Biochemie und Chemie
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Das Bakterium Thermus thermophilus hat sich in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen entwickelt. Die maximale Wachstumstemperatur liegt bei bis zu 85°C, so dass auch Proteine und die gesamte Zellstruktur an diese hohen Temperaturen adaptiert sein müssen. Aufgrund der allgemein erhöhten Stabilität werden diese Proteine zunehmend für biotechnologische Prozesse und zur Strukturbestimmung verwendet. Im Energiehaushalt der Zelle ist der Elektronentransfer von NADH zu molekularem Sauerstoff ein wesentlicher Bestandteil und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. In dieser Arbeit konnten vier direkt aufeinanderfolgende Gene (fbcC, fbcX, fbcF, fbcB) identifiziert werden, die in einem 3,1 kb großen Operon mit einem GC-Gehalt von 69% organisiert sind und für die Untereinheiten eines putativen Thermus bc-Komplexes kodieren. Die in silico translatierte DNA-Information konnte für ausführliche Sequenzvergleiche und eine erste Charakterisierung der bc-Untereinheiten genutzt werden. Während Cytochrom b und das Rieske-Protein typische Eigenschaften zu anderen prokaryotischen Untereinheiten aufweisen, unterscheidet sich die Cytochrom c-Untereinheit hinsichtlich Topologie und Verwandtschaft von klassischen c1-Komponenten. Darüber hinaus wurde eine zusätzliche Untereinheit FbcX identifiziert, die keine Entsprechung in bisher bekannten bc-Komplexen hat. Das gesamte Operon mit vorangestellter d70 Promotorregion wurde amplifiziert, in einen Thermus/E.coli-Shuttlevektor mit hitzeoptimierter Kanamycinresistenz eingefügt und so plasmidkodiert für die Überexpression in T. thermophilus HB27 genutzt. Der membranständige Gesamtkomplex wurde nach Solubilisierung mit ß-D-Decyl-Maltosid stabil in Lösung gebracht und anschließend über eine Metallaffinitätssäule stöchiometrisch als vier-Untereinheiten Komplex aufgereinigt. Der Gesamtkomplex sowie seine Einzelkomponenten und deren Cofaktoren waren somit für eine nähere Charakterisierung verfügbar. Alle vier Genprodukte konnten als Untereinheiten des bc-Komplexes in T. thermophilus über N-terminale Sequenzierung und MALDI-MS/MS eindeutig identifiziert werden. Der in vitro Aktivitätstest zeigte keine Hemmbarkeit des aufgereinigten Thermus Komplexes durch klassische bc-Inhibitoren, was auf eine deutlich abweichende Substratbindung dieses Menachinol-oxidierenden Komplexes hinweist. Durch Optimierung des Thermus/E.coli-Shuttlevektors wurde auch die homologe Überexpression weiterer Thermus-Membranproteine ermöglicht. Dazu gehört neben der ba3-Oxidase auch ein MDL-ähnlicher ABC-Transporter. Weiterhin wurde gezeigt, dass die thermostabilen Eigenschaften sowohl des bc-Komplexes als auch des ABC-Transporters in Detergenzumgebung erhalten bleiben. Dieser Nachweis konnte darüber hinaus auch für den heterolog exprimierten und aus E. coli aufgereinigten ABC-Transporter erbracht werden, der im isolierten Zustand die gleiche Aktivität wie das aus Thermus aufgereinigte Äquivalent aufweist. Neben dem bc-Gesamtkomplex, der ba3-Oxidase und Cytochrom c552 wurden in dieser Arbeit weitere Komponenten der thermophilen Atmungskette in löslicher Form oder mit Membrananker, zum Teil auch heterolog in E. coli exprimiert und unter Erhalt der Redox-Cofaktoren aufgereinigt. Mit der Identifizierung und Charakterisierung eines intakten Cytochrom bc-Komplexes konnte die Lücke im Verständnis der thermophilen Atmungskette von T. thermophilus geschlossen und die Grundlage für weitere Struktur- und Funktionsanalysen dieses membranintegralen Enzymkomplexes geschaffen werden.
Das “Protein Associated with Myc” spielt in den verschiedenen physiologischen Vorgängen eine Rolle. Dazu zählen Prozesse der Synaptogenese und Schmerzverarbeitung ebenso wie eine Regulation des Pteridin- und cAMP-Stoffwechsels. Auf welche Weise PAM die unterschiedlichen Effekte vermittelt, ist bislang nur in Ansätzen verstanden. Um die Wirkmechanismen von PAM aufzuklären, wurden in dieser Arbeit seine biochemischen Funktionen untersucht. Die These, dass PAM als E3 Ubiquitinligase aktiv ist, konnte in vitro mittels biochemischer Versuche zweifelsfrei bestätigt werden. Sowohl das nativ aufgereinigte, humane PAM, als auch der heterolog expremierte C-Terminale Bereich (C-PAM), der die katalytisch aktive RING Finger Domäne enthält, wiesen die Fähigkeit zur Ubiquitinkettenbildung und Autoubiquitinierung auf. Bei der Identifikation eines möglichen Zielproteins rückte das Protein TSC2 und der damit verbundene TSC2 / mTOR Signalweg in den Fokus. Für das gewählte Modell-System HeLa Zellen ließ sich eine Interaktion von PAM und TSC2 durch Ko-Immunopräzipitationen und Immunzytochemie nachweisen. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass das vollständige, native PAM, nicht aber die isolierte RING Finger Domäne, TSC2 polyubiquitinieren und zum proteasomalen Abbau markieren kann. TSC2 ist ein negativer Regulator der mTOR Kinaseaktivität, in dem es den stimulatorischen Einfluss von Rheb auf mTOR inhibiert. PAM wird in HeLa Zellen durch das Phospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aktiviert. Nach S1P Behandlung der Zellen war eine Phosphorylierung der Proteinkinase mTOR nachweisbar. Diese ging mit einer Aktivierung der Kinaseaktivität einher, wie die rapamycinsensitive Phosphorylierung der mTOR Zielproteine p70S6K und 4E-BP1 zeigte. Durch Gabe von Rezeptor-Agonisten/-Antagonisten konnte eine Beteiligung des S1P1 und S1P2 Rezeptors ausgeschlossen werden. Der zunächst vermutete Mechanismus eines S1P induzierten, PAM-abhängigen Abbaus von TSC2 konnte trotz vielfältiger Herangehensweisen nicht nachgewiesen werden. Eine Phosphorylierung als Indikation einer Inaktivierung war ebenfalls nicht detektierbar. Auch die GAP Aktivität von TSC2 auf Rheb, wird in in vitro Versuchen durch die Interaktion mit PAM nicht vermindert. Durch eine Verminderung der TSC2 Expression mittels spezifischer siRNA zeigte sich, dass TSC2 nicht in die S1P-abhängige mTOR Aktivierung involviert ist. Auch regulatorische Proteinkinasen wie AKT, ERK oder PI3K, die durch S1P aktiviert werden können, sind an dem Signalweg nicht beteiligt, wie die Hemmung dieser Enzyme mit spezifischen Inhibitoren zeigte. Dagegen konnte eine Beteiligung von PAM und Rheb zum einen mittels Proteintransfektion bestätigt werden, zum anderen ließen sich die S1P Effekte durch Hemmstoffe verhindern, die für eine Aktivierung von PAM, respektive Rheb, nötig sind. Durch Nukleotidbindungsstudien war ein Einfluss von PAM auf den GTP-Beladungszustand von Rheb nachweisbar. Sowohl in einem GTPS Bindungsversuch als auch in einem GDP Dissoziationsexperiment erhöhte PAM konzentrationsabhängig die GTP Bindung bzw. den GDP/GTP Austausch an Rheb. In dieser Arbeit wird damit erstmalig eine duale Funktion eines Proteins als Ubiquitinligase und GEF beschrieben. So konnte die postulierte Aktivität von PAM als Ubiquitinligase bestätigt und TSC2 als Zielprotein identifiziert werden. Gleichzeitig wurde ein TSC2 unabhängiger Weg der mTOR Aktivierung aufgeklärt, an dem PAM und Rheb beteiligt sind. Als möglicher Mechanismus kommt eine Aktivität von PAM als Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) auf Rheb in Frage. Durch Beschreibung von PAM als negativem Regulator von TSC2 und Aktivator von Rheb trägt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur TSC2 / mTOR Forschung bei. Umgekehrt ermöglicht sie eine neue Sichtweise auf partiell PAM-abhängige Vorgänge wie Synaptogenese und Nozizeption, indem sie TSC2 / mTOR in diese Prozesse integriert.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Das Tau-Protein bildet im Verlauf von zahlreichen Demenzen, mit Morbus Alzheimer als die bekannteste unter ihnen, Aggregate, die sogenannten „neurofibrillären Geflechte“, die aus Fibrillen, den „paired helical filaments“ (PHFs) bestehen. Außerdem ist das Tau-Protein ein essentielles „microtubule-associated protein“, welches für die Aufrechterhaltung des neuronalen Zellmetabolismus notwendig ist. Dies veranlasste uns dazu, das Tau-Protein als Monomer, in der Mikrotubuli-gebundenen Form und als Fibrille zu charakterisieren. Die Technik, die wir hierzu verwendeten war die NMR-Spektroskopie, die als einzige strukturaufklärende Technik mit atomarer Auflösung dazu in der Lage ist, intrinsisch ungeordnete Proteine, wie das Tau-Protein, zu charakterisieren. Zwar war die Signalzuordnung der NMR-Spektren eine große Herausforderung, dennoch war es möglich praktisch alle Rückgratresonanzen sogar für die längste Tau-Isoform htau40 mit 441 Resten erfolgreich eindeutig zu identifizieren. Mit Hilfe der Zuordnung war es möglich das Tau-Protein bezüglich residualer Strukturelemente, Rückgratdynamik und Bindungsverhalten zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass in der C-terminalen Hälfte des Tau-Proteins, in welcher eine charakteristische Domäne vorliegt, die durch vier imperfekte „repeat“-Regionen (Länge ist jeweils ca. 31 Reste) gekennzeichnet ist, partieller beta-Strukturcharakter vorliegt. Ebenfalls weist diese Region eine verhältnismäßig hohe Rigidität auf. Aus diesem Grund betrachten wird diesen sequentiellen Bereich als den Aggregationskeim, was auch durch die Beobachtung verstärkt wird, das genau diese Zone den rigiden Teil der Fibrillen bildet. Diese aggregationsanfällige Region bindet gleichzeit stark an Mikrotubuli, wodurch ihre Pathogenität im gesunden biologischen System blockiert sein sollte. Mutationen oder Instabilität in den Mikrotubuli können jedoch dazu führen, dass immer höhere Mengen an Tau in freier gelöster Form vorliegen, sich Dimere ausbilden, welche dann weiter aggregieren und schließlich PHFs bilden, die eine starke cross-beta-Struktur aufweisen. Die übrigen Bereiche, wie die N-terminale Hälfe oder die äußersten 50 C-terminalen Reste weisen hingegen einen partiellen alpha-helikalen Charakter auf und eine höhere Peptidrückgratflexibilität. Deshalb kann man diese Elemente als aggregationsinhibierend betrachten. Das genauere Zusammenspiel dieser Elemente muss noch aufbauend auf der vorliegenden Dissertation verstärkt im Detail untersucht werden.
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.
Poster presentation In pharmaceutical research and drug development, machine learning methods play an important role in virtual screening and ADME/Tox prediction. For the application of such methods, a formal measure of similarity between molecules is essential. Such a measure, in turn, depends on the underlying molecular representation. Input samples have traditionally been modeled as vectors. Consequently, molecules are represented to machine learning algorithms in a vectorized form using molecular descriptors. While this approach is straightforward, it has its shortcomings. Amongst others, the interpretation of the learned model can be difficult, e.g. when using fingerprints or hashing. Structured representations of the input constitute an alternative to vector based representations, a trend in machine learning over the last years. For molecules, there is a rich choice of such representations. Popular examples include the molecular graph, molecular shape and the electrostatic field. We have developed a molecular similarity measure defined directly on the (annotated) molecular graph, a long-standing established topological model for molecules. It is based on the concepts of optimal atom assignments and iterative graph similarity. In the latter, two atoms are considered similar if their neighbors are similar. This recursive definition leads to a non-linear system of equations. We show how to iteratively solve these equations and give bounds on the computational complexity of the procedure. Advantages of our similarity measure include interpretability (atoms of two molecules are assigned to each other, each pair with a score expressing local similarity; this can be visualized to show similar regions of two molecules and the degree of their similarity) and the possibility to introduce knowledge about the target where available. We retrospectively tested our similarity measure using support vector machines for virtual screening on several pharmaceutical and toxicological datasets, with encouraging results. Prospective studies are under way.
Colorectal cancer is one of the most cause of cancer and death in Western societies. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of they ability to stop the growth and induce cell death in colon cancer tumours, representing a promising transcriptional cancer therapy. This kind of cancer initiates with an activating mutation in the Wnt cascade, allowing the nuclear import of ß-catenin binding to LEF/TCF. This induces the overexpression of growthpromoting oncogenes affecting the cell cycle arrest, lineage-specific cell differentiation and apoptosis processes. In addition, ß-catenin also participates in cell-cell adhesion via interactions with E-cadherin, which can be repressed by families of transcription factors Snail and ZEB. This, and gain of vimentin has been closely correlated with local invasion and metastasis since they avoid the induction of apoptosis through the loss of cell anchorage, a phenomenon called anoikis. In this process the inactivation of the kinases Src an FAK provoking disruption of focal adhesion complexes through is involved. LAQ824 is a HDAC inhibitor derivative of hydroxamic acid, which present antitumor effect in colon and other cancer cells. The aim of this study is to analyse the effect of LAQ824 in cell proliferation, apoptosis, motility and tumour invasion in a colon carcinoma model based on the adenoma-carcinoma sequence descrying trough which pathways LAQ824 is able to cause these effects. Here I demonstrate for the first time that a HDAC inhibitor, LAQ824, induces detachmentinduced cell death of colon cancer cell lines HCT116 and HT-29, a phenomenon called anoikis, in a caspase-dependent and p53-independent manner. In this process the component of the Wnt signalling pathway ß-catenin is involved. Furthermore LAQ824 upregulates the adhesion molecule E-cadherin expression in these cell lines independently of its repressor Snail, but probably mediated by the repressor ZEB. In addition LAQ824-induced anoikis is caused by disruption of focal adhesion complexes through inhibition of the activity of the kinases FAK and Src inhibiting cell motility indicating a strong antimetastatic potential for LAQ824.