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Untersuchungen zum HIV-assoziierten Immun-Rekonstitutions-Inflammationssyndrom bei Tuberkulose
(2021)
HIV- und Tuberkulose (TB)-koinfizierte Patienten können nach Beginn einer antiretroviralen Therapie (ART) als Komplikation ein Immunrekonstitutionssyndrom (IRIS) entwickeln. Dabei kommt es zu einem Neuauftreten oder einer Verschlechterung von klinischen Symptomen oder radiologischen Befunden im Zusammenhang mit der TB. Präsentieren kann sich ein IRIS entweder als eine plötzliche Verschlechterung der Infektion nach ART-Beginn („paradoxical/paradoxes IRIS“) oder durch ein Demaskieren einer vorher klinisch inapparenten und unbehandelten Infektion („unmasking/demaskierendes IRIS“). Aufgrund nicht einheitlich definierter Diagnosekritierien kann die Diagnosestellung im klinischen Alltag eine Herausforderung darstellen.
Ziel dieser Dissertation war es deshalb, klinische Charakteristika, Risikofaktoren und ggf. protektive Faktoren für die Entwicklung eines IRIS bei TB zu identifizieren. Diese Ergebnisse sollten zu besseren Verständnis und Vorhersagen von IRIS im Zusammenhang mit TB beitragen.
Dazu wurden retrospektiv Daten von 52 Patienten, die im Zeitraum 01.01.2010 - 30.06.2016 mit einer HIV-Infektion und zur Behandlung einer aktiven Tuberkulose stationär in der Infektiologie des Uniklinikums Frankfurts aufgenommen wurden, pseudonymisiert erfasst. Es wurden u. a. Arztbriefe, Laborbefunde, Fieberkurven und Visitenberichte aus dem Patientenmanagementprogramm „ORBIS“, der Datenbank „epidem“ und des Laborinformationsprogramms „Nexus swisslab“ des Uniklinikums Frankfurt genutzt. Zu den Parametern gehörten neben patientenspezifischen Daten wie Alter und Geschlecht unter anderem auch Routinelaborparameter, Serologien, Art der TB, genaue ART und TB-Therapien und Laborparameter, die zur Beurteilung einer Entwicklung der Immunrekonstitution und der virologischen Suppression hinweisend sind. Dazu zählen insbesondere HI-Viruslastwerte, CD4- und CD8-Zellzahlen für einen Zeitraum von 48 Wochen ab ART-Beginn.
Zur Untersuchung der unterschiedlichen IRIS-Arten wurden die Patienten in zwei Gruppen aufgeteilt: bereits mit einer ART vorbehandelte Patienten, bei denen somit die Entwicklung eines demaskierendem IRIS möglich war, und ART-naive Patienten, die theoretisch ein paradoxes IRIS entwickeln konnten. Durch Beurteilung des Krankheitsverlaufes und unter spezieller Berücksichtigung der HI-Viruslast im Verlaufe der ART wurde nach der IRIS-Definition von French et al. (2004) festgelegt, ob ein IRIS vorlag. Bei unklaren Fällen erfolgte eine gemeinsame Besprechung und definitive Einteilung im kliniksinternen Kolloquium. Schließlich wurde die statistische Auswertung mithilfe des Statistikprogramms „bias“ durchgeführt und dabei jeweils die „IRIS“ mit der „Nicht-IRIS“-Gruppe verglichen. Angewandt wurden der Exakte Fisher-Test für kategorische und der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test für numerische Variablen.
Die paradoxe IRIS-Inzidenz betrug 29,7 %, die demaskierende IRIS-Inzidenz 46,7 %. Am häufigsten präsentierte sich das IRIS in der Frankfurter Kohorte mit Fieber, am zweithäufigsten als Lymphadenopathie oder mit respiratorischen Beschwerden. Für sowohl Patienten mit paradoxem als auch demaskierendem IRIS zeigte sich ein signifikant längerer Krankenhausaufenthalt als für Patienten, die kein IRIS entwickelten. Sonst wurden für das demaskierende IRIS keine weiteren statistisch signifikanten Parameter gefunden, u. a. aufgrund Limitationen wie der sehr kleinen Studienpopulation (15 Patienten).
Patienten mit paradoxem IRIS hatten zudem eine signifikant höhere Rehospitalisierungsrate (63,3 % vs. 15,4 %; p= 0,006), was die klinische Relevanz aufzeigt. Außerdem korrelierten extrathorakale TB-Manifestationen (p= 0,025), niedrige CD4+-Lymphozyten-Zellzahl (p= 0,006) und hohe Viruslast (p= 0,017) vor ART-Beginn mit einer paradoxen TB-IRIS-Entwicklung. Diese Patienten sollten folglich nach ART-Beginn besonders engmaschig klinisch kontrolliert werden, da bei ihnen ein IRIS wahrscheinlicher ist. Ebenfalls statistisch signifikant zeigte sich erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH) und erniedrigtes Albumin im Serum. In Kombination mit den davorgenannten Parametern könnten die Werte dabei behilflich sein, das individuelle paradoxe IRIS-Risiko bei Tuberkulose einzuschätzen. ART-Bestandteile oder Zeit zwischen dem Beginn der TB-Therapie und ART hatten in der Studie keinen Einfluss.
Aktivierende Mutationen der Fms-like tyrosine kinase (FLT3) treten bei 25 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) auf und begünstigen die unkontrollierte Proliferation maligner Blasten. Autophagie ist ein intrazellulärer Prozess, durch den zytoplasmatische Bestandteile lysosomal abgebaut werden und fungiert als intrazellulärer Homöostase-Mechanismus unter Stress-Bedingungen.
Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, ob FLT3-ITD+-AML-Zellen vulnerabel gegenüber Autophagie-Hemmung sind.
Hierzu wurde zunächst untersucht, wie sich FLT3-ITD-Signaling und Autophagie unter basalen Wachstumsbedingungen gegenseitig beeinflussen. In einem genetischen Modell zeigte sich, dass FLT3-ITD-transformierte wachstumsfaktorunabhängige Zellen während ihrer fortgesetzten Proliferation vermehrt Autophagie betreiben. Lysosomale Autophagie-Inhibitoren zeigten jedoch unter diesen Bedingungen keine erhöhte Wirksamkeit gegenüber FLT3-ITD-positiven Zellen. Humane FLT3-ITD-positive AML-Zellen zeigten nach genetischer Deletion von ULK1 ebenfalls nur transiente und milde Proliferationsdefizite. Unter basalen Wachstumsbedingungen zeigte sich also keine erhöhte Vulnerabilität FLT3-ITD-exprimierender Zellen gegenüber Autophagie-Inhibition.
Daraufhin wurde die Bedeutung von Autophagie während pharmakologischer Hemmung von FLT3 untersucht. FLT3-Inhibition mittels AC220, einem FLT3-spezifischer Tyrosinkinase-Inhibitor, induzierte bzw. steigerte die autophagische Aktivität ähnlich stark wie eine direkte mTOR-Inhibition. Dies ließ sich im Zellmodell therapeutisch ausnutzen: eine Kombinationsbehandlung mit AC220 und einem lysosomalen Autophagie-Inhibitor zeigte eine synergistische antiproliferative Wirkung. Dies stellt möglicherweise einen neuen rationalen Kombinationsbehandlungsansatz für die Therapie FLT3-ITD-positiver AML-Patienten dar.
Vergleichend durchgeführte licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen ergeben, daß es sich bei den Keimen der PPLO-Gruppe um stark unterschiedlich große und einheitlich bläschenartige Organismen handelt, die keine Zellmembran nach Art der Bakterien besitzen.
Äußere Einflüsse führen außerordentlich leicht zur Deformierung der Organismen, wobei Fadenformen und mycelähnliche Gebilde entstehen.
Die Laidlow-Elfordschen und Seiffertsehen Organismen unterscheiden sich von den übrigen Stämmen durch Ausbildung einer steiferen Zelloberfläche. Die aufgehellten Formen aus alten Kulturen, die intrazellulär einzelne punktförmige Substanzanhäufungen zeigen, werden als sekundäre und bis zu einem gewissen Grad involutive Zellformen und nicht als notwendiges Stadium im Vermehrungszyklus betrachtet.
Abschließend werden Fragen der Vermehrungsweise, der Nomenklatur und der Klassifizierung besprochen.
Weltweit stellt das kolorektale Karzinom die dritthäufigste Krebsdiagnose bei Männern und die zweithäufigste bei Frauen dar. Von den bekannten beeinflussbaren Risikofaktoren sind Ernährung, Rauchen und körperliche Aktivität zu nennen, hingegen gelten Alter, familiäre Belastung und männliches Geschlecht als nicht beeinflussbare Risikofaktoren. Neben Genmutationen, welche beispielsweise bei der Familiären Adenomatösen Polyposis coli und beim “Lynch Syndrom” eine wichtige Rolle spielen, kann auch die pathologisch verstärkte Expression von tumorrelevanten Proteinen wie z.B. induzierbare COX-2, Cyclin A, B und D, c-Fos, EGF, MMP-9, VEGF sowie das ubiquitäre RNA-Bindeprotein HuR maßgeblich zur Entstehung des Kolonkarzinoms beitragen. Viele der bislang identifizierten Zielgene des HuRs sind an der Regulation tumorpromovierender Eigenschaften wie Proliferation, Invasion, Metastasierung und Apoptose beteiligt, was HuR zu einem hochattraktiven Target der molekularen Tumortherapie macht. Bislang ist bekannt, dass eine gesteigerte HuR-Bindung an AREs in der 3’UTR vieler Zielgene entweder zur Stabilisierung und/oder
Translationsveränderung von kurzlebigen mRNAs von tumorrelevanten Genprodukten führen kann. Eine pathologisch erhöhte zytosolische HuR Akkumulation, welche bekanntlich oft mit einer ungünstigen Prognose der Tumorpatienten korreliert, wird jedoch im Wesentlichen als Folge eines fehlerhaft regulierten erhöhten Exportes des überwiegend im Zellkern lokalisierten HuR Proteins ins Zytoplasma (sogenanntes “HuR-Shuttling”) betrachtet, während genomische oder epigenetische Mechanismen vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Der Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der bisher nur wenig bekannten zugrunde liegenden Mechanismen des erhöhten HuR-Shuttlings in der Kolonkarzinom-Zelllinie DLD-1 unter besonderen Berücksichtigung PKCδ-abhängiger Signalwege. Durch Zugabe des pharmakologischen PKCδ-Inhibitors Rottlerin konnte die subzelluläre HuR-Lokalisation in den Kolonkarzinom Zelllinien DLD-1 und SW-620 deutlich reduziert werden, wobei die maximale Wirkung erst nach einer Inhibitionszeit von 16 Stunden erreicht wurde. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass Rottlerin die PKCδ Aktivität in DLD-1 Zellen hemmt. Hingegen konnten Inhibitoren von verschiedenen MAPK-Kinasen (SB203580, SP600125, PD98059, Raf-1-Inhibitor) die basale zytoplasmatische HuR Lokalisation nicht beeinflussten, ebensowenig der pharmakologische Inhibitor der Calcium-abhängigen PKCs (PKCα und PKCβ) Gö6976. Auf der anderen Seite bewirkte das Phorbolester PMA eine deutliche Steigerung der PKC-Aktivität. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit nach tumorrelevanten Genen gesucht, deren Expression in humanen Kolonkarzinomzellen posttranskriptionell von HuR und gleichzeitig von PKCδ kontrolliert wird. Mit Hilfe von RNA-Pulldown Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der PKCδ funktionell zu einer starken Reduktion der an HuR-gebundenen mRNAs wie c-myc, cyclin A und D sowie COX-2 führt. Schließlich haben Aktivitätsmessungen der Gesamt-PKC-Aktivität gezeigt, dass diese in Kolonkarzinom-Zelllinien nachweisbar und damit basal aktiv ist. Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit können zum besseren Verständnis der pathophysiologischen Bedeutung des ubiquitären RNA-Bindeproteins HuR für die Kolonkarzinogenese sowie der prokarzinogenen Rolle der PKCδ im Kolongewebe beitragen.
CFTR ist ein Chloridkanal, der bei der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose defekt ist. Es ist bekannt, dass CFTR durch Proteinkinasen aktiviert und seine Aktivität durch Nukleotide reguliert wird. Die Regulation von CFTR wurde unter zwei verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Zum einen wurden Experimente durchgeführt, die Aufschluss über die Beteiligung der Nukleotidbindedomänen beim Öffnen und Schließen des Kanals und über die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse geben sollten. Zum anderen wurde untersucht, ob neben der durch Proteinkinasen vermittelten Aktivierung von CFTR ein alternativer Prozess existiert. Hierbei wurde ein Regulationsmechanismus entdeckt, der eine Proteinkinase-unabhängige Aktivierung von CFTR durch Phosphatidylinositolphosphate ermöglicht.
Humaner CFTR wurde in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis heterolog exprimiert und mit der Patch-Clamp-Methode untersucht. Stationäre und zeitaufgelöste Ströme des CFTR-Wildtyps wurden mit mutierten CFTR-Kanälen verglichen. Das Lysin im Walker AMotiv ist an der Koordinierung des γ-Phosphats von MgATP bei der Hydrolyse beteiligt, so dass Walker A-Mutationen die ATP-Bindung und –Hydrolyse von ATPasen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden Walker A-Mutanten untersucht, die eine Substitution des konservierten Lysins innerhalb der Walker A-Sequenz der NBD1 (K464A) oder beider Nukleotidbindedomänen (K464A/K1250A) aufwiesen. Da die Öffnungsgeschwindigkeit der Mutante K464A kaum einen Unterschied zu der des Wildtyps aufzeigte, die Mutante K1250A jedoch das Öffnen stark verlangsamte, wurde gefolgert, dass keine Hydrolyse von ATP an der NBD1 für die Öffnung nötig ist. Während Wildtyp-Kanäle auf eine gleichzeitige Applikation von ATP und AMP-PNP, einem nichthydrolysierbaren ATP-Analogon, mit einem verlängerten Offenhalten der Kanäle („locked open“–Effekt) reagierten, das sich in einem langsamen Schließen der Kanäle äußerte, konnte bei K464A-Mutanten dieser Effekt nicht beobachtet werden. Außerdem erfolgte das Schließen der Doppelmutante K464A/K1250A im Vergleich zur Einzelmutante K1250A nach MgATP-Entzug schneller. Daraus wurde geschlossen, dass die NBD1 auf das durch die NBD2 vermittelte Offenhalten des Kanals, möglicherweise durch eine direkte Interaktion, regulierend einwirkt, bevor letztere den Kanal wieder schließt. Da auch ein Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals unter Mg2+-freien Bedingungen zu beobachten war, unter denen keine ATP-Hydrolyse erfolgen kann, konnte die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse bezüglich des Kanalgatings ausgeschlossen werden. Ein Einwirken der NBD1 auf das Offenhalten der Kanäle durch die NBD2 war unter nicht-hydrolytischen Bedingungen anhand des Vergleichs der Schließkinetiken von WT und Mutante K464A nicht feststellbar, so dass eine direkte Interaktion beider Nukleotidbindedomänen wahrscheinlich ausgeschlossen werden kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Phospholipids Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) auf CFTR-Kanäle untersucht. Die Applikation von PIP2 und MgATP zu unphosphorylierten CFTR-Kanälen zeigte einen deutlichen Stromanstieg, der einem Chloridstrom entsprach. Einzelkanaluntersuchungen ergaben, dass durch PKA induzierte Kanäle und Einzelkanäle, die durch PIP2 aktiviert wurden, dieselbe Leitfähigkeit von ~5 pS besaßen. Somit konnte eine PIP2-induzierte Aktivität endogener Chloridkanäle ausgeschlossen und ein Einfluss des Phospholipids auf CFTR-Chloridkanäle bewiesen werden, der zudem ATP-abhängig war.
Neben PIP2, welches den stärksten Effekt auf die CFTR-Aktivität zeigte, konnten auch Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylinositol-4-monophosphat (PIP), sowie Arachidonsäure unphosphorylierte CFTR-Kanäle aktivieren. Damit wurde gezeigt, dass der Effekt des Signalanstiegs durch Phosphatidylinositole abhängig von der Struktur des Moleküls war, also von der Anzahl der Phosphatgruppen am Inositolring und der Fettsäurezusammensetzung des Phospholipids.
Experimente, die unter Mg 2+-freien Bedingungen durchgeführt wurden, so dass eine Phosphorylierungsreaktion durch Kinasen ausgeschlossen werden konnte, zeigten dennoch eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen. Auch eine Substitution des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP anstelle von ATP erlaubte die Öffnung unphosphorylierter CFTR-Kanäle. Mit diesen beiden Ergebnissen wurde gezeigt, dass eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen unabhängig von einer Proteinphosphorylierung ist.
Physiologisch betrachtet könnte man sich vorstellen, dass über die Aktivierung von Lipidkinasen die Synthese von PIP2 über PI und PIP stimuliert wird, so dass das Phospholipid, wie für viele Ionenkanäle und Transporter gezeigt, eine direkte Interaktion mit dem Protein eingeht. Eine ATP-abhängige Synthese von PIP2 in Makropatches an Xenopus-Oozyten durch endogene Lipidkinasen könnte eine mögliche Erklärung für den gezeigten ATP-abhängigen Anstieg des CFTR-Signals sein.
In dieser Arbeit wurde bei CFTR-Kanälen zum ersten Mal ein alternativer Regulationsmechanismus über Phosphatidylinositolphosphate identifiziert, der Proteinkinaseunabhängig ist und der möglicherweise über eine direkte Interaktion zwischen dem Phospholipid und dem Protein vermittelt wird.
Durch die weltweite Verbreitung von bakteriellen Resistenzgenen wie der Carbapenemase New-Delhi-Metallo-β-Laktamase (NDM), die nahezu alle Beta-Laktamantibiotika spalten kann, und die langwierige Entwicklung neuer Antibiotika, hat die Erforschung von Resistenzdeterminanten eine hohe Priorität. In der vorliegenden Arbeit wurde die neu entdeckte Variante NDM 16b unter epidemiologischen Gesichtspunkten, mit einem in vivo Infektionsmodell sowie die Interaktion von NDM-Varianten mit dem menschlichen Komplementsystem untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Datenerhebung für 60 blaNDM tragende Patientenisolate des Zeitraums 2007 - 2017 auf Basis klinikinterner Datenbanken zu multiresistenten Erregern und zudem eine quantitative Empfindlichkeitstestung für 13 (Reserve-)Antibiotika. Es fiel eine kontinuierliche Zunahme an NDM-Isolaten und insbesondere von NDM-Varianten mit der Punktmutation M154L auf, da diese Mutation eine erhöhte Hydrolaseaktivität vermittelt. Deutlich erkennbar war eine Korrelation der M154L-Varianten und E. coli. Im Resistenzprofil der blaNDM-positiven Isolate zeigten sich hohe Resistenzraten (> 94%) gegen alle Beta-Laktam-Antibiotika und Fluorchinolone. Fosfomycin und Colistin waren in über 75% der Fälle noch wirksam.
Im zweiten Teil wurden Infektionsversuche mit dem Modellorganismus Galleria mellonella (Larve der großen Wachsmotte) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die NDM-Produktion der injizierten Erreger keinen Einfluss auf die Pathogenität hatte. Zudem konnte in Therapieversuchen mit Imipenem im lebenden Organismus gezeigt werden, dass über die bakterielle NDM-Produktion die Resistenz gegen Imipenem vermittelt wird.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die NDM-Varianten NDM 1Δ28, NDM 4Δ28 und NDM 16bΔ28 hinsichtlich ihres inhibitorischen Potentials auf Komplement untersucht. Mit den erzielten Ergebnissen der funktionellen Tests konnte für den klassischen und den Lektinweg eine signifikante Hemmung durch alle drei NDM Varianten nachgewiesen werden. Ein direkter Vergleich der einzelnen NDM-Varianten ergab, dass NDM 1Δ28 die stärkste und NDM 16bΔ28 die schwächste Inhibition auf den klassischen Komplementweg ausübte. Bindungsanalysen mit einzelnen Komplementkomponenten (C3, C3b, C3c, C4 und C4b) ließen auf eine Interaktion von NDM 1Δ28 mit C4b schließen.
Zusammenfassend leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Fortführung epidemiologischer Untersuchungen von NDM Varianten und erbringt den in vivo Nachweis für Resistenzvermittlung durch NDM. Weiterhin wurde gezeigt, dass NDM neben der Carbapenemasefunktion auch eine immunmodulierende Wirkung erfüllt, indem der klassische und Lektinweg des Komplementsystems gehemmt wird. Damit liegt die Vermutung nahe, dass die globale Ausbreitung von NDM-produzierenden Erregern nicht nur durch die Vermittlung der Antibiotikaresistenz, sondern auch durch eine Immunevasion bedingt ist. Zukünftig könnte somit die Erforschung des Mechanismus der Immunevasion ebenso interessant sein wie die Suche nach wirksamen Inhibitoren der NDM.
A method which serves to isolate the gonads from the sea cucumber (Holothuria polii) is outlined. Criteria that will secure a well determined status of maturity of the sperm are given. From this preparation a deoxyribonucleic acid is made, purified and analysed. It is concluded that the analytical data are in compliance with the theory of Crick and Watson. The ratio of Moles for this DNA while its nitrogen to phosphorus ratio on weight basis is 1,67.
Highlights
• High resolution profile of C. pipiens' sugar diet has been obtained using UHPLC-MS.
• Artificial feeding using ornamental plants provides similar sugar profiles as observed in field collected mosquitoes.
• Metabolomic profiling found secondary metabolites and pollutants of anthropogenic use.
Abstract: Culex pipiens (Linnaeus, 1758) mosquitoes search plant sources of sugars to cope with the energetic demand of various physiological processes. The crop as part of the digestive system is devoted to the storage of sugar-based meal obtained from various nectars sources. The profiling of sugars and metabolites in the Culex pipiens’ crop is scarce, and only few studies used Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC-MS), which provides broad detection for biomonitoring environmental substances and even contaminants in the sugar diet of mosquitoes populations.
Therefore, sugar and metabolite profiling were performed on crops obtained from mosquitoes exposed to plant nectar under laboratory or natural conditions by Ultra High-Performance LC-MS (UHPLC-MS). This method allowed us a precise quantitative and qualitative identification of sugar diet and associated environmental compounds in the crop of the mosquito C. pipiens. Under laboratory condition, mosquitoes were allowed to feed on either glucose solution, commercially-available flowers or field collected flowers. In addition, we collected mosquitoes from the field to compare those crop metabolomes with metabolome patterns occurring after nectar feeding in the lab.
The sugar quantities and quality obtained from the crops of mosquitoes collected in the field were similar to those crops obtained from mosquitoes that fed on commercially-available flowers and from field collected flowers with a limit of detection of 10 μg/L for sucrose, glucose and sucrose. Next to sugar compounds, we identified 2 types of amino acids, 12 natural products, and 9 pesticides.
Next to the diversity of sugar compounds, we could confirm that secondary metabolites and environmental pollutants are typically up taken from floral nectar sources by C. pipiens. The in-depth knowledge on mosquito–plant interactions may inspire the development and further optimization of mosquito trap systems and arboviral surveillance systems.
Background: Up- and/or downgrading rates in single intermediate-risk positive biopsy core are unknown.
Methods: We identified single intermediate-risk (Gleason grade group (GGG) 2/GGG3) positive biopsy core prostate cancer patients (≤ cT2c and PSA ≤ 20 ng/mL) within the Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) database (2010–2015). Subsequently, separate uni- and multivariable logistic regression models tested for independent predictors of up- and downgrading.
Results: Of 1,328 assessable patients with single core positive intermediate-risk prostate cancer at biopsy, 972 (73%) harbored GGG2 versus 356 (27%) harbored GGG3. Median PSA (5.5 vs 5.7; p = 0.3), median age (62 vs 63 years; p = 0.07) and cT1-stage (77 vs 75%; p = 0.3) did not differ between GGG2 and GGG3 patients. Of individuals with single GGG2 positive biopsy core, 191 (20%) showed downgrading to GGG1 versus 35 (4%) upgrading to GGG4 or GGG5 at RP. Of individuals with single GGG3 positive biopsy core, 36 (10%) showed downgrading to GGG1 versus 42 (12%) significant upgrading to GGG4 or GGG5 at RP. In multivariable logistic regression models, elevated PSA (10–20 ng/mL) was an independent predictor of upgrading to GGG4/GGG5 in single GGG3 positive biopsy core patients (OR:2.89; 95%-CI: 1.31–6.11; p = 0.007).
Conclusion: In single GGG2 positive biopsy core patients, downgrading was four times more often recorded compared to upgrading. Conversely, in single GGG3 positive biopsy core patients, up- and downgrading rates were comparable and should be expected in one out of ten patients.
Cadmium-mediated toxicity of cultured proximal tubule (PT) cells is associated with increased production of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. We found that cadmium-dependent apoptosis (Hoechst 33342 and annexin V assays) decreased with prolonged CdCl(2) (10 microM) application (controls: 2.4 +/- 1.6%; 5 h: +5.1 +/- 2.3%, 20 h: +5.7 +/- 2.5%, 48 h: +3.3 +/- 1.0% and 72 h: +2.1 +/- 0.4% above controls), while cell proliferation was not affected. Reduction of apoptosis correlated with a time-dependent up-regulation of the drug efflux pump multidrug resistance P-glycoprotein (mdr1) in cadmium-treated cells ( approximately 4-fold after 72 h), as determined by immunoblotting with the monoclonal antibody C219 and measurement of intracellular accumulation of the fluorescent probe calcein +/- the mdr1 inhibitor PSC833 (0.5 microM). When mdr1 inhibitors (PSC833, cyclosporine A, verapamil) were transiently added to cells with mdr1 up-regulation by pretreatment for 72 h with cadmium, cadmium-induced apoptosis increased significantly and to a percentage similar to that obtained in cells with no mdr1 up-regulation (72-h cadmium: 5.2 +/- 0.9% versus 72-h cadmium + 1-h PSC833: 7.2 +/- 1.4%; p < or = 0.001). Cadmium-induced apoptosis and mdr1 up-regulation depended on ROS, since co-incubation with the ROS scavengers N-acetylcysteine (15 mM) or pyrrolidine dithiocarbamate (0.1 mM) abolished both responses. Moreover, cadmium- and ROS-associated mdr1 up-regulation was linked to activation of the transcription factor NF-kappaB; N-acetylcysteine, pyrrolidine dithiocarbamate, and the IkappaB-alpha kinase inhibitor Bay 11-7082 (20 microM) prevented both, mdr1 overexpression and degradation of the inhibitory NF-kappaB subunit, IkappaB-alpha, induced by cadmium. The data show that 1) cadmium-mediated apoptosis in PT cells is associated with ROS production, 2) ROS increase mdr1 expression by a process involving NF-kappaB activation, and 3) mdr1 overexpression protects PT cells against cadmium-mediated apoptosis. These data suggest that mdr1 up-regulation, at least in part, provides anti-apoptotic protection for PT cells against cadmium-mediated stress.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent type of primary liver cancer. Low numbers of HCC patients being suitable for liver resection or transplantation and multidrug resistance development during pharmacotherapy leads to high death rates for HCC patients. Understanding the molecular mechanisms of HCC etiology may contribute to the development of novel therapeutic strategies for prevention and treatment of HCC. UDP-glucose ceramide glycosyltransferase (UGCG), a key enzyme in glycosphingolipid metabolism, generates glucosylceramide (GlcCer), which is the precursor for all glycosphingolipids (GSLs). Since UGCG gene expression is altered in 0.8% of HCC tumors, GSLs may play a role in cellular processes in liver cancer cells. Here, we discuss the current literature about GSLs and their abundance in normal liver cells, Gaucher disease and HCC. Furthermore, we review the involvement of UGCG/GlcCer in multidrug resistance development, globosides as a potential prognostic marker for HCC, gangliosides as a potential liver cancer stem cell marker, and the role of sulfatides in tumor metastasis. Only a limited number of molecular mechanisms executed by GSLs in HCC are known, which we summarize here briefly. Overall, the role GSLs play in HCC progression and their ability to serve as biomarkers or prognostic indicators for HCC, requires further investigation.
Background: To test the impact of urethral sphincter length (USL) and anatomic variants of prostatic apex (Lee-type classification) in preoperative multiparametric magnet resonance imaging (mpMRI) on mid-term continence in prostate cancer patients treated with radical prostatectomy (RP). Methods: We relied on an institutional tertiary-care database to identify patients who underwent RP between 03/2018 and 12/2019 with preoperative mpMRI and data available on mid-term (>6 months post-surgery) urinary continence, defined as usage 0/1 (-safety) pad/24 h. Univariable and multivariable logistic regression models were fitted to test for predictor status of USL and prostatic apex variants, defined in mpMRI measurements. Results: Of 68 eligible patients, rate of mid-term urinary continence was 81% (n = 55). Median coronal (15.1 vs. 12.5 mm) and sagittal (15.4 vs. 11.1 mm) USL were longer in patients reporting urinary continence in mid-term follow-up (both p < 0.01). No difference was recorded for prostatic apex variants distribution (Lee-type) between continent vs. incontinent patients (p = 0.4). In separate multivariable logistic regression models, coronal (odds ratio (OR): 1.35) and sagittal (OR: 1.67) USL, but not Lee-type, were independent predictors for mid-term continence. Conclusion: USL, but not apex anatomy, in preoperative mpMRI was associated with higher rates of urinary continence at mid-term follow-up.
hintergrund: Männer in Deutschland sterben früher als Frauen und nehmen weniger häufig Krebsvorsorgeuntersuchungen wahr.
Fragestellung: Ziel war die prospektive Evaluation einer „Movember-Gesundheitsinitiative“ am Universitätsklinikum Frankfurt (UKF) im November 2019.
Methoden: Im Rahmen der „Movember-Gesundheitsinitiative“ wurde allen männlichen Mitarbeitern des UKF ab dem 45. Lebensjahr und bei erstgradiger familiärer Vorbelastung eines Prostatakarzinoms ab dem 40. Lebensjahr im November 2019 gemäß S3-Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Urologie (DGU) eine Prostatakarzinom-Vorsorgeuntersuchung angeboten.
Ergebnisse: Insgesamt nahmen 14,4 % der Mitarbeiter teil. Eine familiäre Vorbelastung gaben insgesamt 14,0 % Teilnehmer an. Das mediane Alter betrug 54 Jahre. Der mediane PSA(prostataspezifisches Antigen)-Wert lag bei 0,9 ng/ml, der mediane PSA-Quotient bei 30 %. Bei 5 % (n = 6) zeigte sich ein suspekter Tastbefund in der DRU (digital-rektale Untersuchung). Nach Altersstratifizierung (≤ 50 vs. > 50 Lebensjahre) zeigten sich signifikante Unterschiede im medianen PSA-Wert (0,7 ng/ml vs. 1,0 ng/ml, p < 0,01) und der bereits zuvor durchgeführten urologischen Vorsorge (12,1 vs. 42,0 %, p < 0,01). Vier Teilnehmer (3,3 %) zeigten erhöhte Gesamt-PSA-Werte. Bei 32,2 % der Teilnehmer zeigte sich mindestens ein kontrollbedürftiger Befund. Insgesamt wurden 6 Prostatabiopsien durchgeführt. Hierbei zeigte sich in einem Fall ein intermediate-risk Prostatakarzinom (Gleason 3 + 4, pT3a, pPn1, pNx, R0).
Schlussfolgerungung: Im Rahmen der UKF-Movember-Gesundheitsinitiative 2019 konnten durch ein Vorsorgeangebot 121 Männer für eine Prostatakrebs-Vorsorge inklusive PSA-Testung gewonnen werden. Auffällige/kontrollbedürftige Befunde zeigten sich bei 32,2 %. Bei einem Mitarbeiter wurde ein therapiebedürftiges Prostatakarzinom entdeckt und therapiert.
Polypharmacy is associated with a risk of negative health outcomes. Potentially inappropriate medications, interactions resulting from contradicting medical guidelines, and inappropriate monitoring, all increase the risk. This process evaluation (PE) of the AdAM study investigates implementation and use of a computerized decision-support system (CDSS). The CDSS analyzes medication appropriateness by including claims data, and hence provides general practitioners (GPs) with full access to patients’ medical treatments. We based our PE on pseudonymized logbook entries into the CDSS and used the four dimensions of the Medical Research Council PE framework. Reach, which examines the extent to which the intended study population was included, and Dose, Fidelity, and Tailoring, which examine how the software was actually used by GPs. The PE was explorative and descriptive. Study participants were representative of the target population, except for patients receiving a high level of nursing care, as they were treated less frequently. GPs identified and corrected inappropriate prescriptions flagged by the CDSS. The frequency and intensity of interventions documented in the form of logbook entries lagged behind expectations, raising questions about implementation barriers to the intervention and the limitations of the PE. Impossibility to connect the CDSS to GPs’ electronic medical records (EMR) of GPs due to technical conditions in the German healthcare system may have hindered the implementation of the intervention. Data logged in the CDSS may underestimate medication changes in patients, as documentation was voluntary and already included in EMR.
Background: Interventional studies on polypharmacy often fail to significantly improve patient-relevant outcomes, or confine themselves to measuring surrogate parameters. Interventions and settings are complex, with many factors affecting results. The AdAM study’s aim is to reduce hospitalization and death by requiring general practitioners (GPs) to use a computerized decision-support system (CDSS). The study will undergo a process evaluation to identify factors for successful implementation and to assess whether the intervention was implemented as intended.
Objective: To evaluate our complex intervention, based on the Medical Research Council’s guideline dimensions.
Research Questions:
We will assess implementation (reach, fidelity, dose, tailoring) by asking: (1) Who took part in the intervention (proportion of GPs using the CDSS, proportion of patients enrolled in them)? Information on GPs’ and patients’ characteristics will also be collected. (2) How many and which medication alerts were dealt with? (3) Was the intervention implemented as intended? (4) On what days did GPs use the intervention tool?
Methods: The process evaluation is part of a stepped-wedge cluster-randomized controlled trial. Characteristics of practices, GPs and patients using the CDSS will be compared with the non-participating population. CDSS log data will be analyzed to evaluate how the number of medication alerts changed between baseline and 2 months later, and to identify the kind of alerts that were dealt with. Comparison of enrolled patients on weekdays versus weekends will shed light on GPs’ use of the CDSS in the absence or presence of patients. Outcomes will be presented using descriptive statistics, and significance tests will be used to identify associations between them. We will conduct subgroup analyses, including time effects to account for software improvements.
Discussion: This study protocol is the basis for conducting analyses of the quantitative process evaluation. By providing insight into how GPs conduct medication reviews, the evaluation will provide context to the trial results and support their interpretation. The evaluation relies on the proper documentation by GPs, potentially limiting its explanatory power.
Patients with acute myeloid leukemia (AML) are often exposed to broad-spectrum antibiotics and thus at high risk of Clostridioides difficile infections (CDI). As bacterial infections are a common cause for treatment-related mortality in these patients, we conducted a retrospective study to analyze the incidence of CDI and to evaluate risk factors for CDI in a large uniformly treated AML cohort. A total of 415 AML patients undergoing intensive induction chemotherapy between 2007 and 2019 were included in this retrospective analysis. Patients presenting with diarrhea and positive stool testing for toxin-producing Clostridioides difficile were defined to have CDI. CDI was diagnosed in 37 (8.9%) of 415 AML patients with decreasing CDI rates between 2013 and 2019 versus 2007 to 2012. Days with fever, exposition to carbapenems, and glycopeptides were significantly associated with CDI in AML patients. Clinical endpoints such as length of hospital stay, admission to ICU, response rates, and survival were not adversely affected. We identified febrile episodes and exposition to carbapenems and glycopeptides as risk factors for CDI in AML patients undergoing induction chemotherapy, thereby highlighting the importance of interdisciplinary antibiotic stewardship programs guiding treatment strategies in AML patients with infectious complications to carefully balance risks and benefits of anti-infective agents.
Background: A growing interest exists in using polymeric nanoparticles (NPs) especially functionalized with surface-active substances as carriers across the blood brain barrier (BBB) for potentially effective drugs in traumatic brain injury (TBI). However, the organ distribution of intravenous administrated biodegradable and non-biodegradable NPs coated with different surfactants, how much of the administrated dose reach the brain parenchyma in areas with intact and opened BBB after trauma, as well as whether they elicit an inflammatory response is still to be clarified.
Methods: The organ distribution, brain penetration and eventual inflammatory activation of polysorbate-80 (Tw80) and sodium-lauryl-sulfate (SDS) coated poly l-lactide (PLLA) and perfluorodecyl acrylate (PFDL) nanoparticles were evaluated after intravenous administration in rats prior and after undergoing controlled cortical impact (CCI).
Results: A significant highest NP uptake at 4 and 24 hs was observed in the liver and spleen, followed by the brain and kidney, with minimal concentrations in the lungs and heart for all NPs. After CCI, a significant increase of NP uptake at 4 hs and 24 hs was observed within the traumatized hemisphere, especially in the perilesional area, although NPs were still found in areas away from CCI and the contralateral hemisphere in similar concentrations as in non-CCI subject. NPs were localized in neurons, glial and endovascular cells. Immunohistochemical staining against GFAP, Iba1, TNFα and IL1β demonstrated no glial activation or neuroinflamatory changes.
Conclusions: Tw80 and SDS coated biodegradable (PLLA) and non-biodegradrable (PFDL) NPs reach the brain parenchyma in both areas of traumatized and undamaged brain with disrupted and intact BBB, even though a high amount of them are retained in the liver and the spleen. No inflammatory reaction is elicited by these NPs within 24 hs after application. These preliminary promising results postulate the effectiveness and safety of these NPs as drug-carriers for the treatment of TBI.
USP22 controls necroptosis by regulating receptor-interacting protein kinase 3 ubiquitination
(2020)
Dynamic control of ubiquitination by deubiquitinating enzymes is essential for almost all biological processes. Ubiquitin-specific peptidase 22 (USP22) is part of the SAGA complex and catalyzes the removal of mono-ubiquitination from histones H2A and H2B, thereby regulating gene transcription. However, novel roles for USP22 have emerged recently, such as tumor development and cell death. Apart from apoptosis, the relevance of USP22 in other programmed cell death pathways still remains unclear. Here, we describe a novel role for USP22 in controlling necroptotic cell death in human tumor cell lines. Loss of USP22 expression significantly delays TNFα/Smac mimetic/zVAD.fmk (TBZ)-induced necroptosis, without affecting TNFα-mediated NF-κB activation or extrinsic apoptosis. Ubiquitin remnant profiling identified receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) lysines 42, 351, and 518 as novel, USP22-regulated ubiquitination sites during necroptosis. Importantly, mutation of RIPK3 K518 reduced necroptosis-associated RIPK3 ubiquitination and amplified necrosome formation and necroptotic cell death. In conclusion, we identify a novel role of USP22 in necroptosis and further elucidate the relevance of RIPK3 ubiquitination as crucial regulator of necroptotic cell death.
Oncogenic transformation of lung epithelial cells is a multistep process, frequently starting with the inactivation of tumour suppressors and subsequent development of activating mutations in proto-oncogenes, such as members of the PI3K or MAPK families. Cells undergoing transformation have to adjust to changes, including altered metabolic requirements. This is achieved, in part, by modulating the protein abundance of transcription factors. Here, we report that the ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 28 (USP28) enables oncogenic reprogramming by regulating the protein abundance of proto-oncogenes such as c-JUN, c-MYC, NOTCH and ∆NP63 at early stages of malignant transformation. USP28 levels are increased in cancer compared with in normal cells due to a feed-forward loop, driven by increased amounts of oncogenic transcription factors such as c-MYC and c-JUN. Irrespective of oncogenic driver, interference with USP28 abundance or activity suppresses growth and survival of transformed lung cells. Furthermore, inhibition of USP28 via a small-molecule inhibitor resets the proteome of transformed cells towards a ‘premalignant’ state, and its inhibition synergizes with clinically established compounds used to target EGFRL858R-, BRAFV600E- or PI3KH1047R-driven tumour cells. Targeting USP28 protein abundance at an early stage via inhibition of its activity is therefore a feasible strategy for the treatment of early-stage lung tumours, and the observed synergism with current standard-of-care inhibitors holds the potential for improved targeting of established tumours.
Highlights
• USP32 deubiquitinates the Ragulator complex subunit LAMTOR1 at lysine (K) 20
• LAMTOR1 K20 ubiquitination impairs its binding to the vacuolar H+-ATPase
• USP32 knockout reduces mTORC1 activity and elevates autophagic flux
• Depletion of USP32 in Caenorhabditis elegans inhibits mTOR and induces autophagy
Summary
The endosomal-lysosomal system is a series of organelles in the endocytic pathway that executes trafficking and degradation of proteins and lipids and mediates the internalization of nutrients and growth factors to ensure cell survival, growth, and differentiation. Here, we reveal regulatory, non-proteolytic ubiquitin signals in this complex system that are controlled by the enigmatic deubiquitinase USP32. Knockout (KO) of USP32 in primary hTERT-RPE1 cells results among others in hyperubiquitination of the Ragulator complex subunit LAMTOR1. Accumulation of LAMTOR1 ubiquitination impairs its interaction with the vacuolar H+-ATPase, reduces Ragulator function, and ultimately limits mTORC1 recruitment. Consistently, in USP32 KO cells, less mTOR kinase localizes to lysosomes, mTORC1 activity is decreased, and autophagy is induced. Furthermore, we demonstrate that depletion of USP32 homolog CYK-3 in Caenorhabditis elegans results in mTOR inhibition and autophagy induction. In summary, we identify a control mechanism of the mTORC1 activation cascade at lysosomes via USP32-regulated LAMTOR1 ubiquitination.