Biochemie und Chemie
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The use of chemically synthesized short interfering RNAs (siRNAs) is currently the method of choice to manipulate gene expression in mammalian cell culture, yet improvements of siRNA design is expectably required for successful application in vivo. Several studies have aimed at improving siRNA performance through the introduction of chemical modifications but a direct comparison of these results is difficult. We have directly compared the effect of 21 types of chemical modifications on siRNA activity and toxicity in a total of 2160 siRNA duplexes. We demonstrate that siRNA activity is primarily enhanced by favouring the incorporation of the intended antisense strand during RNA-induced silencing complex (RISC) loading by modulation of siRNA thermodynamic asymmetry and engineering of siRNA 3-overhangs. Collectively, our results provide unique insights into the tolerance for chemical modifications and provide a simple guide to successful chemical modification of siRNAs with improved activity, stability and low toxicity.
Starkes Übergewicht und eine damit einhergehende Hypertrophie von Geweben aber auch des Herz-Kreislauf-Systems führen zu einer Reihe von Folgeerkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 oder auch Arteriosklerose. Während im Fettgewebe freie Fettsäuren, die von Makrophagen aufgenommen werden, eine entscheidende Rolle spielen, scheint in der Pathogenese von Arteriosklerose die Aufnahme von Fettsäuren aus Lipoproteinpartikeln durch Makrophagen von großer Wichtigkeit zu sein. Ein weiterer Faktor, der durch freie Fettsäuren ausgelöst wird ist ER-Stress. Makrophagen, die zu Triglycerid (TG) reichen Schaumzellen geworden sind, akkumulieren in arteriosklerotischen Läsionen. Der Lipidmetabolismus von Makrophagen wird transkriptionell u.a. durch den Transkriptionsfaktor PPARγ (Peroxisomproliferator aktivierter Rezeptor γ) reguliert. Sein Zielgen FABP4 (Fettsäuren bindendes Protein 4) beschleunigt die Entwicklung von Arteriosklerose in Mausmodellen. Da die Expression von PPARγ und FABP4 in IL 4- (Interleukin-4) polarisierten Makrophagen induziert wird, sollte die Rolle von FABP4 in humanen, mit IL 4 polarisierten Makrophagen untersucht werden. Hierfür wurden primäre humane Monozyten in Anwesenheit von LPS/IFNγ (Lipopolysaccharid/Interferon γ) bzw. IL 4 zu Makrophagen differenziert. Es zeigte sich, dass in LPS/IFNγ stimulierten Makrophagen PPARγ und dessen Zielgene nicht exprimiert wurden. Dagegen waren sie bei unstimulierten Makrophagen bei IL 4 stimulierten Makrophagen deutlich erhöht. Dies spiegelte sich auch in einer erhöhten Aufnahme von Triglyceriden aus VLDL-Partikeln (Lipoproteinpartikel sehr niedriger Dichte) wider. IL 4 induzierte also einen Fettsäuren akkumulierenden Phänotyp. Durch einen PPAR-Luciferase-Reporter-Test wurde untersucht, ob FABP4 für die Aktivierung von PPARγ nötig war. Dies konnte bestätigt werden, da PPARγ durch seinen Liganden Linolsäure nur in Anwesenheit von FABP4 aktiviert werden konnte. Diese Aktivierung konnte zusätzlich durch den FABP4-Inhibitor HTS01037 verhindert werden. Nun sollte der Einfluss von FABP4 auf die PPARγ-abhängige Genexpression untersucht werden. Hierfür wurde FABP4 während der Differenzierung mit den beiden Inhibitoren HTS01037 oder BMS309403 in IL 4 stimulierten Makrophagen inhibiert. Durch die Inhibition von FABP4 sank die Expression von FABP4 und LPL (Lipoproteinlipase), während die von PPARγ unverändert blieb. Die LPL spielt eine entscheidende Rolle in der Aufnahme von Lipiden aus VLDL-Partikeln und trägt somit zur TG-reichen Schaumzellbildung bei. Die verminderte Expression von LPL spiegelte sich in einer verminderten Lipidaufnahme aus VLDL-Partikeln wider. Gleichzeitig wurde durch die FABP4-Inhibition die Entzündungsantwort der Makrophagen auf VLDL-Partikel abgeschwächt. IL 4 induziert also LPL, indem es PPARγ aktiviert. FABP4 unterstützt hierbei die Aktivierung von PPARγ. Durch die Inhibition kann die LPL-Expression vermindert werden, was die TG-reiche Schaumzellbildung und die Entzündungsreaktion in einem VLDL-reichen Umfeld vermindert und eine neue Therapiemöglichkeit von Arteriosklerose eröffnet. Im Fettgewebe kommt bei starkem Übergewicht, bedingt durch die erhöhte Konzentration an freien Fettsäuren und Hypoxie, zu einer leichten Entzündungsreaktion. Diese Entzündungsreaktion wurde durch eine Stimulation mit Palmitat unter Hypoxie (1 % O2) nachgebildet. Überstände von Makrophagen nach dieser Stimulation (MCM) wurden auf primäre humane Adipozyten übertragen. Diese Überstände konnten zwar keine Insulinresistenz in Adipozyten auslösen, induzierten jedoch eine Entzündungsreaktion. Diese zeigte sich in einer erhöhten Expression der proentzündlichen Zytokine CCL2 (CC-Chemokin-Ligand-2) und IL 6. Gleichzeitig wurde die Expression des antientzündlichen Zytokins Adiponectin vermindert. Der Transfer von MCM ist also ein Modell für die Entstehung der Insulinresistenz in einem frühen Stadium. Beim Versuch, die entzündungsfördernde Fähigkeit des MCMs zu verhindern, wurde AMPK mit verschiedenen Aktivatoren stimuliert. Es zeigte sich, dass der AMPK-Aktivator AICAR (5-Aminoimidazol-4-carboxamidribonukleotid) die Entzündungsantwort und den ER-Stress von mit Hypoxie und Palmitat stimulierten Makrophagen deutlich reduzierte. Der starke Effekt auf den ER-Stress konnte auch mit anderen ER-Stress-Auslösern wie Thapsigargin oder Tunicamycin nachvollzogen werden. Da AICAR ein AMPK-Aktivator ist, wurden typische Effekte der AMPK-Aktvierung wie reduzierte Proteinexpression, verstärkte Sirtuin-1-Aktivierung und Steigerung der Fettsäurenoxidation mittels Inhibitoren verhindert. Dies hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von AICAR. Ebenso wurde untersucht, ob AICAR in die Zelle aufgenommen werden musste und ob es zu seiner phosphorylierten Form ZMP umgewandelt werden musste. Durch den Inhibitor ABT 702 kann die Adenosinkinase inhibiert werden, welche die Phosphorylierung katalysiert. Es zeigte sich, dass die Phosphorylierung von AICAR zu ZMP nicht erforderlich war, damit AICAR die ER-Stress-Antwort hemmen konnte. AICAR und nicht ZMP wirkte gegen den ER-Stress. Da durch das fehlende ZMP die AMPK nicht aktiviert wurde, war das ein weiteres Zeichen, dass AICAR AMPK-unabhängig wirkte. Dies konnte durch einen AMPK-Knockdown bestätigt werden. Durch einen Knockdown verschiedener Adenosintransporter konnte gezeigt werden, dass SLC28A3 (Soluttransporterfamlie 28 Typ A3) verantwortlich für die Aufnahme von AICAR in primäre humane Makrophagen war. Es konnte demnach gezeigt werden, dass AICAR den ER-Stress in primären humanen Makrophagen in einem von AMPK unabhängigen Mechanismus vermindert. Dafür wird es mittels SLC28A3 in die Zelle aufgenommen und wirkt als AICAR und nicht als ZMP. Diese Erkenntnisse stellen eine interessante, neue therapeutische Möglichkeit im Feld von Arteriosklerose und Diabetes dar.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside synthetisiert, um ihren Einfluss auf die Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen. Bei den fluorierten Benzimidazol-Nukleosidanaloga handelt es sich um universelle Basen, die bei der Basenpaarung nicht zwischen den vier natürlichen Nukleosiden unterscheiden können. Die dabei auftretende Destabilisierung der RNA-Duplexe sollte durch die Änderung physikalisch-chemischer Eigenschaften vermindert werden. Durch die Synthese der fluorierten Indol-Nukleosidanaloga mit denselben Fluoratompositionen sollte nachgewiesen werden, welche Rolle ein ausfallendes Stickstoffatom im Fünfring-System spielt. Weitere Untersuchungen wurden so entwickelt, dass die zwei spC-F in 4,6DFBI wie auch in 4,6DFI mit Stickstoffatomen getauscht wurden. So wurde noch eine neue Serie Nukleosidanaloga synthetisiert (Abbildung 9.2). Schließlich wurde noch 1-Desoxy-D-ribofuranose AS als absischer Baustein synthetisiert. Die Synthese der Indol- und 9-Deazapurin-Nukleosidanaloga wurde über eine Glycsilierungsreaktion mit geeignet geschützter Deoxyribose durchgeführt. Dies wurde über vier Stufen, ohne Aufreinigung, aus Deoxyribose synthetisiert. Die entsprechenden Deoxy-nukleoside wurden danach in fünf Schritten zu Ribo-nukleosiden transformiert. Nach der Entschützung von Toluoyl-Gruppen wurden die 5´- und 3´-OH Gruppen sukzessiv geschützt. Nach simultaner 5´-OH Entschützung und 3´-OMs Eliminierung, wurden die gewünschten Ribonukleoside durch katalytische Dihydroxilierung erhalten. Die Darstellung der Verbindung 7NP erfolgte über die Silyl-Hilbert-Johnson-Reaktion. Der abasische Baustein AS wurde ausgehend von 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose durch Dehydroxylierung und anschließende Entschützung erreicht. Von allen Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorindol-Nukleoside mit Ausnahme von 7-N-Purin-Nukleosid 7NP zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 7-Fluorindol-Nukleosid 7FI kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 2,55 Å. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 2,30 Å ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs Csp²-F...H-Csp². Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auf der anderen Seite in der Kristallstruktur von 4-Fluorindol-Nukleosid 4FI konnte ein F-H Abstand von 2,69 Å nachgewiesen werden, welcher deutlich länger als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff ist. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten der Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Nach Umsetzung der Nukleoside zu den Phosphoramiditen konnten diese kupplungsfähigen Monomere in den RNA-Festphasensynthesen eingesetzt und in RNA 12mere eingebaut werden. Um den Einfluss der aromatischen Fluorosubstitutionen auf die thermodynamische Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen, wurden UV/VIS- und CD- spektroskopische Messungen an monomodifizierten RNA 12meren durchgeführt. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt (Abbildung 9.3) und die thermodynamischen Daten ausgerechnet. Die Anwendung hydrophober, Fluorsubstituierter Nukleobasen führte im Fall der fluorierten Indol-Nukleoside zu Destabilisierung im Vergleich mit natürlichen Basenpaaren. Aus den folgenden Resultaten lässt sich zusammenfassen: 1. Position der Fluoratom in fluorierten Indole spielt eine wesentliche Rolle für die Stabilität des RNA-Duplex 2. 6FI bildet die stabilste Basenpaaren mit natürlichen Basen. 3. Basenpaarung von 4FI trägt eine deutlich höhere Destabilisierung. Für diese Modifikation wurden auch die längsten Abstandwerte zwischen C-F…H in der Kristallpackung gemessen. (Die Vermutung liegt nahe, dass diese Base sich außerhalb des Duplex befindet). 4. Alle Fluorindol-Basenanaloga zeigen die Tendenz zur Paarung mit Adenosin. 5. Bei 4,6DFI handelt sich um universelle Base. Um noch weniger destabilisierende universelle Basen zu finden, wurde das Forschungsfeld mit Methoden aus dem Bereich der strukturellen Bioinformatik, Molekül-dynamiksimulationen und freie Energie-Rechnungen ausgeweitet. Resultierende Simulationen führten zu zwei neuen Basen: 7NP als Analogon zu 4,6DFBI und 9DP als Analogon zu 4,6DFI (siehe Kapitel 8). Theoretische Rechnungen ließen sich bestätigen durch experimentelle Ergebnisse Die so entstandene Serie von Purin-Basenanaloga hat uns gezeigt, dass der Austausch von Fluoratomen durch Stickstoffatome stabilisierende Effekte bringt. Die chemischen Änderungen beeinflussen die physikalischen Eigenschaften, welche dadurch Stabilisierung oder Destabilisierung des RNA-Duuplex dirigieren. In Abbildung 9.5 befinden sich ausgerechnete Dipolmomente. Somit können wir für diese Serie folgendes resümieren: * 4,6FI als universelles Base Analogon zu 4,6DFBI zeigt geringere destabilisierende Effekte auf den 12mer RNA-Duplex. * Umtausch von Fluoratomen in den beiden Basen (4,6DFI und 4,6DFBI) resultiert in deutlich besserer Basenpaarung. * Auserrechnete thermodynamische Parametern (von gemessenen Tm-Werten) wurde ersichtlicht, dass höhere Tm-Werte durch geringere Destabilisierung aus Solvatation resultieren, nicht aus erhöhten Stacking Effekten des RNA-Duplex.
Orientation-selective DEER (Double Electron-Electron Resonance) measurements were conducted on a series of rigid and flexible molecules containing Cu(II) ions. A system with two rigidly held Cu(II) ions was afforded by the protein homo-dimer of copper amine oxidase from Arthrobacter globiformis. This system provided experimental DEER data between two Cu(II) ions with a well-defined distance and relative orientation to assess the accuracy of the methodology. Evaluation of orientation-selective DEER (os DEER) on systems with limited flexibility was probed using a series of porphyrin-based Cu(II)–nitroxide and Cu(II)–Cu(II) model systems of well-defined lengths synthesized for this project. Density functional theory was employed to generate molecular models of the conformers for each porphyrin-based Cu(II) dimer studied. Excellent agreement was found between DEER traces simulated using these computed conformers and the experimental data. The performance of different parameterised structural models in simulating the experimental DEER data was also investigated. The results of this analysis demonstrate the degree to which the DEER data define the relative orientation of the two Cu(II) ions and highlight the need to choose a parameterised model that captures the essential features of the flexibility (rotational freedom) of the system being studied.
The core of photosystem I (PS1) is composed of the two related integral membrane polypeptides, PsaA and PsaB, which bind two symmetrical branches of cofactors, each consisting of two chlorophylls and a phylloquinone, that potentially link the primary electron donor and the tertiary acceptor. In an effort to identify amino acid residues near the phylloquinone binding sites, all tryptophans and histidines that are conserved between PsaA and PsaB in the region of the 10th and 11th transmembrane alpha-helices were mutated in Chlamydomonas reinhardtii. The mutant PS1 reaction centers appear to assemble normally and possess photochemical activity. An electron paramagnetic resonance (EPR) signal attributed to the phylloquinone anion radical (A(1)(-)) can be observed either transiently or after illumination of reaction centers with pre-reduced iron-sulfur clusters. Mutation of PsaA-Trp(693) to Phe resulted in an inability to photo-accumulate A(1)(-), whereas mutation of the analogous tryptophan in PsaB (PsaB-Trp(673)) did not produce this effect. The PsaA-W693F mutation also produced spectral changes in the time-resolved EPR spectrum of the P(700)(+) A(1)(-) radical pair, whereas the analogous mutation in PsaB had no observable effect. These observations indicate that the A(1)(-) phylloquinone radical observed by EPR occupies the phylloquinone-binding site containing PsaA-Trp(693). However, mutation of either tryptophan accelerated charge recombination from the terminal Fe-S clusters.
PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Structural biology and life sciences in general, and NMR in particular, have always been associated with advanced computing. The current challenges in the post-genomic era call for virtual research platforms that provide the worldwide research community with both user-friendly tools, platforms for data analysis and exchange, and an underlying e-Infrastructure. WeNMR, a three-year European Commission co-funded project started in November 2010, groups different research teams into a worldwide virtual research community. It builds on the established eNMR e-Infrastructure and its steadily growing virtual organisation, which is currently the second largest VO in the area of life sciences. WeNMR provides an e-Infrastructure platform and Science Gateway for structural biology. It involves researchers from around the world and will build bridges to other areas of structural biology.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Redirection of miRNA‐argonaute complexes to specific target sites by synthetic adaptor molecules
(2020)
Dysregulation of miRNAs is connected with a multitude of diseases for which antagomirs and miRNA replacement are discussed as therapeutic options. Here, we suggest an alternative concept based on the redirection of RISCs to non‐native target sites. Metabolically stable DNA‐LNA mixmers are used to mediate the binding of RISCs to mRNAs without any direct base complementarity to the presented guide RNA strand. Physical redirection of a dye‐labeled miRNA model and of specific miRNA‐programmed RISC fractions present in HeLa extracts is demonstrated by pull‐down experiments with biotinylated capture oligonucleotides.
The title compound, C25H22O5, was obtained by a dehydrogenative carbonylation reaction. It crystallizes with one half-molecule in the asymmetric unit. The molecules have crystallographic C2 symmetry and the two atoms of the carbonyl group are located on the rotation axis. The methoxy groups are coplanar with the benzene ring to which they are attached [C-C-O-C = 1.0 (6)°]. The two furan rings are inclined at 17.3 (3)° with respect to each other and the dihedral angle between the furan ring and the benzene ring is 75.83 (12)°. The crystal structure is stabilized by C-H...O hydrogen bonds. Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 183 K; mean ( σ(C–C) = 0.006 Å; R factor = 0.081; wR factor = 0.195; data-to-parameter ratio = 13.4.
In the paper by Bolte [Acta Cryst. (2006), E62, m1609-m1610], the chemical name in the title and the chemical diagram are incorrect. The correct title is {5-[4'-(2,2,5,5-Tetramethyl-3-pyrroline-1-oxyl-3-carbonyloxy)biphenyl-4-ylethynyl]-2,3,7,8,12,13,17,18-octaethylporphyrinato}copper(II) benzene solvate' and the correct diagram is given below.
The isolation of transcribed DNA sequences of P815 cells and the partial characterization with respect to their sequence composition and relative rates of enzymatic DNA methylation are reported in this paper. Transcribed regions were purified by affinity chromatography using immobilized heterogenous nuclear RNA of P815 cells. About 10% of total genome was found in this fraction. Reassociation analyses showed differences in sequence composition of transcribed versus non-transcribed DNA fractions. The relative proportion of inverted repeats was doubled in the transcribed fraction whereas ordinary highly repetitive sequences comprising mainly of satellite DNA were found almost exclusively in the non-transcribed regions of the P815 genome. About 70% of transcribed portions corresponds to unique and intermediary DNA sequences. After labelling of cells with L-[Methyl-3H]methionine and [14C]deoxycytidine relative rates of enzymatic DNA methylation were computed for different kinetic components of transcribed and non- transcribed portions of P815 genome. No difference was found except in inverted repeats. In transcribed DNA the relative rate of enzymatic DNA methylation was only about 40% of that of the non-transcribed ones. We have quantitated this hypomethylation and found that there is, in average, about one 5-methylcytosine residue in 100 nucleotides of transcribed inverted repeats, compared to about 2.5 5-methylcytosines in non-transcribed fractions. In view of these data we propose that the enzymatic methylation of inverted DNA repeats negatively controls the transcriptional process in a given genomic region.
A specific class of DNA sequences, the inverted repetitive sequences, forms a double-stranded structure within a single linear polynucleotide chain in denatured DNA. The reassociation process is unimolecular and occurs very fast. Quantitative analyses have shown that these sequences com-E rise about 4-5% of the nuclear DNA of various mammalian cells (P815 mouse mastocytoma, Hela, L cells, Raji and Chang cells, and human embryonic hepatocytes) and are interspersed within sequences of other degrees of repetitiveness.
After labeling the cells with L-[Metnyl-3H]methionine and [14C]deoxycytidine, relative rates of enzymic DNA methylation were computed on the basis of 3H and 14C radioactivities found in py rimidine residues of the nuclear DNA. The results indicate that DNA of inverted repetitive sequences is methylated to a level about 50% higher than the ordinary repetitive sequences and to about 300% higher than the unique and intermediary sequences.
The biological function of the inverted repeats as well as the role of their enzymic hypermethyl ation is unknown.
The sequence complexity of nuclear RNA from mouse liver, mouse spleen and highly malignant P815 mastocytoma was measured by nRNA driven hybridization to unique DNA sequences of P815 cells. The unique DNA sequences represent 63% of the total nuclear DNA of P815 cells and their availibility in hybridization experiments was found to be 76%. Of these sequences 7.8% formed hybrids with nuclear RNA of this cell, about 11.5% with mouse spleen and about 14.5% with mouse liver nuclear RNA. Assuming an asymmetrical transcription, the complexities of these transcripts are 2.8 × 108 nucleotides for mouse P815 mastocytoma, 4.3 × 108 for mouse spleen and about 5.3 × 108 nucleotides for mouse liver.
Cellular specifity of the transcribed information was analyzed in additivity experiments, in which unique DNA sequences, not complementary to the nuclear RNA of one cell were annealed to the nuclear RNAs of the two other tissues/cells. In these experiments most of the nuclear RNA se quences of P815 cells were found to be also present in the nucleus of mouse liver and spleen. Only a small portion of the unique DNA sequences of P815 mastocytoma (about 1.2% corresponding to 4.4 ×107 nucleotides) was found to be complementary only to P815 mastocytoma nuclear RNA.
In den letzten zwei Dekaden wurde die Rolle der RNA in biologischen Prozessen intensiv untersucht. Man erkannte immer deutlicher, dass ihre Funktion über die einfache Vermittlung von Information von der DNA hin zum Protein weit hinausgeht. So spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Genexpression und besitzt darüber hinaus auch katalytische Eigenschaften. Die Entdeckung der reversen Transcriptase beim HI-Virus konnte zeigen, dass genetische Informationen nicht nur in Richtung von DNA zu RNA, sondern auch in Entgegengesetzter Richtung übertragen werden kann. Diese Schlüsselrolle in vielen wichtigen biochemischen Prozessen macht die RNA zu einem viel versprechenden Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, um in diese Prozesse eingreifen zu können. RNA bildet eine Vielzahl von stabilen Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die es Proteinen und Antibiotika ermöglicht, sie zu adressieren. Die bis heute wohl mit Ausnahme des Ribosoms und der tRNAs am besten aufgeklärte Struktur einer RNA ist die der HIV TAR-RNA (transaktivierende Region). Ein essentieller Bestandteil für die virale Genexpression ist die so genannte TAR-RNA. Diese befindet sich am 5-Ende aller viraler Transcripte und bildet eine aus 59 Basen bestehende stem-bulge-loop hairpin Struktur. Diese tritt in Wechselwirkung mit dem tat-Protein. Die Grundlage für die Erkennung des hierbei entstehenden Komplexes ist eine Wechselwirkung von tat mit der bulge- und loop-Region von TAR. Durch Interaktion mit der loop- Region kommt es zur Ausbildung eines CyclinT1/tat Komplexes, der im weiteren dafür verantwortlich ist, dass sich die Rate der Transkription um das mehrere hundertfache erhöht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Liganden zu synthetisieren, die spezifische Bindungen mit der TAR-RNA aus HIV-1 eingehen. Durch eine solche Bindung ist es möglich, den viralen Replikationszyklus zu unterbrechen. Ausgehend von einem relativ rudimentären Design, basierend auf dem Arginin-Fork-Model von Frankel, gelang es, mit Triaminopyrazol und verschiedenen seiner Derivaten dieses Ziel zu erreichen. Nach erfolgreicher Synthese der Zielstrukturen wurden diese in einem FRET-Assay im Hinblick auf ihre Affinität zu der TAR-RNA getestet. 3,4,5-Triaminopyrazol übertraf trotz seiner geringen Größe und Ladung mit einem IC50-Wert von 30 µM die Werte vieler tetrakationischer Tripeptide (FRET). Nach erfolgreicher Bestimmung der TAR-Affinität von Triaminopyrazol wurde seine Wirkung auf HIV-infizierte Hela P4-Zellen untersucht, die ein Tat-TAR-kontrolliertes Reportergen exprimierten. Dabei zeigte Triaminopyrazol eine Inhibierung mit IC50 = 50 µM. Bis zu einer Konzentration von 500 µM traten hierbei keine toxischen Effekte auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei Triaminopyrazol tatsächlich um einen tat- Antagonisten handelt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Triaminopyrazol nicht die eines Entryinhibitors ist, sondern dass die Verbindung in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a well established method concerning nanometer distance measurements involving two nitroxide spin-labels. In this thesis the applicability of this method to count the number of spins is tested. Furthermore, this work explored the limits, up to which PELDOR data obtained on copper(II)-nitroxide complexes can be quantitatively interpreted. Spin counting provides access to oligomerization studies – monitoring the assembly of homo- or hetero-oligomers from singly labeled compounds. The experimental calibration was performed using model systems, which contain one to four nitroxide radicals. The results show that monomers, dimers, trimers, and tetramers can be distinguished within an error of 5% in the number of spins. Moreover, a detailed analysis of the distance distributions in model complexes revealed that more than one distance can be extracted from complexes bearing several spins, as for example three different distances were resolved in a model tetramer – the other three possible distances being symmetry related. Furthermore, systems exhibiting mixtures of oligomeric states complicate the analysis of the data, because the average number of spin centers contributes nonlinearly to the signal and different relaxation behavior of the oligomers has to be treated explicitly. Experiments solving these problems are proposed in the thesis. Thus, for the first time spin counting has been experimentally calibrated using fully characterized test systems bearing up to four spins. Moreover, the behavior of mixtures was quantitatively interpreted. In addition, it has been shown that several spin-spin distances within a molecule can be extracted from a single dataset. In the second part of the thesis PELDOR experiments on a spin-labeled copper(II)-porphyrin have been quantitatively analyzed. Metal-nitroxide distance measurements are a valuable tool for the triangulation of paramagnetic metal ions. Therefore, X-band PELDOR experiments at different frequencies have been performed. The data exhibits only weak orientation selection, but a fast damping of the oscillation. The experimental data has been interpreted based upon quantitative simulations. The influence of orientation selection, conformational flexibility, spin-density distribution, exchange interaction J, as well as anisotropy and strains of the g-tensor has been examined. An estimate of the spin-density delocalization has been obtained by density functional theory calculations. The dipolar interaction tensor was calculated from the point-charge model, the extension of the point-dipole approximation to several spin bearing centers. Even assuming asymmetric spin distributions induced by an ensemble of asymmetrically distorted porphyrins the effect of delocalization on the PELDOR time trace is weak. The observed damping of dipolar oscillations has been only reproduced by simulations, if a small distribution in J was assumed. It has been shown that the experimental damping of dipolar modulations is not solely due to conformational heterogeneity. In conclusion the quantitative interpretation of PELDOR data is extended to copper-nitroxide- and multi-spin-systems. The influence of the mean distance, of the number of coupled spins, of the conformational flexibility, of spin-density distribution and of the electronic structure of the spin centers has been analyzed using model systems. The insights on model compounds mimicking spin-labeled biomacromolecules – in oligomeric or metal bound states – calibrate the method with respect to the information that can be deduced from the experimental data. The resulting in-depth understanding allows correlating experimental results (from for example biological systems) with models of structure and dynamics. It also opens new fields for PELDOR as for example triangulation of metal centers and oligomerization studies. In general, this thesis has demonstrated that modern pulsed electron paramagnetic resonance techniques in combination with quantitative data analysis can contribute to a detailed insight into molecular structure and dynamics.
Erfolgreich wurde die biochemische Synthese eines Kernbereiches der spleißosomalen U4/U6-RNA etabliert und die Sekundärstruktur mittels NMR-spektroskopischer Methoden charakterisiert. Die Konformationen von zwei molekularen Regeleinheiten, des auf Gramicidin A basierenden Ionenkanals Minigramicidin sowie einem aus zwei cis-Dekalinen aufgebautenmolekularen Schalters konnten in unterschiedlichen Umgebungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erfolgreich bestimmt werden. Die Synthese des RNA-Konstruktes u4u6a46phh2 erfolgte durch Transkription von plasmidischer Templat-DNA mit T7-Polymerase und anschließender Aufreinigung mittels Gelelektrophorese und Homogenisierung am 3’-Ende mit Hilfe eines passenden Hammerhead-Ribozyms. u4u6a46phh2-RNA kann als Konstrukt für die Synthese von 13C/15N-gelabelter RNA dienen, da die Schneidreaktion und die daraus resultierende RNA definiert ist und die Integrale der Iminoprotonen für eine einzige Konformation der RNA sprechen. Das von Dr. Hans-Dieter Arndt in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Koert an der Humboldt-Universität zu Berlin hergestellte Minigramicidin ist aus zwei verkürzten Gramicidin A-Einheiten aufgebaut, die in einer Kopf-an-Kopf Anordnung durch einen Bernsteinsäure-Linker kovalent verknüpft sind. In dieser Arbeit wurden die Strukturen von Minigramicidin in zwei unterschiedlichen Umgebungen aufgeklärt: in Benzol/Aceton (10:1, v/v) ohne Zusatz von Kationen und in gesättigter Cäsiumchlorid-Chloroform/Methanol (3:1, v/v)-Lösung. Im ersten Fall findet man ein doppelt helikales linksgängiges Dimer von Minigramicidin mit ca. 5.7 Resten pro Windung. Diese Struktur hat eine Länge von ca. 38 Å und einen Durchmesser von ca. 1.2 Å. Mit Cäsium-Kationen liegt die Verbindung als Monomer vor. Sie bildet eine rechtsgängige pi-Helix mit ca. 6.3 Resten pro Windung. Die Struktur hat eine Länge von 17 Å und einen Durchmesser von ca. 4.5 Å. Es konnte erstmals eine zur ionenkanalaktiven Form des gA ähnliche Konformation eines auf gA basierenden künstlichen Ionenkanals in organischen Lösemitteln nachgewiesen werden. Der von Dr. Michael Karle aus der Arbeitsgruppe von Prof. Koert an der Philipps-Universität Marburg synthetisierte molekulare Schalter besteht aus zwei cis-Dekalineinheiten, die durch einen 14-gliedrigen Bislactam-Ring miteinander gekoppelt sind. Der Schaltprozeß wurde dabei durch die saure Spaltung des Ley-Acetals in 13 ausgelöst. Es wurde für die Verbindung 13 eine all-axial Stellung für den Makrozyklus gefunden. Diese Struktur wird auch durch die gefundenen Kopplungskonstanten gestützt. Nach dem Schaltprozeß wurde die Struktur von 16 ermittelt. Wie erwartet, wurde durch das Lösen der konformativen Klammer ein Doppelringflip im linken Dekalingerüst ausgelöst und durch den Makrozyklus auf das rechte Dekalingerüst übertragen. Die gefundenen ROE-Abstände und Kopplungskonstanten für bestimmte Dekalinprotonen bestätigen die umgeschaltete Struktur.
The following mixed-stack donor/acceptor complexes {D···A}∞ have been crystallized and their structures determined: {hexamethylbenzene···3,5-dicyano-1-nitrobenzene hexamethylbenzene···3,5-dinitro-1-cyanobenzene}∞, {pyrene···3,5-dinitro-1-cyanobenzene}∞, {anthracene···(3,5-dinitro-1-cyanobenzene)2}∞, {N,N-dimethylanilin···3,5-dinitro- 1-cyanobenzene}∞ and { 1-3-phenylenediamine···3,5-dinitro-1-cyanobenzene}∞. Their lattice packing consists of parallel layers, which contain either donors and acceptors as for hexamethylbenzene and pyrene or composite ones as in the 1:2 complex of anthracene with each one of the acceptors above and below its peripheral rings. The isostructural hexamethylbenzene complexes exhibit almost identical packing coefficients as well as a hexagonal coplanar arrangement of the C6(CH3)6 donors. Weak intermolecular van der Waals interactions are also observed between antiparallel cyano substituents. The interplanar n distances range between 334 and 353 pm, i. e. around 340 pm of two van der Waals n radii. In none of the complexes, however, significant structural changes in either the donor or the acceptor components due to the complex formation are observed. In both the crystals as well as in solution, the donor/acceptor complexes exhibit colours between yellow and red; their long-wavelength charge transfer absorption maxima, therefore, correspond to a lowering in excitation energy of only up to 1 eV relative to that of the components. The different charge transfer in the ground and the CT excited states is also discussed referring to other data such as vertical first ionization energies or interplanar distances {D···A}, as well as to results from semiempirical calculations based on the crystal structure data determined and including approximate configuration interaction.
Raney nickel, a highly reactive and air-sensitive solid, if prepared and investigated under oxygen-free conditions, exhibits interesting catalytic properties. Using photoelectron spectroscopy for real-time gas analysis in a flow reactor, the following results are obtained with alkyl and acylhalides: Dehydrohalogenation temperatures are lowered relative to thermal HHal elimination up to 350 K. Monochloro and bromo propanes and butenes yield propene and butadiene, respectively. 1,1-Dichloro ethane or 1,1-dibromo propane only split off one HHal and form chloroethene or 1-bromopropene-2. HCl elimination from 2-methyl propionic acid chloride, expectedly, produces dimethyl ketene. Most interesting, however, is the ring opening of monobromo cyclobutane to 1-bromo-butene-3, observed already at room temperature, which strongly suggests the intermediate formation of a chemisorbed surface carbene at Raney nickel. The formation of hexadiene-1,5 as a by-product in the HCl elimination of 1-chloropropane, i. e. a surface carbene dimer, indicates their presence also in other dehydrohalogenations heterogeneously catalyzed by Raney nickel.
Raney nickel, a highly reactive and air-sensitive solid, if prepared and investigated under oxygen-free conditions, exhibits interesting catalytic properties. Using photoelectron spectroscopy for real-time gas analysis in a flow reactor, the following results are obtained with alkyl and acylhalides: Dehydrohalogenation temperatures are lowered relative to thermal HHal elimination up to 350 K. Monochloro and bromo propanes and butenes yield propene and butadiene, respectively. 1,1-Dichloro ethane or 1,1-dibromo propane only split off one HHal and form chloroethene or l-brom opropene-2. HCl elim ination from 2-methyl propionic acid chloride, expectedly, produces dimethyl ketene. Most interesting, how ever, is the ring opening of monobromo cyclobutane to 1-brom o-butene-3, observed already at room temperature, which strongly suggests the intermediate formation of a chem isorbed surface carbene at Raney nickel. The formation of hexadiene-1,5 as a by-product in the HCl elim ination of 1-chloropropane, i.e. a surface carbene dimer, indicates their presence also in other dehydrohalogenations heterogeneously catalyzed by Raney nickel.
The following mixed-stack donor/acceptor complexes {D · · · A }∞ have been crystallized and their structures determined: { 1 ,2,4,5-tetramethylbenzene · · · tetrabromo-p -benzoquinone}∞ , {hexamethylbenzene · · · tetrabromo-p-benzoquinone}∞ , { ( 1 ,2 ,4,5-tetramethyl-benzene)2 · · · tetrachloro -p -benzoquinone}∞ , {pyrene · · · tetrafluoro-p-benzoquinone}∞ , {pyrene · · · tetrabromo-p-benzoquinone}∞ and {perylene · · · tetrabromo-p-benzoquinone}∞ . They exhibit an interesting lattice packing, especially the 2:1 tripeldecker sandwich of tetrachloro-p-benzoquinone, which crystallizes in a herringbone pattern. Their interplanar distances are around 340 pm, i. e. two van der Waals π radii. None of them , however, exhibits in neither the donor nor the acceptor components significant structural changes due to complex formation. Their colours range from orange-red to black in the crystal and to green in H2CCl2 solution. Their long-wavelengths charge transfer absorption maxim a correspond to a lowering in excitation energy of up to 2 eV relative to that of the components. The different charge transfer in the ground and excited states of the donor/acceptor complexes investigated is further discussed referring to data such as cyclovoltammetric reduction potentials as w ell as to results from semiempirical calculations based on the crystal structure data determined and including configuration interaction.