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Die vorliegende Dissertation gliedert sich in 2 Abschnitte: Im 1. Abschnitt wurden die Auswirkungen des Naturstoffs Phytol auf den Krankheitsverlauf des murinen EAE-Modells charakterisiert, während im 2. Abschnitt die immunmodulierenden Eigenschaften der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o untersucht wurden.
Vorarbeiten zeigten einen positiven Einfluss von Phytol auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell für Multiple Sklerose, eine verringerte Proliferationsfähigkeit von Splenozyten sowie eine Regulation der NOX2 mRNA-Expression (Blum et al., 2018b).
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Gabe von Phytol den Prozess der Demyelinisierung im lumbalen Rückenmark deutlich reduzierte und die Anzahl der Immunzellen in den inguinalen Lymphknoten sowie im lumbalen Rückenmark signifikant verringerte. Weiterhin konnte eine Regulation der spezifischen T-Zell Transkriptionsfaktoren T Bet sowie Foxp3 nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass Phytansäure, nicht jedoch Pristansäure, die beiden Metaboliten von Phytol, die Proliferationsfähigkeit der T-Zellen signifikant verringerte. Beide Metaboliten zeigten zusätzlich unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell Subtypen. Hultqvist et al. konnten eine verstärkte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Phytol nachweisen (Hultqvist et al., 2006). Vorarbeiten zeigten eine Steigerung der mRNA-Expression des ROS-produzierenden Enzymkomplex NOX2 im Verlauf des EAE-Modells sowie eine Regulation der NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark und in den inguinalen Lymphknoten durch Phytol (Blum et al., 2018b). Deshalb wurde die Rolle von NOX2 an den Phytol-vermittelten Effekten weiter charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die gesteigerte NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark auf die eingewanderten Immunzellen zurückzuführen war. Die von NOX2 im zentralen Nervensystem (ZNS) gebildeten ROS, welche zur Schädigung der Myelinschicht beitragen können, wurden durch die Gabe von Phytol im lumbalen Rückenmark verringert. Untersuchungen in NOX2KO-Mäusen zeigten, dass die beobachteten ex vivo Effekte von Phytol sowie dessen Metaboliten nur teilweise NOX2-abhängig waren. Im murinen EAE-Modell mit NOX2KO-Mäusen zeigte Phytol weiterhin einen positiven Einfluss auf die klinischen Symptome. Auffällig war dabei, dass NOX2KO-Tiere grundsätzlich weniger klinische Scores zeigten als Wildtyp Tiere. In NOX2-Chimären hatte Phytol keinen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Grund dafür könnte eine Beschädigung der Blut-Hirn-Schranke bei der Generierung der Chimären und eine damit verbundene verstärkte Infiltration von Immunzellen in das ZNS gewesen sein. Weiterhin konnte Phytol möglicherweise über die geschädigte Blut-Hirn-Schranke verstärkt in das ZNS eindringen und dort über eine gesteigerte ROS-Produktion zu schädigenden Effekten führen.
Die in vivo Daten weisen auf einen überwiegend NOX2-unabhängigen Wirkmechanismus von Phytol hin. Dennoch scheint NOX2 bei einigen Effekten zumindest beteiligt zu sein. Zusammenfassend zeigte die Gabe von Phytol einen überwiegend positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell, dennoch ist die Phytol-vermittelte Induktion von NOX2 und die Bildung von ROS kritisch zu sehen, da diese sowohl positive als auch negative Effekte vermitteln und stark von der Quantität sowie der Lokalisation der Bildung abhängig sind.
Im 2. Teilprojekt wurden die immunmodulierenden Auswirkungen der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o charakterisiert. Der anti-viral wirksame Naturstoff Silvestrol zeigte dabei diverse Auswirkungen auf die Differenzierung sowie Polarisierung von humanen Makrophagen. Während der Differenzierung inhibierte Silvestrol das anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Potential der Makrophagen durch eine Reduktion der resolutionsfördernden Oberflächenmarker CD206 und TREM2. Weiterhin wurde die Sezernierung der anti-inflammatorischen Zyto- bzw. Chemokine IL-10 und CCL18 verringert. Der pro-inflammatorische Phänotyp von M1-Makrophagen wurde weiterhin durch die vermehrte Bildung von TNF-α unterstützt, während bei M2-Makrophagen der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp verstärkt wurde. In Dendritischen Zellen schien Silvestrol sowohl die Differenzierung als auch die Aktivierung zu inhibieren, da zahlreiche Oberflächenmarker und sezernierte Zytokine signifikant verringert wurden. Die Stoffwechselwege der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse wurden sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen signifikant reduziert. Demnach ist unklar, ob in der Summe die pro- oder anti-inflammatorischen Aspekte von Silvestrol überwiegen und ob der Einfluss auf den Stoffwechsel die Immunantwort beeinträchtigt.
Der anti-parasitäre Wirkstoff Steroid Substanz 1o zeigte keinen negativen Einfluss auf die Viabilität in primären humanen Immunzellen bis zu einer Konzentration von 50 µM und verstärkte das pro-inflammatorische Profil von M1-Makrophagen. Weiterhin wurde der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp von M2-Makrophagen unterdrückt und stattdessen die pro-inflammatorischen Aspekte verstärkt. Diese Beobachtungen der veränderten Oberflächenmarker sowie der sezernierten Zytokine wurden weiterhin durch die Veränderung des zellulären Stoffwechsels gestützt. Dabei steigerte Steroid Substanz 1o die Glykolyse in M2-Makrophagen, welche eigentlich für M1-Makrophagen charakteristisch ist. Dadurch kann die Verschiebung der M2-Makrophagen zu einem M1-Phänotyp erklärt werden. Weiterhin beeinträchtigte Steroid Substanz 1o die Differenzierung und Aktivierung von Dendritischen Zellen. Zusammenfassend verstärkte Steroid Substanz 1o überwiegend die pro-inflammatorischen Aspekte der Immunreaktion durch eine Aktivierung der M1-Makrophagen. Bei der möglichen Anwendung als Therapeutikum für Malaria sowie Schistosomiasis kann somit das Immunsystem bei der initialen Abwehr der Parasiten unterstützt werden.
Paramyxo- and pneumoviruses include many pathogens with great relevance for human and animal health. To identify common host factors involved in the Paramyxo- and Pneumoviridae life cycle as a basis for new insights in the biology of these viruses and the development of rationally designed therapeutics, genome scale siRNA screens with wild-type measles, mumps, and respiratory syncytial viruses in A549 cells, a human lung adenocarcinoma cell line, were performed. A comparative bioinformatics analysis yielded different members of the coatomer complex I, the translation factors ABCE1 and eIF3A, and several RNA binding proteins as cellular proteins with proviral activity for all three viruses. The strongest common hit, ABCE1, an ATP-binding cassette transporter member, was chosen for further study. We found that ABCE1 supports replication of all three viruses, confirming its importance for both virus families. While viral protein kinetics showed that ABCE1 knockdown resulted in a drastic decrease of MeV protein expression, viral mRNA kinetics are not directly affected by a reduction of ABCE1.
The impact of ABCE1 on viral and global cellular translation was investigated using both 35S metabolic labelling and non radioactive fluorescent protein labelling. ABCE1 knockdown strongly inhibited the production of MeV proteins, while only modestly affecting global cellular protein synthesis and showed that ABCE1 is specifically required for efficient viral, but not general cellular, protein synthesis, indicating that paramyxoand pneumoviral mRNAs may exploit specific translation mechanisms.
In a second approach the efficacy of the small-molecule polymerase inhibitor ERDRP-0519 against MeV was assessed in squirrel monkeys. Animals treated with the drug experienced less severe clinical disease compared to untreated controls, and this effect correlated with the onset of drug treatment.
We observed a reduction of levels of PBMC-associated viremia and virus release in the upper airways, illustrating effective inhibition of virus replication by the drug treatment. ERDRP-0519 drug treatment also alleviated MeV-induced immunosuppression. In addition to providing proof-of-concept for the support of MeV eradication efforts by preventing disease and transmission with a small-molecule polymerase inhibitor, this dissertation provides a novel perspective on cellular proteins that impact the replication of MeV, MuV and HRSV and highlights the role of ABCE1 as host factor that is required for efficient paramyxo- and pneumovirus translation.
Eukaryotische Zellen sind durch, aus Lipiddoppelschichten bestehenden, Membranen in Kompartimente mit unterschiedlichen Funktionen eingeteilt. Um einen Transport von Molekülen über die Membranen hinweg zu gewährleisten, werden Kanälen und Transporter benötigt. Eine Familie von Transportern sind die ATP-binding cassette (ABC) Transporter, die in allen Lebewesen, von Bakterien bis zum Menschen, vorkommen. Ein Mitglied dieser Familie ist der transporter associated with antigen processing-like (TAPL oder ABCB9). TAPL ist ein lysosomaler Polypeptidtransporter der per ATP-Hydrolyse Peptide von 6 – 59 Aminosäuren Länge vom Zytosol in das Lumen der Lysosomen transportiert. Hierbei kann TAPL, das ein Homodimer ist, in zwei funktionale Domänen geteilt werden. Der Teil des Komplexes, der für den Transport zuständig ist, wird als coreTAPL bezeichnet. Dieser beinhaltet die zytosolischen nucleotide binding domains (NBDs), die ATP binden und hydrolysieren können, und die Transmembrandomänen (TMDs), die Peptide binden und sie durch konformationelle Änderungen auf der anderen Membranseite freilassen. Die zweite Domäne ist eine N-terminale TMD, die als TMD0 bezeichnet wird. Dieser, aus vier Transmembranhelices (TMHs) bestehende Teil des Proteins, ist für die Lokalisation von TAPL in der lysosomalen Membran verantwortlich, sowie für die Interaktion mit den dort lokalisierten Membranproteinen LAMP-1 und LAMP-2. CoreTAPL ohne die TMD0s erreicht nicht die Lysosomen, sondern liegt in der Plasmamembran (PM) der Zelle vor. Die TMD0 hingegen benötigt coreTAPL nicht um korrekt in der lysosomalen Membran lokalisiert zu sein.
Die korrekte Lokalisation in der Zelle ist ein kritischer Punkt für ein Protein, um seine Funktion ausüben zu können. Die Transportprozesse vom Ort der Synthese des Proteins, dem Endoplasmatischem Reticulum (ER), zum Organell wo es seine Funktion ausüben soll, umfassen dutzende Proteine und Proteinkomplexe und ein komplexes Zusammenspiel zwischen Proteinen und den einzigartigen Lipidzusammensetzungen der Membranen verschiedener Organellen. Auf das Einfachste heruntergebrochen benötigt ein Transmembranprotein eine kurze Aminosäuresequenz auf der zytosolischen Seite, die Signalsequenz. Diese Sequenz wird von sogenannten Adapterproteinen erkannt, die wiederum andere Bestandteile der zellulären Maschinerie rekrutieren, die letztlich Vesikelbildung, Transport und Fusion mit der Zielorganelle vermitteln. Allerdings weisen nicht alle lysosomalen Transmembranproteine eine solche Signalsequenz auf, sondern besitzen unkonventionelle Zieldeterminanten, wie posttranslationale Modifikationen, oder sie interagieren mit anderen Proteinen, die wiederum die Interaktion mit den Adapterproteinen vermitteln.
Food allergies are defined as an adverse health effect arising from a specific immune response that occurs reproducibly on exposure to a given food. The prevalence of food allergies has increased in the past decade. Epidemiologic studies involving controlled food challenges for the diagnosis of food allergies indicated that between 1 % to 10.8 % of the population have immunemediated non-toxic food hypersensitivity.
Despite the increasing prevalence, no curative treatment has been established for food allergies so far except the complete avoidance of the elicited food. To establish safe and effective immunotherapy for food allergies, it is of crucially importance to elucidate pathological mechanism of such diseases.
Food allergies are classified into IgE-mediated and non-IgE mediated (T-cell mediated) allergies, depending on the immunologic pathways and the role of the IgE on the pathogenesis of the disease. Allergic enteritis (AE) is a gastrointestinal form of food allergy. It is classified as non-IgE-mediated food allergy. However, patients with AE often develop IgE and high levels of IgE have been associated with development of persistent AE. The gastrointestinal symptoms of AE are nonspecific, resulting in the fact that a broad differential diagnoses including diagnostic approaches for allergic diseases are necessary to rule out other gastrointestinal pathologies. Biopsies of patients with allergic enteritis have shown infiltration of inflammatory cells (e.g. mast cells, eosinophils, neutrophils, and T cells) in the lamina propria, disruption of intestinal villi, edema, and presence of goblet cells in the intestine...
Supersaturating formulations are widely used to improve the oral bioavailability of poorly soluble drugs. However, supersaturated solutions are thermodynamically unstable and such formulations often must include a precipitation inhibitor (PI) to sustain the increased concentrations to ensure that sufficient absorption will take place from the gastrointestinal tract. Recent advances in understanding the importance of drug-polymer interaction for successful precipitation inhibition have been encouraging. However, there still exists a gap in how this newfound understanding can be applied to improve the efficiency of PI screening and selection, which is still largely carried out with trial and error-based approaches. The aim of this study was to demonstrate how drug-polymer mixing enthalpy, calculated with the Conductor like Screening Model for Real Solvents (COSMO-RS), can be used as a parameter to select the most efficient precipitation inhibitors, and thus realise the most successful supersaturating formulations. This approach was tested for three different Biopharmaceutical Classification System (BCS) II compounds: dipyridamole, fenofibrate and glibenclamide, formulated with the supersaturating formulation, mesoporous silica. For all three compounds, precipitation was evident in mesoporous silica formulations without a precipitation inhibitor. Of the nine precipitation inhibitors studied, there was a strong positive correlation between the drug-polymer mixing enthalpy and the overall formulation performance, as measured by the area under the concentration-time curve in in vitro dissolution experiments. The data suggest that a rank-order based approach using calculated drug-polymer mixing enthalpy can be reliably used to select precipitation inhibitors for a more focused screening. Such an approach improves efficiency of precipitation inhibitor selection, whilst also improving the likelihood that the most optimal formulation will be realised.
Objectives: The objective of this review is to provide an overview of PK/PD models, focusing on drug-specific PK/PD models and highlighting their value-added in drug development and regulatory decision-making.
Key findings: Many PK/PD models, with varying degrees of complexity and physiological understanding, have been developed to evaluate the safety and efficacy of drug products. In special populations (e.g. pediatrics), in cases where there is genetic polymorphism and in other instances where therapeutic outcomes are not well described solely by PK metrics, the implementation of PK/PD models is crucial to assure the desired clinical outcome. Since dissociation between the pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles is often observed, it is proposed that physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) and PK/PD models be given more weight by regulatory authorities when assessing the therapeutic equivalence of drug products.
Summary: Modeling and simulation approaches already play an important role in drug development. While slowly moving away from “one-size fits all” PK methodologies to assess therapeutic outcomes, further work is required to increase confidence in PK/PD models in translatability and prediction of various clinical scenarios to encourage more widespread implementation in regulatory decision-making.
Stickstoff (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Schwefelwasserstoff (H2S) gehören zur Gruppe der Gasotransmitter. Dabei handelt es sich um kleine gasförmige Signalmoleküle, welche innerhalb des Körpers gebildet werden und dort wichtige physiologische Funktionen bei der Regulation der Apoptose, der Proliferation, der Entzündungsreaktion und der Genexpression übernehmen. Aufgrund ihrer Membranpermeabilität ist die Wirkung der Gasotransmitter nicht an die Interaktion mit spezifischen membranständigen Rezeptoren gebundenen. Je nach Organ, Gewebe und Konzentration können diese Mediatoren unterschiedliche Prozesse beeinflussen und teils sogar gegenteilige Wirkungen hervorrufen.H2S beispielsweise kann im Verlauf der Leukozytenadhäsion im Epithelium anti-inflammatorisch, bei Brandwunden oder rheumatischen Erkrankungen jedoch pro-inflammatorisch wirken. Im Kreislaufsystem hingegen bewirkt H2S durch die Aktivierung von ATP-abhängigen K+-Kanälen und die damit zusammenhängende Vasorelaxion der glatten Muskelzellen einen eindeutig protektiven Effekt.
H2S kann je nach Substrat und Zelltyp durch eines von 3 Enzymen gebildet werden. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) und die Cystathionin-β-Synthase (CBS) nutzen L-Cystein als Substrat für die Synthese von H2S. Das dritte H2S-bildende Enzym, die 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3-MST) verwendet α-Ketoglutarat als Substrat, welches zuvor von der Cystein-Aminotransferse (CAT) aus L-Cystein synthetisiert wurde. Während die beiden Enzyme CSE und CBS im Zytosol der Zelle zu finden sind, ist die 3-MST hauptsächlich in den Mitochondrien der Zelle zu finden. Im Gegensatz zur CBS, welche eher ein konstitutiv exprimiertes Protein ist, wird die Expression der CSE auf der Transkriptionsebene durch u.a. Entzündungsmediatoren wie TNF-α oder Wachstumsfaktoren wie PDGF-BB induziert.
Ein Ziel der Arbeit war es, die Wirkung von H2S bei der Wundheilung, bei entzündlichen glomerulären Erkrankungen der Niere und beim Schlaganfall zu untersuchen. Für diesephänotypische Analysen stand ein Knockoutmodell für die CSE zur Verfügung.
Zudem wurden in dieser Arbeit Untersuchungen mit einem Knockoutmodell für das zytoskeletäre Protein durchgeführt. Bei Clp36 (PDLIM1) handelt es sich um ein PDLIM-Protein (PDZ and LIM domain protein),welches durch die Gasotransmitter NO und H2S auf transkriptioneller und translationaler Ebene reguliert wird ist und aufgrund seiner Assoziation mit dem Zytoskelett dynamische Vorgänge der Zelle moduliert. Es ist bereits bekannt, dass Clp36 ein negativer Regulator des Glykoprotein VI (GPVI), welches eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten spielt, ist.
Beide Knockoutmodelle wurden in murinen Mesangiumzellen der Niere und in Krankheitsmodellen der Haut (kutane Wundheilung)und des Gehirns (Schlaganfall mit dem MCAO-Modell) analysiert.
Neben nicht signifikanten Effekten im MCAO-Modell, konnten sowohl Effekte des CSE-, als auch des CLP36-KOs auf die Migration und Proliferation und im Falle der CSE auch auf die Adhäsion der murinen Mesangiumzellen beobachtet werden. Die Depletion von Clp36 führte zu einer Verringerung der Migrations- und einer Erhöhung der Proliferationsrate, wohingegen die Depletion der CSE zu einer Erhöhung der Migrations-, Proliferations- und Adhäsionsrate führte. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten im Tiermodell der kutanen Wundheilung generiert werden. Untersucht wurde die Expression der H2S-produzierenden Enzyme CSE, CBS und 3-MST. Alle drei Enzyme zeigten im Tiermodell keine transkriptionelle Regulation und blieben auch während der akuten Entzündungsphase und der proliferativen Phase der Wundheilung unverändert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Expression der CSE in der späten Phase der Wundheilung signifikant anstieg, wenn die Proliferation innerhalb des Granulationsgewebes und der Neoepidermis geringer wurde. Die Vermutung, dass H2S in dieser Phase eine wichtige Rolle spielt, konnte durch die Analyse der CSE-KO Mäuse bekräftigt werden, da dort der Verlust der CSE offenbar durch die CBS kompensiert wurde.
In immunhistochemischen Untersuchungen konnten insbesondere follikuläre Keratinozyten der Neo-Epidemis als Quelle der CSE-Expression identifiziert werden. Durch in-vitro Studien auf mRNA und Proteinebene in HaCaT Zellen wurde gezeigt, dass H2S die Keratinozyten-Differenzierung beeinflusst. Der langsam freisetzendeH2S-Donor GYY4137 konnte in humanen Keratinozyten zu einer signifikanten Erhöhung der Ca2+- induzierten Expression der frühen Keratinozyten-Differenzierungsmarker Cytokeratin 10 (CK10) und Involucrin (IVN) beitragen.
Im Laufe dieser Arbeit konnte der molekulare Mechanismus hinter diesen Beobachtungen noch nicht geklärt werden.
Durch weitere Versuche meiner Arbeitsgruppe konnte jedoch gezeigt werden, dass die GYY4137-abhängige Induktion der CK10-Expression durch eine verstärkte Bindung der RNA-Polymerase II an den CK10 Promotor zustande kommt.
Persistent and, in particular, neuropathic pain is a major healthcare problem with still insufficient pharmacological treatment options. This triggered research activities aimed at finding analgesics with a novel mechanism of action. Results of these efforts will need to pass through the phases of drug development, in which experimental human pain models are established components e.g. implemented as chemical hyperalgesia induced by capsaicin. We aimed at ranking the various readouts of a human capsaicin–based pain model with respect to the most relevant information about the effects of a potential reference analgesic. In a placebo‐controlled, randomized cross‐over study, seven different pain‐related readouts were acquired in 16 healthy individuals before and after oral administration of 300 mg pregabalin. The sizes of the effect on pain induced by intradermal injection of capsaicin were quantified by calculating Cohen's d. While in four of the seven pain‐related parameters, pregabalin provided a small effect judged by values of Cohen's d exceeding 0.2, an item categorization technique implemented as computed ABC analysis identified the pain intensities in the area of secondary hyperalgesia and of allodynia as the most suitable parameters to quantify the analgesic effects of pregabalin. Results of this study provide further support for the ability of the intradermal capsaicin pain model to show analgesic effects of pregabalin. Results can serve as a basis for the designs of studies where the inclusion of this particular pain model and pregabalin is planned.