Biochemie und Chemie
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Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
The inhalation of particulate matter (PM) in second-hand smoke (SHS) is hazardous to health of smokers and non-smokers. Tobacco strength (amount of tar, nicotine, and carbon monoxide) and different additives might have an effect on the amount of PM. This study aimed to investigate the influence of tobacco strength or additives on PM. Four cigarette types of the brand Marlboro with different strengths and with or without additives were analyzed in comparison to the 3R4F reference cigarette. SHS was generated by an automatic environmental tobacco smoke emitter (AETSE) in an enclosed space with a volume of 2.88 m³. PM concentrations (PM10, PM2.5, PM1) were measured with a laser aerosol spectrometer followed by statistical analysis. The two strongest Marlboro brands (Red and Red without additives) showed the highest PM concentrations of all tested cigarettes. The measured mean concentrations Cmean of PM10 increased up to 1458 µg/m³ for the Marlboro Red without additives (PM2.5: 1452 µg/m³, PM1: 1263 µg/m³). The similarly strong Marlboro Red showed very similar PM values. The second strongest type Marlboro Gold showed 36% (PM10, PM2.5) and 32% (PM1) lower values, respectively. The “lightest” type Marlboro Silver Blue showed 54% (PM10, PM2.5) or 50% (PM1) lower PM values. The results indicate that the lower the tar, nicotine, and carbon monoxide amounts, as well as the longer the cigarette filter, the lower are the PM levels. An influence of additives could not be determined.
Children are commonly exposed to second-hand smoke (SHS) in the domestic environment or inside vehicles of smokers. Unfortunately, prenatal tobacco smoke (PTS) exposure is still common, too. SHS is hazardous to the health of smokers and non-smokers, but especially to that of children. SHS and PTS increase the risk for children to develop cancers and can trigger or worsen asthma and allergies, modulate the immune status, and is harmful to lung, heart and blood vessels. Smoking during pregnancy can cause pregnancy complications and poor birth outcomes as well as changes in the development of the foetus. Lately, some of the molecular and genetic mechanisms that cause adverse health effects in children have been identified. In this review, some of the current insights are discussed. In this regard, it has been found in children that SHS and PTS exposure is associated with changes in levels of enzymes, hormones, and expression of genes, micro RNAs, and proteins. PTS and SHS exposure are major elicitors of mechanisms of oxidative stress. Genetic predisposition can compound the health effects of PTS and SHS exposure. Epigenetic effects might influence in utero gene expression and disease susceptibility. Hence, the limitation of domestic and public exposure to SHS as well as PTS exposure has to be in the focus of policymakers and the public in order to save the health of children at an early age. Global substantial smoke-free policies, health communication campaigns, and behavioural interventions are useful and should be mandatory.
Objective: Inhaled particulate matter (PM) in secondhand smoke (SHS) is deleterious for smokers and non-smokers. Different additives in cigarettes might effect the amount of PM. This study aimed to assess the influence of additives on the PM emissions from different cigarette types in SHS.
Design: An experimental study of PM measuring in SHS of cigarettes without exposition of any person.
Method: The concentrations of PM (PM10, PM2.5 and PM1) in SHS of four different types of cigarettes of the brand Lucky Strike, two types with additives (Original Red, Original Blue) and two types without additives (Straight Red, Straight Blue), in comparison to the reference cigarette 3R4F were analysed. An automatic environmental tobacco smoke emitter generated SHS in an enclosed space with a volume of 2.88 m3. PM was measured with a laser aerosol spectrometer (Grimm model 1.109). Afterwards, the measuring values of the four Lucky Strike brands and the reference cigarette were statistically evaluated and visualised.
Results: Lucky Strike Straight Blue, a cigarette type without additives and lower tar amount, showed 10% to 25% lower PM mean values compared with the other tested Lucky Strike products, but 21% (PM1) respectively 27% (PM2.5,PM10) higher mean values than the reference cigarette. The PM mean of all measured smoke-free baseline values (clean air) was 1.6 µg/m³. It increased up to about 1800 µg/m³ for the reference cigarette and up to about 3070 µg/m³ for the Lucky Strike Original Blue.
Conclusions: The findings of this study show the massive increase of PM amount by smoking cigarettes in enclosed spaces and suggest that additives in tobacco products increase the PM amount in SHS. For validation, further comparative studies are necessary focusing on the comparison of the PM concentration of cigarettes with and without additives.
Implications: Due to the exposure to SHS, 890 000 people die each year worldwide. PM in SHS endangers the health of both non-smokers and smokers. This study considers the effect of additives like aromatics and humectant agents in cigarettes on PM in SHS. Do additives in tobacco products increase the amount of PM?
The influence of temperatur and pressure on the fluorescence quantum yield of N-methylacridone (9,10-dihydro-9-oxo-10-methyl-acridine) in toluene in the range of 283-313 K and 1 bar to 2.5 kbar, respectively, has been investigated. Treatment of the data in terms of the Eyring transition-state theory leads to a consistent interpretation of the observed effect. The unusually large increase of the quantum yield with increasing pressure is attributed to a positive volume of activation, ⊿V≠, for the thermally activated S1-T2 intersystem crossing which is known to be the only deactivation process (of the Si-state) competing with fluorescence. Comparison of the values for ⊿H≠, the activation enthalpy of this process, determined at various pressures, indicates a decrease in ⊿H≠ at elevated pressures. Since ⊿H≠ can be associated with the S1-T2 energy gap involved in intersystem crossing, this result further confirms the conclusion that the change in Franck-Condon factors alone cannot account for the decrease in the intersystem crossing rate with increasing pressure.
The immune system makes use of major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules to present peptides to other immune cells, which can evoke an immune response. Within this process of antigen presentation, the MHC I peptide loading complex, consisting of a transporter associated with antigen processing TAP, MHC I, and chaperones, is key to the initiation of immune response by shuttling peptides from the cytosol into the ER lumen. However, it is still enigmatic how the flux of antigens is precisely coordinated in time and space, limiting our understanding of antigen presentation pathways. Here, we report on the development of a synthetic viral TAP inhibitor that can be cleaved by light. This photo-conditional inhibitor shows temporal blockade of TAP-mediated antigen translocation, which is unleashed upon illumination. The recovery of TAP activity was monitored at single-cell resolution both in human immune cell lines and primary cells. The development of a photo-conditional TAP inhibitor thus expands the repertoire of chemical intervention tools for immunological processes.
A great challenge in life sciences remains the site-specific modification of proteins with minimal perturbation for in vitro as well as in vivo studies. Therefore, different chemoselective reactions and semi-synthetic techniques such as native chemical ligation or intein-mediated protein splicing have been established. They enable a site-specific incorporation of chemical reporters into proteins, such as organic fluorophores or unnatural amino acids. In this PhD Thesis, protein trans-splicing was guided by minimal high-affinity interaction pairs to trace proteins in mammalian cells. In addition, the temporal modulation of cellular processes by photo-cleavable viral immune evasins was achieved.
Protein trans-splicing mediated by split inteins is a powerful technique for site-specific and 'traceless' protein modifications. Despite recent developments there is still an urgent need for ultra-small high-affinity intein tags for in vitro and in vivo approaches. So far, only a very few in-cell applications of protein trans-splicing are reported, all limited to C-terminal protein modifications. Here, a strategy for covalent N-terminal intein-mediated protein labeling at sub-nanomolar probe concentrations was developed. Combined with the minimalistic Ni-trisNTA/His-tag interaction pair, the affinity between the intein fragments was increased 50-fold (KD ~ 10 nM). Site-specific and efficient 'traceless' protein modification by high-affinity trans-splicing is demonstrated at nanomolar concentrations in mammalian cells.
High background originating from non-reacted, 'always-on' fluorescent probes still is a crucial issue in life sciences. Covalent labeling approaches with simultaneous activation of fluorescence are advantageous to increase sensitivity and to reduce background signal. Therefore, high-affinity protein trans-splicing was combined with fluorophore/quencher pairs for online detection of covalent N-terminal protein labeling in cellular environments. Substantial fluorescence enhancement at nanomolar probe concentrations was achieved. This ultra-small fluorogenic high-affinity split intein system is an unprecedented example for real-time monitoring of the trans-splicing reaction in cell-like environments as well as for protein labeling with fluorogenic probes at nanomolar concentrations.
To extend the field of chemical immunology and to address spatiotemporal aspects in adaptive immune response, new tools to control antigen processing are required. Therefore, synthetic photo-conditional viral immune evasins were designed to modulate antigen processing on demand. By using light, the time and dose controlled antigen translocation by the transporter associated with antigen processing (TAP) was triggered with response in the second regime. Peptide delivery and loading by the peptide-loading complex (PLC) was rendered inactive, whereas blocking was abolished in a light-controlled fashion to inactivate the synthetic viral immune evasin ICP47 along with simultaneous activation of the antigen presentation pathway. Lightresponsive peptide translocation by the TAP complex was assayed in vitro by utilizing microsomes isolated from professional antigen presenting B-cell lymphomas (Raji). To extend these studies, suppression and photo-controlled rescue of antigen presentation was examined at single-cell resolution in human primary immune cells.
Native chemical ligation interconnects peptide chemistry with recombinantly expressed proteins. This technique was applied to generate the semi-synthetic full-length ICP47. Although this approach was realized, the low product yield was not sufficient for further functional studies. Therefore, full-length ICP47 was consecutively generated by utilizing a full synthetic four-fragment ligation approach. However, this synthetic viral immune evasin was not able to block peptide translocation in a robust way.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO–Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR–Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezi…schen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J–Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD–Wert der Rückgratatome von 1,07+-0,15Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterienmit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht. Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
In dieser Arbeit wurde eine Geometrieuntersuchung am FABP-Molekülmodell durchgeführt. Um 3J-Kopplungsinformation für die Diederwinkelanalyse zu bestimmen, wurden J-modulierte [15N,1H]-COSY-Experimente durchgeführt. Mit Hilfe numerischer Anpassungsroutinen wurden die Signalintensitäten quantitativ ausgewertet, um sehr genaue 3JHN,H-alpha-Kopplungskonstanten zu erhalten. Diese Kopplungskonstanten wurden in Kraftfeldrechnungen als experimentelle Randbedingungen für die Phi-Diederwinkel des Proteinrückgrates berücksichtigt. Dadurch ist eine Aussage über die Winkelverteilung und über die zeitlich gemittelten Kopplungseffekte im Proteinmodell möglich. Die aus der Molekulardynamiksimulation bestimmten 3JHN,H-alpha-Kopplungskonstanten wurden mit den experimentellen verglichen. Die Analyse ergab, daß die den beta-Faltblättern zugewandten Ränder der alpha-Helixbereiche sowie zwei der zehn beta-Faltblattbereiche sehr flexible Teilabschnitte aufweisen. Diese Arbeit konnte somit die Überlegungen stützen, die vor allem den flexiblen Teilabschnitt zwischen der alpha-II-Helix und dem beta-B-Faltblattbereich für die Funktion des Proteins verantwortlich machen.
Small interfering RNAs (siRNAs) are now established as the preferred tool to inhibit gene function in mammalian cells yet trigger unintended gene silencing due to their inherent miRNA-like behavior. Such off-target effects are primarily mediated by the sequence-specific interaction between the siRNA seed regions (position 2–8 of either siRNA strand counting from the 5'-end) and complementary sequences in the 3'UTR of (off-) targets. It was previously shown that chemical modification of siRNAs can reduce off-targeting but only very few modifications have been tested leaving more to be identified. Here we developed a luciferase reporter-based assay suitable to monitor siRNA off-targeting in a high throughput manner using stable cell lines. We investigated the impact of chemically modifying single nucleotide positions within the siRNA seed on siRNA function and off-targeting using 10 different types of chemical modifications, three different target sequences and three siRNA concentrations. We found several differently modified siRNAs to exercise reduced off-targeting yet incorporation of the strongly destabilizing unlocked nucleic acid (UNA) modification into position 7 of the siRNA most potently reduced off-targeting for all tested sequences. Notably, such position-specific destabilization of siRNA–target interactions did not significantly reduce siRNA potency and is therefore well suited for future siRNA designs especially for applications in vivo where siRNA concentrations, expectedly, will be low.