundlich-Isotherme beschreiben. Während die Reaktionsordnung im Adsorbat für die Adsorption der Thiole nahe an 1 liegt, hat sie für die Adsorption von TP2SAc einen Wert von ca. 1/4. Damit ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption k_a(HDT) = (2,3 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(AdaSH) = (6,1 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(TP2SH) = (7,3 +-0,4) 10^3 L/(mol s) und k_a(TP2SAc) = (8 +-3) 10^-2 L^(1/4)/(mol^(1/4) s). Die Adsorptionskurven der Thiole weisen bei Konzentrationen unterhalb von 5 10^-5 mol/L einen linearen Bereich auf, der einer zwischenzeitlichen Diffusionskontrolle zugeordnet wird.
An die aufgenommenen Adsorptionskurven der Thiole wurden literaturbekannte Modelle numerisch angepasst und teilweise weiterentwickelt. Die Anpassung konnte durch die Einführung einer vor der Oberfläche gelagerten Diffusionsgrenzschicht, in welcher der zeitabhängige Verlauf der Analytkonzentration in einem System von 10 Schichten berechnet wurde, deutlich verbessert werden. Von allen getesteten Modellen zeigt nur die Adsorption mit Ausschlussmuster keine Konzentrationsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Desorption. Dieses Modell bezieht den Verlust von Adsorptionsplätzen mit ein, die einem besetzten Adsorptionsplatz benachbart sind und durch das adsorbierte Teilchen verdeckt werden. Der daraus resultierende Zusammenhang zwischen der Konzentration freier Adsorptionsplätze und dem Bedeckungsgrad der Oberfläche Theta_F(Theta) ist abhängig vom Verhältnis der Stoßfrequenz zwischen den Teilchen und der Oberfläche zur Platzwechselfrequenz der Teilchen auf der Oberfläche. Zur Bestimmung von Theta_F(Theta) für die numerische Anpassung der Adsorptionskurven von HDT und TP2SH wurde die Oberflächenbesetzung in einem Monte-Carlo-Verfahren für eine Konzentrationsreihe in Zehnerpotenzschritten simuliert.
Chronic inflammation is considered to be a cause of the autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, etc. The search for effective compounds with anti-inflammatory properties to combat these diseases is still ongoing. Natural compound narciclasine, derived from plants of Narcissus species, demonstrated its anti-inflammatory activity in in vivo arthritis models. Further investigation of narciclasine’s anti-inflammatory activity together with its impact on the interaction between leukocytes and endothelial cells was the main focus of this PhD thesis.
Narciclasine reduced the infiltration of monocytes and neutrophils to the abdomen and the concentration of the pro-inflammatory cytokines TNF, IL-6 and IL-1β. Together with this, it reduced acute visceral pain caused by zymosan injection. Narciclasine interfered with leukocyte-endothelial cell interaction in both in vivo and in vitro models. In vivo microscopy revealed that the compound reduced rolling, adhesion and transmigration of leukocytes in the vessels of an injured murine cremaster muscle. This observation was confirmed in the in vitro models for adhesion and transmigration where narciclasine reduced the level of leukocyte’s interaction with HUVECs. Narciclasine demonstrated profound anti-inflammatory properties based on its interference with leukocyte-endothelium interaction by downregulation of endothelial cell adhesion molecules expression (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, CX3CL1) and shutdown of NF-κB pathway. All these effects were a result of the TNF receptor 1 protein translation blocking by narciclasine.
In this work the ability of the compound to reduce visceral pain, downregulate the expression of the endothelial cell adhesion molecules and to interfere with the interaction between leukocytes and endothelial cells was demonstrated for narciclasine for the first time. Obtained results open a promising insight into the understanding of narciclasine’s anti-inflammatory properties and justify further investigation of its potential for treatment of inflammatory diseases.