Biochemie und Chemie
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This thesis describes the structural characterization of interactions between biological relevant ribonucleic acid biomacromolecules (RNAs) and selected ligands to optimize the methodologies for the design of pharmacological lead compounds. To achieve this aim, not only the structures of the RNA, the ligand and their complexes need to be known, but also information about the inherent dynamics, especially of the target RNA, are necessary. To determine the structure and dynamics of these molecules and their complexes, liquid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a suitable and powerful method. The necessity for these investigations arises from the lack of knowledge in RNA-ligand interactions, e.g. for the development of new medicinal drugs targeting crucial RNA sequences. In the first chapters of this thesis (Chapters II to IV), an introduction into RNA research is given with a focus on RNA structural features (Chapter II), into the interacting molecules, the biology of the specific RNA targets and the further development of their ligands (Chapter III) and into the NMR theory and methodologies used within this thesis (Chapter IV). Chapter II begins with a description of RNA characteristics and functions, placing the focus on the increasing attention that these biomacromolecules have attracted in recent years due to their diverse biological functionalities. This is followed by a detailed description of general structural features of RNA molecules. The biological functions of the RNAs investigated in this thesis (Human immunodeficiency virus PSI- and TAR-RNA and Coxsackievirus B3 Stemloop D in the 5’-cloverleaf element), together with their known structural characteristics are introduced in Chapter III. Furthermore, a description of the investigated ligands is given, focusing on the methods how their affinity and specificity were determined. The introduction is completed in Chapter IV, where the relevant NMR theory and methodologies are explained. First, kinetics and thermodynamics of ligand binding are summarized from an NMR point of view. Subsequently, a detailed description of the resonance assignment procedures for RNAs and peptidic ligands is given. This procedure mainly concentrates on the assignment of the proton resonances, which are essential for the later structure calculation from NMR restraints. The procedure for NMR structure calculation of RNA and its complexes follows with a short introduction into the programs ARIA and HADDOCK. The final part of this chapter explains the relaxation theory and the methodology to extract dynamic information from autocorrelated relaxation rates via the model-free formalism. In the Chapters V to VII of this thesis, the original publications are included and grouped into three topics. Chapter V comprehends the publications on the investigations of HIV PSI-RNA and its hexapeptidic ligand. These three publications[1-3] focus on the characterization of the ligand and its binding properties, its structure and the optimization of its composition aiming to improve its usage for further spectroscopic investigations.
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
Introduction: Immune paralysis with massive T-cell apoptosis is a central pathogenic event during sepsis and correlates with septic patient mortality. Previous observations implied a crucial role of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) during T-cell apoptosis.
Methods: To elucidate mechanisms of PPARγ-induced T-cell depletion, we used an endotoxin model as well as the caecal ligation and puncture sepsis model to imitate septic conditions in wild-type versus conditional PPARγ knockout (KO) mice.
Results: PPARγ KO mice showed a marked survival advantage compared with control mice. Their T cells were substantially protected against sepsis-induced death and showed a significantly higher expression of the pro-survival factor IL-2. Since PPARγ is described to repress nuclear factor of activated T cells (NFAT) transactivation and concomitant IL-2 expression, we propose inhibition of NFAT as the underlying mechanism allowing T-cell apoptosis. Corroborating our hypothesis, we observed up-regulation of the pro-apoptotic protein BIM and downregulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 in control mice, which are downstream effector proteins of IL-2 receptor signaling. Application of a neutralizing anti-IL-2 antibody reversed the pro-survival effect of PPARγ-deficient T cells and confirmed IL-2-dependent apoptosis during sepsis.
Conclusion: Apparently antagonizing PPARγ in T cells might improve their survival during sepsis, which concomitantly enhances defence mechanisms and possibly provokes an increased survival of septic patients.
Na+/H+ antiporters are ubiquitous membrane proteins involved in ion homeostasis and pH sensing. The amino acid sequence of one such antiporter, MjNhaP1, from Methanococcus jannaschii, shows a significant homology to eukaryotic sodium proton exchangers like NHE1 from Homo sapiens and SOS1 of Arabidopsis thaliana than to the well-characterized Escherichia coli NhaA or NhaB. MjNhaP1 shows activity at acidic pH unlike NhaA, which is active at basic pH. 13 transmembrane helices have been predicted to be present in NhaP1. A projection map, calculated by Cryo-EM of 2D crystals of MjNhaP1 grown at pH 4, showed it to be a dimer containing elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core (Vinothkumar et al., 2005). Incubation of 2D crystals at pH 8 on the EM grid resulted in well-defined conformational changes, clearly evident in a difference map as a major change in density distribution within the helix bundle (Vinothkumar et al., 2005). The aim of this dissertation is to understand the working mechanism of MjNhaP1 by determining its three-dimensional structure. The aim was initially approached by structure determination by X-ray crystallography. The limitation for this method was the low expression yield, which was 0.5–0.7mg/ml (Vinothkumar et al., 2005). After various optimization trials, the expression yield of the recombinant protein could be elevated to 2-2.5mg of pure protein per litre of culture by the method of autoinduction (Studier et al., 2005). To obtain well diffracting 3D crystals, purification conditions (Vinothkumar et al., 2005) were modified. 3D crystals were obtained under various conditions, which has so far not diffracted X-Ray beyond 8Å. Parallely, optimization of parameters (Vinothkumar et al., 2005) for 2D crystals formation was carried out. A combination of 1% DDM used for lipid solubilization, and 1% OG in the buffer of the purified protein produced 1-2 μm wide tubular 2D crystals of NhaP1. This batch of crystal proved to be the optimal for data collection at higher tilt angle with the electron microscope. A 3D map showed p22121 symmetry and revealed a tight dimer with an oval shape. The region in the central part of the dimer is composed of several tilted helices forming an interface between both monomers. On either side of the dimer interface, a group of six tightly packed helices form a bundle. This bundle contains three straight helices in the centre of the monomer and three helices in the periphery. Comparison of the structures of E.coli NhaA and M. jannaschii NhaP1 show substantial differences in length and slope of corresponding helices between both antiporters. A 3D model of NhaP1 based on the 3D map revealed 13 helices, which has been named as A-M to distinguish it from the NhaA helices. Overlaying the X-ray structure onto the 3D map revealed that the disrupted helices IV and XI of NhaA superimpose two central helices at similar position in the 3D map of NhaP1. The disrupted helices IV and XI in the X-ray structure of NhaA have been proposed as the putative ion-binding and translocation site (Hunte C et al, 2005; Arkin IT et al, 2007; Screpanti & Hunte (2007). This motif appears to be present also in NhaP1, as suggested by the close fit of NhaA helices IV and XI on the putative helices E and L of the NhaP1 model. These two putative helices E and L in NhaP1 contain the highly conserved TDP and GPRVVP motif, which are crucial for antiporter activity (Hellmer et al., 2002, Hellmer et al., 2003). In the overlay, helix V of NhaA containing the two essential, conserved aspartates D163 and D164 fits the density of the putative helix F of NhaP1, which contains the conserved motif FNDP. The homologous D161 in the FNDP motif of NhaP1 is essential for transport activity as show by mutagenesis (Hellmer at al., 2003). Significant differences are visible in the region of the dimer interface of the 3D map of NhaP1 occupied by helices VI, VII, and VIII in NhaA. This region shows an extra helical density (A) in the 3D map of NhaP1. By alignment of MjNhaP1 sequence with the amino acid sequences of several Na+/H+ exchangers, it was evident that the additional helix (A) is located in the N terminus of NhaP1. In our sequence alignment, a putative hydrophobic segment corresponding to this additional helix A is present in other archaeal and eukaryotic antiporters but not in any of the bacterial ones. The N-terminus of the human Na+/H+ exchanger NHE1 has been predicted to contain a highly hydrophobic signal peptide. This indicates the probability of the N-terminal helix A of NhaP1 to be an uncleaved signal peptide. Besides being a signal sequence targeting NhaP1 to the membrane, the map suggests that this helix might be involved in the formation of dimer contacts between both monomers. A gene duplication event is evident in the 3D map of NhaP1, as not only the helices D, E, F and K, L, M are related by an inverted repeat but also the helices B, C and I, J are related. We present here the three-dimensional architecture of a Na+/H+ antiporter from archaea. The presence of the 13th helix suggests the location of the N-terminus to be located in the cytosol and the C-terminus in the periplasm. This would orient NhaP1 in an inverted manner in the membrane in comparison to NhaA. Further structural information at higher resolution and biochemical and biophysical investigations are required to confirm the topology.
Die vorliegende Arbeit ist aus drei Teilen aufgebaut. Im ersten, relativ kurz gehaltenen Kapitel wird die klassische Standard-Industrie-Solarzelle auf der Basis monokristallinen Siliziums vorgestellt. Der bisherige Herstellungsprozess der Standard-Industrie-Solarzelle, der in wesentlichen Teilen darauf abzielt, diese Verluste zu minimieren, dient als Referenz für die Entwicklung neuer Fertigungsverfahren, wie sie in den Kapiteln 2 und 3 dieser Arbeit vorgestellt werden. Den ersten thematischen Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Entwicklung eines alternativen Wafering-Konzeptes zum Multi-Drahtsägen, der klassischen Technologie zur Fertigung von Silizium-Wafern. Die Basis des neuen, hier vorgestellten Wafering-Prozesses bildet das Laser-Micro-Jet-Verfahren (LMJTM). Dieses System besitzt eine Reihe von Vorteilen gegenüber klassischen „trockenen“ Laserverfahren. Das ursprünglich auf reinem, deionisiertem Wasser als Strahlmedium aufbauende System wurde im Rahmen dieser Arbeit so modifiziert, dass der Flüssigkeitsstrahl nunmehr nicht nur als flüssiger Lichtleiter dient, sondern gleichzeitig auch als Transportmedium für Ätzmittel, welche den thermischen Abtrag des Siliziums durch den Laserstrahl unterstützen. Ausgehend vom aus der Literatur bekannten chemischen Verhalten des Siliziums wurden 3 Ätzsysteme für Silizium vorgestellt. Dabei wurden Vor- und Nachteile für deren technischen Einsatz diskutiert. Den praktischen Teil dieses Arbeitspaketes bildete der Test zweier Ätzmedien im Experiment. Dabei konnte gezeigt werden, dass wasserfreie Strahlmedien basierend auf perfluorierten Lösemitteln mit bereits sehr geringen Zusätzen gasförmigen Chlors als Ätzmittel für Silizium wässrigen alkalischen Ätzsystemen jeder Konzentration prinzipiell überlegen sind- Parallel zur Evaluation des Einflusses der chemischen Beschaffenheit des Flüssigkeitsstrahls auf den Abtragsprozess fand auch eine Untersuchung verschiedener Prozessparametereinflüsse statt, etwa der Laserleistung, der Laserlichtwellenlänge, etc. Den zweiten thematischen Schwerpunkt der Arbeit bildet die Modifizierung der nasschemischen Schritte zwischen dem Wafering und dem ersten Hochtemperatur-Fertigungsschritt in der Solarzellen-Produktion, der Emitterdiffusion. Diese nasschemischen Schritte umfassen bei der Standard-Industrie-Solarzelle in der Regel eine zum Teil aufwändige Reinigung der Wafer-Oberflächen von partikulären und metallischen Kontaminationen, die vor allem vom Wafering-Prozess herrühren, als auch eine Texturierung der Substrate. Kernanliegen des praktischen Teils dieses Arbeitspaketes ist zum einen die Suche nach alternativen Texturmitteln zum 2-Propanol, dem klassischen Badadditiv in basischen Ätzbädern, das in der Praxis über zahlreiche Nachteile verfügt, etwa einem relativ niedrigen Siedepunkt, der zu seinem permanenten Ausgasen aus der Lösung führt. Zum anderen sollte der auf die Textur folgende Reinigungsprozess rationalisiert werden, um Prozesskosten zu minimieren, entweder durch eine Straffung des Prozesses durch Verringerung des Chemikalienverbrauchs und einer Reduzierung der Prozesszeit oder durch eine Verringerung der Chemikalienkosten. Bei der Suche nach neuen Texturmitteln wurden 45 verschiedene organische Substanzen verschiedener Verbindungsklassen hinsichtlich ihrer Texturwirkung auf monokristallinen Silizium-substraten getestet. Mit 1-Pentanol und p-Toluolsulfonsäure wurden zwei Substanzen ermittelt, welche in der Zukunft als praktikable Alternativen zu 2-Propanol als Texturadditive dienen könnten. Im Kontext der Suche nach neuen Reinigungsverfahren wurden eine Reihe verschiedener neuer Reinigungssequenzen getestet, die sich entweder durch veränderte - in der Regel verringerte - Badkonzentrationen, durch neue Badsequenzen, welche auf bestimmte Teilschritte verzichten oder durch neue Badkompositionen, etwa durch Hinzuziehen von Komplexbildnern für metallische Verunreinigungen von den klassischen Reinigungsprozessen unterscheiden. Der Erfolg des Reinigungseffektes der nasschemischen Sequenzen wurde anhand der Ladungsträger-Lebensdauer in den Wafern abgeschätzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe von LMJ produzierte (gelaserte) Wafer-Oberflächen wesentlich straffere Reinigungsprozesse erfordern als drahtgesägte Substrate. Neben einer deutlichen Straffung des Reinigungsprozesses ist auch eine Verkürzung der Texturzeit bei den mit Lasern geschnittenen Oberflächen möglich, die wiederum ihren Grund im geringeren Schädigungsgrad dieser Oberflächen hat, der einen geringeren Materialabtrag durch die Ätzbäder erfordert, als bei drahtgesägten Wafern. Abschließend konnte noch gezeigt werden, dass drahtgesägte Substrate, die bei gleicher Prozesszeit mit den neuen Texturmitteln prozessiert wurden, über erheblich höhere mechanische Stabilitäten verfügen, als jene, bei denen das klassische Texturmittel 2-Propanol eingesetzt wurde.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
The transcription factor p63 is part of the p53 protein family, which consists of three members, p53, p63 and p73. P63 shares structural similarity with all family members, but is associated to different biological functions than p53 or p73. While p53 is mainly linked to tumor suppression and p73 is connected with neuronal development, p63 has been connected to critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology as well as supervision of the genetic stability of oocytes. Due to its gene structure p63 is expressed as at least six different isoforms, three of them containing a N-terminal transactivation domain. The isoforms that are of biological relevance both have a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates the transcriptional activity. This inhibitory domain is supposed to contain two individual components of which one is internally binding and masking the transactivation domain while the other one can be sumoylated. To further investigate this domain a mutational analysis with the help of transactivation assays in SAOS2 cells was carried out to identify the critical amino acids within the inhibitory domain and the impact on transcriptional activity of TAp63alpha, the p63-isoform which is essential for the integrity of the female germline. The results of these experiments show that a stretch of approximately 13 amino acids seems to be important for the regulation of transcriptional activity in TAp63alpha, due to the increased transcriptional activity occurring in this region after mutation. Additional experiments showed that this mechanism is distinct from sumoylation, which seems to have only implications for the intracellular level of TAp63alpha. As a conclusion, the C-terminus of the Tap63alpha is essential for two different mechanisms, which control the transcriptional activity of the protein. Both regulatory elements are independent from each other and can now be restricted to certain amino acids. Activation of the wild type protein might take place in the identified region via post-translational modification. Furthermore an inhibition assay was carried out to test if the same region might have implications on the second biological relevant isoform deltaNp63alpha. The results show that the same amino acids which show an impact on transcriptional activity in Tap63alpha lead to a significant change in functional behaviour of deltaNp63alpha. There is a possibility that both proteins are regulated with opposite effects via the same mechanisms, based at the C-terminus of the p63alpha-isoforms. In both cases a modification of these residues could lead to a more opened conformation of the protein with consequences on promoter binding, which can be even important for deltaNp63alpha with respect to promoter squelching. Both alpha-isoforms seem to be regulated via the C-terminus and to elucidate if that is also the case for TAp63gamma a deletion analysis was carried out. The results show that there are also amino acids within the C-terminus of TAp63gamma, which have implications on the transcriptional activity of the protein. Therefore the C-terminus seems to play a major role for regulation of diverse p63 isoforms.
Elektronentransferprozesse in Pd-Komplexen 1,4-Chinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(2009)
PdII-katalysierte Oxidationsreaktionen organischer Verbindungen stellen wichtige synthetische Werkzeuge dar. Um das Übergangsmetall in katalytischen Mengen einsetzen zu können ist es nötig, das im Zuge der Substratumwandlung entstehende Pd0 seinerseits wieder zu reoxidieren. Im großtechnischen Wacker-Prozess setzt man zu diesem Zweck das Redoxsystem CuII/CuI ein, welches Elektronen von Pd0 aufnimmt und sie auf molekularen Sauerstoff überträgt, so dass als einziges Abfallprodukt Wasser entsteht. Da beim Einsatz von Kupfersalzen allerdings Probleme durch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können, stieß man auf der Suche nach alternativen Redox-Cokatalysatoren auf 1,4-Benzochinon. Man nimmt an, dass der Reoxidation von Pd0 eine Koordination des 1,4-Benzochinons an das Übergangsmetallatom vorausgeht. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit ein 1,4-Naphthochinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Ligand entwickelt, dessen Pd-Komplex das katalytisch aktive Übergangsmetallatom und den Redox-Cokatalysator in einem einzigen Molekül vereint. Eine direkte intra- und intermolekulare 1,4-Chinon/Pd-Koordination wird durch das Ligandendesign jedoch verhindert. Anhand dieses Modellsystems sollte dann untersucht werden, ob alternativ zu den etablierten mechanistischen Vorstellungen zum Ablauf des Elektronentransfers, eine durch den Raum verlaufende elektronische Kommunikation der beiden redoxaktiven Zentren möglich ist. Sollte das der Fall sein, wäre man künftig bei der Entwicklung und Optimierung solcher Hybridkatalysatoren nicht auf die Miteinbeziehung des 1,4-Chinons in die Koordinationssphäre des Übergangsmetallions angewiesen, sondern könnte diese ausschließlich an die koordinationschemischen Erfordernisse des Pd-Zentrums anpassen. Nachdem das Modellsystem zur Verfügung stand, galt es im ersten Schritt, die elektrochemischen Eigenschaften von freiem Ligand und PdII-Komplex mittels Cyclovoltammetrie zu bestimmen. Mit Kenntnis der Redoxpotentiale wurden daraufhin elektrochemisch selektiv reduzierte Spezies des Liganden bzw. seines PdII-Komplexes erzeugt und deren UV-vis-Spektren in situ aufgenommen. Letztere lieferten nötige Referenzwerte für die folgenden Experimente. Auf Grundlage dieser Vorarbeiten konnte nun die elektronische Kommunikation der redoxaktiven Zentren in dem Komplex untersucht werden. Da im Modellsystem zunächst beide redoxaktive Zentren in der oxidierten Form vorliegen, war es erforderlich, das PdII-Ion selektiv zu reduzieren, um dem System an der richtigen Stelle Elektronen zuzuführen. Als Reduktionsmittel wurde Triethylamin gewählt; entsprechende Vergleichsexperimente stellten zuvor sicher, dass dieses keine Nebenreaktionen mit dem Liganden selbst eingeht. Im Zuge der Reduktion des PdII-Zentrums ist eine Änderung der UV-vis-spektroskopischen Eigenschaften des Liganden zu beobachten. Ein Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzspektren der elektrochemisch erzeugten reduzierten Spezies legt den Schluss nahe, dass nach Überführung des PdII-Zentrums in die nullwertige Stufe der durch den Raum verlaufende Übergang eines Elektrons auf den 1,4-Naphthochinon-basierten Liganden erfolgt. Das hierbei entstehende 1,4-Naphthosemichinonradikal wurde zusätzlich ESR-spektroskopisch nachgewiesen.