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Colorectal cancer (CRC) has the third highest incidence and the fourth highest mortality rate worldwide and represents a substantial health care burden and affects the life of millions of people. CRC is a genetic disease caused by the stepwise accumulation of genetic alterations. The initiating event in colorectal carcinogenesis is the aberrant activation of the WNT pathway, but other pathways are also commonly deregulated, including the PI3K/AKT pathway. A number of previous studies using genetically engineered mouse models aimed at dissecting the exact role of PI3K/AKT pathway in CRC, but have yielded in rather conflicting results. Despite the inconsistent results, these studies already put forward the idea that PI3K/AKT signaling in combination with other genetic events might substantially contribute to tumor progression. Since the PI3K/AKT pathway is frequently activated in CRC, it represents an ideal candidate for therapeutic intervention. Although extensive efforts had led to the development of numerous inhibitors targeting the PI3K/AKT pathway, the diversity of genetic alterations can challenge the identification of the most effective therapeutic targets. Therefore, the discovery of shared tumor-promoting mechanisms downstream of these genetic alterations might unravel new biomarkers and druggable targets. The aim of this study was to elucidate the precise role of PI3K/AKT pathway during the course of colorectal carcinogenesis and to decipher novel protumorigenic molecular mechanisms downstream of PI3K/AKT activation that can be used for therapeutic intervention.
To obtain a better insight into the role of the PI3K/AKT pathway during colorectal carcinogenesis, mice expressing an oncogenic variant of AKT1 (AktE17K) specifically in the intestinal epithelial cells (IEC) were used. At the age of 6 months untreated AktE17K mice showed clearly perturbed intestinal homeostasis, but no tumor formation. To induce colonic tumorigenesis, AktE17K mice were subjected to treatment with the colonic carcinogen azoxymethane (AOM). In response to AOM, AktE17K mice developed invasive but non-metastatic tumors, which showed strong nuclear accumulation of TP53. To investigate the role of PI3K/AKT signaling specifically in CRC progression, AktE17K mice were crossed to TP53-deficient mice (Tp53ΔIEC). Unlike AktE17K mice, untreated Tp53ΔIEC; AktE17K, developed highly invasive small
intestinal tumors by the age of 6 months. To investigate the role of AKT hyperactivation in colonic tumor progression, Tp53ΔIEC; AktE17K mice were subjected to AOM treatment. AKT hyperactivation significantly enhanced tumor progression and induced metastatic dissemination.
To get a better insight how AKT signaling can promote tumor progression, whole tumor tissues from AOM-treated Tp53ΔIEC and Tp53ΔIEC; AktE17K mice were subjected to next generation mRNA sequencing and phospho-proteomic analysis by mass spectrometry. Both analyses indicated that AKT hyperactivation expands the inflammatory tumor microenvironment and upregulates pathways associated with invasion and metastasis. Importantly, Gene Set Enrichment Analysis revealed that AOM-induced colon tumors of Tp53ΔIEC; AktE17K animals, are highly similar in their gene expression profile to the CMS4 subtype of human CRC, which is associated with worse overall- and relapse-free survival. Gene expression analysis also suggested elevated NOTCH signaling in the Tp53ΔIEC; AktE17K tumors. Interestingly, while the expression of Notch3 mRNA was increased in the tumors of Tp53ΔIEC; AktE17K mice, the expression of the other NOTCH receptors was unaffected by AKT hyperactivation. In vitro experiments using TP53-deficient mouse tumor organoids with hyperactive AKT signaling confirmed the direct, tumor cell-intrinsic link between AKT activation and increased Notch3 expression. Moreover, inhibition of EZH2 mimicked the effect of AKT hyperactivation on Notch3 expression, suggesting that AKT regulates Notch3 via an epigenetic mechanism.
Knock-down of Notch3 in TP53-deficient mouse tumor organoids with hyperactive AKT signaling resulted in differential regulation of several pathways with potential role in invasion and metastasis and in cell death and survival. Subsequent in vivo experiments confirmed the role of NOTCH3 signaling in CRC progression. Treatment of AOM-induced Tp53ΔIEC; AktE17K mice with a NOTCH3 antagonistic antibody or the γ-secretase inhibitor DAPT significantly reduced invasion and metastasis. Importantly, NOTCH3 expression was also found to be associated with human CRC progression, suggesting that NOTCH3 represent a valid target for the treatment of CRC. This work, using genetically engineered mouse models and advanced in vitro techniques, has demonstrated a strong tumor promoting role for PI3K/AKT signaling in CRC progression and has identified NOTCH3 signaling as a potential therapeutic target downstream of the PI3K/AKT pathway.
Microsporidia are a group of parasites that infect a wide range of species, many of which play important roles in agriculture and human disease. At least 14 microsporidian species have been confirmed to cause potentially lifethreatening infectious diseases in both immunocompromised and immunocompetent humans. Approximately 1,400 species of microsporidia have been described. Depending on their host and habitat they are classified into three groups, the aquasporidia, the terresporidia and the marinosporidia.
Microsporidia were originally classified as fungi by Naegeli (1857). However, their lack of typical eukaryotic components – such as mitochondria, Golgi bodies or peroxisomes – suggested to place the microsporidia together with other amitochondriate protists within the Archezoa kingdom. This "microsporidia-early" hypothesis was further supported by molecular phylogenies inferred from individual genes. Despite this evidence, the placement of microsporidia as an early branching eukaryote remained a topic for debate. The phylogeny of microsporidia is prone to suffer from biases in their reconstruction. The high evolutionary rate of microsporidian proteins tends to place these proteins together with other fast evolving lineages, a phenomenon known as long-branch attraction. In 1996, the first molecular phylogenetic studies placed the microsporidia inside the fungi.
Subsequently, several further studies located the microsporidia at different positions inside the fungal clade. Since then, microsporidia have been considered as members of the Ascomycota, Zygomycota, Cryptomycota, or as a sister group to the Ascomycota and Basidiomycota, or even as the sister group of all fungi.
The difficulties in determining the evolutionary origin of microsporidia are not only caused by their lack of several cellular components but also by their reduced genomes and metabolism. Being obligate intracellular parasites, microsporidia successfully reduced their genome sizes, down to the range of bacteria. As the smallest eukaryotic genome described so far, the genome of Encephalitozoon intestinalis is just 2.3 Mbp, about half the size of the one of Escherichia coli. Due to their low number of protein coding genes (less than 4,000), microsporidia are thought to retain only genes essential for their survival and development. Furthermore, several key metabolic pathways are missing in the microsporidia, such as the citric acid cycle, oxidative phosphorylation, or the de novo biosynthesis of nucleotides. As a result they are in an obligatory dependence on many primary metabolites from the hosts. However, the presence of hsp70 protein suggests a more complex genome of the microsporidian ancestor. Consequently, the small microsporidian genomes and the reduced metabolism would be consequences of a secondary loss process that molded the contemporary microsporidia from a functionally more complex ancestral species. However, it remains unclear whether the last common ancestor (LCA) of the microsporidia was already reduced, or whether the genome compaction was lineage-specific and started from a more complex LCA.
We investigated the evolutionary history of the contemporary microsporidia through the reconstruction and analysis of their LCA. As a first step in our analysis, we have developed and implemented a software facilitating an intuitive data analysis of the large presence absence-patterns resulting from the tracing of microsporidian proteins in gene sets of many different species. These so called phylogenetic profiles can now be dynamically visualized and explored with PhyloProfile. The software allows the integration of other additional information layers into the phylogenetic profile, such as the similarity of feature architecture (FAS) between the protein under study and its orthologs. The FAS score can be displayed along the presence-absence pattern, which can help to identify orthologs that have likely diverged in function. PhyloProfile closes the methodological gap that existed between tools to generate large phylogenetic profiles to delineate the evolutionary history and the contemporary distribution of large – and ultimately complete – gene sets, and the more function-oriented analysis of individual protein. In the next step we tackled the problem of how to transfer functional annotation from one protein to another. We have developed HamFAS that integrates a targeted ortholog search based on the HaMStR algorithm with a weighted assessment of feature architecture similarities (FAS) between orthologs. In brief, for a seed protein we identify orthologs in reference species in which proteins have been functionally annotated based on manually curated assignments to KEGG Ortholog (KO) groups. The FAS scores between the orthologs and seed proteins are calculated. Subsequently, we compute pairwise FAS scores for all reference proteins within a KO group. A group's mean FAS score serves then as cutoff that must be exceeded to warrant transfer of its KO identifier to the seed. A benchmark using a manually curated yeast protein set showed that HamFAS yields the best precision (98.5%) when compared with two state-of-the-art annotation tools, KAAS and BlastKOALA. Furthermore, HamFAS achieves a higher sensitivity. On average HamFAS annotates almost 50% more proteins than KAAS or BlastKOALA.
With this extended bioinformatics toolbox at hand, we aimed at reconstructing the evolutionary history of the microsporidia. We generated a robust phylogeny of microsporidia using a phylogenomics approach. As a data basis, we identified a set of microsporidian proteins encoded by 80 core genes with one-to-one orthologs. A maximum likelihood analysis of this data
with 48 fungi and additionally in 13 species from more distantly related such as animals and plants combined in a supermatrix strongly supported the hypothesis that microsporidia form the sister group of the fungi. We confirmed that the data explains this microsporidia-fungi relationship significantly better than any other of the previously proposed phylogenetic hypotheses.
On the basis of this phylogeny, and of the phylogenetic profiles of microsporidian proteins, we then focused on reconstructing the dynamics microsporidian genome evolution. Between 2% of the proteins in the compact microsporidia Encephalitozoon intestinalis and up to 49% of the proteins of Edhazardia aedis are private for individual microsporidian species. A comparison of the sequence characteristics of these proteins to that of proteins with orthologs in other microsporidian species revealed individual differences. Yet, without further evidences it remains unclear whether these private genes are indeed lineage-specific innovations contributing to the adaptation of each microsporidium to its host, or whether these are artifacts introduced in the process of gene annotation. A total of 14,410 microsporidian proteins could then be grouped into 1605 orthologous groups that can be traced back to the last common ancestor of the microsporidia (LCA set). We found that 94% of the microsporidian LCA proteins could be tracked back to the last eukaryotic common ancestor. The high evolutionary age of these proteins, together with the resistance against gene loss in the microsporidia suggests that the corresponding functions are essential for eukaryotic life. Further 3% of the LCA proteins could be dated to the common ancestor microsporidia share with the fungi. Only 3% of the LCA proteins appear as microsporidia specific inventions. These proteins are potentially of importance for the evolutionary of the obligate parasitic lifestyle nowadays shared by all microsporidia.
The functional annotation and metabolic pathway analysis of the microsporidian LCA protein set gave us more insight into the adaptation of the microsporidia to their parasitic lifestyle and the origin of the microsporidian genome reduction. The presence of E1 and E3 components of the pyruvate dehydrogenase complex and the mitochondrial hsp70 protein support an ancestral presence of mitochondria in the ancestral microsporidia. In addition, several ancient proteins that complement gapped metabolic pathways were found in the microsporidian LCA. They suggested a more complex genome and metabolism in the LCA. However, our reconstruction of the metabolic network of the microsporidian LCA still lacks many main pathways. For example, the TCA cycle for effective energy production, and key enzymes that are required for in vivo synthesis of critical metabolites like purines and pyrimidines appear absent. We therefore find that the parasitic lifestyle and the genome reduction already occurred in the microsporidian LCA. This ancestral state was followed by further losses and gains during the evolution of each individual microsporidian lineage.
In conclusion, I described for the first time the in vivo functions of PAK2 during cardiac development and its requirement for heart contractility
AIM1 – Characterization of Pak2a and Pak2b functions during cardiovascular system development: description of the phenotype triggered by the loss of expression of pak2b in the pak2a mutant Firstly, in addition to the confirmation of the published data regarding the pak2a mutant and morphant phenotype, I showed that pak2bbns159 mutant does not exhibit morphological defects, neither in the ISV formation nor in the brain vascular patterning. More importantly, I analyzed in more details the phenotypic consequences of pak2a and pak2b loss of expression in the trunk and brain vasculatures. Indeed, the lack of blood flow in the embryos, was associated with central arteries migration defects and reduced lumen in these central arteries and the ISVs. Moreover, pak2a and pak2b loss of expression resulted in cardiac failure.
AIM2 – Role of Pak2 on cardiac contractility From 40 -46 hpf, I found a weaker heart contractility in the pak2ami149/mi149;pak2bbns159/bns159. Although, the PAK proteins have been shown to impact the actin cytoskeleton organization, the heart morphological defects associated with the altered contractility, were not associated with acto-myosin filament reorganization. However, by analyzing in more details the structure of the sarcomeres, I was able to demonstrate that the proteins constituting the sarcomeres were strongly affected and showed an altered spatial organization. Then, I also described the effects of the loss of expression of both paralogs on the junctional protein localization. I demonstrated the loss of Pak2 function resulted in junction protein rearrangement in the cardiomyocytes in the pak2ami149/mi149;pak2bbns159/bns159 mutants at 40 and 46 hpf.
Thus, I was able for the first time to demonstrate in vivo PAK2 functions during cardiac development and its requirement for proper cardiac contractility activity.
AIM3 – Decipher mechanism of Pak2 signaling cascade involved during cardiac development Both pak2a and pak2b WT mRNAs were able to rescue the pak2ami149/mi149;pak2bbns159/bns159 mutant heart defects and the results indicated that these paralogs share overlapping function during cardiac development. Moreover, although I was not able to examine the control transgenic lines, myocardial and endothelial specific pak2a overexpression did not ameliorate the mutant cardiac deficiency. Thus,the absence of rescue by reactivating pak2a in cardiomyocytes indicates a non-cell autonomous function of Pak2a on cardiomyocytes.
For the first time, this study allowed to follow PAK2 in vivo functions during cardiovascular development. More importantly, its role on heart contractility regulation would enable further investigations to generate new tools for the treatment of cardiomyopathies.
Polyploidie in Prokaryoten
(2018)
Diese Arbeit teilt sich in drei Teile auf, die sich mit der Regulation der Polyploidie sowie mit der Genkonversion als evolutionären Vorteil von Polyploidie in Haloferax volcanii beschäftigen.
Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde der Einfluss der DNA-Replikationsinitiatorproteine Orc1/Cdc6 auf das Ploidielevel untersucht. Hierbei konnte anhand von Deletionsmutanten zunächst gezeigt werden, dass lediglich drei der 16 Orc1/Cdc6-Proteine in H. volcanii essentiell sind. Bestimmung des Ploidielevels mittels qPCR-Analyse ergab, dass jedes der 12 untersuchten Orc1/Cdc6-Proteine das Ploidielevel mindestens eines Replikons beeinflusst und dementsprechend sowohl die mit einem Replikationsursprung assoziierten als auch die „verwaisten“ Orc1/Cdc6-Proteine eine Funktion haben. Die mit einem Replikationsursprung assoziierten Orc1/Cdc6-Proteine hatten hierbei keinen größeren Einfluss auf das Ploidielevel als die „verwaisten“. Zusätzlich konnte durch Wachstumsanalysen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass die meisten Deletionsmutanten unter allen getesteten Bedingungen ein mit dem Wildtyp vergleichbares oder besseres Wachstum zeigen. Eine Deletionsmutante eines Orc1/Cdc6-Proteins hingegen zeigte nur verbessertes Wachstum bei Glukose als Kohlenstoffquelle, was ein Hinweis auf die Verwendung verschiedener Orc1/Cdc6-Proteine unter verschiedenen Bedingungen sein könnte. Zusätzlich wurden zwei mit dem Replikationsursprung assoziierte Orc1/Cdc6-Proteine überexprimiert und via ihres N-terminalen His-Tag im Western-Blot nachgewiesen, sodass diese nun für Co-Affinitätsaufreinigungen zur weiteren Charakterisierung des komplexen Zusammenspiels der Orc1/Cdc6-Proteine zur Verfügung stehen.
Im Rahme des zweiten Teils der Arbeit wurde der Einfluss der in der 5‘-Region der der Replikationsursprünge ori1 und ori2 kodierten Proteine auf Wachstum und die Kopienzahl des Hauptchromosoms bestimmt. Zunächst wurde die Expression der drei in Haloarchaea hoch-konservierten oap-Gene upstream von ori1 mittels Nothern-Blot untersucht und es konnte gezeigt werden, dass das oap-Operon tatsächlich als Operon abgelesen wird. Um alle Gene in den 5‘-Regionen von ori1 und ori2 genauer zu charakterisieren, wurden induzierbare Überexpressionsmutanten im Wildtyp-Hintergrund angefertigt. Es konnte mittels Wachstumsversuchen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass bei Induktion von Beginn an die Überexpression der Hef-Helikase und des oapB-Proteins zu einem starken Wachstumsdefekt führen, die von oapC und HVO_1724 zu einem moderaten Wachstumsdefekt, wohingegen für die Überexpressionsmutante von oapA vergleichbares Wachstum zum Wildtyp und für die Überexpression der Rad25d-Helikase verbessertes Wachstum beobachtet werden konnte. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sowohl die Deletion als auch die Überexpression der Helikasen keinen Einfluss auf das Ploidielevel hat; die Deletion von oapC führt jedoch zu einer Reduktion der Genomkopienzahl in exponentieller und stationärer Phase, was ein erster Hinweis darauf ist, dass das oap-Operon eine Rolle bei der Regulation des Ploidielevels spielen könnte.
Im dritten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um Genkonversion farblich sichtbar zu machen. Hierbei wurde sich H. volcaniis Carotinoidbiosynthese zu Nutze gemacht. Es wurden zwei verschiedene, auxotrophe Elternstämme mittels Protoplastenfusion verschmolzen, um eine heterozygote Tochterzelle zu erzeugen. Ein Genkonversionsereignis wurde durch einen roten Keil angezeigt, der aus einer weißen Kolonie wuchs und durch die erfolgreiche Reparatur des Carotinoidbiosynthesegens entstand. Es wurden insgesamt 8525 Klone ausgestrichen und 0,14 % der Kolonien zeigten eine entsprechende rote Färbung. Das Proof-of-Principle dieser Methode ist in damit in dieser Arbeit gelungen. Um die Genkonversion in den weißen Kolonien auf genetischer Ebene genauer zu untersuchen, wurde PCR verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass in den Zellen aller 135 untersuchten Kolonien Genkonversion stattgefunden hatte und zwar so effizient, dass nur in seltenen Fällen Heterozygotie vorlag. Unter Selektionsdruck stehende Loci hatten in beiden untersuchten Fällen eine starke Präferenz in Richtung Homozygotie und Erhalt der Prototrophie. Für nicht unter Selektionsdruck stehende Loci konnte gezeigt werden, dass die Hälfte der untersuchten Kolonien dem Elternstamm 1 glich, während die andere Hälfte dem Elternstamm 2 glich. Auch hier waren die Zellen nur in seltenen Fällen homozygot.
The fungal interaction with plants is a 400 million years old phenomenon, which presumably assisted in the plants’ establishment on land. In a natural ecosystem, all plant-ranging from large trees to sea-grasses-are colonized by fungal endophytes, which can be detected inter- and intracellularly within the tissues of apparently healthy plants, without causing obvious negative effects on their host. These ubiquitous and diverse microorganisms are likely playing important roles in plant fitness and development. However, the knowledge on the ecological functions of fungal root endophytes is scarce. Among possible functions of endophytes, they are implicated in mutualisms with plants, which may increase plant resistance to biotic stressors like herbivores and pathogens, and/or to abiotic factors like soil salinity and drought. Also, endophytes are fascinating microorganisms in regard to their high potential to produce a great spectrum of secondary metabolites with expected ecological functions. However, evidences suggest that the interactions between host plants and endophytes are not static and endophytes express different symbiotic lifestyles ranging from mutualism to parasitism, which makes difficult to predict the ecological roles of these cryptic microorganisms. To reveal the ecological function of fungal root endophytes, this doctoral thesis aims at assessing fungal root endophytes interactions with different plants and their effects on plant fitness, based on their phylogeny, traits, and competition potential in settings encompassing different abiotic contexts. To understand the cryptic implication of nonmycorrhizal endophytes in ecosystem processes, we isolated a diverse spectrum of fungal endophytes from roots of several plant species growing in different natural contexts and tested their effects on different model plants under axenic laboratory conditions. Additionally,we aimed at investigating the effect of abiotic and biotic variables on the outcome of interactions between fungal root endophytes and plants.
In summary, the morphological and physiological traits of 128 fungal endophyte strains within ten fungal orders were studied and artificial experimental systems were used to reproduce their interactions with three plant species under laboratory conditions. Under defined axenic conditions, most endophytes behaved as weak parasites, but their performance varied across plant species and fungal taxa. The variation in the interactions was partly explained by convergent fungal traits that separate groups of endophytes with potentially different niche preferences. According to my findings, I predict that the functional complementarity of strains is essential in structuring natural root endophytic communities. Additionally, the responses of plant-endophyte interactions to different abiotic factors, namely nutrient availability, light intensity, and substrate’s pH, indicate that the outcome of plant-fungus relationships may be robust to changes in the abiotic environment. The assessment of the responses of plant endophyte interactions to biotic context, as combinations of selected dominant root fungal endophytes with different degrees of trait similarity and shared evolutionary history, indicates that frequently coexisting root-colonizing fungi may avoid competition in inter-specific interactions by occupying specific niches, and that their interactions likely define the structure of root-associated fungal communities and influence the microbiome impacts on plant fitness.
In conclusion, my findings suggest that dominant fungal lineages display different ecological preferences and complementary sets of functional traits, with different niche preferences within root tissues to avoid competition. Also, their diverse effects on plant fitness is likely host-isolate dependent and robust to changes in the abiotic environment when these encompass the tolerance range of either symbiont.
Colorectal cancer (CRC) has the third highest incidence and the fourth highest mortality rate worldwide and represents a substantial health care burden and affects the life of millions of people. CRC is a genetic disease caused by the stepwise accumulation of genetic alterations. The initiating event in colorectal carcinogenesis is the aberrant activation of the WNT pathway, but other pathways are also commonly deregulated, including the PI3K/AKT pathway. A number of previous studies using genetically engineered mouse models aimed at dissecting the exact role of PI3K/AKT pathway in CRC, but have yielded in rather conflicting results. Despite the inconsistent results, these studies already put forward the idea that PI3K/AKT signaling in combination with other genetic events might substantially contribute to tumor progression.
Since the PI3K/AKT pathway is frequently activated in CRC, it represents an ideal candidate for therapeutic intervention. Although extensive efforts had led to the development of numerous inhibitors targeting the PI3K/AKT pathway, the diversity of genetic alterations can challenge the identification of the most effective therapeutic targets. Therefore, the discovery of shared tumor-promoting mechanisms downstream of these genetic alterations might unravel new biomarkers and druggable targets. The aim of this study was to elucidate the precise role of PI3K/AKT pathway during the course of colorectal carcinogenesis and to decipher novel pro-tumorigenic molecular mechanisms downstream of PI3K/AKT activation that can be used for therapeutic intervention.
To obtain a better insight into the role of the PI3K/AKT pathway during colorectal carcinogenesis, mice expressing an oncogenic variant of AKT1 (AktE17K) specifically in the intestinal epithelial cells (IEC) were used. At the age of 6 months untreated AktE17K mice showed clearly perturbed intestinal homeostasis, but no tumor formation. To induce colonic tumorigenesis, AktE17K mice were subjected to treatment with the colonic carcinogen azoxymethane (AOM). In response to AOM, AktE17K mice developed invasive but nonmetastatic tumors, which showed strong nuclear accumulation of TP53. To investigate the role of PI3K/AKT signaling specifically in CRC progression, AktE17K mice were crossed to TP53- deficient mice (Tp53ΔIEC). Unlike AktE17K mice, untreated Tp53ΔIECAktE17K, developed highly invasive small intestinal tumors by the age of 6 months. To investigate the role of AKT hyperactivation in colonic tumor progression, Tp53ΔIECAktE17K mice were subjected to AOM treatment. AKT hyperactivation significantly enhanced tumor progression and induced metastatic dissemination.
To get a better insight how AKT signaling can promote tumor progression, whole tumor tissues from AOM-treated Tp53ΔIEC and Tp53ΔIECAktE17K mice were subjected to next generation mRNA sequencing and phospho-proteomic analysis by mass spectrometry. Both analyses indicated that AKT hyperactivation expands the inflammatory tumor microenvironment and upregulates pathways associated with invasion and metastasis. Importantly, Gene Set Enrichment Analysis revealed that AOM-induced colon tumors of Tp53ΔIECAktE17K animals, are highly similar in their gene expression profile to the CMS4 subtype of human CRC, which is associated with worse overall- and relapse-free survival7 . Gene expression analysis also suggested elevated NOTCH signaling in the Tp53ΔIECAktE17K tumors. Interestingly, while the expression of Notch3 mRNA was increased in the tumors of Tp53ΔIECAktE17K mice, the expression of the other NOTCH receptors was unaffected by AKT hyperactivation. In vitro experiments using TP53-deficient mouse tumor organoids with hyperactive AKT signaling confirmed the direct, tumor cell-intrinsic link between AKT activation and increased Notch3 expression. Moreover, inhibition of EZH2 mimicked the effect of AKT hyperactivation on Notch3 expression, suggesting that AKT regulates Notch3 via an epigenetic mechanism.
Knock-down of Notch3 in TP53-deficient mouse tumor organoids with hyperactive AKT signaling resulted in differential regulation of several pathways with potential role in invasion and metastasis and in cell death and survival. Subsequent in vivo experiments confirmed the role of NOTCH3 signaling in CRC progression. Treatment of AOM-induced Tp53ΔIECAkt E17K mice with a NOTCH3 antagonistic antibody or the γ-secretase inhibitor DAPT significantly reduced invasion and metastasis. Importantly, NOTCH3 expression was also found to be associated with human CRC progression, suggesting that NOTCH3 represent a valid target for the treatment of CRC. This work, using genetically engineered mouse models and advanced in vitro techniques, has demonstrated a strong tumor promoting role for PI3K/AKT signaling in CRC progression and has identified NOTCH3 signaling as a potential therapeutic target downstream of the PI3K/AKT pathway.
Bei Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) handelt es sich um genetisch komplexe Störungen mit hoher Erblichkeit. Als zugrundeliegender Pathomechanismus von ASS werden unter anderem Veränderungen der neuronalen Entwicklung diskutiert. Der Phänotyp von ASS ist definiert durch Einschränkungen in der sozialen Interaktion und Kommunikation sowie repetitives und stereotypes Verhalten. Genkopiepolymorphismen (englisch „copy number variations“/CNVs), also Deletionen oder Duplikationen einer chromosomalen Region, wurden wiederholt in Probanden mit ASS identifiziert. Hierbei ist in ASS die Region 16p11.2 mit am häufigsten von CNVs betroffen. Einige Gene aus diesem chromosomalen Abschnitt wurden bereits funktionell charakterisiert. Dennoch können die Befunde der bisherigen Einzelgenstudien nicht alle Aspekte erklären, die durch 16p11.2 CNVs hervorgerufen werden. Ziel dieser Studie war es daher, ein weiteres neuronal assoziiertes Kandidatengen dieser Region zu identifizieren und im Anschluss funktionell im Kontext der neuronalen Differenzierung zu charakterisieren.
Das SH-SY5Y Neuroblastom-Zellmodell wurde auf Transkriptom- und morphologischer Ebene auf seine Eignung als Modell für neuronale Differenzierung untersucht und bestätigt. Eine Analyse der Expressionen aller Gene der 16p11.2-Region zeigte, dass das Gen Quinolinat-Phosphoribosyltransferase (QPRT) eine vergleichsweise hohe Expression mit der stärksten und robustesten Regulierung über die Zeit aufwies. Eine de novo Deletion der 16p11.2-Region wurde in einem Patienten im Vergleich zu seinen Eltern validiert. In Patienten-spezifischen lymphoblastoiden Zelllinien derselben Familie konnten wir eine Gendosis-abhängige Expression von QPRT auf RNA-Ebene bestätigen. In SH-SY5Y-Zellen korrelierte die Expression von QPRT signifikant mit der Entwicklung von Neuriten während der Differenzierung. Um QPRT funktionell zu charakterisieren, benutzten wir drei verschiedene Methoden zur Reduktion der QPRT-Gendosis: (i) knock down (KD) durch siRNA, (ii) chemische Inhibition durch Phthalsäure und (iii) knock out (KO) über CRISPR/Cas9-Geneditierung. Eine Reduktion von QPRT durch siRNA führte zu einer schwachen Veränderung der neuronalen Morphologie differenzierter SH-SY5Y-Zellen. Die chemische Inhibition sowie der genetische KO von QPRT waren letal für differenzierende aber nicht für proliferierende Zellen. Eine Metabolitenanalyse zeigte keine Veränderungen des QPRT-assoziierten Tryptophanstoffwechsels. Gene, welche auf Transkriptomebene im Vergleich zwischen KO- und Kontrollzellen differenziell reguliert vorlagen, waren häufig an Prozessen der neuronalen Entwicklung sowie an der Bildung, Stabilität und Funktion synaptischer Strukturen beteiligt. Die Liste differenziell regulierter Gene enthielt außerdem überdurchschnittlich viele ASS-Risikogene und ko-regulierte Gengruppen waren assoziiert mit der Entwicklung des dorsolateralen präfrontalen Cortex, des Hippocampus sowie der Amygdala.
In dieser Studie zeigten wir einen kausalen Zusammenhang zwischen QPRT und der neuronalen Differenzierung in vitro sowie einen Einfluss von QPRT auf die Regulation von ASS-assoziierten Genen und Gen-Netzwerken. Funktionell standen diese Gene im Kontext mit synaptischen Vorgängen, welche durch Veränderungen zu einem Exzitations-Inhibitions-Ungleichgewicht und letztendlich zum Zelltod von Neuronen führen können. Unsere Ergebnisse heben in Summe die wichtige Rolle von QPRT in der Krankheitsentstehung von ASS, insbesondere in Trägern einer 16p11.2 Deletion, hervor.
This dissertation aimed to shed light on changes of the epigenetic landscape in heart and skeletal muscle tissue of the turquoise Killifish N. furzeri, a novel, short-lived animal model for aging research. The following results could be obtained:
1. A global trend towards closed chromatin conformation could be observed; histone markers for H3K27me3, H3K9me3 and H4K20me3 accumulated in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. Markers for open chromatin conformation such as H3K4me3, H3K9ac and H4K16ac decreased in old skeletal muscle tissue. In old hearts from N. furzeri an accumulation of H3K27me3 could be detected while H3K9ac was found to increase with age as well. mRNA expression levels of methylating enzymes were higher in skeletal muscle tissue from old N. furzeri when compared to expression levels in skeletal muscle tissue from young N. furzeri.
2. The shift of epigenetic pattern was accompanied by a change of gene expression. Via mRNA sequencing in collaboration with the MPI, Bad Nauheim it could be shown that genes associated with cell cycle and DNA repair were lower expressed in skeletal muscle tissue from old N. furzeri than in tissue from young N. furzeri. Genes, associated with inflammatory signaling and glycolysis, displayed increased mRNA levels in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. These results could be confirmed by Western blot and qRT-PCR analyses.
3. Markers for DNA damage and senescence increased in skeletal muscle tissue from old N. furzeri.
4. Cells derived from young and old N. furzeri skeletal muscle could be isolated and cultured for many passages. These cells were a mix of different cell types with properties and features of the native tissue. They could be used for treatment with drugs and/small compounds modulating the epigenetic landscape via specific interference with methylating enzymes.
5. DNA methylation and hydroxy-methylation were found to go in different directions in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri: while increasing in skeletal muscle tissue, a both DNA modifications declined in heart tissue with age.
6. In the heart of N. furzeri microRNA expression changes with age were assed with sequencing in collaboration with the FLI, Jena. It could be demonstrated that miRNA expression is age-dependent. Particular focus was on miR-29 and its target genes: miR-29 was highly upregulated in heart and skeletal muscle tissue, while target genes such as collagens and dnmts were reduced with age in the heart of N. furzeri.
7. Cardiac function remained stable with age and no accumulation of collagens could be found when comparing hearts of young and old N. furzeri despite the increase of markers for oxidative stress.
8. Cell culture experiments with human cardiac fibroblasts revealed that miR-29 is upregulated with increasing age of the donor. In addition to that, it could be shown that miR-29 is positively regulated by oxidative stress.
9. A zebrafish mutant with modified expression of miR-29 that was created in collaboration with the SNS, Pisa, presented a severe hypoxic phenotype and an altered mRNA expression profile compared to wild type control zebrafish. Cardiac dysfunction and hypertrophy were observed as well as an increase in DNA methylation and collagens.
Taken together, it could be shown that the aging process in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri leads to a series of changes on epigenetic levels. It remains to be elucidated whether these changes are result or cause for further changes of mRNA expression, protein levels and pathophysiology, yet the N. furzeri represents a promising research model for further aging studies.
Lizards of Paraguay: an integrative approach to solve taxonomic problems in central South America
(2018)
Paraguay is located in the center of South America with drier and warmer climatic conditions in the western part of the country, and more temperate and humid in the eastern region. Biogeographically, Paraguay is a key spot in South America, where several ecoregions converge. In my study, I sampled most of the ecoregions of Paraguay. The main objective of my work is to solve taxonomic problems, identified through genetic barcoding analyses, in the central region of South America. To achieve this objective, I used selected taxa of the Paraguayan Squamata as models taking into consideration the crucial geographic position of the country, plus the scarce available genetic data of Paraguayan reptiles.
The collecting activities were performed in the framework of a barcoding inventory project of the Paraguayan herpetofauna and carried out mostly in rural areas searching for animals in different types of habitats using active search as the sampling technique.
For genetics, the extraction of DNA was performed with DNeasy® Blood & Tissue Kit of Qiagen® for sets of few samples, and the fiber glass plate protocol for sets of 96 samples. I assessed the quality of sequences after amplification in agarose gel electrophoresis. The first marker sequenced was 16S mtDNA, used for barcoding analysis. A DNA barcode is a genetic identifier for a species. Once a taxonomic problem was detected, I generate more gene sequences to target the issue.
All the analyses to test phylogenetic hypotheses (based on single genes or concatenated datasets) were performed under Maximum Likelihood and Bayesian approaches. To root the phylogenetic trees, I chose the available taxon (or taxa) most closely related to the respective studied group as outgroups. For the general tree of Paraguayan Squamata, based on barcodes of 16S, I chose Sphenodon punctatus.
I generated a total of 142 sequences of 64 species of Squamata from Paraguay (Appendix I). The final alignment of 615 bp comprised 249 samples. The best substitution model for the Barcoding dataset based on the gene 16S was GTR+G, according to the BIC.
To complement molecular evidence generated with the ML grouping of 16S barcodes, I took a morphological approach based on voucher specimens collected during fieldwork (usually the same specimens that I used for genetic analysis), supplemented by the revision of museum collections.
Summarizing my results, samples of Colobosaura exhibit large genetic distances, and accordingly I revalidated Colobosaura kraepelini (Appendix II). Tropidurus of the spinulosus group show two clades and among them there is little genetic and morphological variation, I synonymized T. tarara and T. teyumirim with T. lagunablanca, and T. guarani with T. spinulosus (Appendix III). I detected the presence of candidate species of Homonota, and I restricted the name H. horrida for Argentina, and described two new species of Homonota (Appendices IV and V), and a new species of Phyllopezus also in the Family Phyllodactylidae (Appendix VI).
In this work I present the most comprehensive analysis of genetic samples of Squamata from Paraguay. The results obtained here will be useful to help to clarify further taxonomic issues regarding the squamate fauna from the central region of South America. Moreover, the data generated for this study will have a positive impact in a larger geographic context, beyond Paraguayan borders.
Regarding the conservation of the Paraguayan reptiles, and considering the taxonomic changes accomplished here, it is important to note that many species lack legal protection. In Paraguay, the major problem for conservation is habitat loss due to extensive crop farming. Thus, currently, the protected areas are the best strategy for conservation of biodiversity in the country. However, many such areas face legal problems (e.g., lack of official measurements, management plans, forest guards, infrastructure, etc.) so that the maintenance of their biodiversity over time is not guaranteed.
In conclusion, in this study I present contributions on the taxonomy of mostly lizards from Paraguay. Due to lack of samples, I was not able to deal with a deep taxonomic revision of the country's snakes. Based on my results, I can argue that analyses of Xenodontini and Pseudoboini are currently a pressing research issue. This barcoding project may continue since some colleagues in Paraguay are interested in collaboration. Given that the sequenced specimens are yet a small portion of the actual diversity of Paraguay, it will be of utmost importance to continue and expand these studies that will further improve our taxonomic knowledge. Furthermore, it is desirable to have Paraguayan scientists not only involved, but to see them taking the lead of high quality taxonomic research.
Hämophilie A ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die aufgrund von Mutationen innerhalb des Gens von Gerinnungsfaktor VIII (FVIII) zum funktionellen Defekt oder zum Fehlen des körpereigenen FVIII führt. FVIII zirkuliert als Heterodimer und besteht aus einer schweren Kette mit der Domänenstruktur A1-A2-B und einer leichten Kette mit der Domänenstruktur A3-C1-C2. Bei Patienten unter Prophylaxe wird durch regelmäßige Substitution mit rekombinanten oder aus Plasma gewonnenen FVIII-Präparaten die Hämostase wiederhergestellt. Allerdings entwickeln hierbei etwa 30% der Patienten mit einer schweren Hämophilie eine FVIII-spezifische Immunantwort in Form von neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren). Die sogenannte Immuntoleranz-Therapie (engl. immune tolerance induction therapy, ITI) ist bisher die einzige etablierte Therapie, die zu einer dauerhaften Eradikation der FVIII-Inhibitoren und Induktion von Toleranz gegenüber FVIII führen kann. Die Therapie beruht auf einer meist täglichen Gabe hoher FVIII-Dosen, welche sich, je nach Behandlungsdauer, über Wochen bis hin zu Jahren erstrecken kann. Bei etwa 30% der Patienten ist diese Therapie nicht erfolgreich. Für solche Patienten besteht die Gefahr lebensbedrohlicher, unkontrollierbarer Blutungen und erheblicher Gelenkschäden.
Die spezifische Ansteuerung des Membran-gebundenen Immunglobulin G (mIg) des B-Zellrezeptors (BZR) mithilfe von Immuntoxinen ist eine mögliche Option zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen und somit zur Eradikation von FVIII-Inhibitoren. Solche Immuntoxine bestehen aus einer zellbindenden und einer zytotoxischen Domäne, welche nach Internalisierung zur Apoptose der Zielzelle führen soll. Da FVIII aufgrund der Größe als zellbindende Domäne ungeeignet ist, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Entwicklung und Evaluierung alternativer Immuntoxine zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen. Die FVIII-spezifische Immunantwort ist zwar polyklonal, jedoch vor allem gegen A2- und die C2-Domäne gerichtet. Aus diesem Grund wurden die humane A2- und C2-Domäne (hA2, hC2) als zellbindende Domäne verwendet und jeweils genetisch an eine verkürzte Version des Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa fusioniert, bei welcher die natürliche zellbindende Domäne entfernt wurde. Die rekombinanten Proteine wurden bakteriell produziert und im Anschluss an die Aufreinigung biochemisch charakterisiert. Während das bakterielle Expressionssystem für hA2-ETA nicht geeignet war, konnte hC2-ETA neben weiteren Kontrollproteinen mit korrekter Konformation der hC2-Domäne hergestellt und aufgereinigt werden.
Die Fähigkeit zur selektiven Eliminierung hC2-spezifischer B-Zellen wurde im weiteren Verlauf sowohl in vitro mithilfe einer hC2-spezifischen Hybridomazelllinie als auch ex vivo und in vivo mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen untersucht.
Durch Inkubation der hC2-spezifischen Hybridomazelllinie mit hC2-ETA konnten ca. 38 % der Zellen eliminiert werden. Weitere Untersuchungen der Zelllinie ergaben, dass diese keinen vollständigen funktionalen B-Zellrezeptor auf der Oberfläche exprimierte, welcher für die Bindung und die korrekte Internalisierung des Immuntoxins notwendig ist. Aufgrund dessen eignet sich diese Zelllinie nicht als Modell für eine genauere Analyse der in vitro Eliminierungseffizienz von hC2-ETA.
Weitere Analysen mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen haben jedoch gezeigt, dass durch ex vivo Inkubation der Splenozyten mit hC2-ETA, alle hC2-spezifischen B-Zellen vollständig, selektiv und konzentrations-abhängig eliminiert werden konnten. Auch die mehrfache Applikation von hC2-ETA in FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen führte bei der Hälfte der Tiere zur vollständigen Eliminierung aller hC2-spezifischen B-Zellen. Eine Reduktion des hC2-spezifischen Antikörpersignals konnte nach Gabe von hC2-ETA in allen behandelten Tieren beobachtet werden. Die unvollständige Eliminierung in der Hälfte der Tiere ist vermutlich auf die Präsenz hC2-spezifischer Antikörper zurückzuführen, die einen Teil des applizierten Immuntoxins neutralisiert haben, sodass nicht alle hC2-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen erreicht und eliminiert werden konnten. Um die Eliminierungseffizienz von hC2-ETA weiter zu erhöhen, müsste das Behandlungsprotokoll geändert werden. Sowohl eine Verlängerung des Behandlungszeitraums als auch eine kombinierte Therapie aus FVIII und hC2-ETA sollte zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit des Toxins und dadurch zu einer gesteigerten Eliminierungseffizienz führen.
Die Ausweitung des hier vorgestellten Ansatzes auf weitere FVIII-Domänen ist generell möglich, jedoch muss hierzu ein alternatives Expressionssystem aufgrund des eukaryotischen Ursprungs von FVIII in Betracht gezogen werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen dennoch, dass FVIII-Domänen-Immuntoxine ein wirkungsvolles Mittel sind, um FVIII-spezifische B-Zellen selektiv zu eliminieren. Die Anpassung der Gabe von FVIII-Domänen-Immuntoxinen an die individuelle Immunantwort des Patienten könnte das Auftreten von Nebenwirkungen minimieren. Außerdem könnte eine kombinierte Therapie aus ITI und FVIII-Domänen-Immuntoxinen die Zeit bis zur Induktion von Toleranz verkürzen und die Chancen für den generellen Therapieerfolg erhöhen.
The metabolome of any live cell consists of several hundred, if not thousands of different molecules at any given moment, be it a relatively small bacterial cell or a whole multicellular organism. Although there are continuous attempts to differentiate between primary and secondary metabolites, the borders often blur in the eye of almost perfect interconvertability of all such matter. With chemistry and physics dominating this domain of biology it is an interdisciplinary endeavor to tackle the questions surrounding the workings of the metabolic pathways involved, searching for answers that ultimately help us to better understand life and find solutions to problems that affect us humans. One area of biochemistry that serves as a formidable example of the intertwined primary and secondary metabolic pathways are fatty acids, essential components of bacterial membranes, sources of energy and carbon but also important building blocks of several natural products. The second area to be mentioned is the metabolism of amino acids, the basic components of proteins and enzymes, which also serve as precursors to a diverse set of metabolites with many biological purposes.
This work focuses on these two areas of biochemistry, as several intermediates of their metabolism serve as building blocks for complex secondary metabolites whence many interesting and bioactive natural products are derived. The powerful and relatively novel tool of click-chemistry is employed to track azide-labeled precursors of primary and secondary metabolism in various bacterial strains to observe biochemistry at work and adds to the knowledge gained through other methods. The methods presented in this work serve the observation of fatty acid biosynthesis, degradation, modification and transport through direct ligation of azido fatty acids with cyclooctynes on one hand, leading to a revision of fatty acid transport in general. On the other hand a cleavable azide-reactive resin is devised to generally track the fate of azidated compounds through the myriads of metabolic pathways offered by entomopathogenic bacteria possessing a rich secondary metabolism. The resulting findings led to the identification of several antimicrobial peptides, amides and other compounds of which many had remained so far undetected in the strains that underwent investigation, underlining the worth of this method for future metabolomic research and beyond.
The role of the homeobox transcription factor Meis2b in zebrafish heart development and asymmetry
(2018)
Zebrafish heart development: The heart of the zebrafish is the first organ to form and function during embryonic development, and is composed by one atrium and one ventricle. Between 5-17 somites stage, the cardiomyocyte precursors form the bilateral cardiac fields in the anterior lateral plate mesoderm (ALMP); where the endocardial precursors are located anterior to the cardiac fields (Zeng, Wilm et al. 2007). Then, the pools of endocardial andmyocardial precursors fuse at the midline and form the heart disc; where atrial cardiomyocytes are located around, the ventricular cardiomyocytes are located in the centerof the heart disc, and the future endocardium is located in a ventral position relative to the cardiomyocytes (Bakkers 2011). After the heart disc is formed, the cardiomyocyte progenitors start to migrate and rotate asymmetrically to form the heart tube (de Campos-Baptista, Holtzman et al. 2008, Rohr, Otten et al. 2008, Smith, Chocron et al. 2008). This process is followed by a rightward bending of the heart tube, and the arterial and venous poles rotate at different speed and directions (a process known as heart looping) (Smith, Chocron et al. 2008). The heart looping process results in a ventricle located on the right side and a more posterior atrium located on the left side with respect to the midline; at this point the atrium and ventricle are separated by a fine segment called the atrioventricular canal, where the valves will be formed (Staudt and Stainier 2012). The second heart field (SHF) is a pool of cardiac progenitors that are specified later during the formation of the heart disc and until the heart looping stages. The SHF contributes withcells to the distal side of the ventricle, the outflow and inflow tracts, and is important for the specification of the cardiac conduction system (de Pater, Clijsters et al. 2009, Hami, Grimes et al. 2011, Zhou, Cashman et al. 2011, Witzel, Jungblut et al. 2012, Guner-Ataman, Paffett-Lugassy et al. 2013)....
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
Die forensische Entomologie nutzt nekrophage Insekten, hauptsächlich Dipteren und ihre juvenilen Stadien, zur Schätzung der minimalen Leichenliegezeit. Dem liegt zugrunde, dass nekrophage Dipteren binnen Minuten nach dem Todeseintritt potentiell in der Lage sind, einen Leichnam zu detektieren und zu besiedeln. Das anschließende Wachstum und die Entwicklung der juvenilen Stadien erfolgt als Funktion von der Art und der Umgebungstemperatur.
Mit Hilfe von Laborstudien konnten bislang für einige forensisch relevante Fliegenarten Entwicklungsdaten erhoben werden, die eine Altersbestimmung der sich an einem Leichnam entwickelnden Larven und Puppen erlauben und so eine Schätzung der minimalen Leichenliegezeit ermöglichen. Als Nährsubstrat für Laborstudien werden tierische Gewebe verwendet. Eine Übertragbarkeit der Daten auf humanes Gewebe wurde aber bislang nicht verifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde das larvale Wachstum und die juvenile Entwicklungsgeschwindigkeit der forensisch relevanten Schmeißfliege Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) auf humanem Muskelgewebe untersucht und mit dem Wachstum auf Schweineleber, magerem Schweinemuskelfleisch und Schweinehackfleisch verglichen. Die auf humanem Gewebe heranwachsenden Individuen waren mit bis zu 3,5 mm signifikant länger als die Individuen, die sich auf Leber und dem mageren Schweinemuskelfleisch entwickelten. Bei der Verwendung von Hackfleisch vom Schwein zeigte sich kein Unterschied. Darauf basierend wird die Empfehlung ausgesprochen, für zukünftige Entwicklungsstudien Schweinehackfleisch als Ersatz für humanes Gewebe zu verwenden.
Zahlreiche Anleitungen zur Asservierung forensisch-entomologischer Spuren empfehlen das Sammeln getrennt nach Körperregionen eines Leichnams. Dies soll eine mögliche gewebespezifische Entwicklungsrate berücksichtigen. Das für die vorliegende Arbeit durchgeführte systematische Absammeln von Fliegenlarven von 51 Leichnamen getrennt nach Körperregionen zeigte keine artspezifischen Präferenzen für bestimmte Gewebe oder Körperregionen. Das Artenspektrum entsprach größtenteils dem aufgrund von Studien an Schweinekadavern zu erwartendem Artenspektrum für Deutschland und Mitteleuropa. Insgesamt konnten 15 Schmeißfliegenarten nachgewiesen werden, von denen in der Regel mehrere gleichzeitig an einem Leichnam zu finden waren. Dies zeigt, dass ein Faktor wie interspezifische Konkurrenz in Zukunft mehr Beachtung in der Forschung erhalten sollte.
Bislang wurde in der forensischen Entomologie die minimale Leichenliegezeit durch die Untersuchung juveniler Stadien von Fliegen eingegrenzt. Eine eventuell mögliche Ausweitung dieses Zeitfensters könnte durch eine Altersbestimmung der adulten Fliegen oder der leeren Puparien gelingen. Der Nachweis, dass die dafür untersuchten Fliegen bzw. Puparien tatsächlich von dem fraglichen Leichnam stammen, war bislang nicht möglich. Die forensische relevante Schmeißfliege Lucilia sericata wurde in der vorliegenden Arbeit auf humanem Gewebe und Gewebe von elf weiteren Tierarten großgezogen. Durch die Analyse stabiler Kohlen- und Stickstoffisotope konnte ein von diesen elf Tierarten abgrenzbares humanes Isotopenprofil sowohl für die adulten Fliegen von L. sericata, als auch für ihre leeren Puparien detektiert werden. Dieses Profil spiegelte die Nahrungszusammensetzung der Wirte wider.
Die vorliegende Arbeit erhebt Daten zur Entwicklung einer forensisch relevanten Schmeißfliegenart auf humanem Gewebe, belegt das bislang lediglich am tierischen Modell erhobene Schmeißfliegeninventar als für menschliche Leichen relevant und hinterfragt die gewebespezifische Asservierungsempfehlung als ein akademisches Artefakt. Auf dieser Basis konnten Empfehlungen für die Weiterzucht fallrelevanter entomologischer Spuren ausgesprochen werden, die gerichtsverwertbar sind und die Verwendung von tierischem Gewebe oder Tierkadaver in der forensisch-entomologischen Forschung legitimieren. Die Analyse stabiler Isotope legt darüber hinaus einen neuen, innovativen Grundstein für die routinemäßige Spurenzuordnung älterer Entwicklungsstadien und ist damit Vorreiter auf dem Gebiet der forensischen Entomologie.
Heat stress transcription factors (Hsfs) are required for transcriptional changes during heat stress (HS) thereby playing a crucial role in the heat stress response (HSR). The target genes of Hsfs include heat shock proteins (Hsps), other Hsfs and genes involved in protection of the cell from irreversible damages due to exposure to elevated temperatures. Among 27 Hsfs in Solanum lycopersicum, HsfA1a, HsfA2 and HsfB1 constitute a functional triad which regulates important aspects of the HSR. HsfA1a is constitutively expressed and described as the master regulator of stress response and thermotolerance. Activation of HsfA1a under elevated temperatures leads to the induction of HsfA2 and HsfB1 which further stimulate the transcription of HS-responsive genes by forming highly active complexes with HsfA1a. Despite the well-established role of these three Hsfs in tomato HSR, information about functional relevance of other Hsfs is currently missing.
The heat stress inducible HsfA7 belongs alongside with HsfA2 to a phylogenetically distinct clade. Thereby the two proteins share high homology and a functional redundancy has been assumed. However, HsfA7 function and contribution to stress responses have not been investigated into detail in any plant species.
Tomato HsfA7 protein accumulates already at moderately elevated temperatures (~35°C) while HsfA2 becomes dominant at higher temperatures (>40°C). HsfA7 pre-mRNA undergoes complex and temperature-dependent alternative splicing resulting in several transcripts that encode for three protein isoforms. HsfA7-I contains a functional nuclear export signal (NES) and shows nucleocytoplasmic shuttling while HsfA7-II and HsfA7-III have a truncated NES which leads to the strong nuclear retention of the protein. Differences in the nucleocytoplasmic equilibrium have a major impact on the stability of protein isoforms, as nuclear retention is associated with increased protein turnover. Consequently, HsfA7-I shows a higher stability and can be detected even after 24 hours of stress attenuation, while HsfA7-II is rapidly degraded. The degradation of these factors is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway.
HsfA7 can physically interact with HsfA1a and HsfA3 and form co-activator (“superactivator”) complexes with a very high transcriptional activity as shown on different HS-inducible promoters. In order for the complex to be successfully transferred to the nucleus and confer its activity it needs a functional nuclear localization signal (NLS) of HsfA7. In contrast, the activator (AHA) motif of HsfA7 is not essential for its co-activator function. Interestingly, while interaction of HsfA7 with either HsfA3 or HsfA1a stabilizes HsfA7 isoforms, concomitantly this leads to an increased turnover of HsfA1a and HsfA3. In contrast, HsfA2 has a stabilizing effect on the master regulator HsfA1a.
Thus, HsfA7 knockout mutants generated by CRISPR/Cas9 gene editing, show increased HsfA1a levels and a stronger induction of HS-related genes at 35°C compared to wild-type plants and HsfA2 knockout mutants. Consequently, HsfA7 knockout seedlings exhibit increased thermotolerance as shown by the enhanced hypocotyl elongation under a prolonged mild stress treatment at 35°C. In summary, these results highlight the importance of HsfA7 in regulation of cellular responses at elevated temperatures. Under moderately elevated temperatures, the accumulation of HsfA7 and its subsequent interaction with HsfA1a, leads to increased turnover of the latter, thereby ensuring a milder transcriptional activation of temperature-responsive genes like Hsps. In turn, in response to further elevated temperatures, HsfA2 becomes the dominant stress-induced Hsf. HsfA2 forms co-activator complexes with HsfA1a which in contrast to HsfA7, allows the stabilization of the master regulator, leading to the stronger expression of HS-responsive genes required for survival. Thereby, this study uncovers a new regulatory mechanism, where the temperature-dependent competitive interaction of HsfA2 and HsfA7 with HsfA1a control the fate of the master regulator and consequently the activity of temperature-responsive networks.
Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Echolocation allows bats to orientate in darkness without using visual information. Bats emit spatially directed high frequency calls and infer spatial information from echoes coming from call reflections in objects (Simmons 2012; Moss and Surlykke 2001, 2010). The echoes provide momentary snapshots, which have to be integrated to create an acoustic image of the surroundings. The spatial resolution of the computed image increases with the quantity of received echoes. Thus, a high call rate is required for a detailed representation of the surroundings.
One important parameter that the bats extract from the echoes is an object’s distance. The distance is inferred from the echo delay, which represents the duration between call emission and echo arrival (Kössl et al. 2014). The echo delay decreases with decreasing distance and delay-tuned neurons have been characterized in the ascending auditory pathway, which runs from the inferior colliculus (Wenstrup et al. 2012; Macías et al. 2016; Wenstrup and Portfors 2011; Dear and Suga 1995) to the auditory cortex (Hagemann et al. 2010; Suga and O'Neill 1979; O'Neill and Suga 1982).
Electrophysiological studies usually characterize neuronal processing by using artificial and simplified versions of the echolocation signals as stimuli (Hagemann et al. 2010; Hagemann et al. 2011; Hechavarría and Kössl 2014; Hechavarría et al. 2013). The high controllability of artificial stimuli simplifies the inference of the neuronal mechanisms underlying distance processing. But, it remains largely unexplored how the neurons process delay information from echolocation sequences. The main purpose of the thesis is to investigate how natural echolocation sequences are processed in the brain of the bat Carollia perspicillata. Bats actively control the sensory information that it gathers during echolocation. This allows experimenters to easily identify and record the acoustic stimuli that are behaviorally relevant for orientation. For recording echolocation sequences, a bat was placed in the mass of a swinging pendulum (Kobler et al. 1985; Beetz et al. 2016b). During the swing the bat emitted echolocation calls that were reflected in surrounding objects. An ultrasound sensitive microphone traveling with the bat and positioned above the bat’s head recorded the echolocation sequence. The echolocation sequence carried delay information of an approach flight and was used as stimulus for neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus of the bats.
Presentation of high stimulus rates to other species, such as rats, guinea pigs, suppresses cortical neuron activity (Wehr and Zador 2005; Creutzfeldt et al. 1980). Therefore, I tested if neurons of bats are suppressed when they are stimulated with high acoustic rates represented in echolocation sequences (sequence situation). Additionally, the bats were stimulated with randomized call echo elements of the sequence and an interstimulus time interval of 400 ms (element situation). To quantify neuronal suppression induced by the sequence, I compared the response pattern to the sequence situation with the concatenated response patterns to the element situation. Surprisingly, although the bats should be adapted for processing high acoustic rates, their cortical neurons are vastly suppressed in the sequence situation (Beetz et al. 2016b). However, instead of being completely suppressed during the sequence situation, the neurons partially recover from suppression at a unit specific call echo element. Multi-electrode recordings from the cortex allow assessment of the representation of echo delays along the cortical surface. At the cortical level, delay-tuned neurons are topographically organized. Cortical suppression improves sharpness of neuronal tuning and decreases the blurriness of the topographic map. With neuronal recordings from the inferior colliculus, I tested whether the echolocation sequence also induced neuronal suppression at subcortical level. The sequence induced suppression was weaker in the inferior colliculus than in the cortex. The collicular response makes the neurons able to track the acoustic events in the echolocation sequence. Collicular suppression mainly improves the signal-to-noise ratio. In conclusion, the results demonstrate that cortical suppression is not necessarily a shortcoming for temporal processing of rapidly occurring stimuli as it has previously been interpreted.
Natural environments are usually composed of multiple objects. Thus, each echolocation call reflects off multiple objects resulting in multiple echoes following the calls. At present, it is largely unexplored how neurons process echolocation sequences containing echo information from more than one object (multi-object sequences). Therefore, I stimulated bats with a multi-object sequence which contained echo information from three objects. The objects were different distances away from each other. I tested the influence of each object on the neuronal tuning by stimulating the bats with different sequences created from filtering object specific echoes from the multi-object sequence. The cortex most reliably processes echo information from the nearest object whereas echo information from distant objects is not processed due to neuronal suppression. Collicular neurons process less selectively echo information from certain objects and respond to each echo.
For proper echolocation, bats have to distinguish between own biosonar signals and the signals coming from conspecifics. This can be quite challenging when many bats echolocate adjacent to each other. In behavioral experiments, the echolocation performance of C. perspicillata was tested in the presence of potentially interfering sounds. In the presence of acoustic noise, the bats increase the sensory acquisition rate which may increase the update rate of sensory processing. Neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus could strengthen the hypothesis. Although there were signs of acoustic interference or jamming at neuronal level, the neurons were not completely suppressed and responded to the rest of the echolocation sequence.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sRNAs des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich ihrer biologischen und ihrer regulatorischen Funktion charakterisiert.
Um einen Überblick über die biologischen Funktionen archaealer sRNAs zu erhalten, wurde eine umfassende phänotypische Charakterisierung von 27 sRNA-Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp ausgewertet. Im Zuge dieser phänotypischen Charakterisierungen wurden zehn verschiedene Wachstumsbedingungen, morphologische Unterschiede und Veränderungen in der Zellmotilität untersucht. Hierbei zeigten nahezu alle Deletionsmutanten unter mindestens einer der getesteten Bedingungen phänotypische Unterschiede. Durch den Verlust von sRNAs wurden sowohl sogenannte Gain-of-function als auch Loss-of-function Phänotypen beobachtet. Haloarchaeale sRNAs spielen eine wichtige Rolle beim Wachstum mit verschiedenen Salzkonzentrationen, mit verschiedenen Kohlenstoffquellen und beim Schwärmverhalten, sind jedoch weniger in die Adaptation an diverse Stressbedingungen involviert.
Zur näheren Charakterisierung der regulatorischen Funktion archaealer sRNAs wurden sRNA362, sRNAhtsf468 und sRNA479 mittels molekulargenetischer Methoden wie Northern Blot-Analyse und DNA-Mikroarray sowie bioinformatischer in silico-Analyse untersucht. Das Expressionslevel von sRNA362 konnte bestimmt und potentielle Zielgene für sRNAhtsf468 und sRNA479 identifiziert werden.
Eine vorangegangene Studie zeigte den Einfluss von sRNA30 unter Hitzestress und führte zur Identifikation differentiell produzierter Proteine in Abwesenheit der sRNA. In dieser Arbeit wurde mittels Northern Blot-Analysen die Expression der sRNA30 charakterisiert. Das Wachstum in An- und Abwesenheit von sRNA30 wurde bei 42°C und 51°C phänotypisch charakterisiert und der regulatorische Einfluss der sRNA auf die mRNA differentiell regulierter Proteine durch Northern Blot-Analyse überprüft. Eine Transkriptomanalyse mittels DNA-Mikroarray nach Hitzeschock-Induktion führte zur Identifikation differentiell regulierter Gene involviert in Transportprozesse, Metabolismus, Transkriptionsregulation und die Expression anderer sRNAs. Die differentielle Regulation des Proteoms nach Hitzeschockinduktion in An- und Abwesenheit von sRNA30 konnte bestätigt werden.
Desweiteren wurde in dieser Arbeit sRNA132 und deren phosphatabhängige Regulation der Ziel-mRNA HVO_A0477-80 näher charakterisiert. Eine Induktionskinetik nach Phosphatentzug bestätigte die Bedeutung von sRNA132 für die verstärkte Expression des Operons HVO_A0477-80 unter Phosphatmangel-Bedingungen und verwies auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen. Während vor und nach Phosphatentzug kein Unterschied bezüglich der Zellmorphologie von Wildtyp und Deletionsmutante zu erkennen war, führte das Wachstum mit einem starken Phosphatüberschuss von 5 mM zu einer Zellverlängerung der Deletionsmutante. Die Kompetition der nativen 3‘-UTR des Operons HVO_A0477-80 mit einer Vektor-kodierten artifiziellen 3‘-UTR legt eine Regulation über die Bindung von sRNA132 an die 3‘-UTR nahe. Der Transkriptomvergleich nach Phosphatentzug in An- und Abwesenheit von sRNA132 führte zur Identifikation des Phosphoregulons der sRNA. Zu diesem Phosphoregulon gehören unter anderem zwei Glycerinphosphat-Dehydrogenasen, Transkriptionsregulatoren, eine Polyphosphatkinase und eine Glycerolphosphodiesterase. Zudem waren die Transkriptlevel der beiden ABC-Transporter HVO_A0477-80 und HVO_2375-8 für anorganisches Phosphat und des Transporters HVO_B0292-5 für Glycerinaldehyd-3-Phosphat in Abwesenheit der sRNA verringert. Die beiden ABC-Transportsysteme für anorganisches Phosphat wurden im Rahmen dieser Arbeit deletiert und weiter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass das ABC-Transportsystem HVO_2375-8 bei geringen Phosphatkonzentrationen leicht induziert wird und das Transkriptlevel in Anwesenheit von sRNA132 erhöht ist. Wachstumsversuche der jeweiligen Deletionsmutante in direkter Konkurrenz mit dem Wildtyp zeigten, dass keiner der beiden ABC-Transporter den anderen vollständig ersetzen kann und der Wildtyp mit beiden intakten ABC-Transportern unter phosphatlimitierenden Bedingungen einen Wachstumsvorteil besitzt. In silico-Analysen der Promotorbereiche von sRNA und ABC-Transporter legen zudem die Existenz von P-Boxen nahe.
The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the most important biological model organisms, but only the comparative approach with closely related species provides insights into the evolutionary diversification of insects. Of particular interest is the live imaging of fluorophores in developing embryos. It provides data for the analysis and comparison of the threedimensional morphogenesis as a function of time. However, for all species apart from Drosophila, for example the red flour beetle Tribolium castaneum, essentially no established standard operation procedures are available and the pool of data and resources is sparse. The goal of my PhD project was to address these limitations. I was able to accomplish the following milestones:
- Development of the hemisphere and cobweb mounting methods for the non-invasive imaging of Tribolium embryos in light sheet-based fluorescence microscopes and characterization of most crucial embryogenetic events.
- Comprehensive documentation of methods as protocols that describe (i) beetle rearing in the laboratory, (ii) preparation of embryos, (ii) calibration of light sheet-based fluorescence microscopes, (iv) recording over several days, (v) embryo retrieval as a quality control as well as (vi) data processing.
- Adaption of the methods to record and analyze embryonic morphogenesis of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata and the two-spotted cricket Gryllus bimaculatus as well as integration of the data into an evolutionary context.
- Further development of the hemisphere method to allow the bead-based / landmark-based registration and fusion of three-dimensional images acquired along multiple directions to compensate the shadowing effect.
- Development of the BugCube, a web-based computer program that allows to share image data, which was recorded by using light sheet-based fluorescence microscopy, with colleagues.
- Invention and experimental proof-of-principle of the (i) AGameOfClones vector concept that creates homozygous transgenic insect lines systematically. Additionally, partial proof-of-principle of the (ii) AClashOfStrings vector concept that creates double homozygous transgenic insect lines systematically, as well as preliminary evaluation of the (iii) AStormOfRecords vector concept that creates triple homozygous transgenic insect lines systematically.
- Creation and performance screening of more than fifty transgenic Tribolium lines for the long-term imaging of embryogenesis in fluorescence microscopes, including the first Lifeact and histone subunit-based lines.
My primary results contribute significantly to the advanced fluorescence imaging approaches of insect species beyond Drosophila. The image data can be used to compare different strategies of embryonic morphogenesis and thus to interpret the respective phylogenetic context. My technological developments extend the methodological arsenal for insect model organisms considerably.
Within my perspective, I emphasize the importance of non-invasive long-term fluorescence live imaging to establish speciesspecific morphogenetic standards, discuss the feasibly of a morphologic ontology on the cellular level, suggest the ‘nested linearly decreasing phylogenetic relationship’ approach for evolutionary developmental biology, propose the live imaging of species hybrids to investigate speciation and finally outline how light sheet-based fluorescence microscopy contributes to the transition from on-demand to systematic data acquisition in developmental biology.
During my PhD project, I wrote a total of ten manuscripts, six of which were already published in peer-reviewed scientific journals. Additionally, I supervised four Master and two Bachelor projects whose scientific questions were inspired by the topic of my PhD work.
The continuous conversion of natural wildlife habitats into agricultural areas, as well as the fragmentation of the last wildlife refuges, is increasing the interface between people and wildlife. When wildlife negatively impacts on people and vice versa, we speak about human-wildlife conflicts (HWCs). This definition includes losses on both sides and takes into consideration the rooting of most of these conflicts between different groups of interest, such as advocates for nature conservation and economic groups. The centres of highest biodiversity are located in developing countries, which are also characterized by poverty. In African and Asian countries, people living in the vicinity of national parks and other conservation areas mostly receive only little support through the government or conservation organisations. Especially for those people who are dependent on agriculture, damage to fields and harvests can have catastrophic consequences. If the species causing damage is protected by national or even international law, the farmer is not allowed to use lethal methods, but has to approach the authority in charge. If this agency, however, cannot offer appropriate support, resentment, anger or even hate develops, and the support for wildlife conservation activities declines. For this reason, HWCs were declared as one of the most important conservation topics today, being particularly relevant for large and threatened species such as the African and Asian elephant, hippopotamus and the greater one-horned rhino, as well as for large predators. Up to today, no general assessment scheme has been recommended for damage caused by protected wildlife species.
In my study, HWCs in Asia and Africa are compared, focussing on all herbivorous species identified which damaged crops. For the French NGO Awely, des animaux et des hommes, I developed a detailed assessment scheme suitable for all terrestrial ecosystems, and any type of HWCs and any species (Chapter 2). This HWC assessment scheme was used in four different study areas located in two African countries (South Luangwa/Zambia (SL), Tarangire/Tanzania (TA)) and two Asian countries (Bardia/Nepal (BA) and Manas/India (MA)). This scheme ran for six consecutive years (2009 to 2014) for Zambia, Nepal and India and two years (2010 to 2011) for Tanzania. To carry out the assessments, I trained local HWC officers (Awely Red Caps) to assess HWCs by field observations (measurement of damage, identification of species through signs of presence, landscape attributes etc.) and interviews with aggrieved parties (socio economic data). Results of this assessment are presented in Chapters 2-4.
To determine whether elephants prefer or avoid specific crop species, two field experiments were carried out, one in SL and one in BA (Chapter 5 and 6). For this, two test plots were set up and damage by elephants (and other herbivores) were quantified.
Within this doctoral thesis, 3306 damage events of 7408 aggrieved parties were analysed. In three out of the four study areas (SL, BA, MA), elephants caused the highest number of damage events compared to all other wildlife species, however, in TA, most fields were damaged by zebra. Furthermore, the greater one-horned rhino, hippopotamus, wild boar, bushpig, deer and antelope, as well as primates, caused damage to fields and harvests. Damage to houses and other property were nearly exclusively caused by elephants.
With this doctoral thesis I was able to show that season, crop availability, type and the phenological stage of the crop played an important role for crop damaging behavior of herbivores (Chapter 2). Elephants especially damaged rice, maize and wheat and preferred all crop types in a mature stage of growth. In contrast, rhinos preferred wheat to rice and similar to antelope and deer, they preferred crops at earlier stages of growth, before ripening. Crop damage by wildlife species varied strongly in size; most damages fell below 40% of the total harvest per farmer, but in several cases (3 to 8% depending on the study area), harvests were completely destroyed. Interestingly, during times of low nutritional availability in the natural habitat (dry season), crop damages in all four study areas were significantly less than during other seasons.
In all four study areas, crop protection strategies, such as active guarding in the fields, chasing wildlife with noise or fire torches or erecting barriers, were used. In some cases protection strategies were combined. Analysis of data revealed that traditional protection strategies did not reduce the costs of damage (Chapter 3). In some cases, costs of damage, on protected fields were even higher than for unprotected fields. Only in MA did strategic and cohesive guarding significantly reduce crop damage by wildlife species.
Besides damage in the fields, elephants also caused damage to properties in the villages. In search for stored staple crops, they damaged houses, grain stores and kitchens. Such damage was analysed in three study areas (SL, BA, MA) (Chapter 4). Although property damage occurred less frequently compared to crop damage in the fields, the mean cost of this damage was found to be double in BA/MA and four times higher in SL, compared to the costs of crop damage in the fields. It is further remarkable that property damage significantly increased towards the dry season, when the harvest was brought into the villages.
The findings of this study underpin the assumption that wildlife herbivores, especially elephants, are lured to fields and crops because the highly nutritional food (crop) being readily available. Traditional crop protection is cost and labour intensive and does not reduce the costs of damage. For this reason, crop types, which are thought to be not consumed by elephants were systematically tested on their attractiveness in field experiments in SL and BA (Chapter 5 and 6). In SL, lemon grass, ginger and garlic were proven to be less attractive to African elephants than maize and in BA, basil, turmeric, chamomile, coriander, mint, citronella and lemon grass were found to be less attractive to Asian elephants than rice.
The results of this doctoral thesis are relevant for the management of wildlife conservation as they can lead to new approaches to the mitigation of HWCs in African and Asian countries. Finally, specific needs for more scientific research in this field have been identified.
Im Kindes- und Jugendalter gehoert das Rhabdomyosarkom zu den haeufigsten Weichteilsarkomen. Bisher belaeuft sich das Therapieverfahren auf chirurgische Entfernung, gefolgt von Chemotherapie, bzw. bei nicht-operablen Faellen auf Radiotherapie und Chemotherapie, jedoch haben sich die Ueberlebenschancen fuer Patienten mit einer Erkrankung in metastasiertem oder rezidiviertem Stadium trotz intensiver Forschung ueber mehrere Jahrzehnte hinweg kaum gebessert und bleiben bei unter 30%. Neue therapeutische Strategien versuchen das Immunsystem des Patienten zu modulieren und dieses gezielter oder aggressiver gegen Tumorzellen zu machen. Nebst direkter Injektion von Zytokinen oder Antikoerpern bietet die adoptive Immunzelltherapie einen vielversprechenden Ansatz. In der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf Natuerlichen Killer- (NK) Zellen, da diese ein hohes zytotoxisches Potential gegenueber Tumorzellen aufweisen. Eine der groessten Herausforderungen der NK-Zellforschung ist die Breitstellung ausreichender Mengen an NK-Zellen mit optimaler antitumoraler Funktion fuer den klinischen Einsatz. Viele aktuell erprobte NK-Zellexpansionsstrategien basieren auf der Verwendung von Hilfs- oder Feeder-Zellen (Versorgerzellen), die jedoch vor der Applikation in Patienten aus dem finalen Produkt entfernt werden muessen. In der vorliegenden Arbeit sollten Feeder-zellfreie NK-Zellexpansionsprotokolle unter Verwendung von Gammakettenzytokinen getestet werden.
Interleukin (IL-) 15 erwies sich dabei vor allem fuer die Vermehrung der NK-Zellen als besonders foerderlich. Im Vergleich dazu fielen die Expansionsraten mit IL-2 oder IL-21 geringer aus. Interessanterweise wurde der expansionsfoerdernde Effekt von IL-15 durch dauerhafte Anwesenheit von IL-21 im Kulturmedium gehemmt. Ein kurzer, dreitaegiger IL-21-Boost am Ende der Expansionsphase wirkte sich wiederum positiv auf die NK-Zellexpansionsraten aus. Zudem zeigte sich durch IL-21 ein vermehrtes Auftreten von NK-Zellen des reiferen CD16posCD56dim Phaenotyps, der die zytotoxische Funktion vermittelt. Bei Degranulationsuntersuchungen wurden eine IL-21-induzierte Exozytoseaktivitaet und die vermehrte Ausschuettung von Perforin und Granzym B, welche Apoptose in den Zielzellen ausloesen, beobachtet. Vor allem der dreitaegige Boost mit IL-21 bewirkte eine gesteigerte Zytotoxizitaet gegenueber Tumorzellen, insbesondere gegenueber Rhabdomyosarkomzellen.
Auf dieser Grundlage bot es sich an fuer die NK-Zellexpansion ein Zwei-Phasen-Protokoll anzuwenden, bestehend aus einer initialen Proliferationsphase mit IL-15 und einem anschliessendem IL-21-Boost, durch den die antitumorale Funktionalitaet der NK-Zellen gesteigert wurde. Dieses IL-15+21boost-Protokoll wurde mit anderen Kombinationen aus den Gammakettenzytokinen IL-2, IL-15 und IL-21 verglichen und stellte sich hinsichtlich der NK-Zellexpansionsraten, der Degranulationskapazitaet und der damit verbundenen Zytotoxizitaet als den anderen Protokollen ueberlegen heraus.
Zytokinexpandierte NK-Zellen zeigten eine hoehere Rezeptorexpression an ihren Oberflaechen als unstimulierte Zellen. Die Expansion mit dem IL-15+21boost-Protokoll bewirkte die hoechste Dichte des Todesrezeptors TRAIL, jedoch auch der inhibitorischen KIR2D-Rezeptorfamilie. Fuer andere Oberflaechenmarker ergab sich jeweils eine mittlere Expressionsdichte verglichen mit dem IL-15- bzw. dem IL-15+21-Expansionsprotokoll. Die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interferon-gamma (IFN-g) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-a) wurde zudem verstaerkt durch IL-21 angeregt, aber ebenso die Sekretion des immunsupprimierenden IL-10.
Weiter wurden die zytoinexpandierten NK-Zellen zur UEberpruefung ihrer in vivo Funktionalitaet anhand eines praeklinischen Xenograftmodells unter Verwendung von NOD SCID IL-2-Rgamma-/- (NSG) Maeusen und der Technologie der in-vivo-Biolumineszenzbildgebung getestet. Dabei konnte beobachtet werden, dass die NK-Zellen das Wachstum luciferaseexprimierender humaner Rhabdomyosarkome verlangsamten. Die Wirksamkeit der IL-15+21boost-expandierten NK-Zellen zeigte sich vor allem in einem kombinierten Ansatz, bei dem die Tumore zunaechst mit ionisierender Strahlung behandelt wurden und residuale Rhabdomyosarkomzellen anschliessend durch den adoptiven Transfer von humanen NK-Zellen in ihrem Wachstum gehemmt waren, solange die NK-Zelltherapie andauerte. Somit stellte sich die Kombination aus Bestrahlung und NK-Zelltransfer als wirksamer im Einsatz gegen Rhabdomyosarkome heraus als die alleinige Behandlung der Tumore durch Radiotherapie.
Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit ein NK-Zellexpansionsprotokoll entwickelt werden, dass durch den ausschliesslichen Einsatz von Gammakettenzytokinen zu einem funktionalen NK-Zellprodukt fuehrte, welches auch in vivo lytische Aktivitaet gegenueber Rhabdomyosarkomzellen aufwies.
In der vorliegenden dreiteiligen Studie werden Mongolische Wüstenrennmäuse untersucht, deren Hörspektren im tieffrequenten Bereich und deren Unterscheidungsfähigkeiten von Kommunikationsrufen denen des Menschen ähneln. Die extrazelluläre Aktivität im primären auditorischen Kortex (AI) der narkotisierten Versuchstiere, evoziert durch Reintöne und arteigene Kommunikationsrufe, wird in der linken (LH) und rechten Gehirnhemisphäre (RH) aufgenommen. Es werden Multikanalelektroden (16 Eingangskanäle) verwendet, welche eine simultane Aufnahme der neuronalen Aktivitäten aller kortikalen Schichten ermöglichen. Zur Analyse der neuronalen Mechanismen werden Wellenformen einzelner Elektrodenkanäle und Aktivitätsprofile, bestehend aus den Wellenformen aller Elektrodenkanäle in einem Zeitfenster von 600 ms, auf Ebene von Aktionspotentialen (MUA), lokalen Feldpotentialen (LFP) und Current-source-density (CSD) Analysen, untersucht. Während MUAs die neuronalen Aktionspotentiale im Nahfeld der Elektrode reflektieren, umfassen die LFPs die summierten Potentiale (inhibitorisch und exzitatorisch) von Neuronen eines größeren Areals. Die CSDs hingegen werden durch die Integration von LFP-Wellenformen benachbarter, linear angeordneter Elektrodenkanäle berechnet und ermöglichen so eine Lokalisation der Ursprünge geräuschspezifischer Aktivitätsflüsse.
Im ersten Teilprojekt werden CSD-Profile in Antwort auf unterschiedliche Reintöne untersucht, um die Aktivitätskomponenten, die so genannten Sinks, für weiterführende Analysen zu quantifizieren. Es können zwei primäre (s1 und s2), drei mittlere (s3-s5) und vier späte (s6-s9) Sinks in einem Zeitfenster von 600 ms definiert werden. Eine Veränderung der Stimulusfrequenz eine Oktave über und unter der charakteristischen Frequenz (CF), beziehungsweise des Lautstärkepegels = 24 dB über der minimalen Schwelle, führt zu qualitativen Veränderungen in der CSD-Profilstruktur. Die Sink s7 wird durch Stimuli mit niedrigem Lautstärkepegel weniger verlässlich evoziert, wohingegen die Sink s9 bei Stimuli eine Oktave über der CF verlässlicher evoziert wird. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass im AI die spektralen Informationen eine Oktave über und unter der CF asymmetrisch integriert werden.
Auf Einzelschichtebene konnte bereits gezeigt werden, dass spektrotemporale Eigenschaften von Stimuli durch MUAs schlechter reflektiert wurden als durch LFPs, was vermutlich eine direkte Konsequenz der unterschiedlichen Ursprünge der Signaltypen ist. Daher werden im zweiten Teilprojekt die spezifischen Unterschiede der MUA-, LFP- und CSD-Antworten auf Ebene kortikaler Schichten und kompletter laminarer Profile untersucht, um die Unterschiede und den Informationsgehalt der drei Signaltypen zu charakterisieren. Signifikante Unterschiede, welche durch zwei Reintöne und sieben Kommunikationssignale evoziert werden, können verstärkt im mittleren und späten Latenzbereich und in granulären und infragranulären Schichten vorgefunden werden. Der Grad der Rufspezifizität ist in LFP und CSD-Antworten im Vergleich zu demjenigen in MUA-Antworten größer. Die Segregationsleistung ist im Vergleich zu einzelnen kortikalen Schichten in den von kortikalen Kolumnen abgeleiteten laminaren Profilen um den Faktor 1,8-2,6 erhöht. Die Neuronenpopulationen einzelner kortikaler Kolumnen sind vermutlich wichtig für die Kodierung von Geräuschen, welche sich in ihren spektrotemporalen Eigenschaften unterscheiden.
Viele vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Gehirnhemisphären akustische Signale asymmetrisch verarbeiten. Daher werden im dritten Hauptteil die laminaren Profile der LH und RH quantitativ und statistisch verglichen. Die MUA-, CSD-Profile und im geringeren Maße auch die LFP-Profile zeigen systematische Unterschiede auf signifikantem Niveau in der Dauer, Onset Latenz und vertikalen Ausdehnung bestimmter Aktivitäten. Kommunikationsrufe evozieren in der LH, welche beim Menschen auf Sprachstimuli spezialisiert ist, im Vergleich zur RH komplexere CSD-Profile. Die neuronale MUA-, LFP- und CSD-Aktivitätsstärke ist in der RH für weniger komplexe Stimuli teilweise signifikant erhöht. Die Asymmetrie in der Auftrittsverlässlichkeit der Sink s6 lässt vermuten, dass sich die intrakolumnäre Vernetzung in Schicht VIa zwischen der LH und RH unterscheidet. Die wenigen, signifikanten und nicht systematischen Unterschiede zwischen den Sink-Parametern der LH und RH nach kortikaler Ausschaltung mit dem GABAA-Rezeptor Agonist Muscimol weisen darauf hin, dass die Hemisphärenasymmetrie durch Prozesse des ipsilateralen Kortex maßgeblich beeinflusst wird.
Characterizing the hologenome of Lasallia pustulata and tracing genomic footprints of lichenization
(2017)
The lichen symbiosis – consisting of fungal mycobionts and photoautotroph photobionts (green algae or cyanobacteria) – is globally successful. It covers an estimated 6% of the global surface with habitats ranging from deserts to the arctic. This success is reflected in the diversity of the mycobionts, with around 21% of all fungal species participating in lichen symbioses that can be facultative or obligate. Lichenization is furthermore evolutionary old, with fossil evidence for lichens reaching back 415 million years. For an individual fungal lineage, the Lecanoromycetes, the lichenization happened around 300 million years ago. This longstanding symbiotic relationship and the diversity of observed symbiotic dependency make them promising models to study the genomic consequences that follow the establishment of symbioses. Despite this, only little is known about the genomic effects of lichenization and extreme symbiotic dependency. To fill this gap we sequenced the hologenome of the lichen Lasallia pustulata, where the mycobiont could so far not been cultivated, suggesting that it might be more dependent on its symbionts.
As the poor culturability of lichen symbionts renders their genomes inaccessible to standard sequencing practices, we evaluated the extent to which different metagenome sequencing- and de novo assembly-strategies can be used to sequence and reconstruct the genomes of the individual symbionts. We find that the abundances of individual genomes present in the L. pustulata hologenome vary substantially, with the mycobiont being most abundant. Using in silico generated data sets and real Illumina sequencing data for L. pustulata we observe that the skewed abundances prevent a contiguous assembly of the underrepresented genomes when using only short-read sequencing. We conclude that short-read sequencing can offer first insights into lichen hologenomes. The fragmentation of the reconstructions hinders downstream analyses into the genomic consequences of lichenization though, as these are focused on identifying the gain and loss of genes.
We thus demonstrate a hybrid genome assembly strategy that is based on both short- and long-read sequencing. We show that this strategy is capable of creating highly contiguous genome reconstructions, not only for the L. pustulata mycobiont but also its photobiont Trebouxia sp., along with substantial amounts of the bacterial microbiome. A subsequent analysis of the microbiome of L. pustulata – performed over nine different samples collected in Germany and Italy – showed a stable taxonomic composition across the geographic range. We find that Acidobacteriaceae, which are known to thrive in nutrient poor habitats, are the dominant taxa. These would make them well adapted for the co-habitation with L. pustulata, which largely grows on rocks. Whether the Acidobacteriaceae are functionally involved in the lichen symbiosis is unclear so far.
As further comparative genomic studies rely on comprehensive genome annotations, we evaluate the completeness and fidelity of the gene annotations for the mycobiont L. pustulata as well as four further Lecanoromycetes. This reveals that un- and mis-annotated genes impact all evaluated genomes, with artificially joined genes and unannotated genes having the largest impact. In addition to these factors we find that the sequence composition – especially G/C-rich inverted repeats – lead to sequencing errors that interfere with the gene prediction. We minimize the effects of these artifacts through a rigorous curation.
Given the extremely sparse taxon sampling of available green alga genomes, we focus our search for the genomic footprints of lichenization on the mycobionts. We compare the genomes of the Lecanoromycetes to their closest relatives, the Eurotiomycetes and Dothideomycetes. This reveals that the last common ancestor of the Lecanoromycetes has lost around 10% of its genes after they split from the non-lichenized ancestor they share with the Eurotiomycetes. These losses are furthermore enriched, showing an excessive loss of genes involved with the degradation of polysaccharides. The loss of these genes fits a change from an ancestral saprotrophic lifestyle that depends on degrading complex plant matter, to the symbiotic lifestyle that relies on simpler nutrients provided by the photobionts. While the last common ancestor of the Lecanoromycetes additionally gained around 400 genes these could so far not be further characterized due to a lack of functionally annotated reference data.
As the mycobiont L. pustulata could so far not been grown in axenic culture, we initially expected to find an extensive genomic remodeling compared to the other mycobionts that easily grow in culture. We do not find evidence for this. Analyzing both the contraction of gene families and the loss of genes, we observe that L. pustulata and Umbilicaria muehlenbergii – its close relative that is easily grown in culture – share most of these. Furthermore, L. pustulata does not show an excessive loss of evolutionary old and well-conserved genes. These effects are mirrored on the functional level, as neither gene family contractions nor gene losses show a functional enrichment. This is partially due to the lack of functional reference data, analogous to the genes gained in the Lecanoromycetes, rendering their characterization hard. Thus, further studies on the genomic consequences of lichenization and differences in symbiotic dependence will have to be conducted, including larger taxon sets. This will be even more important for the photobionts, as the Chlorophyta are even more sparsely sampled today, hindering an effective functional and evolutionary study.
Tissue size regulation is critical for the normal functioning of the organ as well as to prevent unwanted pathogenesis such as cancer. The Hippo signaling pathway is well known for its robust regulation of tissue growth by the negative regulation of its nuclear effectors YAP1 and WWTR1. In this study, I have described the role of Yap1/Wwtr1 in zebrafish development, with a primary emphasis on the cardiovascular system.
I have generated zebrafish yap1 and wwtr1 mutants by CRISPR/CAS9. The mutant alleles are likely to be nonfunctional due to a premature stop codon and they show evidence of nonsense-mediated decay. Given that Yap1 and Wwtr1 are closely related proteins and have overlapping functions, I am given the opportunity to perform combinatorial analysis of the mutations on zebrafish development. Together with molecular probing tools, high-throughput sequencing and high-resolution imaging, I showed that
1. Double yap1;wwtr1 mutants exhibit severe posterior elongation phenotype, but somitogenesis appears to proceed as usual.
2. Yap1 and Wwtr1 may play an important role in PCV development and secondary angiogenic sprouting. However, key experiments will be needed to elucidate the direct role of Yap1 and Wwtr1 on these processes.
3. wwtr1-/- larvae hearts have a reduction in trabeculation, but in mosaic WT hearts, mutant cardiomyocytes prefer to populate the trabecular layer. My studies revealed that the mutant compact wall could not support trabeculation, which explains the hypotrabeculation phenotype of wwtr1-/- hearts. Additionally, Wwtr1 is required for myocardial Notch activity and can inhibit compact wall cardiomyocytes from entering the trabecular layer.
In summary, the Hippo signaling pathway, through Yap1/Wwtr1 has important regulatory functions in growth control. My work has revealed a surprising role for Yap1/Wwtr1 in tissue morphogenesis such as posterior tail morphogenesis and specific developmental processes of the cardiovascular system. It will be of interest to elucidate the regulation of Yap1/Wwtr1 in individual cells that translates into the complex cellular behaviors that drives morphogenesis.
Cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide. Aging is among the greatest risk factors for cardiovascular disease. Cardiovascular disease comprises several diseases, for example myocardial infarction, elevated blood pressure and stroke. Many processes are known to promote or worsen cardiovascular disease and in the present study, cellular senescence and inflammatory activation were of special interest, as they have a strong association to aging and can be seen as hallmarks of cellular aging.
Long noncoding RNAs (lncRNAs) are noncoding RNAs with a length of more than 200 nucleotides. In recent years, numerous regulatory functions were shown for these transcripts and lncRNAs were shown to directly interact with DNA, RNA and proteins. The long noncoding RNA H19 was among the first described noncoding RNAs and was initially shown to act as a tumor suppressor. More recently, several studies showed oncogenic roles for H19. In regards to the cardiovascular system, H19 was not analyzed before.
We show that H19 is the most profoundly downregulated lncRNA in endothelial cells of aged mice compared to young littermates. Microarray analysis of human primary endothelial cells upon pharmacological H19 depletion revealed an involvement of H19 in cell cycle regulation. Loss of H19 in human endothelial cells in vitro led to reduced proliferation and to increased senescence. H19 depletion was shown to counteract proliferation before, but none of the described mechanisms applied to endothelial cells. We show that the reduction in proliferative capacity and the pro-senescent function of H19 is most probably mediated by an upregulation of p16ink4A and p21 upon H19 depletion.
When we compared the angiogenic capacity of aortic endothelial cells from young and aged mice in an aortic ring assay, rings from aged mice showed a reduced cumulative sprout length. Interestingly, pharmacological inhibition of H19 in aortic rings of young animals, where H19 is highly expressed, was sufficient to reduce the cumulative sprout length to levels we observed from aged animals. Furthermore, overexpression of human H19 in aortic rings of aged mice, where H19 is poorly expressed, rescued the impaired angiogenic capacity of aged endothelial cells.
We generated inducible endothelial-specific H19 knockout mice (H19iEC-KO) and subjected these animals to hind limb ischemia surgery followed by perfusion analysis in the hind limbs by laser-doppler velocimetry and histological analysis. Perfusion in the operated hind limb was increased in H19iEC-KO compared to Ctrl littermates, which was in contrast to a reduction in capillary density in the operated hind limbs of H19iEC-KO animals compared to Ctrl littermates and to our previous results. Analysis of arteriogenesis revealed an increase in collateral growth upon EC-specific H19 depletion in the ischemic hind limbs, which explains the increase in perfusion despite the reduction in capillary density. Further characterization of the animals revealed an increase in leukocyte infiltration into the tissue in the ischemic hind limbs upon endothelial-specific H19 depletion, indicating a potential role of H19 in inflammatory tissue activation.
Reanalysis of the microarray data from human primary endothelial cells upon H19 depletion revealed an association of H19 with inflammatory signaling and more specifically with IL-6/JAK2/STAT3 signaling. Analysis of cell surface adhesion molecule expression revealed an upregulation of ICAM-1 and VCAM-1 on mRNA level and an increase of the abundance of the two proteins on the cell surface of human primary endothelial cells. Consequently, adhesion of isolated human monocytes to human primary endothelial cells was increased upon H19 depletion in vitro. Interestingly, TNF-α mediated inflammatory activation of primary human endothelial cells repressed H19 expression. H19 did not function via previously described mechanisms. We excluded a competitive endogenous RNA (ceRNA) function for H19 in endothelial cells and showed that miR-675, which is processed from H19, does not play a role in the endothelium. Furthermore, H19 did not regulate previously described genes or pathways.
Analysis of transcription factor activity upon H19 depletion and overexpression revealed a differential activity of STAT3. STAT3 phosphorylation at TYR705 and thus activation was increased upon H19 depletion. Inhibition of STAT3 activation using a small compound inhibitor abolished the effects of H19 depletion on mRNA expression of p21, ICAM-1 and VCAM-1 and on proliferation, indicating that the effects of H19 are at least partially mediated via STAT3. STAT3 was shown to have positive effects on the cardiovascular system before, most likely due to upregulation of VEGF in a STAT3-dependent manner. We were not able to confirm previously described mechanisms for STAT3 in the present study and propose a new mechanism of action for the H19-dependent regulation of STAT3. Taken together, these results identify the long noncoding RNA H19 as a pivotal regulator of endothelial cell function. Figure 38 summarizes the described functions of H19 in endothelial cells.
Deciphering the ecological functions of fungal root endophytes based on their natural occurrence
(2017)
Plants are colonized by a large diversity of fungi, some residing on the surface and others penetrating the plant tissues, the latter referred to as fungal endophytes (endon Gr., within; phyton, plant; de Bary 1879). Despite the saprotrophic potential of fungal endophytes, they are not found to cause visible disease symptoms to the host. Plants are colonized simultaneously by various fungal species, which form rich and diverse endophytic assemblages. Although it is hypothesized that fungal endophytes contribute to the fitness of their hosts and to the functioning of ecosystems, the ecological function of fungal endophytic assemblages remains cryptic. The aims of this doctoral thesis are to gain insight to the ecological functions of root fungal endophytes, by deciphering their roles in ecosystems based on their natural occurrence and the structure of their assemblages. The thesis focuses on studying the diversity and structure of the endophytic mycobiome within roots of two annual and widespread plant hosts Microthlapsi perfoliatum and M. erraticum (Brassicaceae) in several locations across northern Mediterranean and central Europe. The thesis is composed by six Chapters, with a primary focus on Chapter 1, 2 and 3.
Chapter 1 (Glynou et al., 2016) aimed at characterizing the diversity of fungal endophytes in roots at a continental scale and at assessing the factors affecting the structure of endophytic assemblages with the use of cultivation-based methods. For that, root samples were collected from 52 plant populations, along with a collection of soil, bioclimatic, geographic and host data. Cultivation of surface-sterilized root samples on culture media and isolation of fungal colonies in pure culture generated 1,998 fungal colonies. Grouping of sequences into Operational Taxonomic Units (OTUs), based on the 97% similarity of the isolates’ rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence, generated in total 296 OTUs, representing taxa mostly within the phylum Ascomycota with a minor representation of Basidiomycota. Endophytic assemblages were mostly correlated with variation in bioclimatic conditions. Interestingly, despite the large diversity revealed, the assemblages were dominated by only six OTUs related to the orders Hypocreales, Pleosporales and Helotiales, which had a widespread distribution across populations but with some following patterns of ecological preferences.
Chapter 2 aimed at characterizing the uncultivable fraction of the root fungal endophytic diversity, which was not possible to capture in Chapter 1. High-throughput sequencing via the
Illumina Miseq platform was implemented in 43 of the 52 original populations and mostly in the same root samples. In comparison with the cultivation-based approach, the HTS managed to cover the overall diversity within samples. It revealed a large non-cultivated endophytic diversity but the same cultivable fungi dominated assemblages. Moreover, the endophytic diversity was grouped mostly within fungal orders with demonstrated ability to grow in culture and taxonomically related groups were found to have divergent ecological preferences.
The genetic identity of the most abundant OTUs was further investigated in Chapter 3 (Glynou et al., 2017), aiming to unravel genotypic variability, which was possibly overlooked due to the use of lTS, as a universal genetic marker, and could explain their high abundance and widespread distribution. Multi-locus gene sequencing and AFLP profiling for the five most abundant OTUs suggested a low within-OTU genetic variability and show that these fungi have ubiquitous distribution and are not limited by environmental conditions within the ecological ranges of the study. A selection of endophytes frequently isolated in Chapter 1 was functionally characterized in Chapter 4 (Kia et al., 2017) based on the isolates’ traits and interactions with plants. In Chapter 5 (Cheikh-Ali et al., 2015) fungal cultures of Exophiala sp. with differential colony structure where investigated for their production of secondary metabolites. Moreover, Chapter 6 (Maciá-Vicente et al., 2016) comprises the description of the new species Exophiala radicis based on morphological and molecular characteristics.
Compilation of all results shows that the fungal endophytic diversity in roots of Microthlaspi spp. is high but few widespread OTUs dominate the assemblages, and have unlimited dispersal ability. These fungi seem also to have a wide niche breadth and are not affected by environmental filtering. The findings indicate that the local environment but also processes of competitive exclusion determine the structure of endophytic assemblages. In addition, the fungal endophytes associated with Microthlapsi spp. likely have saprotrophic activity however the interactions with plants are likely context-dependent. Further research is needed to assess the biotic interactions among endophytes and their effect on the structure of fungal endophytic assemblages. Ultimately, the findings of this thesis are useful to shed light on the processes underlying the structure of endophytic assemblages. They also upraise the need to describe diversity by combining genetic, metabolic and physiological data, in order to disentangle the elusive ecological roles of the endophytic mycobiome.
Savannas provide essential ecosystem services for human well-being in West Africa. Thus, ecosystem change not only directly affects biodiversity but also human livelihoods. Human land use considerably shaped these savanna ecosystems for millennia, particularly agriculture, livestock grazing, logging and the collection of non-timber forest products (NTFPs). NTFPs are wild plant products and comprise all organic matter from herbaceous plants, shrubs, and trees (excluding timber). Current increasing land use pressure through fast demographic changes is widely esteemed as a severe threat for savanna biodiversity and the socio-economy of rural communities. In consideration of the pivotal role of NTFP species for biodiversity and livelihoods, it is important to evaluate the effect of increasing land use change on savanna vegetation and on its provisioning service for human well-being. Thus, the major aim of this thesis is to investigate the impacts of land use intensification on vegetation composition, diversity and function and its consequences for provisioning ecosystem services (NTFPs) and human well-being in a West African savanna.
The research for this study was conducted in the North Sudanian vegetation zone of south-eastern Burkina Faso, where population growth exceeds the nationwide trend. Generally, Burkina Faso belongs to the worldwide poorest countries, where nearly one quarter of the population suffers from malnutrition (FAO 2014). The integration of NTFPs and particularly wild food species into rural household economies is, thus, an important measure in the national combat against poverty and food insecurity (FAO 2014). Against this background, I focus on vegetation changes, the economic importance of NTFPs as well as the decrease and substitution of wild food species in this study.
Vegetation resurveys of different vegetation types since the early 1990s showed that land use change led to more pronounced changes in the herbaceous than in the woody vegetation layer. Most woody vegetation types stayed stable in species composition and richness, even though some highly useful tree species (Vitellaria paradoxa, Parkia biglobosa) declined in some woody vegetation types. In contrast, in most herbaceous vegetation types species richness increased and species composition considerably changed. This change might be explained by a general ruderalisation process through a pronounced increase of wide-ranging herbaceous species. However, in spite of a general species increase in the herbaceous layer, a decrease of preferred herbaceous fodder species was found. Thus, the decline of useful species in both layers is alarming. Herbaceous vegetation types also showed more pronounced changes in plant functional trait characteristics in comparison to woody vegetation types. However, an increase of smaller plant species and species with a high diaspore terminal velocity (VTerm) was found in both vegetation layers. Since these two trait responses are generally related to grazing and browsing, the strong increase of livestock herds is likely to be responsible for the detected vegetation changes.
In addition to the vegetation study, interviews showed that all useful food species were widely considered to decline. The two economically most important tree species, the shea tree (Vitellaria paradoxa) and the locust bean tree (Parkia biglobosa) that contribute with 70% to wild food income, were considered among the most declining species of all cited wild food species. On this matter, local perceptions of species decline and results from field observations are in accordance. However, a wide range of cited substitutes indicated a great knowledge on alternative plant species in the area. Most wild food species are, however, substituted by other highly valued wild food species. Although our results suggest that rural communities are able to cope with the decrease or absence of wild food species, growing decline of one species would concurrently increase the pressure on other native food species. Therefore, the need to counteract the decrease of highly useful wild food species should be of high priority in management measures. In general, I showed that NTFPs are an essential component in rural households, since it contributed with 45 % to total household income. Significant differences in NTFP dependency between the two investigated villages and across the three main ethnic groups were detected, reflecting different traditional uses and harvesting practices. In general, it was shown that poorer households depend more on NTFP income than wealthier households. Against the background of this study, management strategies for agroforestry systems and poverty alleviation should consider local differences, and ethnicity-dependent NTFP-use patterns.
Overall, the combination of field studies on temporal and functional vegetation change with socio-economic and ethno-botanic interviews increases the knowledge on qualitative and quantitative vegetation changes and on the consequences for rural populations. This thesis gives a thorough insight into decreasing trends of economically valued plant species and thus gives evidence on the consequences of vegetation changes for ecosystem services of West African savanna ecosystems. Further, different NTFP-dependencies and use preferences according to socio-economic and cultural variables, such as ethnicity, present a valuable basis for specific decision-making and should be considered in management plans.
Research in cell and developmental biology requires the application of three-dimensional model systems that reproduce the natural environment of cells. Processes in developmental biology are therefore studied in entire systems like insects or plants. In cell biology, three-dimensional cell cultures (e.g. spheroids or organoids) model the physiology and pathology of cells, tissues or organs. In all systems, the cellular neighborhood and interactions, but also physicochemical influences, are realistically presented. The production and handling of these model systems is rather simple and allows for reproducible characterization.
Confocal and light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) enable the observation of these systems while maintaining their three-dimensional integrity. LSFM is applicable to imaging live samples at high spatio-temporal resolution over long periods of time. The quality of the acquired datasets enables the extraction of quantitative features about morphology, functionality and dynamics in the context of the complete system. This approach is referred to as image-based systems biology. Exploiting the potential of the generated datasets requires an image analysis pipeline for data management, visualization and the retrieval of biologically meaningful values.
The goal of this thesis was to identify, develop and optimize modules of the image analysis pipeline. The modules cover data management and reduction, visualization, reconstruction of multiview image datasets, the segmentation and tracking of cell nuclei and the extraction of quantitative features. The modules were developed in an application-driven manner to test and ensure their applicability to real datasets from three-dimensional fluorescence microscopy. The underlying datasets were taken from research projects in developmental biology in insects and plants, as well as from cell biology.
The datasets acquired in fluorescence microscopy are typically complex and require common image processing steps in order to manage, visualize, and analyze the datasets. The first module accomplishes automatic structuring of large image datasets, reduces the data amount by image cropping and compression and computes maximum projection images along different spatial directions. The second module corrects for intensity variations in the generated maximum projection images that occur as a function of time. The program was published as a part of an article in Nature Protocols. Another developed module named BugCube provides a web-based platform to visualize and share the processed image datasets.
In LSFM, samples can be rotated in-between two acquisitions enabling the generation of multiview image datasets. Prior to my work, Frederic Strobl and Alexander Ross acquired the complete embryogenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum, and the field cricket, Gryllus bimaculatus, with LSFM. I evaluated a plugin for the software FIJI as a module for the reconstruction of such datasets. The plugin was optimized for automation and efficiency. We obtained the first high quality three-dimensional reconstructions of Tribolium and Gryllus datasets.
Optical clearing increases the penetration depth into samples, thus providing endpoint images of entire three-dimensional objects with cellular detail. This work contributes a quantitative characterization module that was applied to endpoint images of optically cleared spheroids. A program for the generation of ground truth datasets was developed in order to evaluate the cell nuclei segmentation performance. The program was part of a paper that was published in BMC Bioinformatics. Using the program, I could show that the cell nuclei segmentation is robust and accurate. Approaches from computational topology and graph theory complete the segmentation of cell nuclei. Thus, the developed module provides a comprehensive quantitative characterization of spheroids on the level of the individual cell, the cell neighborhood and the whole cell aggregate. The module was employed in four applications to analyze the influence of different stress conditions on the morphology and cellular arrangement of cells in spheroids. The module was accepted for publication in Scientific Reports along with the results for one application. The cell nuclei segmentation further provided a data source for simulation models that used correlation functions to identify structural zones in spheroids. These results were published in Royal Society Interface.
The final part of this work presents a module for cell tracking and lineage reconstruction. In collaboration with Dr. Alexis Maizel, Dr. Jens Fangerau and Dr. Daniel von Wangenheim, I developed a module to track the positions of all cells involved in lateral root formation in Arabidopsis thaliana and used the extracted positions for extensive data analysis. We reconstructed the cell lineages and established the first atlas of all founder cells that contribute to the formation. The analysis of the retrieved data allowed us to study conserved and individual patterns in lateral root formation. The atlas and parts of the analysis presented in this thesis were published in Current Biology.
In this thesis, I developed modules for an image analysis pipeline in three-dimensional fluorescence microscopy and applied them in interdisciplinary research projects. The modules enabled the organization, processing, visualization and analysis of the datasets. The perspective of the image analysis pipeline is not restricted to image-based systems biology. With ongoing development of the image analysis pipeline, it can also be a valuable tool for medical diagnostics or industrial high-throughput approaches.
Die Psoriasis vulgaris (PsV) ist eine immunvermittelte entzündliche Erkrankung der Haut mit einer Prävalenzrate von 2-3 %, sodass etwa zwei Millionen Menschen in Deutschland an dieser erkrankt sind. Charakteristisch für die PsV sind veränderte Hautareale (Plaques), die im Rahmen der der entzündungsbedingten Durchblutungssteigerung gerötet erscheinen und eine silbrig-weiße Schuppung als Resultat einer vermehrten Abschilferung abgestorbener Keratinozyten aus der hyperproliferativen Epidermis aufweisen.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des proinflammatorischen Zytokins granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in der Pathogenese einer modellhaften Experimentalerkrankung der PsV untersucht. GM-CSF wird unter anderem von Interleukin (IL-) 17 produzierenden T-Helferzellen (Th17-Zellen) sezerniert, deren pathogenetische Bedeutung für die PsV gut etabliert ist. Die pathogene Wirkung von GM-CSF als Effektorzytokin konnte bereits in Tiermodellen anderer Th17-vermittelter Autoimmunerkrankungen wie der multiplen Sklerose und der rheumatoiden Arthritis (RA) gezeigt und die therapeutische Wirkung von GM-CSF-neutralisierenden Antikörpern in klinischen Studien an RA-Patienten demonstriert werden.
Das in dieser Arbeit angewendete murine Krankheitsmodell der Imiquimod (IMQ-) induzierten psoriasiformen Dermatitis wird durch die topische Anwendung des Medikaments Aldara®, dessen Wirkstoff IMQ ist, ausgelöst und führt zu einer Entzündung der Haut, die in vielen Aspekten dem humanen Krankheitsbild einer PsV ähnelt. Die pathogenetische Bedeutung von GM-CSF für die IMQ-induzierte psoriasiforme Dermatitis wurde über zwei unterschiedliche experimentelle Ansätze untersucht. So wurde GM-CSF in C57Bl/6J Mäusen mittels eines spezifischen, rekombinanten murinen Antikörpers in der Induktionsphase des Krankheitsmodells neutralisiert und zeitgleich der modifizierte Psoriasis Area Severity Index (PASI-)Score als Parameter des Schweregrades der klinischen Manifestationen ermittelt. Des Weiteren wurde am Versuchsende die Infiltration von Immunzellen in das entzündete Gewebeareal untersucht. Diese Ergebnisse wurden mit den Daten einer Behandlungsgruppe, nach Applikation eines IgG-Isotyp identischen Kontrollantikörpers verglichen. Dabei zeigte die Neutralisierung des Zytokins einen therapeutischen Effekt, der in einem signifikant niedrigeren PASI-Score, einer verringerten Tnfa mRNA Expression und einer reduzierten Infiltration mit neutrophilen Granulozyten resultierte.
Parallel zu diesen Versuchen wurde die Modellerkrankung auch in einer GM-CSF-defizienten C57Bl/6J Mauslinien (GM-CSF-/-) studiert. Die funktionelle Inaktivität des GM-CSF-kodierenden Csf2 Gens wurde 1994 durch gezielte genetische Manipulation etabliert. Unter den experimentellen Bedingungen war der Schweregrad der IMQ-induzierten psoriasiformen Dermatitis in GM-CSF-/- Mäusen nicht signifikant different von dem der wildtypischen (Wt) Mäuse und zeigte somit im Gegensatz zu den Ergebnissen aus den Versuchsreihen der Antikörper vermittelten Zytokinneutralisierung keinen offensichtlichen Hinweis auf eine GM-CSF-Abhängigkeit. In den GM-CSF-defizienten Tieren war jedoch nach IMQ-Induktion eine signifikant höhere Il6 und Il22 mRNA Expression am Entzündungsort im Vergleich zu den Wt Mäusen auffällig. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der Phänotyp der GM-CSF-defizienten Mäuse genauer untersucht und eine vermehrte Anzahl plasmazytoider dendritischen Zellen (pDCs) in Milz und Lymphknoten nachgewiesen. Diese Zellen werden im Rahmen ihrer Differenzierung aus Vorläuferzellen durch GM-CSF suppressiv reguliert und sind sowohl in die Entwicklung der PsV im Menschen als auch die Pathogenese der IMQ-induzierten psoriasiformen Dermatitis involviert. Aufgrund des in den sekundären lymphatischen Organen GM-CSF-defizienter Mäuse expandierten pDC-Kompartiments wurde die Beteiligung dieser Zellen in der Initiationsphase des Modells analysiert. Im Vergleich mit GM-CSF-suffizienten C57Bl/6J Mäusen weisen die Tiere der GM-CSF-defizienten Mauslinie zu diesen Zeitpunkten eine verstärkte Infiltration von pDCs in die Haut auf. Für pDCs ist bekannt, dass sie über die Produktion von IL-6 und TNF die Effektorzelldifferenzierung aktivierter, naiver T-Lymphozyten in Richtung Th22-Zellen polarisieren können. Dieser Mechanismus liefert ein hypothetisches Konzept, das die Ergebnisse zur gesteigerten IL-6-Produktion und Differenzierung IL-22-produzierender T-Zellen in IMQ-behandelten GM-CSF-/- Mäusen im Kontext der nachweisbaren Expansion von pDCs, erklären könnte. Dieser in den GM-CSF-/- Mäusen nachweisbare alternative Pathogenesemechanismus, ist offenbar geeignet die proinflammatorische Wirkung des genetisch fehlenden Zytokins zu kompensieren, aber hinsichtlich seiner Etablierung über ein verändertes pDC-Kompartiment von Dauer und Ausmaß der GM-CSF-Defizienz abhängig. So erklärt sich, warum die zeitlich limitierte Antikörper vermittelte GM-CSF-Neutralisierung in GM-CSF-suffizienten-Mäusen zu keiner pDC-Expansion und Steigerung von IL-6 und IL-22 Expression nach IMQ-Induktion führt.
Die GM-CSF-Neutralisierung durch einen rekombinanten murinen Antikörper reduziert deutlich die Krankheitsschwere der IMQ-induzierten psoriasiformen Dermatitis und belegt damit das therapeutische Potenzial dieses Therapieansatzes für die Humanerkrankung der PsV. Die unter angeborener GM-CSF-Defizienz in den Studien darüber hinaus aufgedeckten Veränderungen des pDC-Kompartiments sind von potenzieller Relevanz für zukünftige therapeutische Anwendungen dieses Prinzips, da unter einer dauerhaften GM-CSF-Neutralisierung mit therapeutischen Antikörpern ein Monitoring dieser Zellpopulation empfehlenswert erscheint z.B. über veränderte Interferonsignaturen durch pDCs, um mögliche Wirkverluste, aber auch unerwünschte Effekte zu erkennen.
Die neuronalen Mechanismen, welche den meisten kognitiven Prozessen zu Grunde liegen, bestehen aus dem Zusammenspiel verschiedener Neuronen-Typen und deren spezifischen Funktionsmechanismen, sowohl in lokalen, als auch in globalen neuronalen Netzwerken. Eine funktionelle Interaktion mit diesen Netzwerken ist unumgänglich um das „kognitive“ Gehirn zu studieren, da neuronale Gruppen in einer hierarchischen, nicht linearen Weise miteinander interagieren, und dabei charakteristische raum-zeitliche Muster aufweisen. In dieser Arbeit untersuchten wir die Struktur und Funktion eines wichtigen Merkmals kortikaler Prozesse: Die neuronale gamma-Band Oszillation.
Die Verarbeitung während des Hörprozesses von Säugetieren verläuft von der Kochlea mit den inneren und äußeren Haarsinneszellen (äHZ) über afferente Nervenbahnen bis zum auditorischen Kortex (AK). Die daran beteiligten Schaltstationen und deren Funktion sind überwiegend aufgeklärt. Die Hörbahn ist zudem in besonderer Weise durch efferente Rückkopplungen gekennzeichnet, die interne Modulationen sowie sekundäre Reaktionen auf den Reiz ermöglichen. Anatomisch betrachtet verlaufen efferente Projektionen vom AK zu sämtlichen am Hörprozess beteiligten Kerngebieten. Vom Olivenkomplex erfolgt über mediale und laterale Fasern eine Innervation der äHZ bzw. des Hörnervs. Trotz der gut beschriebenen Anatomie ist die funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde der funktionelle Zusammenhang vom AK zu den äHZ in der mongolischen Wüstenrennmaus untersucht. Dafür wurde entweder eine pharmakologische Blockierung der Kortexaktivität durch den Natriumkanalblocker Lidocain erzeugt oder eine Aktivierung der Kortexaktivität durch die Anwendung elektrischer Reize ausgelöst. Der Einfluss der Manipulationen wurde in der Kochlea mittels Messungen von Distorsionsprodukt-otoakustischen Emissionen (DPOAE) erfasst. Diese entstehen durch die nichtlineare Verstärkung leiser Schallsignale durch die äHZ zur Erzielung hoher Sensitivität und Frequenzauflösung. Die DPOAE treten als kubische (z. B. 2f1-f2) und quadratische (z. B. f2-f1) Verzerrungen auf und geben Aufschluss über unterschiedliche Parameter der äHZ-Verstärkungsfunktion.
Die Lidocainversuche wurden entweder kontra- oder ipsilateral zur DPOAE-Messung durchgeführt. In beiden Konstellationen traten nach der Lidocaininjektion Erhöhungen und Verringerungen der DPOAE-Pegel im Vergleich zur Basismessung oder unveränderte DPOAE-Pegel auf. Im Mittel lagen die Pegeländerungen bei ca. 11 dB, in Einzelfällen betrugen sie bis zu 44,8 dB. In den Gesamtdaten waren die Effekte nach kontralateraler Injektion oft signifikant größer als nach ipsilateraler Injektion. Ebenso waren die Effekte in der 2f1-f2 Emission meist signifikant größer als in der f2-f1 Emission. Zudem wurde beobachtet, dass signifikant größere Effekte bei einer Stimulation mit Pegeln von 60/50 dB SPL im Vergleich zu 40/30 dB SPL erreicht wurden. Grundsätzlich trat in allen Datensätzen eine Reversibilität der DPOAE-Pegel mit zunehmender Versuchsdauer auf. Die Effekte waren direkt nach der Injektion am größten und erreichten je nach Stimuluspegel und Emissionstyp nach 28-100 min die Basispegel. In keinem der Datensätze lag eine Abhängigkeit der im Kortex gereizten charakteristischen Frequenz (CF) zum betroffenen Frequenzbereich in der Kochlea vor. Die Effekte waren über den gesamten gemessenen Frequenzbereich von 1-40 kHz nachweisbar. Allerdings waren die Frequenzbereiche von 1-10 kHz und 30,5-40 kHz besonders stark von der Lidocaininjektion betroffen.
Auch nach der elektrischen Reizung wurden die drei oben beschriebenen Effekttypen definiert. Mit 54,6 % war der Prozentsatz unveränderter DPOAE-Pegel allerdings sehr hoch. In den anderen beiden Kategorien konnten zusätzlich Differenzierungen im zeitlichen Verhalten der DPOAE-Pegel vorgenommen werden. In 21,6 % bzw. 16,5 % der Datensätze waren die Verringerungen bzw. Erhöhungen bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt nach der elektrischen Reizung irreversibel und nur in jeweils 2,8 % der Datensätze war eine Reversibilität zu verzeichnen. In diesen Fällen war die Effektdauer mit im Mittel 31 bzw. 25 min kürzer als in den Lidocainversuchen. Auch die Effektstärken waren mit maximal 23,9 dB und je nach Effekttyp im Mittel 5,1-13,7 dB geringer als nach der Lidocaininjektion. Die größten Effekte traten in einem mittleren Stimuluspegelbereich von 45-55 dB SPL auf. Wiederum konnte keine Abhängigkeit des betroffenen Frequenzbereichs von der kortikal gereizten CF nachgewiesen werden. In Einzelfällen waren auf DPOAE-Ebene nur die Frequenzen ober- und unterhalb der kortikalen CF beeinflusst, wohingegen bei der CF selbst keine Effekte auftraten.
Durch Kontrollexperimente (Salineinjektion bzw. Einführen der Elektrode ohne elektrische Reizung) konnte nachgewiesen werden, dass die Effekte durch die Manipulation der Kortexaktivität hervorgerufen wurden. Somit liegt eine funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie vor, die langanhaltende massive Ausmaße annehmen kann. Die Effektrichtung ist vermutlich durch die exzitatorisch oder inhibitorisch wirkenden Neurone vom Colliculus inferior zum Olivenkomplex bedingt. Die größeren Effekte in der kontralateralen Konfiguration lassen sich durch die Diskrepanz in der Anzahl der gekreuzten (2/3) und ungekreuzten (1/3) medialen Efferenzen erklären. Die kubischen Komponenten der äHZ-Verstärkungsfunktion scheinen stärker beeinflusst zu sein als die quadratischen Komponenten, was in größeren Pegeländerungen in der 2f1-f2 Emission resultiert. Die teils großen Effektstärken sowie die nicht vorhandene Frequenzabhängigkeit zwischen AK und Kochlea sind vermutlich auf den großen Kortexbereich zurückzuführen, der von den gewählten Injektionsvolumina bzw. elektrischen Reizstärken betroffen war. Die großen Effekte im mittleren Stimuluspegelbereich lassen sich sowohl mit einer möglichen Schutzfunktion der Efferenzen vor zu lauten Schallereignissen als auch mit einer Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zur erleichterten Detektion akustischer Signale in Einklang bringen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivität des AK einen starken Einfluss auf periphere auditorische Mechanismen hat, wodurch die kochleäre Verarbeitung akustischer Signale je nach kortikalem Verarbeitungsstatus massiv modifiziert werden kann.
Fossile Rohstoffe dienen in unserer heutigen Gesellschaft als Energiequelle und als Rohstofflieferant für Grund-, Feinchemikalien und Pharmazeutika. Sie tragen jedoch zum Klimawandel und Umweltverschmutzung bei. Lignocellulosische Biomasse ist eine erneuerbare und nachhaltige Alternative, die durch biotechnologische Prozesse erschlossen werden kann. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein sehr gut untersuchter Modellorganismus, für den es zahlreiche genetische Werkzeuge und Analysemethoden gibt. Zudem wird S. cerevisiae häufig in biotechnologischen Prozessen eingesetzt, da diese Hefe robust gegenüber industriellen Bedingungen wie niedrigen pH-Werten, toxischen Chemikalien, osmotischem und mechanischem Stress ist. Die Pentose D-Xylose ist ein wesentlicher Bestandteil von lignocellulosischer Biomasse, die aber nicht natürlicherweise von der Bäckerhefe verwerten werden kann. Für eine kommerzielle Herstellung von Produkten aus lignocellulosischer Biomasse muss S. cerevisiae D-Xylose effektiv verwerten. Für die Bäckerhefe konnten heterologe Stoffwechselwege etabliert werden, damit diese D-Xylose verwerten kann. Für eine effiziente Xyloseverwertung bleiben dennoch zahlreiche Herausforderungen bestehen. Unter anderem nehmen die Zellen D-Xylose über ihre endogenen Hexosetransporter nur langsam auf. Die heterologe Xylose-Isomerase (XI) besitzt in S. cerevisiae eine geringe Aktivität für die Isomerisierung von D-Xylose. Unspezifische Aldosereduktasen konkurrieren mit der Xylose-Isomerase um das gleiche Substrat und produzieren Xylitol, ein starker Inhibitor der Xylose-Isomerase. Eine Möglichkeit die Umsatzrate von Enzymen zu steigern und Substrate vor Nebenreaktionen zu schützen, ist die Anwendung von Substrate Channeling Strategien. Bei Substrate Channeling befinden sich die beteiligten Enzyme in einem Komplex, wodurch die Substrate lokal angereichert werden und von einem aktiven Zentrum zum nächsten weitergeleitet werden, ohne Diffusion in den restlichen Reaktionsraum. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Komplex zwischen einem membranständigen Transporter und einem löslichen Enzym konstruiert werden kann, um durch Substrate Channeling eine verbesserte Substrat-Verwertung zu erreichen. Die Xylose-Isomerase aus C. phytofermentans und die endogene Hexose-Permease Gal2 sollten in dieser Arbeit als Modellproteine in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe von Protein-Protein-Interaktionsmodulen (PPIM) in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.
Die Expression verschiedener PPIM konnte in S. cerevisiae mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch Fusionsproteine aus unterschiedlichen PPIM wurden in dieser Hefe exprimiert. Die PPIM binden komplementäre PPIM oder kurze Peptidliganden, welche an die Xylose-Isomerase und an den Gal2-Transporter fusioniert wurden. Die Funktionalität beider Proteine wurde mittels in vivo und in vitro Tests untersucht. Die Xylose-Isomerase mit N-terminalen Liganden des WH1-Protein-Protein-Interaktionsmoduls (WH1L-XI) und der Gal2-Transporter mit N-terminalen SYNZIP2-Protein-Protein-Interaktionsmodul (SZ2-Gal2) erwiesen sich als geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisierung von SZ2-Gal2 und WH1L-XI, die einander über ein Scaffold-Protein binden, nachgewiesen werden.
Transformanten, in denen ein Komplex aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gebildet wurde, zeigten bessere Fermentationseigenschaften gegenüber der Scaffold-freien Kontrolle und dem Wildtyp: Sie verwerteten Xylose schneller, bildeten weniger vom unerwünschten Nebenprodukt Xylitol, produzierten mehr Ethanol und wiesen eine höhere Ethanolausbeute auf. Der beobachtete Substrate Channeling Effekt kompensierte die geringere Enzymaktivität der WH1L-XI im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Wirksamkeit des Substrate Channeling wurde verringert, wenn die Bildung des Komplexes aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gestört wurde, indem ein getaggtes GFP mit dem Scaffold-Protein um die Bindungsstelle an Gal2 konkurrierte. Dies zeigt, dass die positive Wirkung auf die Komplex-Bildung zwischen XI und Gal2 zurück zu führen ist. Die Fermentationseigenschaften konnten gesteigert werden, indem der zuvor zwischen SZ2-Zipper und Gal2-Transporter verwendete Linker, der aus zehn Aminosäuren von Glycin, Arginin und Prolin (GRP10) bestand, durch einen aus Glycin und Alanin (GA10) ersetzt wurde. Die verbesserten Fermentationseigenschaften beruhten auf einem Substrate Channeling Effekt und einer gesteigerten Aufnahmerate des SZ2-GA10-Gal2-Transporters. Ein Vergleich der Strukturvorhersagen von SZ2-GRP10-Gal2 und SZ2-GA10-Gal2 zeigte, dass der GRP10-Linker einen unstrukturierten, flexiblen Linker ausbildet, während der GA10-Linker eine starre α-Helix ausbildet. Die Struktur und der Transportprozess von Gal2 sind nicht aufgeklärt. Bei verwandten Transportern geht man davon aus, dass Substrate durch Konformationsänderungen ins Innere der Zelle transportiert werden, indem die beiden Domänen gegeneinander klappen. Die α-Helix könnte die Geschwindigkeit der Konformationsänderungen begünstigen.
Durch Kontrollexperimente konnte ausgeschlossen werden, dass die gesteigerten Fermentationseigenschaften eine Folge der Stabilisierung der XI- und Gal2-Fusionsproteine durch das Anfügen des Liganden oder durch Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein waren. Substrate Channeling zwischen Gal2 und XI entsteht durch die Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein, wodurch sich Gal2 und XI in räumlicher Nähe zueinander befinden. Dieser Effekt beruht möglicherweise zusätzlich aufgrund einer hohen örtlichen Ansammlung dieser Proteine, da die tetramere XI weitere Scaffold-Proteine binden könnte, welche weitere Gal2-Transporter binden könnte. Darüber hinaus sammeln sich Transporter an bestimmten Orten der Membran an und Transporter mit ähnlicher oder gleicher Transmembransequenz tendieren dazu zu ko-lokalisieren. Hierdurch könnten Gal2-XI-Agglomerate entstehen und Xylose wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer der vielen Xylose-Isomerasen umgesetzt.
In dieser Arbeit wurde der Hefepilz Xanthophyllomyces dendrorhous als vielseitige biotechnologische Plattform für die Produktion von Carotinoiden verwendet. Durch genetische Modifikationen der Carotinoidbiosynthese wurde ein Astaxanthin-Hochproduzent zur Akkumulation des farblosen Phytoens, das die menschliche Haut vor der schädlichen Wirkung der UV-Strahlung schützt und des gelben Zeaxanthins, das zur Förderung und Erhalt der Sehfähigkeit beiträgt, befähigt. Zur Generierung eines Phytoen-Hochproduzenten wurde das Gen crtI (Phytoen-Desaturase) inaktiviert und der Phytoengehalt durch Überexpression der Gene HMGR, crtE und crtYB gesteigert. Die Generierung eines Zeaxanthin-Hochproduzenten beinhaltete die Inaktivierung des Gens asy (Astaxanthin-Synthase) und die heterologe Expression einer bakteriellen ß-Carotin-Hydroxylase CrtZoXd.
Die Inaktivierung der Gene erfolgte mit spezifischen Knock-Out-Konstrukten, die mittels homologer Rekombination in crtI oder asy integrierten. Nachdem die Transgene auf Vektoren mit verschiedenen Antibiotikaresistenzen kloniert wurden, wurde die Überexpression durch genomische Integration in die ribosomale DNA erreicht. Anschließend wurde die Carotinoidzusammensetzung der Zellextrakte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer C18-Trennsäule oder durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Der Knock-Out-Nachweis erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion und Amplifikation der Genloci, während die Anzahl integrierter Carotinoidgene durch quantitative Real-Time-PCR bestimmt wurde. Die Kultivierungen von X. dendrorhous wurden sowohl in Schikanekolben als auch in einem 2L-Bioreaktor durchgeführt.
Im Zuge der genetischen Modifikationen konnte der Ploidiegrad des Wildtyps bestimmt werden, der bis dahin unbekannt war. Durch das Auftreten von instabilen heterozygoten Stämmen und deren Überführung zu stabilen Homozygoten wurde die Existenz eines diploiden Genoms nachgewiesen. Um die für die biotechnologische Anwendung notwendige Stabilität der Carotinoidbiosyntheseleistung zu erreichen, wurden zwei Strategien entwickelt. Hierbei erfolgte die Stabilisierung der Stämme als Folge mitotischer Rekombination nach Subkultivierung und anschließender Farbselektion oder durch Induktion des sexuellen Zyklus und Sporulation.
Der crtI-Knock-Out führte zur Akkumulation von 3,6 mg/g dw Phytoen. Anschließend wurde die Limitierung der Phytoensynthese durch crtYB-Überexpression aufgehoben und die Versorgung der Carotinoidbiosynthese mit Vorläufermolekülen durch HMGR- und crtE-Überexpression erhöht. Im Bioreaktor wurde durch die Anwendung eines dreistufigen Fed-Batch-Prozesses, der eine effiziente Glucoseverwertung sicherstellte, mit 10,4 mg/g dw die höchste bis dato publizierte zelluläre Phytoenkonzentration im stabilisierten Hochproduzenten erreicht.
Der asy-Knock-Out führte zur Akkumulation von 4,5 mg/g dw ß-Carotin, das anschließend durch heterologe Expression der codon-optimierten ß-3,3-ß-Hydroxylase crtZoXd im Hochproduzenten zu 3,5 mg/g dw Zeaxanthin umgesetzt wurde. Zur Optimierung des Vorgehens wurden Knock-In-Konstrukte entwickelt, mit denen beide Schritte (Knock-Out und Integration von Carotinoidgenen) in nur einem molekular-biologischen Schritt durchgeführt und 94 % des in einem Wildtypstamm vorhanden ß-Carotins zu Zeaxanthin umgesetzt wurden. Die Optimierung der Wachstumsbedingungen bei der Bioreaktor-Kultivierung des stabilisierten Zeaxanthinproduzenten führte mit 10,8 mg/L zu einem 5-fach höheren Zeaxanthingehalt im Vergleich zur Schikane-Kultivierung.
Durch den Einsatz der Pentosen Arabinose und Xylose als alternative Kohlenstoffquellen wurde der Carotinoidgehalt der Phytoen- und Zeaxanthin-Hochproduzenten um 70 bzw. 92 % im Vergleich zur Glucose-Kultivierung gesteigert, wobei die Gründe für diesen Effekt in einer stärkeren Kohlenstoffverwertung und der Hemmwirkung von Glucose vermutet wurden. Aus verschiedenen pflanzlichen Abfallstoffen kann Xylose durch Hydrolyse freigesetzt werden, deren Nutzung zum Aufbau einer nachhaltigen und kostengünstigen biotechnologischen Carotinoidproduktion beitragen kann.
Darüber hinaus wurden multioxigenierte Zeaxanthinderivate, von denen eine positive Wirkung auf die menschliche Gesundheit vermutet wird, durch kombinatorische Biosynthese erhalten. Durch die schrittweise Integration der Gene crtZoXd, crtG (ß-2,2-Hydroxylase) und bkt (ß-4,4-Ketolase) in eine ß-Carotinmutante wurde die Biosynthese von Zeaxanthin, Nostoxanthin und schließlich von 4-Keto-Nostoxanthin und 4,4-Diketo-Nostoxanthin erreicht. Anschließend erfolgte die chemische Reduktion zu den neuartigen Carotinoiden 4-Hydroxy-Nostoxanthin und 4,4-Dihydroxy-Nostoxanthin und der zweifelsfreie Nachweis aller vier Carotinoide anhand der mittels Massenspektrometrie bestimmten Molekülmassen und Fragmentierungsmuster.
Introduction:
The evolutionary patterns of symbiotic organisms are inferred using cophylogenetic methods. Congruent phylogenies indicate cospeciation or host-switches to closely-related hosts, whereas incongruent topologies indicate independent speciation. Recent studies suggest that coordinated speciation is a rare event, and may not occur even in the highly specialized associations. The cospeciation hypothesis was mainly tested for free-living mutualistic associations, such as plant-pollinator interactions, and host-parasitic systems but was rarely tested on obligate, mutualistic associations involving intimate physiological interactions. Symbionts with lower partner selectivity may not experience coordinated speciation due to frequent switching of partners. On the other hand, symbionts with high partner selectivity may influence each other’s evolution owing to the highly interdependent lifestyles. Symbiont association patterns are also influenced by habitat and it has been proposed that symbiotic interactions are stronger in warm regions as compared to cooler regions (also referred as latitudinal gradient of biotic specialization). This hypothesis however, has recently been challenged and it has been suggested that a gradient of biotic specialization may not exist at all. Reliable species concepts are a prerequisite for understanding the association and evolutionary patterns of symbiotic organisms. The species concepts of many groups traditionally relied on the morphological species concept, which may not be adequate for distinguishing species due to the: i) homoplasious nature of morphological characters, an due to the inability to distinguish cryptic species. Thus phylogenetic species concept along with coalescent-based species delimitation approaches, which utilize molecular data for inferring species boundaries have been used widely for resolving taxonomic relationships. Lichens are obligatory symbiotic associations consisting of a fungal partner (mycobiont) and one or more photosynthetic partners, algae, and/or cyanobacteria (photobionts). I used the lichen forming fungal genus Protoparmelia as my study system, which consists of ~25-30 previously described species inhabiting different habitats, from the arctic to the tropics. This makes Protoparmelia an ideal system to explore the association and evolutionary patterns across different macrohabitats.
Objectives:
The objectives of this thesis were to 1. Elucidate the phylogenetic position of Protoparmelia within Lecanorales, and infer the monophyly of Protoparmelia; 2. Understand species diversity within Protoparmelia s.str. using coalescent-based species delimitation approaches; and 3. To identify the Trebouxia species associated with Protoparmelia using phylogenetic and species delimitation approaches and to infer the association and cophylogenetic patterns Protoparmelia and Trebouxia in different macrohabitats.
Results and discussion:
Chapter 1: Taxonomic position of Protoparmelia
In the first part of this study I explored the taxonomic position of Protoparmelia within the order Lecanorales. Overall this study included 54 taxa from four families, sequenced at five loci (178 sequences). I found Protoparmelia to be polyphyletic and sister to Parmeliaceae.
Chapter 2: Multilocus phylogeny and species delimitation of Protoparmelia spp.
In this part of the study, I identified and delimited the Protoparmelia species forming a monophyletic clade sister to Parmeliaceae i.e., Protoparmelia sensu stricto group, based on the multilocus phylogeny and coalescent-based species delimitation approaches. I included 18 previously described and three unidentified Protoparmelia species, which represents ~70% of the total described species, and 73 other taxa, sequenced at six loci. I found that the sensu stricto group comprised of 25 supported clades instead of 12 previously described Protoparmelia species. I tested the speciation probabilities of these 25 clades using species delimitation softwares BP&P and spedeSTEM. I found nine previously unrecognized lineages in Protoparmelia and I propose the presence of at least 23 species for Protoparmelia s.str., in contrast to the 12 described species included in the study.
Chapter 3: Association and cophylogenetic patterns of Protoparmelia and its symbiotic partner Trebouxia
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In the dentate gyrus (DG) of the mammalian hippocampus, neurogenesis continues to take place throughout an organism’s life. Adult neurogenesis includes proliferation and differentiation of neural stem cells into dentate granule cells (GCs) that mature and integrate into the existing cellular network. This thesis work presents a novel approach that enables longitudinal examination of living postnatally generated GCs in their endogenous niche by using retroviral (RV) labeling in organotypic entorhino-hippocampal slice cultures (OTCs). Older GCs were fluorescence-labeled with an adeno-associated virus controlled by the synapsin 1 promoter (AAV-Syn). The combination of time-lapse imaging and 3-D reconstruction of newborn developing GCs and older, more mature GCs enabled comparative analyses of dendritic growth and cellular dynamics as well as investigations of spine formation and the establishment of synaptic contacts.
Postnatal neurogenesis was studied in the mouse and rat DG in vivo by analysis of the distribution of chemical neuronal maturation markers doublecortin (DCX) and calbindin in combination with the GC marker Prox1 between P7 and P42. The marker expression patterns at different time points indicated that the number of mature GCs increased gradually over time and that young, immature GCs were added to the inner layers of the granule cell layer (GCL), as is the case in the adult brain. The most substantial shift in GC maturation took place between P7 and P14, though GCs in the rat DG matured faster (i.e. by ~5 days) than GCs in the mouse. Immunocytochemical in vitro analysis in OTCs at DIV 7, 14, and 28 exhibited a distribution of marker expression over time that was comparable to in vivo, though the number of DCX-expressing GCs was low at DIV 28, indicating a considerable decrease in neurogenesis rate over time in the OTC. Nevertheless, RV-labeling of newborn GCs at DIV 0 yielded successful visualization and enabled time-lapse imaging of complete developing GCs up to 4 weeks after mitosis. During the second week of development, newborn GCs exhibited a high level of structural dynamics, including extension and retraction of dendritic segments. In the third week, newborn GCs displayed high dendritic complexity which was followed by pronounced dendritic pruning. Finally, a phase of structural stabilization and local refinement could be observed during the fourth week. Older AAV-Syn-labeled GCs did not exhibit such dynamic structural remodeling. Anterograde tracing of entorhinal projection fibers using the biotinylated dextran amine Mini Ruby showed innervation of the outer molecular layer (OML) by entorhinal axons at early time points, i.e. DIV 8 when newborn GCs started to extend dendrites into the ML, as well as at DIV 20 when RV-labeled GCs exhibited elaborate dendritic trees with processes in the OML intermingling with entorhinal fibers. This shows that newborn GCs in the OTC grow into an area of existing entorhinal axon terminals, which is highly similar to the situation in the adult brain. Hence, the results show that postnatal neurogenesis can be studied effectively in the OTC system as a model of adult neurogenesis. The first appearance of spine-like protrusions in newborn GCs was observed two weeks post RV injection. Ultrastructural electron-microscopic images revealed that spines established synaptic contacts with axonal boutons. These findings suggest that newborn GCs are successfully integrated into the existing cellular circuitry in the OTC system. The high level of structural flexibility found in this study might be a necessary requisite of new neurons for successful dendritic maturation and functional integration into a neuronal network. Thus, live imaging of postnatally born GCs in the OTC appears as a useful novel approach to elucidate the mechanisms that affect cellular dynamics of neurogenesis.
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der frühen embryonalen Entwicklung. ESCs können mit Hilfe neuer Technologien zur Modifikation von Genen (z.B. mit dem CRISPR/Cas9 System) genetisch manipuliert werden. Daraus resultierende „knockout“ ES Zelllinien können helfen, die physiologische Rolle von Proteinen während der Differenzierung zu verstehen.
Transkriptionsfaktoren, die schnell und spezifisch Signalwege regulieren, spielen während der Embryonalentwicklung und während der Differenzierung von ESCs in vielen verschiedenen Zelltypen eine essentielle Rolle. Der Transkriptionsregulator „Far Upstream Binding Protein 1“ (FUBP1) ist ein Protein, welches eine ganz bestimmte einzelsträngige DNA Sequenz, das „Far Upstream Sequenz Element“, erkennt, bindet, und dadurch Gene wie z.B c-myc oder p21 reguliert. Mit der Entwicklung zweier Fubp1 Genfallen Mausstämme (Fubp1 GT) sollte die Frage nach der physiologischen Funktion von FUBP1 beantwortet werden. Die homozygoten FUBP1-defizienten GT Embryonen sterben im Mutterleib ungefähr am Tag E15.5 der Embryonalentwicklung. Sie sind kleiner als Wildtypembryonen und zeigen ein anämisches Aussehen. Daher wurden diese Mausmodelle hinsichtlich der Hämatopoese untersucht, die zu diesem Zeitpunkt vor allem in der Leber stattfindet. Es konnte eine signifikante Reduktion der hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) festgestellt werden und zusätzlich war die langfristige Repopulation der FUBP1-/--Stammzellen im Knochenmark in Transplantationsexperimenten reduziert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von FUBP1 in einem weiteren Stammzellsystem analysiert und gleichzeitig seine Bedeutung in anderen Zelltypen der frühen Embryonalentwicklung untersucht.
Die Quantifizierung der FUBP1 Expression in den ESCs und während der Differenzierung zu sogenannten `embryoid bodies` (EBs) zeigten eine starke Expression auf mRNA- und auf Proteinebene. Nach der erfolgreichen Optimierung der Differenzierung von murinen ESCs wurden Fubp1 „knockout“ (KO) ESC Klone mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie etabliert. Die molekularbiologische Analyse der ESCs zeigte eine signifikante Erhöhung der Oct4 mRNA-Expression, während Nanog und die Differenzierungsmarker Brachyury, Nestin und Sox17 unverändert und in vergleichbarer Menge zu den Kontrollen vorhanden waren. Während der Differenzierung der Fubp1 KO Klone zu EBs zeigte sich eine signifikante Reduktion mesodermaler Marker wie Flk-1, SnaiI, Snai2, Bmp4 und FgfR2. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Analysen bestätigte sich die verzögerte Bildung mesodermaler Zellen (Brachyury- und Flk-1-exprimierender Zellen) in den Fubp1 KO Klonen der EBs an den Tagen 3, 4 und 5 nach Beginn der Differenzierung.
Die Anwendung einer Ko-Kultivierung auf OP9 Zellen zur Differenzierung der ESCs in hämatopoetische Linien sollte zeigen, ob der Fubp1 KO ESCs ein Defekt in der frühen Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen zu beobachten ist. Erneut konnte am Tag 5 der ESC-Differenzierung in der OP9 Ko-Kultur eine signifikante Reduktion der mesodermalen (Flk-1+) Zellen festgestellt werden. Die weitere Differenzierung zu hämatopoetischen CD45+ Zellen zeigte jedoch keinen Unterschied im prozentualen Anteil CD45+ Zellen am Tag 12 der Differenzierung. Auch die gezielte Differenzierung zu erythroiden Zellen durch Zugabe des Zytokins EPO zum Medium zeigte keinen signifikanten Unterschied im Differenzierungsgrad der erythroiden Zellen zwischen Kontroll- und Fubp1 KO Klonen.
In weiteren Experimenten habe ich in dieser Arbeit die Expression von FUBP1 in WT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 der Embryonalentwicklung untersucht. Hierbei zeigte sich in beiden Entwicklungsstadien eine immunhistochemische Anfärbung von FUBP1 in den meisten Zellen des Embryos. Die Annahme, dass die Abwesenheit von FUBP1 in der Embryonalentwicklung zu verstärkten apoptotischen Vorgängen führen könnte und gleichzeitig die massive Expansion von Zellen gestört sein könnte wurde mit Hilfe immunhistochemischer Färbung von „cleaved Caspase 3“ (Apoptosemarker) und „Ki-67“ (Proliferationsmarker) in den homozygoten Fubp1 GT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 nicht bestätigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die Regulation von Apoptose und Proliferation durch FUBP1 während der Embryonalentwicklung nicht die Hauptrolle von FUBP1 darstellt. Es zeigte sich jedoch, dass FUBP1 als Transkriptionsregulator wichtig für die mesodermale Differenzierung von ESCs ist. Zu beobachten war, dass es in den FUBP1-defizienten ESCs zu einer Verzögerung der mesodermalen Differenzierung kommt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass FUBP1 essenziell für die Selbsterneuerung von HSCs ist. Dies macht deutlich, dass FUBP1 neben der Proliferation und Apoptose ein breiteres Spektrum an Signalwegen reguliert, die für Stammzellen und deren Differenzierung von Bedeutung sind.
BACKGROUND: Acetogenic bacteria are able to use CO2 as terminal electron acceptor of an anaerobic respiration, thereby producing acetate with electrons coming from H2. Due to this feature, acetogens came into focus as platforms to produce biocommodities from waste gases such as H2+CO2 and/or CO. A prerequisite for metabolic engineering is a detailed understanding of the mechanisms of ATP synthesis and electron-transfer reactions to ensure redox homeostasis. Acetogenesis involves the reduction of CO2 to acetate via soluble enzymes and is coupled to energy conservation by a chemiosmotic mechanism. The membrane-bound module, acting as an ion pump, was of special interest for decades and recently, an Rnf complex was shown to couple electron flow from reduced ferredoxin to NAD+ with the export of Na+ in Acetobacterium woodii. However, not all acetogens have rnf genes in their genome. In order to gain further insights into energy conservation of non-Rnf-containing, thermophilic acetogens, we sequenced the genome of Thermoanaerobacter kivui.
RESULTS: The genome of Thermoanaerobacter kivui comprises 2.9 Mbp with a G+C content of 35% and 2,378 protein encoding orfs. Neither autotrophic growth nor acetate formation from H2+CO2 was dependent on Na+ and acetate formation was inhibited by a protonophore, indicating that H+ is used as coupling ion for primary bioenergetics. This is consistent with the finding that the c subunit of the F1FO ATP synthase does not have the conserved Na+ binding motif. A search for potential H+-translocating, membrane-bound protein complexes revealed genes potentially encoding two different proton-reducing, energy-conserving hydrogenases (Ech).
CONCLUSIONS: The thermophilic acetogen T. kivui does not use Na+ but H+ for chemiosmotic ATP synthesis. It does not contain cytochromes and the electrochemical proton gradient is most likely established by an energy-conserving hydrogenase (Ech). Its thermophilic nature and the efficient conversion of H2+CO2 make T. kivui an interesting acetogen to be used for the production of biocommodities in industrial micobiology. Furthermore, our experimental data as well as the increasing number of sequenced genomes of acetogenic bacteria supported the new classification of acetogens into two groups: Rnf- and Ech-containing acetogens.
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
Phenology is the study of periodic life cycle events of living organisms and how these are influenced by environmental factors. Late phenological phases such as the timing of seed release and subsequent seed dispersal considerably affect ecology and evolution in plants. Since plants are mostly sessile organisms, seed dispersal is a crucial life cycle event for the ecology and evolution of plants. In fact, long-distance seed dispersal (LDD) is a very complex process in plant biology and significantly shapes the spatial and temporal dynamics of plant populations. For example, wind dispersal in plants is influenced by a variety of factors such as plant traits, habitat type and environmental conditions (e.g. wind speed). Considering the variability of wind conditions throughout the year, the timing of seed release and dispersal is known to have considerable effects on LDD. Even though late phenologies such as ripening duration and timing of seed release and subsequent dispersal are vital in estimating ecologically highly relevant LDD, these phenologies are not appropriately addressed in ecological research. The aim of this thesis is to gain insights into the factors that shape late plant phenologies. In particular, we address the following questions: which ecologically or evolutionary parameters drive the ripening process of plant species? How does the seasonal variability of wind affect the seed release phenology of plant species? How do these factors interact for plant species in different habitat types?
In order to address these questions, we applied different methodological approaches, ranging from fieldwork and monitoring phenology to computational simulation studies and statistical modeling. To study the ripening process of species, we monitored the flowering, ripening and seed release phenology of more than 100 Central European plant species. We conducted computational simulation studies for estimating LDD by wind to study the phenology of seed release and the parameters determining LDD by wind. In conjunction with phenological data from literature, we used the obtained simulation results to investigate evidence for the existence of phenological adaptations towards LDD in 165 plant species. Further, we used the results from simulation studies of LDD by wind to disentangle the effects of species, habitat types and meteorological conditions and their interactions on the spatial spread of plant species.
The results of the relationship between plant traits, phylogeny, the ripening process and climatic factors provide insights into the basic understanding of the ripening process of plants. We identified ecological factors that shape species’ ripening phenology and seed release timing. In particular, we suggest that the species’ seed weight, life form and phylogeny shapes ripening and seed release phenology. With the statistical models on species’ temperature demands for reproduction, we introduce data that that are well suitable for parametrization and further development of plant dispersal models. The results from the simulation study based on a seasonal perspective showed that heavier seeded tree species with medium wind dispersal potential (including genera Abies, Acer, Fraxinus and Larix) have a clear synchronisation of seed abscission with periods favouring LDD. These species, which are both ecologically and economically important, showed significant synchronisation of the highest rate of seed release with high wind-speed that promoted LDD by wind in wintertime. For the tree species mentioned, we suggest strong seasonal synchronisation as evidence for phenological adaptations in order to match favourable conditions during seed release. With a closer look at the wind conditions that promote LDD by wind, our results showed considerable differences in how specific wind conditions affect LDD in different species and habitat types. We suggest that LDD by wind in species from open habitats with high wind dispersal potential is likely to be driven by thermal updrafts that are mainly driven by the sun providing energy to the ground. By contrast, LDD of heavier-seeded species from open and forested habitats is more likely to be driven by storms that produce shear-driven turbulence. The results from this thesis contribute to an increased understanding of the complete dispersal process of plants and to making more realistic projections of (future) plant distribution.
The results obtained on factors driving ripening and release phenology provide valuable insights into their ecological and phylogenetic factor constraints. The implementation of more realistic assumptions in assessing species’ dispersal potential throughout the year could help considerably in improving landscape management (e.g. timing of mowing) and in the conservation of plant populations. The evidence found for phenological adaptations towards LDD in plants is an important step in understanding the evolutionary basis of LDD in these species.
Ischemic injuries of the cardiovascular system are still the leading cause of death worldwide. They are often accompanied by loss of cardiomyocytes (CM) and their replacement by non-functional heart tissue. Cardiac fibroblasts (CF) play a major role in the recovery after ischemic injury and in the scar formation. In the last few years researchers were able to reprogram fibroblasts into CM in vitro and in murine models of myocardial infarction using various protocols including a cocktail of microRNAs (miRs). These miRs can target hundreds of messenger RNAs and inhibit their translation into proteins, potentially regulating multiple cellular signaling pathways. Because of this, there has been a rising interest in the use of miRs for therapeutic purposes. However, as different miRs have different effects in different cells, there is the danger of causing serious side effects. These could be alleviated by enacting a cell-specific transport of miRs, for example by using aptamers. Aptamers are usually short strands of DNA or RNA, which can fold into a specific three-dimensional confirmation which allows them to bind specifically to target molecules. Aptamers are commonly selected from a large library for their ability to bind to target molecules using a procedure called SELEX. Aptamers have already been used to transport miRs into cancer cells.
In this thesis, we first established the transport of miRs into cells of the cardiovascular system using aptamers. MiR-126 is an important part of the signaling in endothelial cells (EC), protects from atherosclerosis and supports angiogenesis, which is why we chose it as a candidate to transport into the vasculature. We first tested two aptamers for their ability to internalize into EC and fibroblasts. Both the aptamer for the ubiquitously expressed transferrin receptor (TRA) and a general internalizing RNA motif, but not a control construct, could internalize efficiently into all cell types tested. We then designed three chimeras (Ch) using different strategies to connect TRA to miR-126. While all chimeras could internalize efficiently, only Ch3, which connects TRA to Pre-miR-126 using a sticky bridge structure, had functional effects in EC. Ch3 reduced the protein expression of VCAM-1 in EC and increased the VEGF induced sprouting of EC in a spheroid-sprouting assay. Treatment of breast cancer cells with Ch3 emulated the effects of treatment with classical miR-126-3p and miR-126-5p mimics. In the SK-BR3 cell line Ch3 and miR-126-3p reduce the viability of the cells while they reduce recruitment of EC by the MCF7 cell line. miR-126-5p had no apparent effect in the SK-BR3 line, but increased viability of MCF7 cells, as did Ch3. This implies that Ch3 can be processed to both functional miR-126-3p and miR-126-5p in treated cells.
We were unable to achieve a reprogramming of adult murine cardiac fibroblasts into cells resembling CM using the cocktail of 4 miRs. This indicates that the miR-mediated transdifferentiation is only possible in neonatal fibroblasts. The effects in mice after an AMI might possibly be caused by an enhanced plasticity of fibroblasts in and close to the infarcted area.
We also screened to find aptamers specifically binding to cells of the cardiovascular system. We used two oligonucleotide libraries in a cell-SELEX to select candidates which bind to CF, but not EC. We observed that only the library which contains two randomized regions of 26 bases showed an enrichment of species binding to fibroblasts. We then sequenced rounds 5-7 of the SELEX and analyzed the data bioinfomatically to select 10 candidate aptamers. All candidates showed a strong binding not only to CF, but also EC. This indicates that the selection pressure against species binding to EC was not high enough and would have to be increased to find true CF-aptamers. Four promising candidates were also analyzed for their potential to be internalized and we surprisingly found that all of them were internalized by EC and CF more efficiently than TRA. The similar behavior of the candidates implies that they possibly share a ligand, which is expressed both by EC and CF, but more prominently by the latter.
This work demonstrates the possibility of using aptamers to transport miRs into cells of the cardiovascular system. It also shows that it is possible to select aptamers for non-cancerous mammalian cells, which has not been done before. It is reasonable to assume that a refinement of the cell-SELEX will allow selection of cell-specific aptamers. Due to the failure of reprogramming of adult fibroblasts into induced cardiomyocytes we were unable to test whether a miR-mediated reprogramming might be inducible using aptamer transported-miRs. Ultimately, aptamer mediated transport of miRs is a feasible and promising therapeutic option for the treatment of cardiovascular diseases and other disorders like cancer.
Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Reading is an essential ability to master everyday life in our society. The ability to read is based on specific connections between brain regions involved in the reading process – so-called cortical networks for reading. These cortical networks for reading allow us to learn the correct identification of visual words. The use of visual words is based on knowledge about the orthography (lexical) and the meaning of words (semantic). This knowledge must be acquired by beginning readers (first grader), i.e. beginning readers learn in a first step to link letters to a whole word and in a second step associate this whole word with meaning. To retrieve this knowledge during visual word recognition (VWR) a cortical network for lexical-semantic process must be activated. However, it is currently unclear whether beginning readers and reading experts activate the same neuronal network during VWR. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the question whether beginning readers (first grader, children) and reading experts (adults) use different cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR.
To address this question we recorded electroencephalographic (EEG) activity during VWR in children and adults. Children and adults were instructed to read a visualizable word to compare this word with a following picture stimulus. The first part of this thesis is concerned with the analysis of ERPs for visual word recognition in children and adults at sensor level. For both groups we observed the typical ERP components P100 and N170 for visual word recognition. These components differed in amplitude and time course between both groups. The second part of this thesis investigated the neuronal generators (brain areas) of ERPs during VWR and possible differences between children and adults at source level. We observed a high overlap in brain areas involved during VWR in children and adults. However, the brain areas differed in activation and time course between children and adults. Finally, the third and most important part of the thesis investigated the question whether children and adults use different cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR over time. To address this question Dynamic Causal Modeling (DCM) and Bayesian model comparison were used. We compared nine biologically plausible cortical network models underlying the ventral lexical-semantic path in VWR. In addition, increasing time intervals were used to consider possible changes of network structure during VWR. The network models included eight brain regions (four bilateral pairs) involved in the lexical-semantic processing in VWR: occipital cortex (OC), temporo-occipital part of inferior temporal gyrus (ITG), temporal pole (TP), and inferior frontal gyrus (IFG). In almost all time intervals we found evidence that children and adults use the same cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR. However, we found differences between adults and children in the connection strengths of the favoured model. Interestingly, we found a stronger direct connection from OC to IFG in adults compared to children.
In conclusion, our results suggest that children and adults activate largely the same lexical-semantic networks during VWR over time. This supports the notion that children and adults use the same biological fiber connections for VWR. However in contrast to children, adults showed increased use of the shortcut pathway from OC to IFG. The increased use of the shortcut pathway from OC to IFG in adults can be interpreted as consequence of learning. Learning causes in accordance with the Hebbian learning rule (“neurons that fire together, wire together” (Hebb, 1949)) synaptic change. Consequently the frequent coactivation of the input and output stage of OC and IFG during the lexical-semantic process facilitates the stronger direct connection between both brain areas. The stronger direct connection from OC to IFG most likely allows adult reading experts to speed up the lexical-semantic process during VWR. Accordingly, we conclude that the stronger direct connections from OC to IFG in adults compared to children underlay the different reading capabilities in both groups.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss sowohl akuter als auch chronischer Aufnahme subletaler Mengen des Insektizids Thiacloprid auf Einzelbienen und Bienenvölker untersucht. Anlass für diese Art an Untersuchungen gibt ein seit Jahren in Nordamerika und Europa auftretendes unerklärliches Phänomen, „Colony Collapse Disorder“ genannt, bei dem Bienenvölker durch einen plötzlichen Verlust der Flugbienen zusammenbrechen. Als Ursache für das Völkersterben stehen neben anderen Faktoren wie Parasiten, Pathogenen und Umweltfaktoren die Insektizide aus der Gruppe der Neonikotinoide und deren Auswirkungen auf Bienen in subletalen Mengen im Verdacht. Basierend auf Studien der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) wurde der zugelassene Einsatz der drei Neonikotinoide Clothianidin, Imidacloprid und Thiamethoxam im Pflanzenschutz für zunächst zwei Jahre durch die EU-Kommission stark eingeschränkt.
Thiacloprid, ein weiteres Insektizid, welches zur Gruppe der Neonikotinoide gehört, ist weiterhin für den Einsatz im Pflanzenschutz zugelassen. Es wirkt in ähnlicher Weise wie die zuvor genannten Neonikotinoide als Agonist am nikotinischen Acetylcholinrezeptor, wobei es jedoch als weniger toxisch für Bienen gilt. Trotzdem sind subletale Auswirkungen dieses Neonikotinoids auf Bienen denkbar, die sich in Verhaltensänderungen der Bienen äußern und als Folge Einfluss auf das gesamte Bienenvolk nehmen könnten.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden in chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern über mehrere Monate regelmäßige Populationsschätzungen durchgeführt, um die Entwicklung der Bienenvölker unter Aufnahme von Thiacloprid festzustellen. In einem weiteren Versuch wurde die Entwicklung der Brut unter chronischer Fütterung mit Thiacloprid beobachtet. Zusätzlich wurde eine große Zahl an Bienen mit RFID-Transpondern ausgestattet, um das Flugverhalten zu dokumentieren. Insbesondere wurden hier der Zeitpunkt des ersten Ausflugs und die Lebensdauer der Bienen zu Vergleichen herangezogen. Nach akuter Fütterung einer subletalen Einzeldosis Thiacloprid wurden Versuche zum Heimkehrvermögen von Bienen durchgeführt.
Unter feldrelevanten und bis zu zehnfach höheren Thiacloprid-Konzentrationen wurden keine beeinträchtigenden Einflüsse auf die Volksentwicklung beobachtet. Bei Konzentrationen, die um ein 25faches bzw. ein 40faches höher als die feldrelevante Konzentration waren, wurde festgestellt, dass die Brutzellenanzahl im Verhältnis zur Bienenanzahl verringert war. Bienen aus chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern starteten mit höherem Alter zu ihrem ersten Flug aus dem Bienenstock. Die Zeit, die die Bienen als Sammlerinnen verbrachten, änderte sich nicht. Durch Beobachtungen der Brutflächen konnte festgestellt werden, dass sich die Brut in Thiacloprid-gefütterten Völkern entsprechend der Brut in Kontrollvölkern entwickelte. Aufgrund weiterer Ergebnisse wurde eine Störung der olfaktorischen Wahrnehmung von Bienen aus Thiacloprid-gefütterten Völkern vermutet. Die akut verabreichte subletale Dosis an Thiacloprid führte zu einem erheblichen Verlust an heimkehrenden Bienen und deutet auf eine Beeinträchtigung des Orientierungs- bzw. Navigationsvermögens der Bienen hin.
In den durchgeführten Versuchen wurden sowohl direkte Auswirkungen von chronischer und akuter Aufnahme subletaler Mengen an Thiacloprid, als auch indirekte Auswirkungen auf Honigbienen beobachtet. Da teilweise erst bei hohen, nicht feldrelevanten Konzentrationen in den Versuchen Effekte beobachtet wurden, kann nur bedingt durch die Verhaltensänderung von Einzelbienen auf daraus resultierende Auswirkungen auf ein gesamtes Bienenvolk unter realistischen Bedingungen geschlossen werden.
Termites are important ecosystem engineers of the savanna biome, with the large mounds of fungus-cultivating termites being sources of habitat heterogeneity and structural complexity in African savanna landscapes. Studies from different localities throughout Africa have shown that termite mounds have a strong influence of diversity and composition of plant communities. However, most research has been conducted only at the local scale, and integrating knowledge across Africa is hampered by different methodology of studies and differing environmental context. Little is known about the variation in vegetation composition on termite mounds compared to the surrounding savanna at the regional scale and at the landscape scale, and the main determinants of plant communities on mounds are yet to be ascertained.
This thesis aimes at better understanding the influence of termite mounds on vegetation compared to the surrounding savanna across spatial scales. Three research projects analyse vegetation data and soil data from paired mound and savanna plots in West Africa. The first project examines the influence of termite-induced heterogeneity on plant diversity and vegetation composition at a regional scale, following a bioclimatic gradient from the Sahel of Burkina Faso to the Sudanian vegetation zone in North Benin. The second Project analysed variation of vegetation on and off mounds at the landscape scale in Pendjari National Park, North Benin. The third is a monitoring study over the course of two years, exploring dynamics of juvenile woody plant communities on mounds and in the surrounding savanna at a local scale. The thesis thus provides the first comparative quantitative analysis across scales of mound and savanna vegetation and the drivers of the mound–savanna difference in vegetation.
Synthesizing across scales, its results confirm that termite mounds strongly contribute to savanna plant diversity, even though mounds are not generally more species rich than the surrounding savanna. Variation in mound vegetation is much higher along climatic and soil gradients than previously acknowledged. Mound vegetation differs from the surrounding savanna in the whole study area and in each sampled savanna type, with the strongest differences occurring at the most humid study sites. A large proportion of the differences between mound and savanna vegetation is explained by clay enrichment and related soil factors, such as cation concentrations. Plants on mounds thus benefit from favourable soil conditions, including higher fertility and higher water availability, which is also mirrored by the higher abundance and basal area of juvenile woody plants found on mounds. The variation in mound vegetation between study sites across scales results in part from local differences in soil composition and from climatic differences that influence the regional distribution of species. Different sets of characteristic mound species are identified in each project. Specific plant families and traits like succulency, lianescence, and adaptations to zoochory are found to be overrepresented in mound communities.
In addition to the findings in this thesis, remaining parts of the variation in mound vegetation between study sites could likely be explained by investigating further factors. Specifically, mound vegetation depends on habitat context, which includes available species pools, spatial distribution of mounds, biotic interactions with dispersers and herbivores, fire, and also anthropogenic influence. The high proportion of species with adaptations to zoochory found on mounds, for example, indicates that animal dispersers should be of particular importance for vegetation on termite mounds. Herbivory and fire regime, which are known to contribute to the diversity and community composition of the mound–savanna system, also show strong local variation, not least because of anthropogenic influence.
In conclusion, termite mounds play a crucial role in maintaining heterogeneity and plant diversity in the savanna across scales. Ecosystem services provided by termites, especially considering long-term effects on soil fertility and ecosystem resilience, are most likely undervalued. Mounds should be considered in management plans from local to regional, transnational scales as a matter of course, accompanied by further research on the role of termite mounds in savanna ecology on a longer temporal scale. The research presented here thus provides a basis for future studies on termite mound vegetation that should specifically consider the biotic and abiotic context of the mound–savanna system.
Die Endometriose ist eine gynäkologische Erkrankung, bei der epitheliale und stromale Zellen des Endometriums Läsionen außerhalb des Uterus bilden, die in ihrem Aufbau dem Endometrium gleichen. Diese Läsionen, sowie deren zyklische Proliferation, führen zu Schmerzen bei betroffenen Frauen. In isolierten, invasiven Epithelzellen (EEC145T) einer Endometriose-Läsion konnte die Expression von Shrew-1 gezeigt werden. Auch in anderen zellulären Zusammenhängen fördert die Expression von Shrew-1 den invasiven Phänotyp. Shrew-1 ist ein Transmembranprotein, das in Epithelzellen mit den Adhärenzverbindungen assoziiert ist und Interaktionen mit β-Catenin und E-Cadherin eingeht. In MCF7-Zellen fördert die Expression von Shrew-1 die EGF-induzierte Internalisierung von E-Cadherin, welche zur Verminderung der Zell-Zell-Adhäsion führt. In 12Z- und HT1080-Zellen konnte eine Interaktion mit CD147 gezeigt werden. CD147 fördert die Aktivität von MMPs und in Shrew-1-überexprimierenden HT1080-Zellen konnte eine erhöhte Aktivität der MMP9 gezeigt werden. Shrew-1 wirkt somit auf die Invasivität von Zellen und ist gleichzeitig Teil der Adhärenzverbindung. Aus diesem Grund wird Shrew-1 eine modulatorische Rolle in diesem Kontext zugeschrieben.
In immunhistologischen Färbungen von Shrew-1 und E-Cadherin konnte in Adenomyose-Läsionen eine inverse Expression der beiden Proteine in einigen epithelialen Zellen gezeigt werden, die im Endometrium nicht detektiert werden konnten. In den epithelialen Endometriose-Zelllinien 12Z und 49Z, die kein E-Cadherin exprimieren und äquivalent zu der Zelllinie EEC145T sind, führte die Herunterregulation von Shrew-1 (Shrew-1 KD) zur Reexpression von E-Cadherin. E-Cadherin ist in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen an der Plasmamembran lokalisiert und interagiert mit β-Catenin, wodurch seine Assoziation mit den Adhärenzverbindungen wahrscheinlich ist. Die Herunterregulation von Shrew-1 führt zu einer verminderten Motilität und Invasivität der 12Z-Zellen, wobei die reduzierte Invasivität nicht alleine auf die Reexpression von E-Cadherin zurückgeführt werden kann. Es ist zu vermuten, dass das verminderte invasive Verhalten mit der ausbleibenden Interaktion von Shrew-1 mit CD147 zusammenhängt, welches die Aktivität von MMPs fördert.
Da Shrew-1 eine direkte Interaktion mit β-Catenin eingehen kann, ist es möglich, dass die Herunterregulation von Shrew-1 zu Veränderungen in der Lokalisation von β-Catenin und weiteren Proteinen, die mit den Adhärenzverbindungen assoziiert sind (p120 Catenin und Aktin), führen. Dies konnte jedoch nicht beobachtet werden. Eine verstärkte Lokalisation von Vinculin an den Enden von Aktin-Stressfasern sowohl in Zellausstülpungen als auch an Zell-Zell-Kontakten konnte in 12Z-Zellen nach der Herunterregulation von Shrew-1 beobachtet werden. Dies könnte eine Folge der E-Cadherin-Reexpression oder entscheidend für die Lokalisation von E-Cadherin an der Membran sein.
Die Reexpression von E-Cadherin, die in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden kann, erfolgt in den 12Z-Zellen vermutlich hauptsächlich über Veränderungen von Histon-Acetylierungen, da die Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor TSA die Expression von E-Cadherin in den 12Z-Zellen induziert. Eine verstärkte H3K9-Acetylierung am CDH1-Promotor konnte in ChIP-Analysen in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen gezeigt werden. Die gesteigerte Acetylierung resultiert vermutlich aus der verminderten Assoziation von HDAC1 und HDAC2 mit dem CDH1-Promotor in diesen Zellen. Eine Beteiligung der Repressoren Snail, Slug, Twist und ZEB1 an der Reexpression von E-Cadherin in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen konnte nicht gezeigt werden. Ebenso scheinen Veränderungen am Methylierungsstatus des CDH1-Promotors nach der Herunterregulation von Shrew-1 nicht zu erfolgen.
TSA induziert auch in weiteren epithelialen Endometriose-Zelllinien (10Z und 49Z) die Expression von E-Cadherin. In stromalen Zellen führt hingegen weder TSA noch die Herunterregulation von Shrew-1 zur Expression von E-Cadherin (17B, 18B und 22B). Dies weist darauf hin, dass die Herunterregulation von Shrew-1 über die Veränderungen von Histon-Acetylierungen wirkt und dass dieser Mechanismus in epithelialen Endometriose-Zellen entscheidend ist. In den stromalen Zellen muss die Expression von E-Cadherin über einen anderen und/oder weitere Mechanismen blockiert sein.
Auch der Wnt-Signalweg scheint an der Reexpression von E-Cadherin in 12Z-Zellen beteiligt zu sein. Die Inhibierung der GSK3β (LiCl und SB216763) führt zur Expression von geringen Mengen an E-Cadherin. In 12Z Shrew-1 KD-Zellen führt die Stabilisierung von Axin (XAV939) zur verminderten Expression von E-Cadherin. Dies lässt darauf schließen, dass Shrew-1 auch einen Einfluss auf den Wnt-Signalweg hat, was vor allem durch dessen Interaktion mit β-Catenin wahrscheinlich ist.
Terrestrische Säugetiere werden von unterschiedlichen Parasiten als Wirte genutzt. Dabei kann ihre Parasitenfauna je nach Art, Lebensweise, Verbreitung, Gesundheitszustand und Reproduktionsstatus des Wirts abweichen. Ein weiterer bestimmender Faktor, ist der Einfluss des Menschen in Form von Regulierungsmaßnahmen und Schaffung urbaner Lebensräume. Domestizierte Haustiere bzw. Nutztiere weisen daher in der Regel andere Parasiten auf als ihre wildlebenden Artgenossen. Gleichzeitig können sich sowohl Wildtiere als auch domestizierte Tiere und Menschen gegenseitig Parasitenarten teilen und wechselseitig aufeinander übertragen. Daraus resultierende Krankheiten werden als Zoonosen bezeichnet.
Insbesondere Fledermäuse (Unterordnung Microchiroptera) zeigen weltweit eine enorme Parasitendiversität, die noch weitgehend unerforscht ist. Ebenfalls Forschungsbedarf besteht für die Sandfloh-Gattung Tunga in Süd- und Mittelamerika in Hinblick auf ihr Wirtsspektrum, welches auch Menschen einschließt. Die Art Tunga penetrans und zahlreiche weitere Parasitenarten, parasitieren gleichzeitig auch bei Hunden. Daher stellen diese Wirte eine direkte Gesundheitsgefahr für Menschen in ihrer unmittelbaren Umgebung dar.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form zusammengefasst und beinhaltet drei Einzelpublikationen sowie einen Reviewartikel.
Ziel war es, die Parasitendiversität von Hunden aus urbanen tropischen Gebieten und die Parasitendiversität des Großen Ameisenbären (Myrmecophaga tridactyla) mit Hilfe morphologischer und molekularbiologischer Methoden zu analysieren. Die jeweiligen Parasitenfaunen wurden in Hinblick auf die soziale bzw. solitäre Lebensweise der beiden Wirtsarten verglichen und ihr zoonotisches Potenzial bewertet.
Ein weiteres Ziel war die Zusammenfassung der Ektoparasitennachweise süd- und mittelamerikanischer Microchiroptera und für die europäischen Arten der Fledermaus-Gattung Myotis (hier Endo- und Ektoparasiten) auf Basis der verfügbaren Literatur. Des Weiteren sollten eigene Parasitennachweise aus Bolivien bzw. Deutschland erfolgen. Für die Nachweise aus Deutschland wurden M. myotis untersucht, deren Artzugehörigkeit vorher bestimmt wurde. Zusätzlich wurden diese Individuen auf humanpathogene Lyssaviren untersucht.
Die Nachweise erfolgten über molekularbiologische und morphologische Methoden.
Vascular tumors associated with chronic B. henselae infections are unique examples of infection-associated pathological angiogenesis. The chaotic vascular architecture and prominent myeloid infiltrate of B. henselae induced vascular lesions show many similarities with malignant tumors.
In human cancers infiltrating myeloid cells play a decisive role in tumor progression and vascularization. In particular, tumor associated macrophages (TAMs) transform the tumor microenvironment, drive tumor invasion and vascularization through secretion of pro-angiogenic and immune modulatory cytokines and participation in matrix remodeling processes.
Myeloid angiogenic cells (MACs) are a subset of circulating myeloid progenitors with important roles in regenerative and pathological angiogenesis and a critical involvement in tumor vascularization. The phenotypic plasticity and importance of MACs in pathological angiogenic processes, position these cells as key potential players in B. henselae associated vascular tumor formation.
To investigate the possible role of MACs in B henselae induced pathological angiogenesis, the objective of this study was to examine the interaction of B. henselae with MACs and determine how this may affect their angiogenic capacity.
Building on previous work by Mӓndle (2005) this study has demonstrated that MACs are susceptible to infection with B. henselae and reside in intracellular vacuoles. As in endothelial cells, infection of MACs with B. henselae was associated with inhibition of apoptosis and activation of endogenous angiogenic programs including activation of the angiogenic transcription factor HIF-1.
In addition to angiogenic re-programming on a molecular level B. henselae infection increases MAC functional angiogenic capacity. B. henselae infected MACs were found to integrate into growing endothelium and increase the rate of angiogenic sprouting in a paracrine manner.
When cultured in a Matrigel capillary formation assay, infected MACs were also found to form networks of capillary-like structures that were stable over long periods of time. The B. henselae pathogenicity factor BadA was essential for the induction of this vascular mimicry phenotype as well as the activation of HIF-1 in infected MACs indicating that this factor may play an important role in MAC angiogenic re-programming.
Examination of infected MACs via FACS analysis, cytospin immunohistochemistry and qRT-PCR revealed that endothelial differentiation does not play a role in the B. henselae induced pro-angiogenic phenotype. Instead, MACs were shown to be myeloid in phenotype displaying typical macrophage markers which were upregulated upon B. henselae infection and maintained over long-term culture.
The increased angiogenic activity of B. henselae infected MACs was found to be associated with a broad phenotypic reprogramming in infected cells. In particular, gene expression programs related to angiogenesis, structural organization, apoptosis, sterol metabolism and immune regulation, were upregulated. Further examination of microarray gene expression profiles revealed that B. henselae infected MACs display a predominantly M2 anti-inflammatory macrophage activation status.
Finally, examination of the paracrine microenvironment created by B. henselae infected MACs revealed a diverse cytokine secretion profile dominated by inflammatory-angiogenic cytokines and matrix remodeling elements and lacking expression of some of the most important cytokines involved in the expansion of the inflammatory response. This B. henselae induced activation status was demonstrated to be distinct from the general inflammatory response induced by E. coli LPS treatment.
Comparison of B. henselae infected MACs to TAMs revealed many parallels in functional and phenotypic characteristics. Both TAMs and B. henselae infected MACs demonstrate increased angiogenic capacity, invasive, and immune modulatory phenotypes and the ability to participate in the formation of vascular mimicry phenotypes under angiogenic pressure. Furthermore, the pro-angiogenic paracrine microenvironment created by B. henselae infected MACs shows many similarities to the TAM-created tumor-microenvironment.
In conclusion, these investigations have demonstrated that the infection of MACs with B. henselae results in the phenotypic re-programming towards TAM-like cells with increased pro-angiogenic, invasive and immune-modulatory qualities. The results of this study elucidate new aspects of B. henselae pathogenicity in myeloid cells and highlight the role of these cells as paracrine mediators of B. henselae induced vascular tumor formation. In addition, these findings demonstrate that manipulation of myeloid cells by pathogenic bacteria can contribute to microenvironmental regulation of pathological tissue growth and suggest parallels underlying bacterial infections and cancer.
Die Substitution von klassischen, mit der Nahrungsmittelproduktion in Konkurrenz stehenden, Substraten wie Glukose durch alternative Kohlenstoffquellen in der Biotechnologie ist sowohl aus ethischer, als auch aus ökonomischer Sicht erstrebenswert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von Bulkchemikalien in Form zweier Dicarboxylsäuren und einer Feinchemikalie in Form eines Sesquiterpens aus dem alternativen Substrat Methanol mit Hilfe genetisch veränderter Stämme des methylotrophen α-Proteobakteriums Methylobacterium extorquens.
Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure sind Dicarboxylsäurederivate der CoA-Ester Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA, die als Intermediate im Ethylmalonyl-CoA- Weg (EMCP) vorkommen. M. extorquens nutzt den EMCP für die Regeneration von Glyoxylat, das für das Wachstum auf C1-Substraten wie Methanol obligatorisch ist. In dieser Arbeit konnte erstmals Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure de novo durch die Expression einer für die Vorstufen Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA aktiven Thioesterase produziert werden. Ein kobaltlimitiertes Wachstum von M. extorquens führte aufgrund mangelnder Cofaktorversorgung zweier Vitamin-B12-abhäniger Mutasen im EMCP zu einer Akkumulation der beiden CoA-Ester-Vorstufen, womit eine Produktion von 0.65 g/l Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure erreicht wurde. Weitergehende Untersuchungen belegten außerdem einen positiven Effekt eines ausgeschalteten PHB-Zyklusses auf die Produktion der beiden EMCP- Dicarboxylsäurederivate.
Diese Arbeit beinhaltet zusätzlich grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen zur Substitution der EMCP-katalysierten Glyoxylatregeneration durch einen heterologen Glyoxylatzyklus in EMCP-negativen M. extorquens-Stämmen. Dabei konnte erstmals ein methanolverwertendes, methylotrophes Bakterium identifiziert werden, das einen Serin-Zyklus in Kombination mit dem Glyoxylat-Zyklus zur Kohlenstoffassimilation verwendet, ohne dabei zusätzliche Stoffwechselwege zur CO2-Fixierung wie den EMCP, RuMP oder CBB-Zyklus zu verwenden.
Die Präsenz einer nativen C30-Carotinoidbiosynthese, ausgehend von der Vorstufe Farnesylpyrophosphat (FPP), empfiehlt M. extorquens als Produktionsorganismus für (Sesqui-)Terpene. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer induzierbar gesteuerten Expression einer Terpensynthase in Form einer α-Humulen-Synthase, einer FPP-Synthase und eines prokaryontischen Mevalonatweges, erstmals die de novo Synthese eines Terpens aus Methanol am Beispiel des α-Humulens etabliert. Durch optimierte Expressionen der Terpensynthase, FPPS und einzelner MVA-Gene mit Hilfe angepasster Translationsinitiationsraten der jeweiligen ribosomalen Bindestellen und der Verwendung eines in der nativen Carotinoidbiosynthese inhibierten M. extorquens-Stammes wurden finale Produkttiter von bis zu 1.65 g/l α-Humulen in Fed-Batch-Fermentationen erreicht.
Diese kumulative Dissertation beinhaltet außerdem einen Reviewartikel, in dem der verwendete Mikroorganismus M. extorquens in mikrobiologischer, genetischer, biochemischer und auch biotechnologischer Hinsicht ausführlich beschrieben wird. Zudem gibt ein Buchkapitel eine Übersicht über die Verwendung von Methanol in der Biotechnologie.
The brain vascular system is composed of specialized endothelial cells, which regulate the movement of ions, molecules and cells from the blood lumen to the central nervous system (CNS). Endothelial cells in the brain form the blood-brain barrier (BBB) that is essential to maintain the brain homeostasis and protect the CNS from pathogens and toxins for a proper neurological function. Endothelium together with other cellular components such as pericytes, astrocytes and the basement membrane, forms the neurovascular unit (NVU), the structural unit of the BBB. Breakdown of the BBB occurs in various neurological disorders, leading to edema and neuronal damage. Therapeutic strategies focusing on factors that regulate the permeability of the BBB may help to improve neurological disorders and facilitate drug delivery to the brain.
Angiopoietins (Ang) are potential candidates for therapeutic targeting the BBB due to their role in regulating the vascular permeability in periphery. They are key growth factors that control angiogenesis and vessel maturation. Ang-1 and Ang-2 possess similar binding affinities to the Tie2 receptor tyrosine kinase, which is almost exclusively expressed on endothelial cells. Ang-1 is expressed in smooth muscle cells and pericytes, and binds in a paracrine manner to Tie2. This results in phosphorylation of the receptor and induction of downstream signaling pathways leading to vessel maturation via pericyte recruitment and blood vessel stabilization. Ang-2, on the other hand, is stored in Weibel Palade bodies in endothelial cells and is released upon inflammatory or angiogenic stimuli. Therefore, in mature, stabilized blood vessels, Ang-2 expression is low. Increased level of Ang-2 is only observed during development or in pathology such as ischemia, cancer and inflammation. When Ang-2 is released, it acts in an autocrine manner and interferes with Tie2 phosphorylation in a context-dependent way. Antagonizing the receptor results in de-stabilization of the vessels, often accompanied by reduced numbers of pericytes leading to myeloid cell infiltration. In conjunction with the vascular endothelial growth factor (VEGF), Ang-2 contributes to blood vessel sprouting, whereupon in absence of VEGF it promotes vessel regression. ...
Cyanobacteria belong to the most widely distributed microorganisms in the biosphere and contribute significantly to global primary production. Their metabolism is based on oxygenic photosynthesis and some cyanobacteria can fix elemental nitrogen. Obligate photosynthetic diazotrophs have a particularly high iron demand in comparison to heterotrophic bacteria. Nevertheless the understanding of iron acquisition in cyanobacteria is just beginning to emerge. Iron acquisition in bacteria comprises highly specific transport of siderophore-iron complexes over the outer membrane by TonB-dependent transporter (TBDT). The transport itself is active and energized by a multi-complex localized to the inner membrane termed the TonB-system (TonB-ExbB-ExbD). The siderophore-iron complexes are further transported into the cytosol by a binding protein dependent ABC-transporter. Cyanobacterial iron acquisition response has most extensively been studied in unicellular, non-siderophore synthesizing cyanobacteria in the genus Synechococcus and Synechocystis. Anabaena sp. PCC 7120, however, is a different model organism as it is a freshwater living, siderophore synthesizing and, truly multicellular microorganism. It can be assumed that siderophore synthesis and siderophore-dependent iron uptake are tightly coordinated processes, therefore Anabaena represents a different model organism as compared to non-siderophore producing cyanobacteria. Moreover the surprisingly abundant protein family of 22 putative TBDTs in Anabaena indicates a high complexity of TonB-dependent uptake systems. Sequence similarity analysis revealed 4 putative tonB encoding genes (alr0248, all3585, all5036, alr5329), 2 putative exbB-exbD encoding gene cluster (alr0643-alr0644, all5047-all5046), one single standing putative exbB encoding gene (alr4587) and several hypothetical binding-protein-dependent ATP binding cassette (ABC)-type transporter encoding genes (fhu-, fec- and fut-type transporter).
In this study the respond of the predeicted systems to iron-limiting conditions was analysed by qRT-PCR. The expression analysis revealed on the one hand an enhanced transcription of all5036 (tonB3), all5047-all5046 (exbB3-exbD3) and the fhu-like encoding genes (all0387-all0389) under iron-limitation and at the same time down-regulation of expression under enhanced iron concentrations. Summerizing the transcription profile of the tonB3- and the fhu-system showed an expression regulated by iron-availability. To further characterize the role of TonB3-, ExbB3- and the Fhu-system, mutants thereof were generated. None of the generated mutants, except for the exbB3 mutant, could be fully segregated, suggesting an essential character of the genes. Characterization of the mutants revealed enhanced expression of iron-starvatrion indicator genes (isiA, fhuA) and altered growth of the tonB3 mutant under iron-limiting conditions. The iron starvation phenotype was further strengthened by enhanced siderophore secretion in the tonB3, exbB3 and fhuC mutants. Taken as a whole the results strongly indicate involvement of the tonB3- and the fhu-system in siderophore-dependnet iron uptake in Anabaena.
Investigation of the tonB2 (all3585) mutant under iron and citric acid limitation resultated in altered growth of the mutant. However, growth could be restored by addition of iron chlorid. Therefore a connection of the TonB2 protein to iron uptake is implied and further supported by ressitance to toxic iron concentrations. Lastly, mutation of tonB1 (alr0248) reuslted in insensibility to toxic manganese and copper concentrations and macrolid antibiotics. The altered permeability of the outer membrane may be a result of decreased expression of seven putative porin encoding genes in the mutant. A possible role in transcriptional regulation of porin expression is discussed.
In der vorliegenden Doktorarbeit zur Untersuchung der Rolle der Superoxid-Dismutasen in P. anserina lieferten die durchgeführten Analysen folgende Ergebnisse:
1)Sowohl in P. anserina als auch in S. cerevisiae wurde eine gemeinsame Regulation von SODs nachgewiesen: Stämme, die die mitochondriale MnSod (PaSod3 bzw. ScSod2) überexprimieren zeigen eine erhöhte Cu/ZnSOD-Aktivität (PaSOD1 bzw. ScSOD1).
2)Es konnte keine SOD-Aktivität für die putativen SODs Pa_1_10620, Pa_1_10630 und Pa_1_6300 detektiert werden. Für Pa_1_10620, dessen Überexpression unter Standardbedingungen zu einer Lebensverlängerung führt, wird eine Funktion als mitochondriales ribosomales Protein angenommen.
3)Der ∆PaSod3-Stamm weist keinen Unterschied im Phänotyp, der Wuchsrate und der Lebensspanne unter Standardbedingungen zum Wildtyp auf. Paraquat-Stress führt allerdings zu einer Kurzlebigkeit des ∆PaSod3-Stammes, wohingegen diese Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid aufweist als der Wildtyp.
4)Transkriptomanalysen des Wildtyps und der ∆PaSod3-Mutante lassen vermuten, dass eine Hochregulation von Detoxifizierungs- und Energie-abhängigen Prozessen die durch den Verlust der mitochondrialen PaSOD3 vermuteten negativen Auswirkungen kompensieren.
5)PaSod3_OEx-Stämme weisen unter Standardbedingungen aufgrund der erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Menge, bedingt durch die vermehrte Umsetzung von Superoxid, diverse negative Auswirkungen auf: Eine reduzierte Wuchsrate, verkürzte Lebensspanne, geringere Fertilität, stärkere Pigmentierung, vermehrt fragmentierte Mitochondrien, mehr unprozessierte mitochondriale Proteine und weniger Komplex IV der Atmungskette als der Wildtyp. Zusätzlich wird vermehrt über die alternative Oxidase geatmet, um die ROS-Generierung zu reduzieren.
6)Oxidativer Stress in Form von Paraquat führt in PaSod3_OEx-Stämmen zu einer weiteren Verkürzung der medianen Lebensspanne, während die maximale Lebensspanne von PaSod3_OEx3-Stämmen im Vergleich zum Wildtyp sogar verlängert ist. Wasserstoff-peroxid resultiert in stark verringerten medianen und maximalen Lebensspannen beider PaSod3-überexprimierenden Stämme.
7)Die Anzucht auf Medium mit zusätzlichem Mangan (80 µM MnSO4) kann die beobachteten Defekte der PaSod3_OEx-Stämme fast vollständig auf Wildtyp-Niveau revertieren: Die Wuchsrate, die Lebensspanne, der Phänotyp, die Mitochondrien-morphologie, die Prozessierung mitochondrialer Proteine und die Atmung entsprechen dem Wildtyp. Lediglich die Fertilität erreicht nicht das Wildtyp-Niveau. Diese positiven Effekte von Mangan werden erzielt, da die erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge in PaSod3_OEx-Stämmen entsprechend ihrer Entstehung detoxifiziert wird, denn Mangan führt zu einer gesteigerten Transkription bzw. Aktivität von Katalasen und Peroxidasen sowie zu einer erhöhten Peroxiredoxin-Menge.
8)Die Anzucht des Wildtyps unter Wasserstoffperoxid-Stress resultiert in einer Lebens-spannenverkürzung. Diese kann durch Supplementation mit Mangan revertiert werden. Unter diesen Bedingungen weisen u. a. Peroxidasen eine erhöhte Aktivität auf.
Insgesamt ließen die gewonnenen Daten den Schluss zu, dass das Genom von P. anserina für drei aktive SODs kodiert. Ein Verlust der einzigen mitochondrial lokalisierten SOD kann durch die Induktion von Energie-abhängigen Prozessen sowie von Detoxifizierungsprozessen kompensiert werden. Ferner weisen die durchgeführten Studien darauf hin, dass PaSod3_OEx-Stämme als Modell für erhöhte intrazelluläre Wasserstoffperoxid-Mengen in P. anserina verwendet werden können. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen Mangan und dem Detoxifizierungs-netzwerk in P. anserina nachgewiesen. Dabei können zwei Mechanismen zur Reduktion der Wasserstoffperoxid-Mengen unterschieden werden: Bei Vorhandensein ausreichender Mengen Mangan kommt es zu einer stärkeren Detoxifizierung von Wasserstoffperoxid. Ist Mangan allerdings limitiert und die Detoxifizierung kann nicht gesteigert werden, wird eine Umstellung der Atmung eingeleitet, um die neu entstehende ROS-Menge zu minimieren.
Snake bite envenoming often results in disability or death of breadwinners of poor families in the rural tropics and the subtropics of Nepal. Identification of the medically relevant snake species, circumstances of venomous snake bites, prehospital care of their bites and human responses to snakes and snake bite is, therefore, crucial to enable victims or first aider to select the appropriate first aid measures, physicians to anticipate complications and to use appropriate treatment protocols as well as the local community to implement prevention strategies. Inadequate educational gaps exist in Nepal and hinder identification of snakes involved in bites. To fill this gap, I aim to provide an evidence-based list of medically relevant snake species. Snake specimens brought by patients bitten or their attendants from the tropical and subtropical regions in southeastern, southcentral, and southwestern Nepal to snake bite treatment centres over a period from 2010 through 2014, were taxonomically identified and medical records of envenoming were evaluated.
In Nepal, the epidemiology of snake bite is poorly known. Here I describe the ecological circumstances of proven krait (Bungarus spp.) and Russell´s Viper (Daboia russelii) bites to elucidate and examine, whether environmental circumstances or human behaviour contributed to envenoming. In a cross-sectional study, data about prehospital care, environmental circumstances of 46 krait and 10 Russell´s Viper bites were evaluated. Patients were interviewed using structured interview forms. Snake bite prone communities were surveyed to test people´s knowledge on snakes and their attitude towards venomous snakes in general.
Of 349 snakes involved in bites, 199 (57%) specimens were found to be medically relevant venomous snakes that included 11 species belonging to six genera and two families. Among them, Naja naja (n = 76, 22%), Bungarus caeruleus (n = 65, 19%) and Trimeresusurs albolabris (n = 10, 3%) were the most widely distributed snakes. Daboia russelii (n = 10, 3%) was found to be restricted to the southwestern part of Nepal. For B. walli, a previously poorly known species, 13 voucher specimens represent the first country records of this species as well as the first documented cases of involvement in snake bite envenoming by this species in Nepal.
Numerous snake bites (33%) occurred at night, during the rainy season, and are mainly due to Bungarus species, particularly B. caeruleus. Bites of cobras and Russell’s Vipers are a risk at daytime. Evaluation of data regarding the place where the bite happened, indicates that the snake bite risks appear to be as high in residential areas, in and around houses, as in rural areas. In cases of kraits (n = 46), 61% of the bites occurred while the victim was sleeping indoors, those of Russell´s Vipers mainly during agricultural activities in the fields. Analysis of socio-demographic data revealed that both krait and viper bites predominantly affected farmers or their family members. However, snake bites involved also people of higher socio-economic status, which suggests that it is not a health problem of poor people only living in the rural areas of Nepal.
A small number of snake bite victims (n = 7) sought help from traditional healers, but most patients went to hospitals for medical treatment using motorbikes (65%) or were transferred by ambulance cars (22%). As a first aid measure, most patients (78%) had used a tourniquet, which is of doubtful value and has often severe sequelae, instead of applying the WHO recommended pressure immobilisation bandage or local compression pad. The overall case fatality rate was calculated to be 10%, but up to 17% in cases of Bungarus spp. bites.
Rural community people were found to be extremely afraid of snakes, a major reason for indiscriminate killing of even harmless snakes, e.g., Lycodon aulicus, which were wrongly considered to be venomous. This is mainly due to the poor knowledge on snakes in general and on their role in providing ecological services, which may eventually lead to a decline in snake populations and even the extinction of rare species.
The results of the present study strongly emphasize that snake bite is an important public health issue in Nepal. There is an urgent need to improve the knowledge of people on snakes and to try changing their attitudes towards these reptiles, in addition to documenting the biodiversity and distribution of medically relevant snakes, the epidemiology and circumstances of their bites. Avoiding high-risk behaviour (e.g., killing of snakes), using screened doors and windows are some of the suggested measures preventing snake bite. Early and accurate identification of the snakes involved should help physicians to apply timely treatment, eventually referring the patient to the appropriate hospital. This also has important implications in developing public health and conservation strategies, to the benefit of the people of Nepal.
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Die Parkinson Erkrankung ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung in industrialisierten Ländern. Die charakteristischen Symptome sind schwere Beeinträchtigungen des Bewegungsablaufes welche auf den Verlust dopaminerger Neurone der Substantia nigra und der damit einhergehenden Reduktion des striatalen Dopamin Gehaltes zurückzuführen sind. Alpha-Synuklein (SNCA) ist ein Protein welches zum einen mit sporadischen aber auch mit idiopathischen Erkrankungen assoziiert ist. Mutationen welche einen Funktionsgewinn von SNCA zur Folge haben konnten mit autosomal dominanten Varianten der Parkinson Erkrankung assoziiert werden und genetische Veränderungen an beiden Genenden agieren als Risikofaktor für sporadische Formen der Erkrankung. Des Weiteren wird SNCA als Hauptbestandteil der Lewy Körperchen gefunden, einem pathologischen Kennzeichen der parkinsonschen Erkrankung. Die charakteristischen Bewegungsstörungen können mittels L-DOPA, einer metabolischen Vorstufe von Dopamin, behandelt werden. Neben dem enorm positiven Effekt auf die Bewegungsstörungen, geht die Behandlung mit L-DOPA jedoch auch mit ernsten Nebenwirkungen einher, welche als Levodopa induzierte Dyskinesien (LID) beschrieben werden.
Ziel der Arbeit war die Analyse von Effekten eines SNCA Funktionsgewinns sowie des Pink1 Funktionsverlustes auf molekulare Signalwege der synaptischen Plastizität unter Verwendung dreier PD Mausmodelle (A53T-SNCA überexprimierendes Modell (PrPmtA), Pink1KO Modell sowie A53T-SNCA + Pink1KO Doppelmutante (DM)). Es wurden Kandidatengene welche eine Rolle für synaptische Plastizität spielen in 6 Monate alten Mäusen aller drei PD Mauslinien untersucht. Die Analyse von PrPmtA zeigte erhöhte mRNA Spiegel von Glutamatrezeptor-Untereinheiten und von Kandidatengenen welche eine Rolle bei der synaptischen Signalweiterleitung spielen, sowie reduzierte mRNA Spiegel von IEGs und Transkriptionsfaktoren. Die Analyse der DM zeigte nur geringe Expressionsänderungen der Glutamatrezeptor-Untereinheiten und die Analyse von IEGs und Transkriptionsfaktoren zeigte erneut reduziert mRNA Spiege. In Pink1KO Tieren konnten nur minimale Expressionsveränderungen der Kandidatengene gefunden werden, was den Schluss zulässt, dass die zuvor beschriebenen Expressionsveränderungen in PrPmtA und DM Mäusen eindeutig auf den SNCA Funktionsgewinn zurückzuführen sind. Um frühe Effekte des SNCA Funktionsgewinns zu studieren wurde die Analyse auf 3 Monate alte PrPmtA Mäuse ausgeweitet. Diese ergab, Expressionsveränderungen für Homer1, cFos, NOR1, Nurr1 und Nur77.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde die Auswirkung des SNCA Funktionsgewinns auf das Verhalten sowie auf molekulare Parameter nach Apomorphin Behandlung analysiert. Die Analyse ergab ein erhöhtes Niveau an unwillkürlichen Bewegungsmustern mit stereotypen und dystonischen Eigenschaften in PrPmtA im Vergleich zu Wildtypen (wt). Die molekulare Analyse von striatalem Gewebe wurde zu zwei Zeitpunkten durchgeführt, 30 min nach Apomorphin Injektion und 100 min nach Injektion. Die Analyse von striatalem Gewebe welches zum Zeitpunkt 30 min nach Injektion entnommen wurde ergab eine erhöhte Apomorphin abhängige Phosphorylierung von ERK1/2, sowie eine erhöhte Apomorphin abhängige Expression von Dusp1, Dusp6 und cFos in transgenen und wt Tieren. Genotyp abhängige Unterschiede ergaben sich für cFos, welches signifikant höher in PrPmtA induziert wurde. 100 min nach Apomorphin Injektion ergab die gleiche Analyse eine erhöhte Apomorphin abhängige Phosphorylierung von ERK1 und eine erhöhte Apomorphin abhängige Expression von Dusp1, Dusp6, cFos und Nur77 in PrPmtA im Vergleich zu wt. Die Daten unterstreichen die fundamentale Rolle von SNCA auf die Neurotransmission und synaptische Plastizität und zeigen auf, dass PrPmtA ein zuverlässiges Modell für die Analyse von präsynaptischer Dysfunktion in Frühstadien der Parkinson Erkrankung darstellt.
Der letzte Versuchsansatz stellt die Charakterisierung des DM-Mausmodells welches sich durch einen starken Phänotyp auszeichnet, sowie die Analyse des Pink1 Effektes auf die SNCA induzierte Neurotoxizität dar. DM-Tiere zeigen deutlich reduzierte Spontanmotorik im Alter von 3 Monaten sowie einer progressiven Lähmung der Hinterläufe, was Anlass zu einer immunhistologischen Charakterisierung mittels Schnitten des Gehirns und Rückenmarks gab. Die histologische Analyse zeigte pSer129-SNCA, p62/SQSTM1 und Ubiquitin positive Aggregate innerhalb der grauen Substanz des Rückenmarks sowie innerhalb einer neuronalen Zellpopulation welche dorsal der Substantia nigra angeordnet ist. Das histologische Erscheinungsbild wurde spezifisch in gelähmten DM-Tieren gefunden und nicht in Einzelmutanten oder DM-Tieren ohne Lähmung. Dieses Modell stellt ein wertvolles Instrument für die Identifizierung von pathologischen Mechanismen und Signalkaskaden welche beiden Parkinson relevanten Genen gemeinsam sind, dar.
Die vorliegende Dissertation mit dem Titel: Ecophysiological monitoring of Oaks in Central Europe, introduced in the framework of proactive climate change mitigation beschäftigt sich mit der Anwendung zerstörungsfreier, radiometrischer Methoden zur Bestimmung von Pigment- und Stickstoffkonzentrationen und der photosynthetischen Funktionalität in Blättern von heimischen und gebietsfremden Eichen und ihre Beeinflussung durch Trocken-, Hitze- und Kältestress.
Die Eichenarten Quercus robur L. (Stieleiche), Q. pubescens Willd. (Flaumeiche), Q. frainetto Ten. (Ungarische Eiche), Q. ilex L. (immergrüne Steineiche) und Q. rubra L. (amerikanische Roteiche) wurden im Frühjahr 2011 auf einer Versuchsfläche im Frankfurter Stadtwald gepflanzt, um ihre Nutzung als potentielle Waldbäume in einem sich ändernden Klima zu untersuchen. Über eine Dauer von zwei Jahren wurden diese Arten mit einem hohen Maß an blattspezifischer Merkmalsvariabilität beobachtet und beprobt. Ziel war es, die interspezifischen Unterschiede und die jahreszeitliche Dynamik von morphologischen und chemischen Blattmerkmalen sowie die Beeinflussung der radiometrischen Bestimmung des Chlorophyllgehaltes (und damit assoziierten Komponenten wie z.B. Blattstickstoffgehalt und Karotinoiden) und der photosynthetischen Funktionalität durch klimatische Umweltbelastungen in Eichen zu untersuchen. Die Analyse der Blattproben zielte neben der Bestimmung der Beziehung zwischen absoluten und optisch ermittelten Pigmentgehalten auf die Ermittlung des Einflusses der Blattstruktur auf die Lichttransmission im roten und infrarotem Bereich des Elektromagnetischen Spektrums ab, sowie auf die artspezifische Korrelation von Blattstickstoff zu Blattchlorophyll zu dessen indirekte Quantifizierung. Des Weiteren wurden Versuche zur Trocken- und Hitzestressanpassung durchgeführt, um eine potentiell artspezifische Stressantwort, sowie eine mögliche Beeinflussung der aufgenommenen radiometrischen Messwerte zu ermitteln. Ein zusätzliches Monitoringprogramm im Winter 2012/2013 mit einer Dauer von sechs Monaten ermöglichte die Überprüfung der Anpassungsfähigkeit der immergrünen Steineiche (Q. ilex) an mitteleuropäische Winterbedingungen und die Veränderung der photosynthetischen Funktionalität unter Kältestress. Messungen im Zusammenhang mit der praktischen Anwendbarkeit der zerstörungsfreien, optischen Methode und zur Bereitstellung von Referenzdaten für zukünftige Evaluierungen komplementieren die Untersuchungen.
Signifikante, artspezifische Unterschiede wurden in den blattmorphologischen Schlüsselmerkmalen in den Quercus-Arten ermittelt. Die artspezifischen Unterschiede in den morphologischen Blattmerkmalen beeinflussten auf signifikante Weise die Beziehung zwischen absoluten, massebasierten Pigment- und Stickstoffgehalten und deren radiometrischen Bestimmung. Wurden die Pigmentgehalte hingegen auf die Blattfläche bezogen und die Stickstoffgehalte mittels des Verhältnisses von Blattfläche zu Trockenmasse korrigiert, zeichnete sich eine Beziehung zwischen absoluten und optisch ermittelten Werten ab, der jegliche jahreszeitliche oder artspezifisch morphologische Variabilität fehlte und die somit für alle Quercus-taxa anwendbar ist. Koeffizienten für die Berechnung von flächenbezogenen Gehalten von Gesamtchlorophyll, Chl a, Chl b und Carotinoiden für die jeweiligen Quercus-taxa, wie auch für ein artübergreifendes Modell wurden ermittelt, um die Bestimmung dieser Gehalte während aller Entwicklungsstufen zu ermöglich. Aus der jahreszeitlichen Entwicklung der Pigmentgehalte konnten drei deutliche Phasen abgeleitet werden: Die Phase der Blattentwicklung im Frühling, einer Plateauphase mit geringen Veränderungen (“core vegetation time”) und die Phase des Pigmentabbaus während der Herbstlaubfärbung. Die Übergänge zwischen diesen Phasen variierten zum Teil erheblich zwischen einzelnen Individuen einer Art sowie zwischen den Arten, was Unterschiede in der potentiellen, jährlichen Kohlenstoffaufnahme nach sich zieht. Stressbedingungen, wie Hitze- Kälte- oder Trockenstress, können zu Veränderung von Fluoreszenzparametern ohne gleichzeitige Änderung des Pigmentgehaltes führen, wie auch die indirekte Bestimmung von mit Chl assoziierten Komponenten (Carotinoide, Chl a, Chl b) mittels optischer Bestimmung (durch die Veränderungen von Pigmentverhältnissen) beeinflussen.
Im Rahmen des Forschungsprojektes konnten, Modelle zur Berechnung von Blattpigmenten und Blattstickstoff aus optischem Messdaten, Veränderungen der photosynthetischen Funktionalität, sowie Referenzdaten für die zukünftig nutzbaren Eichenarten hinsichtlich artspezifischer und jahreszeitlicher Variabilität unter mitteleuropäischen Umweltbedingungen ermittelt werden, die eine Nutzung und Einordnung von zerstörungsfreien, optischen Messwerten zur Ermittlung von Vitalitätsunterschieden in Eichen ermöglichen.
Die Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 (SCA2) ist eine autosomal dominant vererbte neurodegenerative Krankheit, welche durch die Expansion des Trinukleotids Cytosin-Adenin-Guanin von ~22/23 auf >32 im Ataxin-2 Gen (ATXN2) verursacht wird. Dieses Trinukleotid codiert für die Aminosäure Glutamin weshalb SCA2 auch zu den Polyglutaminerkrankungen zählt. Zu dieser Gruppe zählen außerdem fünf weitere SCA-Subtypen sowie drei weitere neurodegenerative Erkrankungen, darunter die Huntington-Krankheit.
SCA2 wurde 1971 zum ersten Mal von Wadia und Swami beschrieben und unterscheidet sich von den anderen SCAs aufgrund der typischen Störung der sakkadischen Augenbewegungen. Weitere klinische Symptome von SCA2 sind Ataxie, Tremor, Dysmetrie, Dysarthrie, Hyporeflexie und Dysdiadochokinese. Die Symptome gehen auf einen neuronalen Verlust insbesondere im Cerebellum, aber auch in anderen Hirnregionen wie zum Beispiel dem Hirnstamm zurück.
Atxn2 wird in weiten Teilen des Zentralnervensystems aber auch in vielen nicht-neuronalen Geweben exprimiert. Es handelt sich um ein überwiegend cytoplasmatisch lokalisiertes Protein, welches im Gegensatz zu vielen anderen SCA-Proteinen cytoplasmatische und nur selten nukleäre Aggregate bildet. Die exakte Funktion von Atxn2 ist bisher unklar, es wurde allerdings mehrfach gezeigt, dass es in die mRNA Translation involviert ist aufgrund seiner Interaktion mit dem PolyA-bindenden Protein PABPC1.
Eine Expansion des Trinukleotids in Ataxin-2 kann nicht nur zu SCA2 führen, sondern stellt bei Wiederholungen zwischen 27 und 32 CAGs auch ein erhöhtes Risiko für eine Erkrankung an Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und anderen neurodegenerativen Krankheiten dar. Eine Interaktion zwischen ATXN2 und dem ALS-verursachenden TDP43 (Tardbp) wurde bereits zahlreich beforscht, da Aggregate von ATXN2 in Motoneuronen des Rückenmarks von ALS-Patienten und aggregiertes TDP43 in SCA2-Neuronen beobachtet wurden.
Generell sind die Mechanismen, die zur Pathologie von SCA2 und ALS führen, noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es daher auf der einen Seite einen Einblick in den Pathomechanismus von SCA2 zu erhalten, indem mögliche oder bereits bekannte Interaktoren in etablierten Atxn2-Mausmodellen untersucht wurden. Auf der anderen Seite wurden zwei neue Mausmodelle charakterisiert, um ihre Eignung für die Erforschung von ALS und SCA2 zu prüfen.
Für den ersten Teil der Arbeit dienten Daten aus mehreren Transkriptomstudien von Atxn2-Knock-Out (KO) und Atxn2-CAG42-Knock-In (KIN) Mäusen als Grundlage. Konnten die Daten mit einer unabhängigen Methode bestätigt werden, folgten weitere Untersuchungen auf mRNA und Proteinebene sowie unter zusätzlicher Verwendung von Zellkultur und Patientenmaterial. Dadurch konnten neue Interaktionspartner von ATXN2 identifiziert und bereits bekannte in diesen Mausmodellen bestätigt werden.
So wurde zum Beispiel eine Interaktion von ATXN2 mit der E3-Ubiquitin-Protein-Ligasekomponente FBXW8 gezeigt und deren Beteiligung am Abbau von expandiertem ATXN2. Außerdem wurde eine Interaktion von FBXW8 mit dem bereits bekannten ATXN2-degradierenden Protein PARK2 gezeigt. Eine Hochregulierung des Fbxw8 Transkripts wurde sowohl im Atxn2-CAG42-KIN-Mausmodell als auch in SCA2-Patientenfibroblasten gefunden, während Park2 in keinem der Modelle signifikant veränderte Transkriptspiegel aufwies. Diese Daten belegen die Relevanz von Fbxw8 für den Abbau von moderat-expandiertem Atxn2 und begründen weitere Studien zur genauen Funktion dieses Proteins im Pathomechanismus von Atxn2.
Des Weiteren wurden diverse Kalziumhomöostasefaktoren untersucht, welche eine konsistente Herunterregulierung der Transkripte in beiden Mausmodellen aufwiesen. Auf Proteinebene zeigten sich jedoch Unterschiede zwischen den Modellen. Diese Daten belegen, dass zwar ähnliche Transkriptveränderungen im KIN- und KO-Modell auftreten, diesen aber vermutlich verschiedene Mechanismen zugrunde liegen. Welche Mechanismen dies genau sind bleibt zu klären, es ist jedoch wahrscheinlich, dass im KIN-Modell die Aggregatbildung sowie in beiden Modellen die Beteiligung von ATXN2 an der Translationregulation eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen die Relevanz des Ca2+ Signalwegs für die Entwicklung von SCA2.
Der zweite Teil der Arbeit beinhaltet die Charakterisierung einer ATXN2/TDP43 Doppelmutante auf Verhaltensebene sowie die gründliche Evaluierung des Phänotyps einer vollkommen neuen SCA2 Mausmutante. Während in der Doppelmutante trotz doppelter Genmutation nur ein sehr schwacher Phänotyp auf Verhaltensebene festgestellt werden konnte und bis zu einem Alter von 12 Monaten keine Potenzierung der Mutationen zu beobachten war, zeigte die Atxn2-CAG100-KIN Maus signifikante und früh auftretende Pathologie. Neben einer verminderten Überlebensrate, einem Gewichtsverlust und diversen motorischen Störungen, konnten auch Aggregate des mutierten Proteins in diversen Hirnregionen identifiziert werden. Der Atxn2-CAG100-KIN Phänotyp spiegelt die humanen Symptome daher recht gut wider, weshalb diese Mausmutante ein wertvolles Modell für die weitere SCA2-Forschung darstellt.
Zusammengefasst zeigt diese Arbeit die Bedeutung des ATXN2-Interaktors FBXW8 im SCA2-Mausmodell als auch im Patientenmaterial. Sie betont die Relevanz des Atxn2-KO-Modells in Bezug auf Störungen der Kalziumhomöostase und dokumentiert die Alters- und Gewebespezifität dieser Veränderungen. Außerdem beinhaltet sie die vorläufige Beschreibung eines kombinierten Atxn2/TDP43-Mausmodells und schließlich die ausführliche Charakterisierung eines vollkommen neuen und äußerst wertvollen SCA2-Mausmodells.
Amphibians have existed on the planet for over 300 million years and are today one of the most diverse vertebrate classes in the world with over 7000 known species and still many more to be discovered. However, several studies assume that approximately one third of the world´s known living amphibians are directly threatened with extinction, making it the most endangered vertebrate class. In relation to the relatively small land mass that is occupied by the state of Panama, it supports one of the most diverse amphibian faunas. However, in many cases the ecological role of single species in a wider context and their habitat preferences are still poorly understood and subject to ongoing research. Modern taxonomic approaches in other tropical regions have shown that former assumptions of amphibian diversity were distinct underestimations of the actual species diversity; a situation that is probably also true for Panama. Concurrently, the collection of amphibian diversity data and the description of new species is a race against time. The amphibian fauna of the world and that of Panama in particular, has suffered from an unprecedented loss of diversity over the last 30 years. The reasons are manifold and include destruction, alteration, and fragmentation of their natural habitats as the main causes, but also the deadly amphibian disease chytridiomycosis caused by the fungal pathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). In Panama and Costa Rica, this Emerging Infectious Disease (EID) spread in a wave-like manner from west to east causing mass die-offs and reduced amphibian diversity even in well-preserved habitats. The disease has primarily affected stream-associated highland species. The last large-scale evaluation of the conservation status of Panama´s amphibians through the IUCN Red List of Threatened Species in 2004 concluded that approximately 30% of the known species are acutely threatened with extinction. Furthermore, around 17% of the amphibian species that have been known back then lacked adequate data to be assessed. In view of Panama´s already overwhelming amphibian diversity, as well as the variety of habitats and the large number of sites that have not been examined with regard to amphibians before, I started this study with the conviction that the inventory of Panama´s amphibian diversity is far from being completed. Furthermore, when I started this study, it was uncertain if there would be any surviving amphibian species in areas where chytridiomycosis had emerged. The loss of whole amphibian communities in upland western Panama following Bd arrival led to a shift of amphibian research to lowland sites in central and eastern Panama aiming primarily on pathogen arrival and the documentation of epizootic outbreak and subsequent population decline. The situation of amphibian communities in areas post-decline was therefore largely unknown. Accordingly, the main goals of my study were to add to the taxonomic inventory of amphibians in Panama and to assess the situation of amphibian populations in habitats where chytrid-driven declines have been observed. To address these tasks I conducted fieldwork in western Panama with a focus on mountainous elevations between 1000 and 3475 m asl. Additionally, I visited different lowland sites between sea level and 1000 m asl to collect comparative material. In the period between 2008 and 2013, I conducted five collection trips to Panama that add up to a total of approximately 13 months in the field. I have sampled nine regions in western Panama and collected 767 specimens together with student collaborators, 531 of which were collected under my personal field number. Additional data obtained from those specimens include 68 male anuran call recordings, 102 standardized color descriptions of specimens in life, and 259 tissue samples that to date yielded 185 16S mtDNA sequences. This comprises the most comprehensive data set for amphibians of Panama and the first large-scale DNA barcoding approach for western Panama to date. After a preliminary DNA barcoding and subsequent comparative examination of morphological und bioacoustic data of all specimens collected, the number of taxonomic problems that needed to be addressed was higher than I previously anticipated. For most genetic lineages deeper taxonomic analyses were required to reach conclusive results. A selection had to be made with which lineages to proceed in the analyses, in view of the substantial financial and time expenditure that would be needed for a complete taxonomic revision. Therefore, I chose to run deeper analyses on one genus from each of the three amphibian orders in Panama. The genera selection depended largely on the availability of sufficient material and the scientific relevance of the respective genus.
I selected the genus Diasporus from the order Anura. These small frogs are omnipresent in many habitats and thus relatively easy to find. In addition, the genus is underrepresented in taxonomic studies. This is the first taxonomic study on the genus Diasporus to include a molecular phylogeny and the first comparison of advertisement calls between several populations from western Panama. In total, I collected 67 Diasporus specimens throughout western Panama and compared them morphologically with 49 additional specimens from Central America in collections, including the primary types of D. diasporus and D. hylaeformis. Additional comparative data were taken from literature. The DNA barcoding analysis of a fragment of the 16S rRNA gene included 43 own sequences that were complemented with 15 relevant GenBank sequences. In addition, I compared the advertisement calls of 26 male individuals among each other and with call descriptions from the literature. The DNA barcoding approach revealed several unnamed genetic lineages, but in some cases also resulted in the lumping of morphologically and bioacoustically distinct specimens. Generally, the morphological examination of the collected material revealed almost no specific characters that could be used to distinguish between genetic lineages. However, it was possible to identify species using a combination of several morphological characteristics. Which ones are relevant in the individual case depends on the respective species. My extensive collection of call recordings made it possible to test for the first time the intraspecific call variation of D. hylaeformis in dependency of various parameters. This analysis showed that the dominant frequency depends significantly on the body size of the calling male; the smaller the calling male, the higher the frequency of the call. A similar relationship was observed between the call rate and temperature: the lower the temperature during calling, the lower the call rate. I suppose that these general patterns, which have already been observed in other anuran genera, are also true in other Diasporus species that could not be tested in this study. Taking into account the intraspecific variation of Diasporus advertisement calls, I consider comparative call analyses to be the best way to distinguish between species. This is especially true in syntopic species. Integration of the three lines of evidence (i.e., morphology, DNA barcoding, and bioacoustics) led to the identification of four new species, two of which (i.e., D. citrinobapheus and D. igneus) colleagues and I have already formally described.
I conducted an integrative taxonomic analysis of the western Panamanian representatives of the genus Bolitoglossa from the order Caudata, the larger of the two Panamanian salamander genera. Bolitoglossa is very species-rich with a centre of diversification in the high mountains of Costa Rica and western Panama. I collected 53 Bolitoglossa specimens and compared them to twelve specimens in collection, including the holotype and one paratype of B. gomezi. The dataset was complemented with information from the literature. Among the sampled specimens were two species considered to be endangered that have not been collected or observed for several decades; B. magnifica has not been seen for 34 years and B. anthracina has not been seen for 22 years. Further, I collected salamanders at several new locations. To date, my 16S mtDNA barcoding analysis represents the densest taxon sampling for Panamanian Bolitoglossa composed of 21 own sequences that were combined in the final alignment with 47 GenBank sequences. Even though the molecular phylogeny is based only on a single marker, the received trees largely coincide with previous studies and the nodes received high statistical support. In these trees, I retrieve all previously defined subgenera and species groups. On the basis of this molecular phylogeny, I placed B. anthracina, here sequenced for the first time, in the B. subpalmata species group. Due to the fact that B. anthracina is a large and dark colored species it had previously been placed by implication in the B. schizodactyla species group along with other large black salamanders of the B. nigrescens species complex. Moreover, I found deep divergent genetic lineages among geographically separated populations of B. minutula. However, until now there were no additional morphological characteristics detectable to distinguish between these lineages. Additionally, my colleagues and I described a new deep divergent lineage in the B. robinsoni species group as B. jugivagans, a species new to science. In contrast, I found only minor genetic differences between specimens of B. sombra and B. nigrescens. After combining morphometric data and tooth counts from literature of both species with additional data from specimens of B. sombra that I collected near the type locality, the distinguishing features blurred. In particular, including much larger specimens of B. sombra, not yet known at the time of its description, showed that the tooth count difference is dependent on the size and age of the specimen examined. Larger specimens have more maxillary and vomerine teeth. Based on this evidence I regard B. sombra as a junior synonym of B. nigrescens. Further, I revised the Panamanian distribution of the two relatively common lowland salamanders, B. colonnea and B. lignicolor. Besides filling the gaps in the fragmentary known distributions of these species, I assessed the molecular and morphological variation of both species among populations in Panama. While there was little variation in B. lignicolor, I found divergent genetic lineages among geographically distinct populations of B. colonnea that require further taxonomic examination.
Caecilians (order Gymnophiona) are among the least investigated terrestrial vertebrates. After I received a first specimen of the predominantly South American genus Oscaecilia (family Caeciliidae) in western Panama, I started to work more extensively on the taxonomy of Caeciliidae in Central America. The specimens from western Panama were not readily assignable to a single described species, but shared characters with O. elongata and O. osae. While O. osae was only known from the holotype, the type material of O. elongata was destroyed during World War II. On the basis of the original description, the unique feature in O. elongata within Oscaecilia is the absence of subdermal scales in the posterior part of the body. In a referred specimen of O. elongata mentioned in the original description from eastern Panama, this characteristic cannot be examined as it consists of head and neck only. Therefore, I used non-destructive high-resolution, synchrotron-based X-ray micro CT imaging (HRμCT) to examine cranial characters in the specimens in question and took normal radiographs to count vertebrae and to make subdermal scales visible. I found that the fragmented specimen from eastern Panama likely belongs to the well-sampled species O. ochrocephala and has not much in common with O. osae or the specimens from western Panama. Contrarily, O. osae and the specimens from western Panama share many morphological characters, but also show some differences. Genetic barcoding revealed that both species are close relatives, but the genetic distance could not be finally resolved, because 16S sequences obtained from blood samples of living O. osae were of poor quality. Thus, I compare the Oscaecilia from western Panama to O. osae in this study, but postpone a taxonomic decision until further material becomes available. Further, I designate O. elongata a nomen dubium, because the type material is lost, the type locality is not defined in more detail than “Panama”, and the original description does not allow for a definite assignment. Since previous molecular studies only considered O. ochrocephala, the monophyly of Oscaecilia was never tested before. So far, the genus Oscaecilia is based largely on a single cranial character, the eyes covered with bone. Here, I combined two 16S mtDNA sequences of O. osae from Costa Rica and two sequences from O. sp. from western Panama with two sequences of O. ochrocephala and ten sequences of four species of the genus Caecilia, the sister genus of Oscaecilia. The resulted phylogeny contains two well-supported clades, one clade containing two species of Caecilia, one from Panama and one from western Ecuador and all species of Oscaecilia tested. The other clade consists of two species of Caecilia from the Amazon basin. I therefore assume that the split in both clades is due to the rise of the Andes, what led to today’s cis-trans-Andean distribution of the two clades. For now, to restore monophyly, I suggest to place Oscaecilia within the synonymy of Caecilia until more taxa have been tested. When assessing the conservation status of the amphibian species in mountainous western Panama, I first compiled a list of known species that I potentially could have found during my fieldwork. Using the IUCN categories, I analyzed how many of the endangered species I actually found and how these are distributed over families and species groups. Surprisingly, my rediscoveries of lost species were not equally distributed among the four families that comprise most endangered amphibian species (i.e., Bufonidae, Craugastoridae, Hylidae, and Plethodontidae). While I discovered ten of eleven endangered hylids and six of nine endangered plethodontids, I found only one of four endangered bufonids and none of the nine endangered craugastorids. I assume that the secretive living plethodontids, for which no Bd related declines have been documented, were just overlooked in the past decades. In contrast, I propose that hylids, in which Bd related population decline is well documented, developed distinct evolutionary solutions permitting coexistence with the pathogen. The situation is obviously different in bufonids and craugastorids, where I found no signs of population recoveries at present. So far, the only surviving populations of species from these families exist in climatic or physiographic niches that have probably shielded them from Bd. My data confirm the current view that the risk for naïve amphibian populations to decline during Bd epizootics is predicted by ecological traits (e.g., aquatic index, vertical distribution) and not dependent on taxonomic affiliation. However, I propose that only certain amphibian families (e.g., hylids and centrolenids) have the ability to acquire immunity solutions to coexist with the pathogen during enzootic stages. This is a very new perspective on the worst infectious disease in amphibians worldwide, allowing for new research approaches to understand the host-pathogen dynamics. Moreover, I examined where the share of surviving endangered amphibian species is particularly high in mountainous western Panama. As was to be expected, most of the endangered species are found within the boundaries of protected areas. One exception is the unprotected Cerro Colorado region in the Comarca Ngöbe-Buglé that provides habitat for a wide variety of endangered and undiscovered amphibian species. Nonetheless, planned open pit mining would destroy the forests in a large part of the area. This demonstrates once again that human activities are the biggest threat to amphibians in Panama and elsewhere.
In the interest of understanding the development of a multicellular organism, subcellular events must be seen in the context of the entire three-dimensional tissue. In addition, events that occur within a short period of time can be of great importance for the relatively long developmental process of the organ. Thus, it is required to capture subcellular events in a larger spatio-temporal scale context, which has been up to now a technical challenge. In developmental biology, light microscopy has always been an important tool. The dilemma of light microscopy, in particular fluorescence microscopy, is that molecules receive high light intensities that might change the conformation of molecules, which can have signaling or toxic effects. In Light Sheet-based Fluorescence Microscopy (LSFM), the energy required for a single recording is reduced by several orders of magnitude compared to other fluorescence microscopy techniques. During the last ten years, LSFM has emerged as a preferred tool to capture all cells during embryogenesis of the zebrafish Danio rerio, the fruit fly Drosophila melanogaster or recently the red flour beetle Tribolium castaneum for a period of several days. The motivation of this work was to gain new insights in developmental related processes of plant organs. The aim of this work was to establish a protocol for imaging plant growth over a long period of time using LSFM and perform comprehensive analyses at the cellular level. Plants have to cope with a variety of environmental conditions, therefore the conditions inside the microscope chamber had to be brought under control. The sample preparation methods and the standardized conditions at a physiological level allowed the study of gravity response, day-night rhythms, organ shape development as well as the intracellular dynamic events of the cytoskeleton and endosomal compartments in an unprecedented manner. Several of these projects were successfully published in collaborations with Prof. Jozef Šamaj (Palacký University Olomouc, Czech Republic), Prof. Niko Geldner (University of Lausanne, Switzerland), Prof. Malcom Bennett (University of Nottingham, UK) and Dr. Jürgen Kleine-Vehn (University of Natural Resources and Life Sciences, Austria). The main part of my work focused on the formation of lateral roots in Arabidopsis thaliana and was conducted in close collaboration with Dr. Alexis Maizel (University of Heidelberg, Germany). Previously, most experiments that describe lateral root formation have been performed on a small number of cells and for short periods of time. Capturing the complete process of lateral roots is an ambitious goal, because first, the primordium of a lateral root is located deep inside the primary root and imaging quality is impaired due to scattering of the overlaying tissue. Second, the process takes about 48 h, i.e. the plant has to be kept healthy for the whole period. Third, the amount of excitation light required for the spatio-temporal might have phototoxic effects that lead to a stop of growth at least in conventional microscopic techniques. In Arabidopsis embryogenesis, the sequence of cell divisions is relatively invariant. However, whether lateral root organogenesis follows particular cell division patterns has been unknown. The complete process of lateral root formation was captured from the first cell division until after the emergence from the main root. Images of a nuclei marker and a plasmamembrane marker were recorded every 5 min for a time period of up to 64 h. The positions and cell divisions of all cells were tracked manually. In collaboration with Alexander Schmitz (Goethe University Frankfurt am Main, Germany) and Dr. Jens Fangerau (University of Heidelberg, Germany), comprehensive analyses of the data were performed. A lateral root forms from initially 8-15 founder cells, arranged in a patch of 5-8 parallel files. The occurrence of new cell layers by periclinal divisions, as well as the sequence of layer generation was conserved and resembles the sequence suggested by Malamy and Benfey in 1997. Besides this stereotyped occurrence of periclinal divisions, radial divisions were found to appear stochastically, following no particular pattern. A large variability was also found in the contribution of founder cells and cell files to the final lateral root. In summary, the results suggest that a stereotyped pattern of cell divisions at particular developmental stages and a dynamically adapted control of cell divisions exist in parallel. Both properties allow a controlled but flexible development of the organ according to variations in cell topology and mechanical properties of the surrounding tissue. This work shows that LSFM, the sample preparation methods and controlled environmental conditions allow to capture and analyse the development of plants over several days at high resolution in an unprecedented manner.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine idiopathische chronisch-entzündliche Systemerkrankung, mit primärer Gelenkmanifestation. Die fortschreitende Gelenkentzündung ist die Folge einer immunologischen Fehlerkennung von Gelenkstrukturen durch dysregulierte B- und T-Lymphozyten. So lassen sich in bis zu 70% der entzündeten Gelenke von RA-Patienten IgG-Autoantikörper gegen das knorpelspezifische Kollagen Typ II (CII) nachweisen.
In dieser Arbeit wurde die CII-Epitop-spezifische humorale Autoimmunantwort in der Pathogenese der RA auf molekularer Ebene analysiert. Im Mittelpunkt stehen hierbei bereits gut charakterisierte B-Zell-Epitope auf dem CII, die über die Speziesbarrieren hinweg evolutionär konserviert sind und sowohl in der humanen RA als auch in der murinen Experimentalerkrankung des CIA-Modell (Collagen-Induced-Arthritis) immundominante Strukturen der humoralen arthritogenen Autoimmunität darstellen.
Ein Teilaspekt der Arbeit war die Aufklärung des molekularen Mechanismus, der den katabolen Effekten des murinen arthritogenen CII-Autoantikörper (UL-1) auf den chondrozytären Matrixmetabolismus zugrunde liegt, gewidmet. Der gegen ein immundominantes Epitop (U1-Epitop) auf dem CII gerichtete monoklonale Antikörper kann unabhängig von seinen Fc-vermittelten inflammatorischen Effektorfunktionen, eine direkte Schädigung der Knorpelmatrix über eine Modulation des Chondrozytenmetabolismus im CIA-Modell bewirken. Basierend auf der Analyse von Sequenzhomologien des U1-Epitopes konnte eine immunologische Kreuzreaktivität mit dem LIF (Leukemia-Inhibitory-Factor)-Rezeptor auf Chondrozyten nachgewiesen werden. Weitergehende funktionelle Studien haben jedoch gezeigt, dass die Rezeptorbindung durch den Antikörper keine intrazellulären Signalwege aktiviert, die an der aus der Literatur bekannten Proteoglykan-depletierenden Wirkung des Zytokins LIF beteiligt sind. Während somit eine UL-1 abhängige Aktivierung des LIF-Rezeptors als Erklärungsmodell der katabolen Antikörperwirkung ausscheidet, konnten die funktionellen in vitro Studien eine spezifische UL-1 Antikörper abhängige Src-Kinaseaktivierung in den humanen Chondrozyten als Ansatzpunkt für zukünftige Studien nachweisen.
In der RA-Pathogenese wird die Bedeutung posttranslationaler Modifikationen, insbesondere der Deiminierung von Argininresten unter Bildung von Citrullin für die Neoepitopgenerierung diskutiert. Autoantikörper gegen citrullinierte Peptide (ACPA, anti-citrullinated-peptides-antibody) gelten als diagnostische und verlaufsprädiktive Marker der RA. Zielstrukturen für ACPAs sind nicht nur einige ubiquitär exprimierte Proteine, sondern auch das knorpelspezifische CII. In dieser Arbeit konnte erstmals die in vitro Bindung CII-spezifischer ACPAs an Knorpelgewebe von RA-Patienten, das als asserviertes Biomaterial aus Synovektomie- bzw. Gelenkersatzoperationen zur Verfügung stand, nachgewiesen werden. Darüber hinaus gelang der erstmalige Nachweis einer chondrozytären Expression der für die posttranslationale Modifikation verantwortlichen Peptidylarginin-Deiminasen (PAD) PAD2 und PAD4 im Knorpelgewebe und ihre Hochregulation in den Chondrozyten unter oxidativem und genotoxischem Stress. Diese Stressoren sind an degenerativen Knorpel-veränderungen in der Pathogenese der Osteoarthrose (OA) beteiligt, sodass die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese stützen, dass Degenerationsprozesse des alternden Knorpels zur Expression kollagenmodifiziernder PAD-Enzyme führen und damit die immunologische Selbsttoleranz des Knorpelgewebes durch Neoepitop-Generation in der Knorpelmatrix schwächen können.
Ein zentraler Aspekt der Arbeit galt der Analyse der CII-spezifischen humoralen Immunantwort im Blut und in der entzündlich veränderten Synovialmembran von RA-Patienten über die vergleichenden Analyse der rearrangierten Immunglobulingene in epitopspezifisch über biotinylierte CII-Peptide markierten B- und Plasmazellen. Die Isolation der markierten Zellen erfolgte mittels Laser-Mikrodissektion aus dem Gewebe und durchflusszytometrisch aus dem peripheren Blut. Die anschließende Sequenzanalyse der mittels semi-nested Einzelzell-PCR amplifizierten, für die variable Region der leichten und schweren Antikörperkette kodierenden V-Gene, ergab für die Erkennung des immundominanten CIIC1-Epitopes eine präferentielle V-Genverwendung. Darüber hinaus spricht der Nachweis höherer Mutationsraten in synovialen Plasmazellen im Vergleich zu CII-spezifischen B-Zellen im Blut für eine lokale synoviale Affinitätsreifung der Antikörperantwort. Die Klonierung der amplifizierten V-Gene in einen eukaryotischen Expressionsvektor ermöglicht die Expression rekombinanter Antikörper und deren Validierung im ELISA. Zukünftige Affinitätsbestimmungen und Kristallstrukturanalysen dienen dem verbesserten molekularen Verständnis der CII-Antikörpererkennung und murine Antikörper-transferexperimente der Evaluation der Arthritogenität der humanen CII-Antikörperantwort. Fernziel ist die Entwicklung einer auf der CII-Antigenspezifität beruhenden immunmodularischen Therapie der RA.
By far not all genetic information is expressed by mRNA coding regions of the DNA. 98% of the human genome is not encoding for proteins. Therefore, these non-coding regions have been considered as “junk DNA” for a long time [1, 2]. The last years, new high throughput sequencing techniques have allowed the elucidation of the heterogeneous population of non-coding RNAs (ncRNAs, Table 1). RNAs longer than 200 nucleotides (nt) belong to the family of long non-coding RNAs (lncRNAs). They can exhibit numerous functions: The biggest family of RNAs is represented by the ribosomal RNAs (rRNAs). Together with the transfer RNAs (tRNAs) they are essential for the translation of mRNA into an amino acid sequence.
Die soziale Arbeitsteilung bei Honigbienen ist ein komplexes selbstorganisatorisches System, welches auf zwei Ebenen der biologischen Organisation zu verorten ist: dem Individuum und der Kolonie. Die Regulation der Bruttemperatur ist ebenfalls diesen Gesetzmäßigkeiten unterworfen. Die Arbeits-bereitschaft einzelner Bienen bildet die Grundlage für die Temperaturregulierung des kolonialen Brutnestes.
In dieser Arbeit wird dieses Zusammenspiel aus individuellen Beteiligungen der Arbeiterinnen sowie der erbrachten Gesamtleistung der Kolonie während des Brutwärmens untersucht. Dazu wird eine kleine Bienengruppe auf einer Brutwabe einer thermischen Belastung ausgesetzt. Ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Versuchsaufbau integriert erstmals die Infrarot-Thermografie mit den Temperaturmessungen einer Brutfläche. Somit ist es möglich, die Thoraxtemperaturen der einzelnen, am Brutwärmen beteiligten Arbeiterinnen störungsfrei zu messen und gleichzeitig das erzeugte räumliche und zeitliche Temperaturmuster der Brutwabe zu ermitteln. Zusätzlich wird der Temperaturverlauf der Außentemperatur sowie der zellumgebenden Luft untersucht.
Es kann gezeigt werden, dass die Lufttemperatur im Innenraum eines Bienenstocks ein wichtiger Faktor in der Temperaturregulierung des Brutnestes ist, da sie die untere Temperaturgrenze im Bienenstock bildet. Weiterhin wird der Einfluss der brutwärmenden Arbeiterinnen auf die Temperaturentwicklung einer Brutfläche sichtbar. Durch das flexible Verhalten der Arbeiterinnen kann einer Brutfläche bei thermischer Belastung durch lokal wechselndes Brutwärmen optimal Wärme zugeführt werden. Es gibt es Hinweise auf eine zyklische Periodizität im zeitlichen Temperaturverlauf der Brutzellen, welche auf einen Brutwärmrhythmus durch die Bienen schließen lässt. Durch den Einsatz zweier Unterarten (Apis mellifera carnica & Apis mellifera mellifera) wird sichtbar, dass es zwischen den Gruppen Unterschiede in der Aufrechterhaltung der Lufttemperatur über der Wabe gibt.
Myxobacteria are on order of Gram-negative, soil dwelling bacteria that feature an impressive number of properties: they can glide on solid surfaces by using two different motility motors, subsist by preying on other microorganisms, are often producers of multiple natural products, and upon adverse environmental conditions, they are able to form multicellular structures called “fruiting bodies”. The process, in which these macroscopically visible structures arise from independent single cells, has been the predominant subject of myxobacterial research for many decades. More precisely, researchers have strived for the discovery of genes, proteins and small molecules that act as signals, receivers or modulators of this complex process. In this regard, the species Myxococcus xanthus has evolved into the model organism due to its relatively simple and reliable handling in a laboratory environment. The research underlying this thesis focused on the identification and biosynthesis of lipids that may act as intercellular signaling molecules during the course of fruiting body formation of the myxobacterium Myxococcus xanthus as part of the “E-signal” system. In general, lipids containing branched-chain fatty acids with an uneven number of carbon atoms were found to be important players in this particular process. Nevertheless, their exact roles remain largely unknown as of this day. The first publication that is part of this thesis deals with an aspect that even strengthened the importance of role of iso-branched compounds in myxobacteria: myxobacterial metabolism is able to transform precursors of iso-lipids to isoprenoids. It addresses the question whether isoprenoids in general are important for fruiting body formation. Phenotypic analysis of mutants impaired in the biosynthesis of the central isoprenoid precursor 3-hydroxymethylglutaryl-Coenzyme A (3-HMG-CoA) from acetate and/or branched chain keto acids and their genetic and metabolic complementation clearly showed that isoprenoids are essential for fruiting body formation and confirmed that leucine derived isovalerate is an important source for isoprenoid precursors in myxobacteria. The second, and by far and away most tedious and sophisticated study, addressed the question as to how myxobacteria form fatty acid derived iso-branched ether lipids and to what extent they are important for fruiting body formation and sporulation. In a previous study, those unusual lipids were identified as specific biomarkers for myxobacterial development. No biochemical pathways to ether lipids specific for prokaryotes were known by then. In this study, a putative candidate gene that may be in involved in ether lipid biosynthesis was investigated. A combination of gene disruption and complementation experiments, phenotypic analysis and monitoring of ether lipid formation by means of GC-MS demonstrated its involvement in myxobacterial ether lipid biosynthesis and the importance of these lipids for the developmental process. Heterologous expression and biochemical testing of this gene together with in-silico sequence analysis and docking experiments confirmed the functions of its predicted domains. The discussion section provides an additional suggestion on how the ether bond formation is performed. Furthermore and most importantly, iso-branched ether lipids were found to be essential for sporulation but not for fruiting body formation. In summary, one or several molecules derived from an iso-branched alkylglycerol seem to play a role during sporulation in M. xanthus and a multidomain enzyme unique for myxobacteria is involved in their biosynthesis. The last manuscript addresses the complexity of lipid metabolism in myxobacteria. Prior to this work, there was limited knowledge about the exact composition of the myxobacterial lipidome and no method was available to monitor putative changes in the myxobacterial lipidome down to the single molecular species for studying lipid biosynthesis or regulation. An ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry based method with electrospray ionization (UPLC-ESI-MS) utilizing standard equipment and a water/acetonitrile/isopropanol based eluent system proved to be geared for the construction of lipid profiles for wild type and mutant cells of M. xanthus and to show their differences. Fragmentation spectra based structure elucidation of lipid molecular species resulted in the identification of 99 molecular species comprising glycerophosphoethanolamines, glycerophosphoglycerols, glycerolipids, ceramides and ceramide phosphoinositols. The latter have never been described for any prokaryotes before. Three dimensional plots were created from the relative intensity differences of the single molecular ion species between the different samples to provide an efficient and versatile visualization of the data and enable the researcher to quickly detect differences.
RNA modifications are present in all three kingdoms of life and detected in all classes of cellular RNAs. RNA modifications are diverse, with more than 100 types of chemical modifications identified to date. These chemical modifications expand the topological repertoire of RNAs and are expected to fine-tune their functions. Ribosomal RNA (rRNA) contains two types of covalent modifications, either methylation on the sugar (Nm) or bases (mN), or base isomerization (conversion of uridine into pseudouridines, "). Pseudouridylations and ribose methylations are catalyzed by site-specific H/ACA and C/D box snoRNPs, respectively. The RNA component (snoRNA) of both types of snoRNPs is responsible for the site selection by base pairing with the rRNA substrate, whereas the protein component catalyzes the modification reaction: Nop1 in C/D box and Cbf5 in H/ACA box snoRNPs. Contrastingly, base methylations are performed by snoRNA independent, ‘protein-only’, methyltransferases (MTases). rRNA modifications occur at highly conserved positions, all clustering around functional ribosomal sites. Mutations in factors involved in rRNA modification have been linked to severe human diseases (e.g. X-linked Dyskeratosis congenita). Emerging evidences indicate that heterogeneity in RNA modification prevails, i.e. not all positions are modified at all time, and the concept of ‘specialized ribosomes’ has been coined. rRNA modification heterogeneity has been correlated with disease etiology (cancer), and shown to play a role in cell differentiation(hematopoiesis). Remarkably, alteration in rRNA modification patterns profoundly affects the preference of ribosomes for cap- versus IRESdependent translation initiation, with major consequences on cell physiology.
Fungal organisms, including the most common human pathogens Candida spp., are commensal organisms that are widely present as part of the human flora. Fungal infections are, most frequently, local infections that do not compromise the life of patients. However, mycotic diseases can be life-threatening if they become systemic infections. Systemic fungal infections have risen over the last three decades in parallel to the increased immune-compromised population as a consequence of diseases (e.g. HIV/AIDS) or therapeutic interventions that affect the immune system (e.g. chemotherapy for cancer treatment and immunosuppressors used for patients with organ transplants). This has resulted in the demand of new antifungal drugs that can eradicate the new infections caused by these opportunistic fungal pathogens. However, most of the current compounds have poor pharmaceutical properties such as narrow spectrum of activity, susceptibility to be extruded by efflux pumps or lack of specificity, which make them not suitable for human clinical applications. The treatment of fungal and parasitic infections has been traditionally difficult because the infective organisms are eukaryotic cells that share most of the pathways and enzymes with human cells. To avoid side effects and to develop a targeted therapy, the research has traditionally been centered on the very few enzymes and pathways existing in the infectious organism but absent in humans. Until now, antifungal therapeutic options are limited and are almost dominated by azole class of sterol biosynthesis inhibitors affecting the synthesis of ergosterol, a major constituent of the fungal cell membrane. Because human cells do not have a cell wall, the development of effective and safe antifungal agents has also been directed to enzymes required for the synthesis of the cell wall. Alternatively, it is theoretically possible to target enzymes that are present in fungal organisms and in humans, when: 1) sufficient selectivity can be achieved, and 2) inhibition of the fungal enzyme is lethal to the fungus but does not produce major side effects to humans. In this line, it would be ideal to evaluate the development of selective inhibitors of enzymes which are already known to be drug targets, like protein kinases.
Cancer is a disease characterized by uncontrolled cell growth and the capacity to disseminate to distant organs. The properties of cancers are caused by genetic and epigenetic alterations when compared to their normal counterparts. Genetic mutations occur in oncogenes and tumor suppressor genes and are the initial drivers of cellular transformation (Lengauer et al., 1998; Vogelstein and Kinzler, 2004). In addition, epigenetic alterations, which influence the expression of oncogenes and tumor suppressor genes independently from sequence alterations, are also involved in the transformation process (Esteller and Herman, 2001; Sharma et al., 2010). Genetic alterations and epigenetic regulatory signals cooperate in tumor etiology. Glioblastoma multiforme (GBM) is a frequent and aggressive malignant brain tumor in humans. The median survival of GBM patients is about 15 months after diagnosis. Like in other cancers, genetic and epigenetic alterations can be detected in GBM. Genetic alterations in GBM affect cell growth, apoptosis, angiogenesis, and invasion; however, epigenetic alterations in GBM also affect the expression of oncogenes or tumor suppresser genes that increase tumor malignancy (Nagarajan and Costello, 2009).
Reprogramming is a cellular process in which somatic cells can be induced to assume the properties of less differentiated stem cells. This process can be mediated through epigenetic modifications of the genome of somatic cells by the action of four defined transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) or by the action of the miR 302/367 cluster (Anokye-Danso et al., 2011; Takahashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007) and result in the generation of induced pluripotent stem cells (iPS cells). Reprogramming of somatic cells by the miR 302/367 cluster can generate nontumorigenic iPS cells through the inhibition of the epithelial to mesenchymal transition (EMT), cell cycle regulatory genes and epigenetic modifiers (Lin and Ying, 2013).
Alzheimer’s disease (AD) is a common, age associated neurodegenerative disease that manifests as progressive dementia and is characterized by accumulation of the amyloid beta (Aβ) peptide which is a processing product of a transmembrane protein termed Alzheimer Amyloid Precursor Protein (APP). The Aβ peptide is generated by a sequential proteolytic processing of APP by two distinct proteases that are termed β- and γ-secretase. The β-secretase, also called BACE-1 or memapsin 2, belongs to the family of aspartyl proteases. BACE-1 evidently cleaves APP in an acidic endosomal compartment after endocytosis of APP, thereby facilitating Aβ peptide generation.
Sorting of transmembrane proteins is generally controlled by sorting signals in the cytoplasmic domains of the cargo proteins. The short cytoplasmic tail of BACE-1 with 23 amino acids contains a sorting signal of the acidic cluster, di-leucine (ACDL) type. The two Leu residues in this determinant are important for the clathrin mediated endocytosis of BACE-1, whereas the acidic residues together with the Leu are required for the endosomal sorting and recycling of BACE-1 back to the plasma membrane. The ACDL motif binds to the members of the GGA (Golgi-localized γ ear-containg ARF- binding proteins) family (GGA1-GGA3) that are involved in the sorting of BACE-1.
One of the major aims of this study was to address the role of flotillins in the intracellular sorting of BACE-1. This study shows that flotillin-1 directly binds to the di-leucine motif in the cytoplasmic tail of BACE-1, whereas flotillin-2 only shows an association mediated by flotillin-1. Flotillin-1 competes with GGA2 for the binding to BACE-1 tail, and thus influences the endosomal sorting of BACE-1. Importantly, depletion of flotillins results in an altered localization of the wildtype BACE-1, whereas the plasma membrane resident Leu to Ala (LLAA) mutant is not affected. Flotillin knockdown results in an accumulation of BACE-1, implicating reduced degradation and enhanced stability of this protease. Thus, flotillins appear to be important for the cellular targeting of BACE-1 and also influence the amyloidogenic processing of APP, as demonstrated by an increase in the amyloidogenic C-99 processing fragments.
When flotillin depleted cells were subjected to apoptotic stresses including Aβ25-35 synthetic peptide (inducer of the extrinsic apoptosis pathway) or several chemotherapeutic agents (staurosporine, brefeldin A, doxorubicin, carboplatin and paclitaxel: intrinsic apoptosis pathway) and cytotoxicity was determined, various apoptotic markers were activated in flotillin depleted cells. Caspase-3 and GGA3 are well accepted apoptosis markers and an enhanced caspase-3 cleavage was detected upon STS induced apoptosis in SH-SY5Y, HeLa, and HaCaT cell lines and increased GGA3 cleavage was observed in MCF7 cell line.
One of the major reasons for the apoptotic sensitivity in the absence of flotillins was a PI3K/Akt signaling defect. Neuroblastoma cells depleted of flotillins showed diminished levels of total Akt, phospho-Akt and phospho-ERK upon STS induced apoptosis. Since PI3K/Akt was the primary survival pathway affected upon STS induced apoptosis, ectopic expression of Akt in neuroblastoma cell line reduced caspase-3 cleavage and retarded apoptosis.
The direct downstream target of Akt is FOXO3a, whose localization was investigated in flotillin depleted cells. A major proportion of FOXO3a was localized in the nucleus of flotillin knockdown cells, implicating that FOXOs are active in these cells and subsequently trigger the transcription of death genes. Strikingly, an essential anti-apoptotic molecule and a major cancer target, Mcl-1, was inherently downregulated in flotillin knockdown cells. Mcl-1 is a chief member of the Bcl-2 family as it plays a pivotal role in cell survival and it is a critical protein in cancer therapeutics as suppression of Mcl-1 protein can curtail the survival and growth of tumorous cells.
Neuroblastoma cells were rescued from undergoing permanent damage due to STS induced apoptosis by overexpression of anti-apoptotic Bcl-2. Phorbol esters are well known PKC activators, and pre-treatment of neuroblastoma cells with phorbol esters along with staurosporine reduced caspase-3 cleavage.
These results demonstrate that absence of flotillins can sensitize cellular systems to apoptosis induction. The two main characteristics of cancer cells include resistance to apoptosis and unresponsiveness to chemotherapeutic agents. It is a well established fact that impaired apoptosis is central to tumour development. This study implicates that the downregulation of flotillin function can trigger cellular susceptibility and enhances apoptosis in response to conventional chemotherapeutic agents. Therefore, flotillins can serve as vital regulators in providing a more rational approach in molecular-targeted therapies for receding cancer growth and survival.
Wie andere Vögel auch, verfügen Hühner über zwei verschiedene Magnetfeldrezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden diese beiden Rezeptoren, vor allem unter dem Aspekt Verhaltensontogenie eingehender untersucht. Meine Ergebnisse werden durch histologische Untersuchungen gestützt. Ich untersuchte zwei Hühnerrassen, einen braunen und einen weißen Legehuhn Stamm. Mit der Standardmethode konnte ich die Befunde der Literatur bestätigen. Zur Untersuchung des Magnetkompasses im Auge, habe ich Hühner darauf trainiert einen roten Tischtennisball, auf den sie geprägt wurden, in einer bestimmten magnetischen Richtung zu suchen. Im unbelohnten“ Test ist das Magnetfeld um 90 Grad gedreht, so dass der magnetische Norden nun im geographischen Osten liegt. Die braunen Hühner benutzen den Magnetkompass zum Lösen der gestellten Aufgabe, die weißen Hühner wählen zufällig eine Richtung. Eine Veränderung der Trainingsmethode, ein Training im gedrehten Magnetfeld und eine „Bestrafung“, haben das Ergebnis verändert. Die weißen Hühner sind nun in der Lage, die magnetisch richtige Richtung zu finden, die braunen Hühner reagieren verängstigt und wählen nur zufällig eine Richtung. Beide Hühnerrassen können also - unter verschiedenen Voraussetzungen - einen magnetischen Kompass für die Orientierung benutzen.
Die Funktion der äußeren Haarsinneszellen geht weit über die normale Rezeptoreigenschaft der Kategorie Mechanorezeptor hinaus. Äußere Haarzellen mit ihrer reichhaltigen efferenten Innervierung sind nicht nur für die sensorische Aufnahme mechanischer Bewegung zuständig, sondern ermöglichen aufgrund ihrer motorischen Funktionen die mechanische Verstärkung der Wanderwelle in der Cochlea. Äußere Haarzellen sind eine maßgebliche Komponente des ´cochleären Verstärkers` und ihr Ausfall führt zur Schwerhörigkeit. Beiprodukte des cochleä-ren Verstärkers sind otoakustische Emissionen, deren Messung Aufschluss über aktive mechanische Prozesse im Innenohr gibt.
Die äußeren Haarsinneszellen bilden Synapsen mit dem olivo-cochleären efferenten System, welches im Zentrum der vorliegenden Untersuchung steht. Es vermittelt den Einfluss des Zentralnervensystems auf das Corti-Organ des Innenohrs. Über die akustische Reizung des olivo-cochleären Reflexbogens ist man in der Lage, das efferente System zu aktivieren und gleichzeitig die Antworteigenschaften der Cochlea zu verändern. Efferente Modulationen des cochleären Verstärkers können sich z. B. in einer Veränderung des Emissionspegels bemerk-bar machen. Die Fledermausspezies Carollia perspicillata ist aufgrund ihres Echoortungs-systems mit einem sehr sensitiven und hochauflösenden Hörvermögen ausgestattet und eignet sich hervorragend als Modelltier in der Hörforschung, insbesondere auch deshalb, da oto-akustische Emissionen sehr gut messbar sind.
Das efferente System von C. perspicillata wurde in dieser Untersuchung durch akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea angeregt. Die Stimuli, die nicht nur in ihrem Pegel sondern auch in ihrer Bandbreite und in der Mittelfrequenz in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen variierten, beeinflussten dabei die Generierung der otoakustischen Emis-sionen (DPOAE, engl: distortion product otoacoustic emissions) im ipsilateralen Ohr: akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea bewirkte zuverlässig eine Änderung der DPOAE- Amplitude im kontralateralen Ohr. Vor allem eine Suppression des cochleären Verstärkers in Form von DPOAE-Pegelverminderungen wurde beobachtet. Die supprimieren-den Effekte erreichten trotz leiser bis moderater kontralateraler Rauschpegel (bis maximal 54 dB SPL) Werte von bis zu 14, 17.1 und 13.9 dB SPL (bei f2 = 20, 40 und 60 kHz und effek-tivstem kontralateralen Rauschstimulus) und waren damit deutlich größer als in vorangegang-enen Studien an anderen Spezies. Die DPOAE-Pegelverminderungen waren positiv mit dem x Pegel der kontralateralen akustischen Stimulation, ebenso wie seiner Bandbreite und der Mittelfrequenzen in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen korreliert. Es gab keinen absoluten Frequenzbereich, in dem die efferenten Effekte am größten gewesen wären. Vielmehr traten maximale Effekte immer durch etwas oberhalb der ipsilateralen Stimulusfre-quenzen gelegene kontralaterale Rauschstimuli auf. Die Effekte waren auch abhängig von der Bandbreite des kontralateralen Rauschstimulus und maximal bei einer relativen Bandbreite von 1.5 Oktaven. Die Verschiebung des efferenten Effekts hin zu hohen Frequenzen und die Bandbreitenabhängigkeit sind vereinbar mit den anatomischen Eigenschaften der Projektio-nen der medialen olivo-cochleären Efferenzen in der Säugetiercochlea. Kontralaterale akusti-sche Reizung bewirkte auch eine Verschiebung der Wachstumsfunktionen der 2f1-f2 -DPOAE in einen unsensitiven Bereich und außerdem eine Verformung der Wachstumsfunktion. Bei-des könnte durch Beeinträchtigung des cochleären Verstärkers verursacht sein. Eine Beteili-gung des Mittelohrmuskels an den Effekten kann nahezu ausgeschlossen werden und die beobachteten Effekte sind höchstwahrscheinlich dem olivo-cochleären System zuzuschreiben.
Funktionell ist denkbar, dass bei C. perspicillata das mediale olivo-cochleäre System im Kontext einer Frequenzverschärfung bei der cochleären Verstärkung der Basilarmembranbe-wegung aktiv wird. Aus diesem Grund wurden ipsilateral sogenannte DPOAE-Suppressions- Abstimmkurven gemessen, welche die mechanische Abstimmschärfe im Innenohr beschrei-ben. Während und nach kontralateraler Reizung kam es zu Veränderungen der Abstimmkur-ven. Signifikante Effekte konnten allerdings nicht festgestellt werden, da die Veränderungen der Suppressions-Abstimmkurven variabel und schlecht kategorisierbar war.
Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen weit verbreitete Hypothesen zur Funktion der medialen olivo-cochleären Effernzen in Bezug auf mechanische Suppression, Verbesserung des cochleären Signal-Rauschverhältnisses und einer generellen frequenzspezifischen Wirkung.
Angiogenesis, the formation of new blood vessels from existing ones, is a fundamental biological process required for embryonic development; it also plays an important role during postnatal organ development and various physiological and pathological remodeling processes in the adult organism. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its main receptor, VEGF receptor-2 (VEGFR-2), play a central role in angiogenesis. VEGFR-2 expression is strongly upregulated in angiogenic vessels, but the mechanisms regulating VEGFR-2 expression are not well understood. We found in this study that the G-protein α subunit Gα13 plays an important role in the regulation of VEGFR-2 expression. In vitro, we found that knockdown of Gα13 reduced VEGFR-2 expression in human umbilical vein endothelial cells and impaired responsiveness to VEGF-A. This phenotype was rescued by adenoviral normalization of VEGFR-2 expression. Gα13-dependent VEGFR-2 expression involved activation of the small GTPase RhoA and transcription factor NF-κB; it was abrogated by deletion of the NF-κB binding site at position -84 of the VEGFR-2 promoter. In vivo, endothelial cell-specific loss of Gα13 resulted in reduced VEGFR-2 expression, impaired responsiveness towards VEGF-A in Matrigel assays, and reduced retinal angiogenesis. Importantly, also tumor vascularization was diminished in the absence of endothelial Gα13, resulting in reduced tumor growth. Taken together, we identified Gα13-dependent NF-κB activation as a new pathway underlying the transcriptional regulation of VEGFR-2 during retinal and tumor angiogenesis.
Es ist wohl unumstritten, dass das Leben, wie wir es kennen, ohne die sauerstoffproduzierenden Organismen unserer Erde nicht möglich wäre. Zu ihnen gehören nicht nur die Landpflanzen, deren mannigfaltige Nutzung wichtiger Bestandteil unseres Alltags ist. Auch mikroskopisch kleine Algenarten leisten einen entscheidenden Beitrag zu den Stoffwechselkreisläufen dieser Welt. Unter ihnen befinden sich die Kieselalgen (Diatomeen), die mit einer Varietät von bis zu 10000 Spezies etwa 40 % der marinen Primärproduktion verantworten. Der Ursprung der heutigen zur oxygenen Photosynthese befähigten Eukaryoten geht auf Endosymbioseereignisse zurück, von denen aus sich diese Organismen ausgesprochen vielfältig entwickelt haben. Diese Vielfalt wird dabei nicht nur anhand ihrer äußeren Morphologie, sondern auch auf subzellulärer Ebene, deutlich. So zum Beispiel durch die unterschiedlichen Strukturen der Thyakoidmembranen, die sich in Kieselalgen wie Cyclotella meneghiniana in dreilagigen Bändern arrangieren. In Pflanzen wie Nicotiana tabacum (Tabak) hingegen bilden sie große, stapelartige Bereich aus, die zur räumlichen Separation der in den Thylakoiden eingebetteten Photosystemen beitragen. Auch die an die Photosysteme (PS) gebundenen Lichtsammelproteine (Lhcs) haben sich in Tabak und Cyclotella unterschiedlich entwickelt. Gemäß ihrem Namen zeichnen sie sich zwar allesamt durch die Sammlung und Weiterleitung der Lichtenergie an die Photosysteme aus, grenzen sich aber in Hinblick auf Proteingröße und Pigmentierung voneinander ab.
Die Lhcs der höheren Pflanzen werden entsprechend ihrer Zuordnung zu den Photosystemen in den aus zwei Heterodimeren bestehenden LHCI des PSI und die Lhcb-Antennenproteine des PSII unterschieden. Zu letzteren gehören der trimere Hauptantennenkomplex LHCII und die monomeren, minoren Antennenproteine. Die Lhcs binden die zur Lichtsammlung benötigten Pigmente, vor allem Chlorophyll a und Chlorophyll b, aber auch primäre Carotinoide wie Violaxanthin, Lutein und Neoxanthin, in unterschiedlichen Stöchiometrien. Es ist bereits bekannt, dass die Pigmentierung entscheidend zur Stabilität der Lichtsammelproteine beiträgt, wenngleich zum Teil auch eine gewisse Flexibilität in Bezug auf die Art der gebundenen Pigmente an den entsprechenden Bindestellen der Proteine besteht.
Im Rahmen dieser Arbeit liegt der Fokus auf der Fragestellung inwieweit die in der Regel nicht in Pflanzen vorkommenden Ketocarotinoide die Struktur und Funktion des LHCII aus einer Ketocarotinoide produzierenden N. tabacum - Transformante (bkt-Linie) beeinflussen und welche Auswirkungen sie auf dessen Photosyntheseapparat im Allgemeinen haben. Die bkt-Linie bildet dabei zum Teil auf Kosten ihrer primären Carotinoide sowohl das als antioxidativ und als anti-kanzerogen beschriebene Astaxanthin, als auch dessen Vorstufe Canthaxanthin und einige Derivate dieser Pigmente, die, nach vergleichenden HPLC-Analysen von Blättern und Thylakoidfraktionen, zu einem großen Teil mit der Thylakoidmembran assoziiert sind. Durch spektroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese Ketocarotinoide in Hinblick auf die Energieweiterleitung zum Chlorophyll a nicht funktionell an den LHCII binden, ihre Produktion aber die Trimerisierung dieses Lichtsammelkomplexes in N. tabacum nachhaltig beeinträchtigt. Auch die Assemblierung der PSII-LHCII-Superkomplexe wird dadurch maßgeblich gestört. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Chloroplasten der bkt-Linie verdeutlichten zudem die Beeinträchtigung der Granathylakoid-Stapelung: Sie fällt ungeordneter aus als im Wildtyp, was durch den Mangel an intakten LHCII-Trimeren begründet sein kann.
In funktioneller Hinsicht stören die Ketocarotinoide die Energieweiterleitung innerhalb des PSII und bewirken die Reduktion der photoprotektorischen, nicht-photochemischen Fluoreszenzlöschung des Wirtsorganismus nachhaltig. Zeitgleich reduzieren sie durch einen abschirmenden Effekt auf Grund ihrer Assoziation mit der Thylakoidmembran und/oder durch einen eventuellen S1-S1-Energietransfer von Chl a auf die Ketocarotinoide aber auch die Menge der Lichtenergie, die über die Lhcs an die Photosysteme weitergeleitet wird. Dadurch kommt ihnen neben dem nachhaltig störenden Einfluss auf die Intaktheit des Photosyntheseapparats zugleich auch eine schützende Wirkung vor einem Übermaß an Lichtenergie zu.
Aus Cyclotella meneghiniana sind zwei Hauptantennenkomplexe bekannt: FCPa und FCPb. Im Gegensatz zu den Lhcs der Chl a/b-haltigen Organismen binden die Lichtsammelproteine der Diatomeen das Xanthophyll Fucoxanthin anstelle des Luteins, und Chlorophyll c anstelle des Chlorophyll b. Im Gegensatz zu der bereits sehr detailliert aufgeklärten Struktur des trimeren LHCII in höheren Pflanzen, existieren für den Aufbau des FCPb in C. meneghiniana bisher nur fundierte Modellvorschläge. Diese postulieren eine homotrimere Grundstruktur für den FCPb, die zu höheren Oligomeren assembliert.
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen und der anschließenden Einzelpartikelanalyse nun erstmalig die Struktur des etwa 6-7 nm großen, trimeren FCPb gezeigt und die Richtigkeit der bisher postulierten Modellvorschläge in Hinblick auf die Struktur des Trimers bewiesen werden. Nach den hier dargelegten Erkenntnissen gleicht die Anordnung der Untereinheiten des FCPb-Trimers der des LHCII. Zudem ergibt sich aus dem Zusammenhang der hier erhobenen Daten und den in der Fachliteratur veröffentlichten Ergebnissen zum Thema FCPb ein klares Bild über die Anordnung der höheren Oligomere in Form von Nonameren. Auch diese Erkenntnisse unterstützen das ursprünglich von C. Büchel vorgeschlagene Modell für die oligomere Struktur des FCPb in C. meneghiniana.
Adaptive Radiation und Zoogeographie anisakider Nematoden verschiedener Klimazonen und Ozeane
(2013)
Anisakide Nematoden sind Parasiten aquatischer Organismen und weltweit in marinen Habitaten verbreitet. Ihre Übertragungswege sind tief im marinen Nahrungsnetz verwurzelt und schließen ein breites Spektrum pelagisch/benthischer Invertebraten (z.B. Cephalopoda, Gastropoda, Crustacea, Polychaeta) und Vertebraten (z.B. Teleostei, Elasmobranchia, Cetacea, Pinnipedia, Aves) als Zwischen- bzw. Endwirte ein. Aufgrund der hohen Befallszahlen u.a. in der Muskulatur und Viszera kommerziell intensiv genutzter Fischarten (z.B. Clupea harengus, Gadus morhua, Salmo salar) sowie ihrer Rolle als Auslöser der menschlichen Anisakiasis nehmen die Vertreter der Gattung Anisakis unter den anisakiden Nematoden eine Sonderstellung ein. Anhand der verbesserten Diagnostik und der Etablierung sowie Weiterentwicklung molekularbiologischer Methoden ist es in den letzten zwei Dekaden gelungen, die bestehende Taxonomie und Systematik der Gattung Anisakis zu erweitern bzw. zu revidieren. Aktuelle molekulare Analysen weisen auf die Existenz von insgesamt neun distinkten Arten hin, welche eine hohe genetische Heterogenität und Wirtsspezifität aufweisen, äußerlich jedoch nahezu identisch sind (sog. kryptische Arten). Trotz kontinuierlicher Forschung auf dem Gebiet ist das Wissen über die Biologie von Anisakis immer noch unzureichend.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form verfasst und umfasst drei (ISI-) Einzelpublikationen. Die Zielsetzung der durchgeführten Studien bestand unter anderem darin, unter Verwendung molekularbiologischer und computergestützter Analyseverfahren, Fragestellungen zur Zoogeographie, (Co-)Phylogenie, Artdiagnostik, Lebenszyklus-Ökologie sowie des bioindikatorischen Potentials dieser Gattung zu bearbeiten und bestehende Wissenslücken zu schließen.
Die Verbreitung von Anisakis, welche bisher ausschließlich anhand von biogeographischen Einzelnachweisen abgeschätzt wurde, konnte durch den angewandten Modellierungsansatz erstmalig interpoliert und in Kartenform vergleichend dargestellt werden. Dabei wurde gezeigt, dass die Verbreitung von Anisakis spp. in den Ozeanen und Klimazonen nicht gleichmäßig ist. Die Analysen deuten auf die Existenz spezies-spezifischer horizontaler und vertikaler Verbreitungsmuster hin, welche neben abiotischen Faktoren durch die Verbreitung und Abundanz der jeweiligen Zwischen- und Endwirte sowie deren Tiefenverteilung und Nahrungspräferenzen geprägt sind.
Durch die umfangreiche Zusammenstellung und anschließende Kategorisierung der (mit molekularen Methoden) geführten Zwischenwirtsnachweise konnten indirekte Rückschlüsse über die vertikale Verbreitung von Anisakis spp. entlang der Tiefenhabitate gezogen werden.
Während Anisakis auf Gattungsebene in der gesamten Wassersäule entlang verschiedener Tiefenhabitate abundant ist, wurde für die stenoxene Art Anisakis paggiae ein meso-/bathypelagisch orientierter Lebenszyklus postuliert. Durch den Einbezug eines breiten Spektrums (paratenischer) Zwischen- und Transportwirte aus unterschiedlichen trophischen Ebenen werden Transmissionslücken im Lebenszyklus der Gattung weitestgehend minimiert und der Transmissionserfolg auf den Endwirt, und damit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Reproduktion, erhöht. Ausgeprägte Wirtspräferenzen sowie phylogenetische Analysen des ribosomalen ITS-Markers stützen eine Theorie zur co-evolutiven Anpassung der Parasiten an ihre Endwirte. Anisakis eignet sich daher unter Einschränkungen als Bioindikator für die vertikale und horizontale Verbreitung und Abundanz der Endwirte und lässt Rückschlüsse auf trophische Interaktionen im Nahrungsnetz zu. Durch die weitere Beprobung von Zwischenwirten aus verschiedenen trophischen Ebenen in zukünftigen Studien, kann eine genauere Bewertung potentiell abweichender Lebenszyklus-Strategien gewährleistet werden. Insbesondere ist die Datenlage zur Prävalenz und Abundanz anisakider Nematoden in Cephalopoda und Crustacea noch unzureichend. Die Probennahme sollte dabei unter besonderer Berücksichtigung bislang wenig oder unbeprobter geographischer Regionen, Tiefenhabitate und Wirtsarten durchgeführt werden.
Es gibt für die Orientierung von Vögel ein allgemeingültiges Konzept, das Karte-Kompass-Prinzip (Kramer 1953, 1957): Der Karten-Schritt besteht darin, den eigenen Standort zu ermitteln und mit dem Ziel in Beziehung zu setzten. Damit wird die geografische Richtung bestimmt, die im Kompass-Schritt in eine konkrete Richtung umgesetzt wird. Für Beides nutzen Vögel auch das Magnetfeld der Erde; in der Karte als einen Faktor den Verlauf der Intensität, im Magnetkompass die Achse der Feldlinien. Der Magnetrezeptor, der die Karte mit Informationen versorgt, ist im Schnabel lokalisiert, der des Kompasses im Auge. Ich habe mich in meiner Arbeit darauf konzentriert, die zwei potenziellen Magnetrezeptoren der Vögel feinstrukturell und immunhistologisch weiter zu charakterisieren.
Für den Magnetkompass wird auf Grund des Radikalpaar-Modells angenommen, dass Cryptochrome die Rezeptormoleküle sein könnten (Ritz et al. 2000). Bei Vögeln sind vier Cryptochrome bekannt, allerdings muss das Rezeptormolekül des Magnetkompasses auch in seiner Lokalisation bestimmte Kriterien erfüllen. Die für meine Arbeit bedeutsamen Kriterien sind: (1) die gleiche Ausrichtung der Proteine in einer Rezeptorzelle und (2), dass die einzelnen Rezeptorzellen alle Raumrichtungen abdecken. Ich habe in meiner Arbeit Cryptochrom 1a (Cry1a) und Cryptochrom 1b (Cry1b) auf ihr Vorkommen in der Retina von Rotkehlchen (Erithacus rubecula) und Hühnern (Gallus gallus) untersucht. Cry1b befindet sich bei Rotkehlchen während der Zugzeit in den Ganglienzellen, in denen es teilweise an Membranen gebunden vorliegt, die jedoch keine bevorzugte Richtung haben. Somit erscheint mir Cry1b als Rezeptormolekül für den Magnetkompass als eher ungeeignet. Cry1b könnte, wie viele Cryptochrome, an der Steuerung von circadianen Rhythmen beteiligt sein. Cry1a hingegen ist bei beiden untersuchten Vogelarten in den UV/V-Zapfen an die Diskmembranen gebunden, was eine Ausrichtung ermöglicht. Die UV/V-Zapfen sind über die gesamte Retina gleichmäßig verteilt, und durch die sphärische Form des Auges decken die einzelnen Rezeptoren jede Raumrichtung ab. Somit erfüllt Cry1a die Bedingungen des Radikalpaar-Modells, und ich schließe daraus, dass es sich hierbei um das Rezeptormolekül des Magnetkompasses handeln könnte. Cry1a ändert nach Lichtabsorption wie viele Cryptochrome seine Konformation. Der von mir verwendete Antikörper bindet nur die lichtaktivierte Form des Proteins. In Versuchen, in denen Hühner verschiedenen monochromatischen Lichtern ausgesetzt wurden, zeigt sich, dass sich Cry1a in UV bis Gelb in lichtaktiviertem Zustand befindet. Dies stimmt sowohl mit der spektralen Empfindlichkeit des Magnetkompasses der Vögel als auch mit der des Flavins, des lichtsensitiven Teils des Cryptochroms, überein. Versuche mit grünem Licht lassen vorsichtige Rückschlüsse auf das für den Magnetkompass relevante Radikalpaar zu: so ist das Flavin erst im zweiten Oxidationsschritt grünlicht-sensitiv, und Cry1a ist nur nachweisbar, also lichtaktiviert, wenn der erste Schritt bereits im Hellen abgelaufen ist. Versuche in denen die Tiere vorab im Dunkeln waren, führen nicht zur erneuten Lichtaktivierung unter grünem Licht. Dies macht nur eines der beiden im Flavinzyklus entstehenden Radikalpaare wahrscheinlich, nämlich das in der Reoxidation entstehende, da das Radikalpaar im ersten Schritt der Oxidation unter Grün nicht entsteht.
In Bezug auf den Magnetrezeptor im Schnabel konnte bereits bei Tauben eine detaillierte Struktur beschrieben werden, die als Magnetrezeptor geeignet ist, nämlich Magnetit- bzw. Maghemit-Teilchen in Dendriten der Nerven (Fleissner et al. 2003). Auch Hühner haben eisenhaltige Strukturen im Oberschnabel, die in ihrer Eisenoxid-Zusammensetzung denen der Tauben entsprechen (Falkenberg et al. 2010). Ich konnte in meiner Arbeit zeigen, dass die eisenhaltigen Strukturen im Oberschnabel der adulten Hühner an oder in Nervenfasern liegen. Elektronenoptisch bestehen diese eisenhaltigen Strukturen im Nervengewebe bei Hühnern, wie bei Tauben beschrieben, aus einem 3-5 µm großen Vesikel, der von eisenhaltigen ‘Schuppen’ besetzt ist, aus circa 1 µm langen Plättchen und Kugeln mit einem Durchmesser von etwa 1 µm. Sie sind in Feldern angeordnet, in denen diese Zellstrukturen gleich ausgerichtet sind. In der Anzahl und Lokalisation der Felder der eisenhaltigen Dendriten gibt es Unterschiede zwischen Hühnern und Tauben, allerdings ist unklar, inwie¬weit dies zu Unterschieden in der Verarbeitung im Gehirn führt. Die Entwicklung der eisenhaltigen Dendriten der Hühner beginnt erst nach dem Schlupf, am Tag des Schlupfes haben Küken noch keine eisenhaltigen Strukturen, abgesehen von roten Blutkörperchen. In den ersten 5 Tagen werden eisenhaltige Makrophagen im frontalen Bereich des Schnabels gebildet, die anschließend wieder reduziert werden. Bei 12 Tage alten Hühnern werden diese auch im lateralen Bereich des Oberschnabels angelegt und ebenfalls dort bis Tag 21 wieder reduziert. 21 Tage alte Hühner haben nur noch wenige eisenhaltige Makrophagen, allerdings ein erstes Feld von eisenhaltigen Dendriten. Die Röntgenabsorption zeigt einen Unterschied in der Eisenoxid-Zusammensetzung zwischen eisenhaltigen Makrophagen und eisenhaltigen Dendriten. Es könnte sein, dass die eisenhaltigen Makrophagen an der Synthese der eisenhaltigen Dendriten beteiligt sind, da sie Eisen aufnehmen, aber auch wieder abgeben können und in demselben Zeitraum reduziert werden, wie die eisenhaltigen Dendriten aufgebaut werden.
Sowohl Tauben als auch Rotkehlchen haben sich phylogenetisch bereits vor 95 Millionen Jahren von den Hühnern abgespalten. Es gibt sowohl in der Lokalisation von Cry1a als auch in der Struktur der einzelnen eisenhaltigen Dendriten keine Unterschiede, so dass es sich bei den beiden Magnetrezeptoren der Vögel vermutlich um sehr alte Mechanismen handelt, die sich in der Evolution kaum verändert haben. Vermutlich sind sie vogelspezifisch, da es in dieser Hinsicht keine erkennbare Gemeinsamkeit mit anderen Wirbeltieren gibt.
The spider genus Eusparassus Simon, 1903 (Araneae: Sparassidae: Eusparassinae; stone huntsman spider) is revised worldwide to include 30 valid species distributed exclusively in Africa and Eurasia. The type species E. dufouri Simon, 1932 is redescribed and a neotype is designated from Portugal. An extended diagnosis for the genus is presented. Eight new species are described: Eusparassus arabicus Moradmand, 2013 (male, female) from Arabian Peninsula, E. educatus Moradmand, 2013 (male, female) from Namibia, E. reverentia Moradmand, 2013 (male, female) from Burkina Faso and Nigeria, E. jaegeri Moradmand, 2013 (male, female) from South Africa and Botswana, E. jocquei Moradmand, 2013 (male, female) from Zimbabwe, E. borakalalo Moradmand, 2013 (female) from South Africa, E. schoemanae Moradmand, 2013 (male, female) from South Africa and Namibia and E. mesopotamicus Moradmand and Jäger, 2012 (male and female) from Iraq, Iran and Turkey. 22 species are re-described six of them are transferred from the genus Olios Walckenaer, 1837. Six species-groups are proposed: the dufouri-group [8 species: E. dufouri, E. levantinus Urones, 2006, E. barbarus (Lucas, 1846), E. atlanticus Simon, 1909, E. syrticus Simon, 1909, E. oraniensis (Lucas, 1846), E. letourneuxi (Simon, 1874), E. fritschi (Koch, 1873); Iberian Peninsula to parts of north-western Africa], walckenaeri-group [3 species: E. walckenaeri (Audouin, 1826), E. laevatus (Simon, 1897), E. arabicus; eastern Mediterranean to Arabia and parts of north-eastern Africa], doriae-group [7 species: E. doriae (Simon, 1874), E. kronebergi Denis, 1958, E. maynardi (Pocock, 1901), E. potanini (Simon, 1895), E. fuscimanus Denis, 1958, E. oculatus (Kroneberg, 1846) and E. mesopotamicus; Middle East to Central and South Asia], vestigator-group (3 species: E. vestigator (Simon, 1897), E. reverentia, E. pearsoni (Pocock, 1901); central to eastern Africa and an isolated area in NW India], jaegeri-group [4 species: E. jaegeri, E. jocquei, E. borakalalo, E. schoemanae; southern and south-eastern Africa], tuckeri-group [2 species: E. tuckeri (Lawrence, 1927), E. educatus; south-western Africa). Two species, E. pontii Caporiacco, 1935 and E. xerxes (Pocock, 1901) cannot be placed in any of the above groups. Two species are transferred from Eusparassus to Olios: O. flavovittatus (Caporiacco, 1935) and O. quesitio Moradmand, 2013. 14 species are recognized as misplaced in Eusparassus, thus nearly half of the described species prior to this revision were placed mistakenly in this genus. Neotypes are designated for E. walckenaeri from Egypt, E. barbarus, E. oraniensis and E. letourneuxi (all three from Algeria) to establish their identity. The male and female of Cercetius perezi Simon, 1902, which was known only from the immature holotype, are described for the first time. It is recognized that the monotypic and little used generic name Cercetius Simon, 1902 — a species, which had been known only from the immature holotype — as a synonym of the widely used name Eusparassus. The case proposal 3596 (conservation of name Eusparassus) is under consideration by ICZN.
The first comprehensive molecular phylogeny of the family Sparassidae with focus on the genus Eusparassus is investigated using four molecular markers (mitochondrial COI and 16S; nuclear H3 and 28S). The monophyly of Eusparassus and the dufouri, walckenaeri and doriae species-groups are recovered with the latter two groups more closely related. The monophyly of the tuckeri-group is not supported and the position of E. jaegeri as the only available member of the jaegeri-group is not resolved within the Eusparassus clade. DNA samples of the vestigator-group were not accessible for this study. The origination of the genus Eusparassus around 70 million years ago (MA) is estimated according to molecular clock analyses. Using this recent result in combination with some biogeographic and geological data, the Namib Desert is proposed as the place of ancestral origin for Eusparassus and putative Eusparassinae genera.
Further analyses are done on the phylogenetic relationships of Sparassidae and its subfamilies. The Eusparassinae are not confirmed as monophyletic, with the two original genera Eusparassus and Pseudomicrommata in separate clades and only the latter clusters with most other assumed Eusparassinae, here termed the "African clade". Monophyly of the subfamilies Sparianthinae, Heteropodinae sensu stricto, Palystinae and Deleninae is recovered. The Sparianthinae are supported as the most basal clade, diverging considerably early (143 MA) from all other Sparassidae. The Sparassinae and genus Olios are found to be polyphyletic. The Sparassidae are confirmed as monophyletic and as most basal group within the RTA-clade. The divergence time of Sparassidae from the RTA-clade is estimated with 186 MA in the Jurassic. No affiliation of Sparassidae to other members of the "Laterigradae" (Philodromidae, Selenopidae and Thomisidae) is observed, thus the crab-like posture of this group was proposed a result of convergent evolution. Only the families Philodromidae and Selenopidae are found members of a supported clade. Including a considerable amount of RTA-clade representatives, the higher-level clade Dionycha is not but monophyly of the RTA-clade itself is supported.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der i-AAA Protease in P. anserina, besonders während des Alterns des Ascomyceten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. Unter Standardbedingungen ist der PaIap-Deletionsstamm langlebiger als der Wildstamm, ohne feststellbare physiologische Beeinträchtigungen aufzuweisen. Dass dies auf den Verlust von PaIap zurückzuführen ist, bestätigen die PaIap-Revertantenstämme, in denen das Gen wieder eingeführt wurde, wodurch deren Lebensspanne wieder Wildtyp-artig ist. Dies zeigt, dass PaIAP zelluläre Prozesse beeinflusst, die die Lebensspanne kontrollieren.
2. Bei Hitzestress weist der PaIap-Deletionsstamm dagegen eine höhere Hitzesensitivität auf als der Wildstamm, was sich in einer verkürzten Lebensspanne und der Störung vitaler Funktionen äußert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PaIAP bei der Hitzestressantwort hin.
3. Im Einklang mit dem hitzesensitiven Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms konnte in mitochondrialen Extrakten des Wildtyps gezeigt werden, dass die Proteinmenge von PaIAP durch Hitzestress signifikant zunimmt. Gleichzeitig weisen mitochondriale Proteinextrakte von PaIap-Deletionsstämmen nach Hitzestress signifikant geringere Mengen an PaHSP60 und PaCLPP auf, zwei weiteren Komponenten der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle. Dies unterstreicht die Beteiligung von PaIAP an der Hitzestressantwort von P. anserina.
4. Darüber hinaus beeinflusst der Verlust von PaIap die Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette und führt bei 27°C zu einer vermehrten Organisation der Komplexe in stabilere Superkomplexe. Dieser Mechanismus wird beim Wildstamm erst nach Hitzestress beobachtet, wogegen der PaIap-Deletionsstamm die Superkomplexmenge nicht mehr weiter steigern kann.
5. Die Genexpression von proteolytisch inaktiven Varianten von PaIAP (PaIAPE540Q bzw. PaIAPE540QG) kann den Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms bei 27°C nicht komplementieren und führt ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne von P. anserina. Dies liefert wichtige Informationen über den Mechanismus wie PaIAP die Lebensspanne von P. anserina beeinflusst, da dazu die proteolytische Aktivität von PaIAP benötigt wird.
6. Darüber hinaus zeigt die Analyse des PaIap/PaClpP-Deletionsstamms, dass sich die Mechanismen, wie PaIAP und PaCLPP die Lebensspanne von P. anserina beeinflussen, unterscheiden. Die unterschiedlichen zellulären Aufgaben werden auch bei Hitzestress deutlich, wovon der PaIap/PaClpP-Deletionsstamm noch stärker betroffen ist als durch die Deletion von PaIap bzw. PaClpP. Dies verdeutlicht, dass sich die Effekte der Deletionen der beiden Gene addieren.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die i-AAA Protease PaIAP auch bei P. anserina wichtige zelluläre Funktionen besitzt, die sich auf den Alterungsprozess des Ascomyceten auswirken. Dabei war es möglich verschiedene neue Mechanismen zu identifizieren, wie die i-AAA Protease diese Funktionen ausübt. Dazu gehören z.B. der Einfluss der proteolytischen Aktivität auf die Lebensspanne, die durch die Abwesenheit der i-AAA Protease ausgelöste Reorganisation der Atmungskettenkomplexe in stabile Superkomplexe, und die Induktion der Hitzestressantwort durch PaIAP. Diese Befunde tragen zum besseren Verständnis der zellulären Funktion der i-AAA Protease bei und stellen einen entscheidenden Ausgangspunkt für weiterführende Analysen der bislang wenig verstandenen Aufgaben der Protease dar.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bestimmte neuronale microRNAs im Rückenmark und in den Spinalganglien konstitutiv exprimiert und nach peripherer Entzündung mit Formalin oder Zymosan differenziell reguliert werden. Bei der SNI-induzierten Neuropathie konnte indessen keine signifikante Regulation der untersuchten microRNAs nachgewiesen werden. Aufgrund der Lokalisation in den Neuronen der Schmerz-verarbeitenden Laminae I und II des Dorsalhorns des Rückenmarks und angesichts der Regulation in entzündlich stimulierten Neuronen und Mikroglia wurde der Fokus der Arbeit auf die Untersuchung von microRNA-124a gelegt. Anhand von Expressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass eine periphere entzündliche Stimulation mit Formalin oder Zymosan microRNA-124a im Rückenmark inhibiert, die Expression pro-inflammatorischer und pro-nozizeptiver Gene hiernach ermöglicht und ein vermehrtes Schmerzverhalten bewirkt. Die funktionelle Relevanz von microRNA-124a wurde in vivo mittels intravenöser Applikation von microRNA-124a-Modulatoren bei einem Modell für entzündliche Schmerzen, dem Formalin-Modell untersucht. Dabei führte die Hemmung von microRNA-124a zu einem verstärkten Schmerzverhalten, welches mit einer Hochregulation verschiedener Entzündungsmarker einherging. Die Überexpression von microRNA-124a dagegen antagonisierte die Hochregulation entzündlicher Mediatoren und führte zu einer Schmerzhemmung. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit der antinozizeptive Effekt von microRNA-124a mit der Regulation der Epigenetik-regulierenden Targets MeCP2, HDAC5 und MYST2 assoziiert werden und u.a. über die Hemmung des neuromodulierenden, pro-inflammatorischen Peptids BDNF verifiziert werden. Die spezielle Darreichung von microRNA-124a könnte demzufolge einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie chronisch-entzündlicher Schmerzen liefern. Zukünftig werden weitere Studien notwendig sein um die eindeutige Funktion, die individuelle Wirkung sowie die therapeutische Relevanz von microRNA-124a zu analysieren. Darüber hinaus müssten Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Nebenwirkungsprofile für microRNA-124a erstellt werden, um potenzielle Risiken, Chancen und Vorteile der microRNA-Modulation hinsichtlich einer humanen Schmerztherapie bewerten zu können.
Es gibt viele Theorien, die sich mit der Auswirkung einer zunehmenden carnivoren Ernährung von Homininen auf Carnivorengilden beschäftigen. Aussterbeereignisse in der Carnivorengilde werden oft mit carnivoren Homininen in Verbindung gebracht. Um zu prüfen, ob solche Theorien überhaupt zutreffen, benötigt man zunächst ein Modell, das Effekte von Konkurrenzbeziehungen innerhalb von Carnivorengilden quantifiziert darstellt.
In dieser Arbeit ist daher ein Modell entwickelt worden, das die Konkurrenz um Beute innerhalb einer Carnivorengilde darstellt und ermöglicht Veränderungen durch das Eintreten neuer Mitglieder in die Gilde zu modellieren. Dieses Modell wurde zur Analyse der rezenten Großcarnivorengilden der Serengeti, des Krüger-National-Parks und des Bandipur-Biosphärenreservat verwendet. Ebenso ist es zur Analyse pleistozäner Großcarnivorengilden Javas eingesetzt worden.
In dem Modell wird die verfügbare Beutemasse als limitierende Ressource für die Carnivorengilde betrachtet. Im ersten Schritt wird die Beute kategorisiert – in dieser Arbeit nach ihrer Körpermasse – und geprüft, welche Mitglieder dieselben Beutekategorien nutzen und welche für sie essentiell sind. Im zweiten Schritt wird die konkurrenzfreie Kapazität der Gildenmitglieder berechnet. Hierzu wird die für die gesamte Gilde verfügbare Beutemasse unter der Annahme verwendet, sie stehe einem Gildenmitglied allein zur Verfügung. Die konkurrenzfreie Kapazität ist daher die Populationsgröße, die ein Gildenmitglied mit dieser Beutemasse erreichen kann und stellt einen Referenzwert dar. Basierend auf diesem Referenzwert und der tatsächlichen Populationsgröße kann nun berechnet werden, zu welchem Anteil ein Mitglied diese Kapazität ausschöpft. Ist der Konsum an Beutemasse der übrigen Mitglieder in den essentiellen Beutekategorien bekannt, kann berechnet werden, zu welchem Anteil ein Mitglied durch ein anderes Mitglied von dieser Kapazität verliert. Dieser Verlust an Kapazität wird als Konkurrenzeffekt bezeichnet.
Dieses Modell ist sowohl auf rezente als auch fossile Gilden anwendbar. Um mit dem Modell die Konkurrenzeffekte zu berechnen, werden die Häufigkeit bzw. Populationsgröße, das Beutemassenspektrum sowie der tägliche Bedarf an Beutemasse benötigt.
Diese Größen können bei der Strukturanalyse von rezenten Gilden aus Freilandstudien entnommen werden. Im Falle fossiler Gilden müssen diese Größen erst rekonstruiert werden. Dafür sind in dieser Arbeit vorhandene Rekonstruktionsmethoden ergänzt, aber auch entwickelt worden, mit denen man basierend auf der Körpermasse fossiler Carnivora die benötigten Parameter rekonstruieren kann. Hierzu sind verschiedene Regressionen berechnet worden, die einen Zusammenhang zwischen verschiedenen Zahnparametern und der Körpermasse darstellen. Weiterhin sind Muster der Beutemassenspektren rezenter Carnivora untersucht worden und Regressionen berechnet worden, die zur Rekonstruktion der mittleren Beutemasse eines Carnivoren verwendet werden.
Die benötigten Daten der javanischen Gilden werden mit den eben genannten Regressionen rekonstruiert. Anschließend wird eine Strukturanalyse der genannten rezenten und fossilen Großcarnivorengilden durchgeführt.
Bei den drei rezenten Gilden ist eine generelle sich wiederholende Struktur erkennbar. Die erfolgreichsten Mitglieder schöpfen ihre Kapazität zu ca. 60 % aus und verfolgen eine soziale Lebensweise.
Dennoch werden die erfolgreichsten Mitglieder der Gilden von unterschiedlichen Arten repräsentiert. So sind dies der Löwe im Krüger-Nationalpark, die Tüpfelhyäne in der Serengeti oder der Rothund in Bandipur.
Bei den fossilen Gilden war diese Struktur allerdings nicht erkennbar. Hier schöpft der Tiger seine Kapazität in allen Gilden am stärksten aus und hat extrem hohe Konkurrenzeffekte (bis zu ca. 98 %) auf die übrigen Gildenmitglieder.
Diese Unterschiede können mit Isolationsbedingungen Javas als Insel zusammenhängen, die sich grundsätzlich auf Strukturen der Säugergemeinschaften auswirken.
Vermutlich konnte der Tiger durch Veränderungen der Körpermasse seine konkurrenzstarke Position in der Großcarnivorengilde Javas halten.
Das entwickelte Modell ermöglicht auch eine Modellierung von Szenarien, die verschiedene Möglichkeiten berücksichtigt. Diese sind vor allem Veränderungen der Populationsgrößen, aber auch Veränderungen der Körpermasse und daraus resultierende Verschiebungen der Beutemassenspektren.
In Beispielen der Trinil-Gilde wird gezeigt, dass die Rolle eines hyper- bzw. hypocarnivoren Homo erectus in der Gilde mit dem entwickelten Modell dargestellt werden kann. Auch lassen sich Szenarien modellieren, in denen ein hyper- bzw. hypocarnivorer Homo erectus in die Gilde eindringt und so die übrigen Mitglieder von bei ihrer Kapazitätsausschöpfung Einbuße hinnehmen müssen.
In dem Szenarium von Trinil wird erkennbar, dass nur ein hypercarnivorer Homo erectus einen starken Effekt auf die Gildenmitglieder hatte. Geht man von einem omnivoren Homo erectus aus, ist der Konkurrenzeffekt geringer und es sind keine Aussterbeereignisse zu erwarten.
Das Modell kann in weiteren Studien zur Testung von Hypothesen zu Aussterbeereignissen Aufklärung bieten. Durch Einbeziehung weiterer Faktoren wie Kleptoparasitismus und interspezifische Tötungen kann es noch erweitert werden. Auch eine Dynamisierung des Modells, die eine kontinuierlich zeitliche Veränderung der Gilden modellieren kann, ist in zukünftigen Studien möglich.
Climate and subsequent environmental changes are regarded as one driver of species evolution. Against this background the present study investigates the evolutionary history of the mammalian family Bovidae (Cetartiodactyla, Mammalia), today the most species-rich family of large herbivores on the African continent. Temporal and spatial patterns in that group’s evolution are the focus of the present study and were investigated using methods and data deriving from multiple disciplines (palaeontology, genetics, climatology, conservation biology). The results serve as a validation of macroevolutionary hypotheses of species evolution.
A major proportion of African mammalian fossils can be assigned to that family. Due to their morphological adaptations, bovid species are highly indicative of their habitats. Hence, bovids are of great importance for paleontology. However, a strong taphonomic bias is present in the fossil record of bovids, favoring large and arid- adapted species. Molecular phylogenies of extant species and species distribution modelling combined with climate reconstructions can help to overcome these limitations.
A molecular phylogeny, based on the cytochrome b gene of 136 bovid species served as basis for analysis of temporal patterns. Divergence events were dated using the relaxed molecular clock approach. The tree was time calibrated at 30 nodes using information inferred from the fossil record. Lineage-Through-Time plots and the respective statistical analyses reveal detailed temporal patterns in the evolutionary history of tribes and groups combining arid- and humid-adapted tribes. The resulting pattern shows three distinct phases. Phase 1 (P1) is dominated by speciation events within the humid group, while the second phase (P2) is marked by a dominance of speciation within the arid group. The switch in diversification rates (BDS) from P1 to P2 is dated to 2.8 million years ago. The third phase (P3) shows low diversification rates for all groups, starting around 1.4 million year ago and culminates in a significantly reduced diversification rate for the complete family at 0.8 million years ago. Both transitions are contemporaneous with global climate changes and turnover events in fossil faunal communities.
To investigate the impact of climate changes onto the habitat availability within the last 3 million years and its putative influence on diversification rates, the species distribution modeling method was applied. For 85 African species and subspecies the climate niches were established and grouped into 5 climate-groups based on their climate preferences. For each group the available habitat for the period before and after the BDS was calculated on continental scale using reconstructed climate scenarios. To evaluate the modeled habitat distributions, regional analyses were performed in test areas surrounding well studied fossil sites (Laetoli, Olduvai, Chiwondo Beds, Lothagam, Koobi Fora, West Turkana, Swartkrans, Sterkfontain und Toros-Menalla). Habitat profiles (HP) permitted the comparison of the model based habitat reconstruction with the interpretations of classic paleontological reconstruction. The validity of the habitat modeling has been shown in particular for East African test areas. The reconstructions for the northern and southern fossil sites does not support the modeled habitats in these areas. Yet, the method of habitat- profiling may serve as suitable tool for environmental reconstruction of areas lacking sufficient paleontological material. A comparison of habitat availability before and after the BDS on continental scale identified a significant loss of habitat for humid adapted groups (7-22%) and habitat gain for arid adapted groups (19-173%). The climatically intermediate group experiences a tremendous gain of habitat (3366%). The greatest environmental change was modeled for East Africa, initiated by a progressive regional aridification.
In addition to the distribution modeling for past climate conditions, the geographical distribution was modeled for the future, i.e. for climate scenarios representing the years 2050 and 2080 under a putative climate change scenario (global surface warming). It was shown that in particular the arid groups have to expect a remarkable loss of habitat (41-76%), while a gain of available habitat can be expected for the humid adapted groups (114-577%). The climatically intermediate group suffers the strongest habitat loss (85%). Regions with locally stable climate conditions were detected and may serve as potential refugia and are already today known as Africa’s hot spots of biodiversity.
The results show a positive correlation of high diversification rates and increasing habitat availability. None of the tested speciation hypotheses taken alone explains the observations (e.g., Turnover-pulse Hypothesis, Relay Model). A major element in these hypotheses is the passive fragmentation of populations induced by unfavorable climate changes. In contrast, the Periodic Model (Grubb 1999) considers natural, periodically recurring climate changes and moreover, the active dispersal of individuals and resulting founder events. I added the effect of a superimposed directed climate trend – like the progressive aridification since the late Pliocene in Africa – which leads to a bias in the proportion and probability towards leading edge effects. This Directed Periodic Model explains the patterns found in the evolution of Bovidae.
The combination of a molecular phylogeny and species distribution modeling, together with information inferred from the fossil record, reveals remarkable temporal and spatial patterns in the evolution of bovids, and helps overcome the limitations of the fossil record. The present study highlights the importance of active dispersal and founder populations in speciation processes. A point widely unattended in speciation hypotheses. The fully dated molecular phylogeny is the most densely sampled tree for the family Bovidae to date and may serve as a framework for a connection of present and future population studies, permitting the connection of medium-scale with long- term effects induced by climate and environmental changes.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
The environmental impact of climate change is meanwhile not only discussed in the scientific community but also in the general public. However, little is known about the interaction between climate change and pollutants like pesticides. A combination of multiple stressors (e.g. temperature, pollutants, predators) may lead to severe alterations for organisms such as changes in time of reproduction, reproductive success and growth performance, mortality and geographic distribution. The questions if aquatic organisms tend to react more sensitive towards incidents under climate change conditions remains. Therefore, within the present thesis the aquatic ecotoxicological profile of the fungicide pyrimethanil, as an exemplarily anthropogenic used contaminant, was examined.
A large test battery of ecotoxicological standard tests and supplement bioassays with non-model species was conducted to investigate if species-specific or life stage-specific differences occur or if temperature alteration may change the impact of the fungicide. Two of the most sensitive species (Chironomus riparius and Daphnia magna) were used to investigate the acute and chronic thermal dependence of pyrimethanil effects. The results clearly depict that the ecotoxicity of pyrimethanil at optimal thermal conditions did not depend on the trophic level, but was species-specific. With regard to EC10 values the acute pyrimethanil toxicity on C. riparius increased with higher temperature (6.78 mg L-1 at 14°C and 3.06 mg L-1 at 26°C). The chronic response of D. magna to the NOEC (no observed effect concentration) of the fungicide (0.5 mg L-1) was examined in an experiment which lasted for several generations under three simulated near-natural temperature regimes (‘cold year, today’ (11 to 22.7°C), ‘warm year, today’ (14 to 25.2°C) and ‘warm year, 2080’ (16.5 to 28.1°C)). A pyrimethanil-induced mortality increase was buffered by the strongly related increase of the general reproductive capacity, while population growth was stronger influenced by temperature than by the fungicide. At a further pyrimethanil concentration (LOEC – lowest observed effect concentration: 1 mg L-1), a second generation could not be established by D. magna under all thermal regimes.
Besides daphnids, the midge C. riparius was used for a second multigeneration study. In a bifactorial test design it was tested if climate change conditions alter or affect the impact of a low fungicide concentration on life history and genetic diversity. The NOAEC/2 (half of the no observed adverse effect concentration derived from a standard toxicity test) was used as a low pyrimethanil concentration to which laboratory populations of the midges were chronically exposed under the mentioned temperature scenarios. During the 140-day-multigeneration study, survival, emergence, reproduction, population growth, and genetic diversity of C. riparius were analyzed. The results reveal that high temperatures and pyrimethanil act synergistically on life history parameters of C. riparius. In simulated present-day scenarios, a NOAEC/2 of pyrimethanil provoked only slight to moderate beneficial or adverse effects. In contrast, an exposure to a NOAEC/2 concentration of pyrimethanil at a thermal situation likely for a summer under the future expactations uncovered adverse effects on mortality and population growth rate. In addition, genetic diversity was considerably reduced by pyrimethanil in the ‘warm year, 2080’ scenario, but only slightly under current climatic conditions. The multigeneration studies under near-natural thermal conditions indicate that not only the impact of climate change, but also low concentrations of pesticides may pose a reasonable risk for aquatic invertebrates in the future. This clearly shows that thermal and multigenerational effects should be considered when appraising the ecotoxicity of pesticides and assessing their future risk for the environment.
In addition to temperature further multiple abiotic and biotic stressors alterate pollutant effects. Moreover, to better discriminate and understand the intrinsic and environmental correlates of changing aquatic ecosystems, it was experimentally unraveled how the effects of a low-dose of pyrimethanil on daphnids becomes modified by different temperatures (15°C, 20°C, 25°C) and in the presence/ absence of predator kairomones of Chaoborus flavicans larvae. The usage of a fractional multifactorial test design provided the possibility to investigate the individual growth, reproduction and population growth rate of Daphnia pulex via different exposure routes to the fungicide pyrimethanil at an environmentally relevant concentration (0.05 mg L-1) - either directly (via the water phase), indirectly (via algae food), dually (via water and food) or for multiple generations (fungicide treated source population).
The number of neonates increased with increasing temperatures. At a temperature of 25°C no significant differences between the individual treatment groups were observed although the growth was overall inhibited due to pyrimethanil. Besides, at 15 and 20°C it is obvious that daphnids which were fed with contaminated algae had the lowest reproduction and growth rate. The obtained results clearly demonstrate that multiple stress factors can modify the response of daphnids to pollutants. The exposure routes of the contaminant are of minor importance, while temperature and the presence of a predator are the dominant factors impacting the reproduction of D. pulex. It can be concluded that low concentrations of pyrimethanil may disturb the zooplankton community at suboptimal temperature conditions, but the effects will become masked if chaoborid larvae are present. Therefore it seems necessary to observe prospectively if the combination of several stress factors like pesticide exposure and suboptimal temperature may influence the life history and sensitivity of several aquatic invertebrates differently.
Besides standard test organisms it is inevitable to conduct test with aquatic invertebrate which are not yet considered regularly in ecotoxicological experiments. For example molluscs represent one of the largest phyla of macroinvertebrates with more than 100.000 species, being ecologically and economically important. Therefore, within the present study embryo, juvenile, half- and full-life cycle toxicity tests with the snail Physella acuta were performed to investigate the impact of pollutants on various life stages. Different concentrations of pyrimethanil (0.06-0.5 or 1.0 mg L-1) assessed at three temperatures (15°C, 20°C, 25°C) revealed that pyrimethanil caused concentration-dependent effects independent of temperature. Interestingly, the ecotoxicity of pyrimethanil was higher at lower temperature for the embryo hatching and F1 reproduction, but its ecotoxicity for the growth of juveniles and the F0 reproduction increased with increasing temperature. More specifically, it could have been observed that especially during the reproduction test high mortality rates occurred at the highest concentration of 1 mg L-1 at all temperatures. Due to high mortality rates no snails were available for the F1 at the highest concentrations (0.5 and 1.0 mg L-1). Compared to the F0, overall more egg masses were produced in the F1, being all fertile and no mortality occurred. For the F1-generation the strongest pyrimethanil effects were detected at 15°C. A comparison of effect concentrations between both generations showed that the F1 is more sensitive than the F0.
These results indicate that an exposure over more than one generation may give a better overview of the impact of xenobiotics. With the establishment of an embryo and reproduction test under different temperatures and various concentrations of pyrimethanil with P. acuta we could successfully show that molluscs can respond more sensitive than model organisms and that both, chemical and thermal stressor strongly influence the behaviour of the pulmonates. It can be concluded that the high susceptibility for the fungicide observed in gastropods clearly demonstrates the complexity of pesticide-temperature interactions and the challenge to draw conclusions for the ecotoxicological risk assessment of pesticides under the impact of global climate change.
Ziel dieser Arbeit war es erstmals durch eine Kombination aus chemischer Mutagenese und gezielter genetischer Modifikation (hier: „metabolic engineering“) einen Phaffia-Stamm herzustellen, welcher über die Mutagenese hinaus über eine weiter verstärkte Astaxanthin-Synthese verfügt.
Die von „DSM Nutritional Products“ bereitgestellten chemischen Mutanten wurden analysiert und über einen Selektionsprozess auf Pigmentstabilität und Wachstum hin optimiert, da die Stämme aus cryogenisierter Dauerkultur starke Pigmentinstabilitäten und ein verzögertes Wachstum aufwiesen.
Über eine exploratorische Phase wurde die Carotinoidsynthese analysiert und festgestellt, dass in den Mutanten keine Einzelreaktionen betroffen sind, welche für die Heraufregulierung der Carotinoidsynthese in den Mutanten verantwortlich sind. Hierbei wurden Limitierungen identifiziert und diese durch Transformation von Expressionsplasmiden mit geeigneten Genen aufgehoben, um damit eine noch effizientere Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen hin zu Astaxanthin zu erreichen. Eine Überexpression der Phytoensynthase/Lycopinzyklase crtYB resultierte in einem gesteigerten Carotinoidgehalt bei gleichbleibendem Astaxanthin- Anteil. Durch eine zweite Transformation mit einer Expressionskassette für die Astaxanthin-Synthase asy konnte der Carotinoidgehalt weiter gesteigert und zusätzlich eine Limitierung der Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen behoben werden, sodass die Transformante nahezu alle Intermediate der Astaxanthinsynthese zu Astaxanthin metabolisieren konnte (Gassel et al. 2013). Es konnte gezeigt werden, dass auch in den Mutanten, aus Experimenten mit dem Wildtyp bekannte, Limitierungen identifiziert und ausgeglichen werden konnten.
Die vorliegende, publikationsbasierte Dissertation, bestehend aus den drei Einzelpublikationen Bayer (2011, 2012) und Bayer und Schönhofer (2012), verfolgte das Ziel, die Spinnenfamilie Psechridae zu revidieren. Weiterhin sollten die phylogenetische Position dieser Familie im System der höheren Webspinnen (Araneomorphae) sowie die phylogenetischen Beziehungen der einzelnen Arten innerhalb der beiden Gattungen der Psechridae untersucht werden. In Form von morphologisch-taxonomischen Bearbeitungen wurden die beiden die Psechridae bildenden Gattungen Psechrus und Fecenia revidiert, wobei sämtliches Typus-Material sowie reichhaltiges, weiteres Material eingehend beschrieben, illustriert und diagnostiziert wurde. Hierbei wurden auch intraspezifische Variabilität sowie die Prä-Epigynen subadulter Weibchen, die in taxonomischen Arbeiten bislang nur eine unwesentliche Rolle gespielt haben, beschrieben, illustriert und taxonomisch ausgewertet. Zudem wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bereits Überlegungen über mögliche Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der beiden Gattungen angestellt. ...
Die Makrophytenvegetation eines stillgelegten Kanalabschnittes ("Alte Fahrt") bei Senden in Westfalen hat sich seit Beginn der 90er Jahre drastisch verändert. Aus einem typischen Potamogetonetum lucentis sind Reinbestände von Myriophyllum spicatum geworden, denen stellenweise Ceratophyllum demersum beigemischt ist. Die Ursachen für diese gravierenden Vegetationsveränderungen sind nicht klar. Da es sich um einen der bedeutendsten westfälischen Standorte des Potamogetonetum lucentis, einer in Nordrhein-Westfalen stark gefährdeten Pflanzengesellschaft, handelte, sind weiterführende Untersuchungen und Versuche zur Wiederansiedlung zu fordern.
Die nicht-konventionelle Hefe P. ciferrii produziert große Mengen der tetra-acetylierten Sphingoidbase Phytosphingosin (TAPS). Sphingoidbasen sind essentielle Komponenten des stratum corneums, der multilamellaren Barriere der menschlichen Haut, und daher in der Kosmetik-Industrie von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die biotechnologische Produktion der Sphingoidbasen Phytosphingosin, Sphinganin und Sphingosin auf molekularbiologischer Ebene in P. ciferrii charakterisiert und optimiert werden. Die Hefe P. ciferrii konnte durch Etablierung einer einfachen und hoch-effizienten Transformations-Methode auf genetischer Ebene leicht zugänglich gemacht werden. Durch Inaktivierung des für NHEJ essentiellen PcLIG4 Gens konnte die Effizienz zielgerichteter genomischer Integrationen von transformierten DNA-Konstrukten von 1 % auf 87 % erhöht werden. Die Etablierung des Cre-loxP Systems erlaubte das mehrfache Verwenden eines Selektions-Markers wodurch sukzessiv mehrere genomische Integrationen in einem Stamm ermöglicht wurden. Durch diese Errungenschaften konnte das Ziel „Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe P. ciferrii“ im Folgenden erfolgreich verfolgt werden. Der initiale Schritt der Sphingoidbasen-Biosynthese ist die von der Serin-Palmitoyl-Transferase katalysierte Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA. Durch die Deletion von Genen, die am L-Serin-Katabolismus von P. ciferrii beteiligt sind (PcSHM1, PcSHM2und PcCHA1), konnte die de novo Sphingoidbasen-Biosynthese optimiert werden und führte in einem lig4? Stamm zu einer etwa dreifachen Erhöhung der TAPS-Produktion. Weitere Ansätze den (vermutlich durch L-Serin feed back regulierten) L-Serin-Biosyntheseweg bzw. die in vivo L-Serin-Verfügbarkeit zu optimieren, führten nicht zu einer gesteigerten TAPS-Produktion. Durch weitere Deletion und Überexpression von Genen des Sphingolipid-Stoffwechsels konnte die TAPS-Produktion jedoch um ein Vielfaches verbessert werden. So konnte ein Stamm konstruiert werden, der die Gene PcLCB1, PcLCB2 und PcSYR2 überexprimiert und Deletionen der Gene PcSHM1, PcSHM2, PcCHA1, PcLCB4 und PcORM12 trägt. Dieser Stamm (CSS.L4.O.L2.L1.S2) wies eine mehr als fünffach erhöhte maximale spezifische TAPS-Produktbildungsrate (q Pmax ) auf und produzierte mit 2 g * L rund siebenmal mehr TAPS als der lig4? Ausgangsstamm, weshalb ein Einsatz dieses Stammes für die industrielle TAPS-Produktion denkbar wäre. Ausgehend von einem für die TAPS- (und somit Sphingoidbasen-) Produktion optimierten Stamm sollten Stämme mit optimierter TriASa- oder TriASo-Produktion für industrielle Zwecke generiert werden. Es stellte sich allerding heraus, dass erhöhte Mengen dieser Sphingoidbasen wahrscheinlich wachstumshemmend für P. ciferrii sind, weshalb eine weitere Produktions-Optimierung nicht ohne Weiteres möglich ist. In einem Laborstamm gelang es jedoch, durch Konstruktion und anschließende Transformation eines optimierten integrativen Plasmids (trägt die Gene, die für die Produktion von Sphingosin bzw. TriASo nötig sind) eine TriASo-Produktion von bis zu 30 mg * g (BTM) zu erzielen, wobei gleichzeitig die Bildung des Nebenprodukts TriASa auf weniger als 4 mg * g (BTM)reduziert wurde. Weiterhin konnte durch Deletion von PcSCS7 in einem TriASo-Produktionsstamm die TriASa-Produktion mehr als vierfach reduziert werden. Die Bildung eines weiteren von P. ciferrii gebildeten Nebenproduktes [Tri-Acetyl-Sphingadienin (TriASd)] konnte durch Deletion des PcSLD1 Gens unterbunden werden. Nach Inaktivierung von PcSCH9 konnte eine fast 20 %ige Verbesserung der TriASo-Produktion erreicht werden. Es konnten zwei putative Acetyl-Transferasen identifiziert werden (PcAft2 und PcSli1), die an der Acetylierung von Phytosphingosin (zu TAPS), Sphinganin (zu TriASa) und Sphingosin (zu TriASo) beteiligt sind. Die Aufklärung und Optimierung dieser von PcAtf2 und PcSli1 katalysierten Schritte sind vielversprechende Ansatzpunkte die Sphingoidbasen-Produktion in P. ciferrii weiter zu optimieren.
European pea crabs - taxonomy, morphology, and host-ecology (Crustacea: Brachyura: Pinnotheridae)
(2010)
Pinnotherids are small crabs symbiotic to a variety of invertebrates. The European species infest bivalves and sea squirts. Their way of life is parasitic and poses a threat to commercially exploited bivalves. While juveniles of both sexes still look very similar - being agile swimmers and partially free living - a metamorphosis takes place in the female after mating and results in a conspicuous sexual dimorphism. Thereafter, the female settles in its host definitely and is morphologically strongly adapted to the parasitic life phase. A very high reproductive output was demonstrated among several pea crab species infesting bivalves. Despite from that, hardly any information is present in the literature on the pinnotherids’ reproductive biology and the underlying morphology.
Due to their cryptic way of life, the sexual dimorphism, and the different morphotypes of the female, the taxonomy of the Pinnotheridae is a serious challenge. Two widely accepted species are recognized on European coasts: Pinnotheres pisum and Nepinnotheres pinnotheres. Pinnotheres pectunculi was so far only known from the bivalve Glycymeris glycymeris in its type locality Roscoff (France), while Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni were described as living exclusively in ascidians without careful comparison with the previously described species. In order to produce standardized comparative descriptions, pea crabs were collected and studied from different hosts and localities in the Northeast Atlantic and in the Mediterranean. Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum were redescribed with consideration to characters of female and male. According to our morphological analysis, Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni are junior synonyms of Nepinnotheres pinnotheres, whereas the status of Pinnotheres pectunculi as a valid species was ascertained. Important characters are the mouthparts, the male gonopods, and especially chelipeds that showed consistent characteristics among different crab stages of both sexes.
Based on our sampling, we estimated the host-range of the European species. Nepinnotheres pinnotheres lives in ascidians and in the pen shell Pinna nobilis. Pinnotheres pisum infests numerous bivalve species - Pinna nobilis included. For Pinnotheres pectunculi novel host records are presented, all from the bivalve family Veneridae. Furthermore, feeding of the Pinnotheres-species was observed. They use a setae comb ventrally on the claw to brush mucus (and the accumulated food particles) from the bivalve gills. Feeding strategies and host-ecology will be thoroughly discussed in consideration to other Pinnotheridae.
We investigated the reproductive systems of European pinnotherids by histological methods, scanning and transmission electron microscopy, and confocal laser scanning microscopy.
The Eubrachyura have internal fertilization: paired vaginas enlarge into storage structures, the spermathecae, which are connected to the ovaries by oviducts. Sperm is stored until the oocytes are mature and transported into the spermathecae, where fertilization takes place. In the investigated pinnotherids, the vagina is of the ‘concave pattern’. Musculature is attached alongside flexible parts of the vagina-wall to control the dimension of its lumen. The genital opening is closed by a muscular mobile operculum.
The spermatheca can be divided into two distinct regions by function and morphology. The ventral part includes the connection with vagina and oviduct and is regarded as the zone where fertilization takes place. It is lined with cuticle except where the oviduct enters the spermatheca by the ‘holocrine transfer tissue’. At ovulation, the oocytes have to pass through this multi-layered glandular epithelium, which has a holocrine mode secretion. The dorsal part of the spermatheca is lined by a highly secretory apocrine glandular epithelium, which was to date only found in fiddler crabs of the genus Uca.
The male internal reproductive system consists of paired testes and corresponding vasa deferentia. The sperm morphology of pinnotherids conforms to other thoracotremes, with slight differences between Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum. Spermatozoa become enveloped into spermatophores in the secretory proximal vas deferens. The medial vas deferens is strongly enlarged and stores spermatophores embedded in seminal plasma. The distal vas deferens holds tubular appendices, which extend into the ventral cephalothorax and slightly into the pleon. These appendices produce and store vast quantities of seminal plasma. The copulatory system of the Brachyura is formed by paired penes and two pairs of gonopods, which function in sperm transfer. In pinnotherids, the long first gonopods transfers the sperm mass to the female. It holds the ejaculatory canal inside, which opens proximally and distally. The second gonopod is solid, short and conical. During copulation, the penis and the second gonopod are inserted into the base of the tubular first gonopod. The second gonopod functions in the transport of the sperm mass inside the ejaculatory canal towards its distal opening. The specific shape of the second gonopod is strongly adapted for a sealing of the tubular first gonopod with longitudinal cuticle foldings that interlock inside the first gonopod. The presented results are discussed concerning their function in reproduction and in respect of the systematic account.
The role of secretion in sperm transfer, storage and fertilization among the Brachyura is still under debate. It is notable that structure and function of secretion are more complex in pinnotherids and probably more efficient than in other brachyuran crabs, which will be discussed, in view of the parasitic way of life and the high fecundity of pinnotherids.
For millennia, rural West African communities living in or adjacent of savanna ecosystems have been collecting components of local plant species (e.g. fruits, leaves, bark) in order to fulfil essential household subsistence needs (alimentation, medical care, energy demand etc.), to generate cash income and to overcome times of (financial) crisis. Thus, these non-timber forest products (NTFPs) make a considerable contribution to the well-being of local households. However, climate and land use change severely impact West African savanna ecosystems and, consequently, the safe-guarding of dependent rural livelihoods. The conversion of savanna area into cultivated land for subsistence farming owing to the ongoing population growth, as well as the progressive promotion of cash crops (e.g. cotton) is ever-increasing. As a consequence, present land-use management in West Africa has to cope with serious trade-offs. Within this decision-making NTFPs have been constantly understated due to a lack of appropriate economic figures to use within common cost-benefit analysis, and, thus, have been frequently outcompeted by seemingly more profitable land-use options. Therefore, it is crucial to provide appropriate economic data for NTFPs in order to create positive incentives for both decision-makers and NTFP beneficiaries to conserve NTFP-providing trees. The key finding of this analysis is that income from NTFPs accounts for 39 % on average of an annual total household income in Northern Benin, representing the second largest income share next to crop income and proving the respective households to be economically heavily dependent on NTFPs. Thereby, socio-economic characteristics of NTFP users tremendously shape their preferences for woody species. Particularly ethnicity has a major impact on the species used and the economic return obtained by them. Moreover, the study investigated the impacts of climate and land use change on the economic benefits derived from the three economically most important tree species in the region Vitellaria paradoxa, Parkia biglobosa and Adansonia digitata in 2050: Environmental changes will have primarily negative effects on the economic returns from all the three species. At large, the study underpins the economic relevance of NTFPs for rural communities in West African savannas and, consequently, the necessity to appropriately sustain them in order to safe-guard local livelihoods. Providing key figures on the current and future economic benefits obtained from NTFPs can augment common cost-benefit analysis, and, delivering detailed information about peoples’ use preferences for local species, this study clearly contributes to improve the basis of decision-making with reference to local land-use policies.
Diatoms contribute largely to the total primary production of the ecosphere and are key players in global biogeochemical cycles. Their chloroplasts are surrounded by four membranes owing to their secondary endosymbiotic origin. Their thylakoids are arranged into three parallel bands and differentiation of thylakoid membranes into grana or stroma is not observed. The fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins act as the light harvesting proteins and play a role in photoprotection during excess light as well. The diatom genome encodes three different families of antenna proteins. Family I are the classical light harvesting proteins called "Lhcf". Family II are the red algae related Lhca-R1/2 proteins called "Lhcr" and family III are the photoprotective LI818 related proteins called "Lhcx".
All known Fcps have a molecular weight in the range of 17-23 kDa. They are membrane proteins and have shorter loops and termini compared to LHCs of higher plants and are therefore extremely hydrophobic. This makes the isolation of single specific Fcps using routine protein purification techniques difficult.
The purification of a specific Fcp containing complex has not been achieved so far and until this is done several questions concerning light harvesting antenna systems of diatoms cannot be answered. For e.g. Which proteins interact specifically? Are various Fcps differently pigmented? Which pigments interact with each other and how? Which proteins contribute to photosystem specific antenna systems? Can pure Fcps be reconstituted into crystals like LHCII proteins? In order to answer these questions specific Fcp containing complexes have to be purified. ...
The canonical Wnt/β-catenin and the Shh pathway as well as the Notch signaling cascade
are key regulators in stem cell biology and are independently associated with the development
of cancer. Despite the knowledge of a balanced signaling for cellular maintenance, the
fundamental biochemical mechanisms of crosstalk are still poorly understood. This study
demonstrates that the outcome of interaction between Wnt and Shh is cell type specific. A
combined inhibitory mechanism of the Shh and Notch2/Jagged2 pathways on dominant
active β-catenin signaling in the adult tongue epithelium keeps Wnt/β-catenin signaling
restricted to physiological tolerable levels. In the opposite crosstalk the activation of
Wnt/β-catenin signaling in medulloblastoma (MB) of the Shh subtype, in turn inhibits the Hh
pathway.
The inhibitory mechanism of Shh and Notch2/Jagged2 on Wnt/β-catenin signaling is
independent of the degradation complex of β-catenin and takes place inside the nucleus.
Furthermore, the negative feedback on Wnt/β-catenin signaling by the Shh pathway relies
on transcriptional activity of Gli1/2A. Inhibition of Gli1/2A with the specific inhibitor GANT61
abrogated the negative impact of Shh on β-catenin signaling in vitro. Although the negative
feedback loop of Shh is still functional in human SCC25 cells, the inhibitory effect of
Notch2/Jagged2 is lost and contributes to the cancerogenic phenotype of these cells. In the
inverse situation, the activation of β−catenin signaling has a negative feedback on
constantly active Shh signaling and significantly inhibits the Hh pathway. This was shown in
Ptch+/- and Math1-Cre:SmoM2Fl/+ MB tumor spheres in vitro, in which inhibition of sphere
formation and growth was observed and Hh target gene transcription was down-regulated.
This demonstrates for the first time that the activation of canonical Wnt/β-catenin signaling
in primary MB cells with a Hh pathway over-activation has a negative effect on the growth of
these cells in vitro.
In summary the results show that crosstalk of Wnt/β-catenin and Shh signaling has context
specific outcome on pathway activity. Elucidation of the molecular interactions will improve
our understanding of Wnt and Hh associated tumors and contribute to the development of
new therapeutic strategies.
Das maligne Gliom, auch Glioblastom multiforme (GBM) genannt, ist der häufigste und gleichzeitig auch bösartigste hirneigene Tumor und macht rund 2% aller Krebsneuerkrankungen aus. Die Weltgesundheitsorganisation (world health organisation, WHO) stuft das GBM als Grad IV Tumor ein, was es als hochmalignen Tumor auszeichnet der infiltrativ in das umliegende Hirnparenchym einwandert und mit den gegenwärtigen Behandlungsmethoden, bestehend aus Resektion des Tumors, Chemotherapie und Strahlentherapie nicht kuriert werden kann. Das aggressive Wachstum und die ausgeprägte Resistenz dieses astrozytären Tumors gegenüber den verfügbaren Therapien der Bestrahlung und Chemotherapie sind Hauptgründe für die schlechte Prognose für Patienten mit Glioblastomen, deren medianes Überleben immer noch unter der Zwei-Jahres-Grenze liegt. Daher ist es von Nöten neue therapeutische Strategien auf Grundlage der Chemotherapie zu entwickeln, die selektiv wichtige, deregulierte Signalwege der Krebszelle angreifen. Einer dieser Signalwege in Gliomen ist der Stat3-Signalweg (signal transducer and activator of transcription). Stat3, ein latenter zytoplasmatischer Transkriptionsfaktor liegt in Gliomen oftmals konstitutiv aktiv vor. Diese Deregulation des Signalweges führt zur dauerhaften Transkription proonkogener Zielgene die in transformierten Zellen zu Proliferation, Apoptoseresistenz, Neoangiogenese und Immunsupprimierung führen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern eine pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 molekulare und zelluläre Charakteristika von Gliomen beeinflusst. Dazu wurde für die in-vivo Versuche ein syngenes, murines Gliom-Transplantationsmodell verwendet dessen Pathologie der eines humanen Glioms gleicht und den Vorteil besitzt keine immunsupprimierten Tiere verwenden zu müssen. Die murinen Gliomzelllinien, gewonnen aus spontanen Gliomen von GFAP-v-Src überexprimierenden Mäusen, wurden vorher in-vitro und auch exvivo bezüglich ihres Verhaltens auf die pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 charakterisiert. Für die pharmakologische Inhibierung wurde Kurkumin gewählt, der biologische aktive Wirkstoff der Pflanze Curcuma longa. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Kurkumin konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Stat3 in drei murinen Gliomzelllinien hemmt. Des Weiteren zeigte sich, dass auch die Proliferation der untersuchten transformierten Zellen sowie ihre Fähigkeit zur Invasion und Migration konzentrationsabhängig durch den Einsatz von Kurkumin inhibiert werden konnte, ohne dabei allerdings die Proliferation von primären Astrozyten im gleichen Maße zu hemmen. Kurkumin induziert zusätzlich in den überaus aopotoseresistenten Gliomzellen einen G2/M Zellzyklusarrest. Diese beobachteten Effekte stehen im Zusammenhang mit der konzentrationsabhängigen transkriptionellen Beeinflussung Kurkumins der tumorpromotenden Stat3- Zielgene. Durch Einsatz einer Stat3-Mutante, Stat3C, die ohne Phosphorylierung konstitutiv aktiv in der Zelle vorliegt, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Kurkumin seinen Einfluss auf die Invasion und Migration der murinen Gliomzelllinien auch über den Stat3-Signalweg vermittelt, zeigte sich, dass durch Einbringung dieser Mutante trotz Kurkuminbehandlung die Migrations- und Invasionsfähigkeit partiell retabliert werden konnte. Durch dietätische Gabe von Kurkumin konnte in tumortragenden Mäusen gezeigt werden, dass die invitro ermittelten Effekte an einem längeren Überleben jener Mäuse beteiligt waren, deren Futter das Kurkumin enthielt. Die Administration des Kurkumins wurde entsprechend einer für die Klinik bevorzugten Darreichugsform gewählt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Stat3 in den murinen Gliomzelllinien durch Transduktion mit shRNA gerichtet gegen die Stat3-mRNA stabil depletiert um im Folgenden untersuchen zu können, welche zellulären und molekularen Konsequenzen konstitutiv aktives Stat3 für die Gliomzellen hat. Es zeigte sich, dass der Wegfall von Stat3 das Migrations- und Invasionspotential signifikant verringerte und die Expression tumorfördernder Zielgene ebenfalls in den Stat3-defizienten Zellen auf Protein- und mRNA-Ebene signifikant reduziert war. Der Einfluss von Stat3 auf die Hif1α-Expression, ein Transkriptionsfaktor der die Anpassung der Gliomzellen an ein hypoxisches Milieu und damit verbunden auch Migration und Invasion induziert kann, macht deutlich, dass konstitutiv aktives Stat3 unter normoxischen sowie auch hypoxischen Bedingungen upstream entscheidender Transkriptionsfaktoren liegt und sich somit als Zielmolekül für eine therapeutische Intervention anbietet. Eine ex-vivo Applikation auf organotypischen Schnittkulturen zeigte, dass durch den Wegfall von Stat3 in den murinen Gliomzellen die Einzelzellinvasion unterbunden werden konnte was entscheidend für das klinisch hochrelevante Problem der Rezidive sein könnte. Transplantierte man nun Kontroll- und Stat3-defiziente Zellen orthotrop in die immunkompetenten Mäuse zeigte die Kaplan-Meier-Kurve, dass der Krankheitsbeginn so wie das mediane Überleben in den Mäusen mit Stat3-defizientem Tumor zeitlich deutlich nach hinten verschoben war. Neben den invitro und ex-vivo ermittelten Effekte des Stat3-Wegfalls ist anzunehmen, dass das verlängerte Überleben dieser Mäuse auch mit der fehlenden Immunsupprimierung der Stat3-defizienten Tumore zusammenhängt. Es zeigte sich, dass eine Intervention gegen Stat3, ob nun pharmakologisch oder gentechnisch, die malignen Charakteristika des Glioblastoms positiv beeinflussen kann. Stat3, bestätigt als onkogener Transkriptionsfaktor, stellt damit eine lohnenden Zielstruktur in Gliomen dar.
It has been estimated that about 1% of live births carry severe congenital heart defects and 20-30% among them have valve malformations. Despite its medical importance the underlying cause of many valvular diseases remains undiscovered. Thus, it is important to identify genes that play a crucial role in cardiac valve formation and maturation.
A temporal RNA expression analysis of heart development suggested that the extracellular matrix protein Nephronectin might be a novel regulator of valve development and/or trabeculation. Nephronectin is transiently expressed during rat heart development at the time of heart valve morphogenesis and trabeculation. Moreover, the extracellular matrix is known to be crucial for organogenesis. It is a complex, dynamic and critical component that regulates cell behavior by modulating the activity, bioavailability, or presentation of growth factors to cell surface receptors.
In order to verify the hypothesis that Nephronectin is a novel regulator of valve formation and/or trabeculation the zebrafish was chosen as model system. Females are able to spawn at intervals of 5 days laying hundreds of eggs in each clutch. Development progresses rapidly with precursors to all major organs appearing within 36 hours post fertilization. Zebrafish embryos develop externally, are translucent and continue to grow for several days despite developing severely malformed, non functional hearts. In addition, gene expression can be easily modulated. During the present study it has been shown that Nephronectin expression is correlated to valve development and trabeculation. Morpholinomediated knockdown of Nephronectin in zebrafish caused failure of valve formation and trabeculation resulting in > 85% lethality at 7 days post fertilization.
Cardiac valve formation is initiated at the junction of atrium and ventricle and is characterized by extracellular matrix deposition and endocardial cell differentiation. In accordance with the above-described phenotype the earliest observed abnormality in Nephronectin morphants was an extended tube like structure at the atrio-ventricular boundary. In addition, the expression of myocardial genes involved in cardiac valve formation (cspg2, fibulin1, tbx2b, bmp4) was expanded and endocardial cells along the extended tube like structure exhibited characteristics of atrio-ventricular cells (has2, notch1b and Alcam expression, cuboidal cell shape). Inhibition of has2 in Nephronectin morphants rescued the endocardial but not the myocardial expansion. In contrast, diminishment of BMP signaling in npnt morphants resulted in reduced ectopic expression of myocardial and endocardial atrio-ventricular markers. Taken together, these results identify Nephronectin as a novel upstream regulator of BMP4-HAS2 signaling playing a crucial role in atrio-ventricular canal differentiation.
Savannas are the most important timber and non-timber forest products (NTFPs) providing ecosystems in West Africa. They have been shaped by traditional human land-use (i.e. agriculture, grazing, and harvesting) for thousands of years. In the last decades, land-use has drastically changed due to the rapid population growth and the growing production of cash-crop in West Africa and this process is still continuing. The percentage of land intensively used for agriculture has increased, while the length of fallow periods has decreased. Such changes have enormous ecological, economic, and social consequences. In the context of land-use changes, there is an urgent need to better understand and evaluate the impact of land-use on savannas. Such an understanding provides insights on appropriate management activities that ensure the maintenance of savannas and guarantee the availability of savanna products for subsistence and commercial use of rural West African people.
The major objective of the present thesis was to study the impact of land-use on savanna vegetation and diversity as well as on populations of two important NTFP-providing tree species in a semi-arid area in West Africa. The study area was located in the south-eastern part of Burkina Faso and comprised the protected W National Park and its adjacent communal area.
In the first study (chapter 2), I investigated in cooperation with a colleague from Burkina Faso (Blandine Nacoulma) the impact of land-use on the savanna vegetation. We analyzed which environmental factors determine the occurrence of the vegetation types and investigated the effect of land-use on vegetation structure and the occurrence of life forms and highly valued tree species. Furthermore, we tested whether land-use has an impact on plant diversity pattern and if this impact differed between the vegetation types and layers (woody and herb layer). Vegetation relevés were performed and the vegetation and plant diversity of the protected W National Park were compared with those of its surrounding communal area. Our results reveal five vegetation types occurring in both areas. Elevation and physical soil characteristics and thus soil water availability for plants played the most important role for the occurrence of the vegetation types. The influence of land-use on plant diversity differed between the five vegetation types and the two layers. The impact was highest on the vegetation types with the most favorable soil conditions for cultivation and lowest on rocky habitats with poor soils. While the diversity of the woody layer was increased under human land-use, the diversity of the herb layer was diminished. Overall, as land-use effects were not only negative, our findings suggest that land-use does not automatically lead to a loss of plant species and to a degradation of savanna habitats. We conclude that both protected and communal areas are of great importance for the conservation of savanna vegetation and diversity. Our study highlights furthermore the importance of different management strategies for each vegetation type.
In the following two studies (chapter 3 and 4), the impact of land-use - and in particular of harvesting - on populations of Adansonia digitata L., the baobab tree, and Anogeissus leiocarpa (DC.) Guill. & Perr. was examined. These two tree species were chosen as they provide several NTFPs for the local population and as they show different levels of human protection and opposed life histories. Thus, they may react differently to land-use. Stands of the protected W National Park were compared with those of its surrounding communal area (in fallows, croplands, and villages). I applied dendrometric methods to study the population structures and combined it with rates and patterns of NTFP-harvesting (debarking and chopping/pruning). Furthermore, the impact of land-use and harvesting on the fruit production of A. digitata and on the sprouting ability of A. leiocarpa were studied. The inverse J-shaped size class distribution curve indicates that the stands of A. digitata were in a healthy state in the park, while the low number of smaller size classes in fallows, croplands, and villages may give evidence of an ageing population. However, a high number of seedlings were recorded in villages. The stands of A. leiocarpa were also in healthy states in the park and likewise in fallows. In contrast, the absence of saplings gives evidence of a declining population in croplands. Both species were strongly harvested by local people and harvesting was tree size-specific. Pruning in interaction with tree-size had a significant impact on fruit production of A. digitata. While smaller trees were more vulnerable to pruning, bigger trees benefited from slight-pruning. A. leiocarpa had a great ability to respond to chopping by sprouting. The sprouting ability increased even with higher chopping intensity. Results suggest that despite the intense harvesting and the land-use impact, populations of both species are still well preserved. While A. digitata can withstand the harvesting and land-use pressure by its longevity, extremely low adult mortality rates, and particularly due to positive human influences, A. leiocarpa is able to withstand the use pressure by its fast growing, high recruitment, and high sprouting ability. I conclude that a none protected tree species (A. leiocarpa) might not necessarily be at higher risk to the harvesting and land-use impact than a protected tree species (A. digitata) as the adverse impact of harvesting and land-use can be compensated by its specific life history.
Important additional information to such ecological findings can be provided by local people. Learning from traditional knowledge and management systems of local people will help to produce culturally and ecologically reasonable conservation and management strategies. Thus, I investigated local uses and management strategies of A. digitata and A. leiocarpa in the last two studies (chapter 5 and 6). Quantitative ethnobotanical surveys among the Gulimanceba people were conducted in the communal area in order to document uses of the different plant parts, harvesting modes, perceptions about the population status, and conservation status of both species. Hereby, differences in knowledge between gender, generations, and people from different villages were tested. Interviews reveal that both species are harvested for multipurpose and emphasize the high importance of both species for local people. Especially the leaves and fruits of A. digitata add valuable minerals and vitamins to the otherwise micronutrient-“poor” staple crops of the Gulimanceba people. In comparison with other studies in West Africa, it has turned out that people in this area could benefit even more from A. leiocarpa, e.g. for dyeing of clothes, for treatment of malaria and skin problems. Local knowledge did not differ between genders and generations, while it slightly differed between people from different villages. The lack of age differences suggests that the traditional knowledge about these two species is passed on from one generation to another. Differences between people from different villages might be explained by influences from the neighboring countries Niger and Benin. Current local harvesting modes and management strategies of both species resulted in sustainable use. However, ongoing land-use intensifications require adapted harvesting and management techniques to guarantee the persistence of these economically important species. These results provide, in combination with the ecological findings (chapter 3 and 4), appropriate management recommendations for A. digitata and A. leiocarpa that are reliable under currently practiced management strategies.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.
Von 39 jungen Mauerseglern (Apus apus) verschiedenen Alters wird die Ontogenese morphologischer Parameter des Herzens sowie von Körperlänge und Brustmuskelmasse dargestellt. Die durchschnittliche Herzmasse erwachsener Segler liegt absolut bei rund 0,6–0,7 g. Das sind rund 1,6 % der mittleren Körpermasse und damit rund 40 % mehr als der mittlere Erwartungswert aller Vögel mit entsprechender Körpermasse. Die relative Herzmasse liegt beim Schlupf bei rund 2,7 %. Der Segler kommt mit einem relativ großen Herz auf die Welt, dessen Anteil an der Körpermasse bis zum Ausfliegen also um 41 % reduziert wird. Diese relative Reduktion findet man auch beim Herzvolumen: Es ändert sich absolut von rund 0,377 ml am Schlupftag auf 1,67 ml bei flüggen Mauerseglern; das massenbezogene Volumen nimmt so von rund 0,13 ml/g auf 0,04 ml/g ab. Die Herzbreite (Herzdurchmesser) beträgt über die gesamte Ontogenese konstant mehr oder weniger rund 60 % der Herzlänge. Die Körperlänge und die Masse des Brustmuskels zeigen eher eine (exponentielle) Sättigungskurve: Ab einer Körpermasse von 20-22 g (mittlere Adultwerte: 30,8–55,6 g; Mittelwert 40,5 g; n = 2570) zeigt die Körperlänge einen relativ konstanten Wert von rund 13-14 cm (mittlere Adultwerte: 16,5–18,5 cm); die Brustmasse ab einer Körpermasse von rund 30 g einen Wert von rund 2,0-2,5 g. Das sind rund 5-8 % der Körpermasse, wobei der relative Anteil im Verlauf der Ontogenese zunimmt (Anfangswert rund 2 %).