Biochemie und Chemie
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The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
Die chromosomale Translokation t(4;11) ist mit einer aggressiven pro-B ALL im Kleinkindesalter assoziiert und stellt eine der häufigsten genetischen Veränderungen des MLL Gens dar. Bei bis zu 40 % der untersuchten Translokationen des MLL Gens wurde das AF4 Gen als Translokationspartner identifiziert. Durch Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe konnte in Focus Formation Experimenten das wachstumstrans-formierende Potenzial sowohl des Wildtyp AF4 Proteins, als auch des bei der Translokation entstehenden AF4•MLL Fusionsproteins, nachgewiesen werden. Es kann somit als gesichert angesehen werden, daß es sich bei dem Wildtyp-AF4 Protein um ein Proto-Onkoprotein und bei dem AF4•MLL Fusionsprotein um ein Onkoprotein handelt. Der für beide Proteine identische Bereich beschränkt sich auf die ersten 360 Aminosäuren des AF4 Proteins, was der Hypothese führte, daß der N-Terminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) für das beobachtete onkogene Potential in murinen embryonalen Fibroblasten verantwortlich ist. Ein mit dem AF4•N Protein durchgeführter Hefe-2-Hybrid Screen identifizierte die beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Bindungspartner. Hierbei handelt es sich um Tumorsupressor- Proteine, die durch Ubiquitinylierung von Zielproteinen diese dem proteasomalen Abbau zuführen. Unter normalen physiologischen Bedingungen unterliegt das AF4 Protein einem raschen Abbau am Proteasom. Dies ist für das AF4•MLL Fusionsprotein nur noch eingeschränkt möglich, da es wie für das Wildtyp-MLL beobachetet proteolytisch gespalten wird, mit sich selbst dimerisiert und dann nicht mehr über das Proteasom abgebaut werden kann. Eine Bindung der beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte jedoch noch beobachtet werden, deshalb sollte die AF4 und SIAH Protein-Protein-Interaktion genauer untersucht werden. Hierzu wurden Hefe-2-Hybrid Experimente mit Deletionsmutanten durchgeführt, um die minimalen Kontakt-domänen zu identifiziert. Die Stärke der Interaktionen wurde durch ß-Galaktosidasetests ermittelt. Die identifizierte minimale AF4 Proteindomäne enthält das für die Erkennung durch die E3-Ligasen notwendige PxAxVxP Motiv und hat eine Länge von 25 Aminosäuren. Für die E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte der für die Interaktion notwendige Kontaktbereich innerhalb der sogenannten Substrat-Bindungs-Domäne (SBD) lokalisiert werden. Interessanterweise ist nicht die große Furche des Dimerisierungsinterfaces der beiden SIAH Monomere der Kontaktbereich, sondern der proximale Zink-Finger Bereich. Die experimentell ermittelten Proteindomänen wurden in geeignete bakterielle Expressionssysteme kloniert und ihre in vitro Interaktion durch Pulldown-Experimente bestätigt. Die strukturelle Aufklärung der Kontaktdomäne erfolgte dann mit Hilfe der NMR-Fast-Mapping Methode. Mit dieser kombinatorischen Methode wurden die an der AF4 Bindung beteiligten Aminosäuren des SIAH Proteins durch Änderung ihrer chemischen Verschiebung im [15N,1H] HSQC-Spektrum nach Titration mit steigenden AF4 Konzentrationen identifiziert. Aus den erhaltenen Daten und anhand der bekannten SIAH Röntgenstruktur konnte ein Modell für die Bindung des AF4 Proteins an die E3-Ligase SIAH1 erstellt werden. Über die Funktion des Proto-Onkoproteins AF4 ist bis dato wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß alle Vertreter der ALF Proteinfamilie über transkriptionsaktivierende Eigenschaften verfügen. Da posttranslationale Modifikationen von Proteinen, wie z.B. Sumoylierung, häufig zur Regulation von Transkriptionsfaktoren beobachtet werden, wurden Untersuchungen auf posttranslationale Modifikationen des AF4 Proteins durchgeführt. Hierzu wurde durch Mutation der E3-Ligase Erkennungssequenz PxAxVxP eine stabilisierte AF4 Mutante hergestellt. Durch Immunopräzipitations Experimente nach Transfektion in 293T Zellen konnte sowohl die Sumoylierung, als auch Tyrosin Phosphorylierungen des AF4 Proteins nachgewiesen werden.
Die NO-sensitive Guanylat-Cyclase (GC), der wichtigste physiologische Rezeptor für Stickstoffmonoxid (NO), ist an der Produktion des sekundären Botenstoffes cGMP beteiligt. Die GC ist ein obligates Heterodimer bestehend aus je einer alpha- und einer beta-Untereinheit, wobei die alphabeta-Isoform am häufigsten vorkommt. Die Bindung von NO an die prosthetische Häm-Gruppe der beta-Untereinheit führt zur Aktivierung des Enzyms. Das dabei gebildete cGMP bindet an Effektorproteine wie Proteinkinase G, Phosphodiesterasen und Ionenkanäle und vermittelt dadurch seine zellulären Effekte. Der Mechanismus der NO-induzierten Aktivierung der GC ist weitgehend bekannt; hingegen ist bisher nur wenig über alternative Regulationsmodi der GC wie zum Beispiel Phosphorylierung, Protein-Protein-Interaktion oder Translokation bekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es daher, die Phosphorylierung der GC durch Tyrosinkinasen der Src-Familie sowie den GC-Interaktionspartner AGAP1 zu untersuchen. Die Tyrosinphosphorylierung der GC konnte in Gegenwart von Protein-Tyrosinphosphatase-Inhibitoren wie Pervanadat erstmals in endogenen Zellen wie Thrombozyten und vaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit dem Inhibitor SU6656 zeigten, dass Kinasen der Src-Familie an der Pervanadat-induzierten Phosphorylierung beteiligt sind. In Überexpressionssystemen wurde die GC durch Src und Fyn phosphoryliert, wobei Src hier deutlich effektiver war. Zudem kann Src die beta-Untereinheit der GC in vitro direkt phosphorylieren. Die Verwendung von Kinase-knockout-Zellen zeigte, dass neben Src auch andere Kinasen die GC-Phosphorylierung vermitteln können. Src interagiert mit dem Holoenzym der GC, wenn der Tyrosinrest 192 der beta-Untereinheit phosphoryliert ist. Hierbei bindet Src über seine SH2-Domäne an die GC. Mit der GC assoziiertes Src kann mindestens einen weiteren Tyrosinrest der beta-Untereinheit phosphorylieren. Ferner weisen einige Resultate auf eine zweite Bindungsstelle hin, die unabhängig von Tyrosin-192 und der SH2-Domäne ist. Experimente zur Lokalisation deuten auf eine möglicherweise durch Src vermittelte Translokation der Guanylat-Cyclase zur Plasmamembran hin. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit AGAP1, einem etablierten Interaktionspartner der GC. AGAP1 ist am endosomalen Vesikeltransport beteiligt, indem es die Aktivität von Arf-GTPasen Phospholipid-abhängig stimulieren kann. In dieser Arbeit zeigte sich, dass AGAP1 über seinen N-Terminus sowie einen oder mehrere Segmente des C-Terminus dimerisiert. Außerdem kann AGAP1 über seine Pleckstrin-Homologie-Domäne an Phosphatidylinositol- Monophosphate und Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphat binden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Arbeit neue potentielle Regulationsmechanismen der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase durch Tyrosinphosphorylierung und durch die Interaktion mit der Tyrosinkinase Src und dem Multidomänen-Protein AGAP1 auf. Hierbei wird deutlich, dass der NO/cGMP-Signalweg, die Tyrosinphosphorylierungs-Kaskaden und der Vesikeltransport regulatorisch ineinander greifen.
The N-terminal domain (matrix protein or MA) of a retroviral Gag polyprotein precursor plays a critical role in several stages of the retrovirus life cycle. MA is involved in the effective membrane targeting, assembly and release of the immature viral particles from the infected cell. In order to understand the structural basis of these functions, the full length MA from Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) was purified and the solution structure of the MA MoMuLV was determined by means of heteronuclear high-resolution NMR spectroscopy and compared with that of the X-ray diffraction analysis as well as with the structures of several MA proteins from geterologous viruses. Structural features were also obtained from CD spectroscopy, dynamic light scattering, sedimentation velocity, differential scanning calorimetry and other methods. It was found that the MA MoMuLV globular core (residues 8-98) is comprised of 7 well-defined helices (five alpha-helices and two 310 helices), with the general fold typical for MA proteins from other retroviral species. The N-terminus (residues Met1-Leu7) and the C-terminal proline-rich part (residues Pro103-Tyr131) are not structured in solution. Although MA MoMuLV has a low sequence identity compared with other matrix proteins for which the three-dimensional structure is known, it was shown that its overall topology and pattern of secondary structural units is similar to other retroviral matrix proteins. The monomeric state is observed for the correctly folded MA MoMuLV in a variety of external conditions and protein concentrations, indicating that virion assembly starts with the plasma membrane targeting of the nascent Gag precursor. The denaturation of MA MoMuLV is irreversible and is connected with protein aggregation. For Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) a proteolytic processing of the R-peptide (last 16 amino acids from the C-terminus of the Envelope protein (Env)) has been described as a second mode of fusion and activation preceding the receptor contact between the viral particle and the cellular membrane. An interaction between the R-peptide and MA MoMuLV has been proposed, since the R-peptide and MA are localized at the inner part of the membrane. Therefore the interaction between 15N labelled purified MA MoMuLV and synthesized R-peptide has been investigated using high-resolution NMR. It was found that in water solution MA MoMuLV and R-peptide do not form a tight complex, but in a mature virion in the presence of membranes or other protein factors it might be possible. In the case of HIV-1 the cytoplasmic part (EnvC) of the Env protein is much longer than in other retroviruses and again as for MoMuLV little is known about the interaction between EnvC and HIV MA. Hence, the full length HIV MA, and the last 150 amino acids from HIV Env have been subcloned with suitable expression vectors, purified and analysed by native gel electrophoresis, a pull down assay and by high resolution NMR for the purpose to detect the complex formation of EnvC and HIV MA. Finally, after all those experiments, it was found that a stable complex is not formed, but a weak interaction between the two proteins can not be excluded.
Massenspektrometrische Untersuchungen von DNA, RNA und nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen
(2005)
Ziel dieser Dissertation war es, grundlegende Untersuchungen zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA und RNA durchzuführen, sowie der spezifische Nachweis von nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen. Dabei lag der Schwerpunkt auf den folgenden drei Bereichen: - Allgemeiner Vergleich zwischen DNA und RNA sowie den Ionisierungsmethoden nano-ESI und MALDI - Quantitative Untersuchung des Einflusses des Salzgehaltes und der Aufreinigung der Probe auf das Spektrum - Grundlegende Vorraussetzungen zum spezifischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels Massenspektrometrie (MS) Dabei zeigte sich beim massenspektrometrischen Vergleich von DNA mit RNA, dass die RNA stets eine höhere Stabilität aufweist, wobei diese bei beiden Oligonukleotiden mit steigender Kettenlänge abnimmt. Gleichzeitig erhöht sich mit steigender Kettenlänge die Tendenz zur Kationenanlagerung im Spektrum. Um diese Anlagerungen zu unterdrücken, ist die Verwendung von ammoniumhaltigen Zusätzen ist bei der MS stets erforderlich. Bei MALDI haben die Matrices einen großen Einfluss auf das Fragmentierungsverhalten der Proben. Für die Oligonukleotide konnte daher folgende Einteilung der Matrices von „hart“ nach „weich“ getroffen werden: HCCA > DHB > THAP ungefähr gleich ATT > HPA. Bei der Untersuchung von Oligonukleotiden mittels nano-ESI konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Quarzkapillaren der Verwendung von Glaskapillaren vorzuziehen ist, da mit Quarz die Anlagerungen der Kationen im Spektrum deutlich unterdrückt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Erhöhung des Drucks in der ersten Druckstufe zu einer schonenderen Desolvatisierung und damit zu einer deutlich verbesserten Nachweisgrenze führt. Bei der quantitativen Untersuchung des Salzeinflusses konnte eine maximale Salzkonzentration ermittelt werden, bei der eine massenspektrometrische Untersuchung von DNA und RNA noch möglich ist. Dabei hat sich gezeigt, dass bei direktem Vergleich nano-ESI 1000fach empfindlicher auf Salzverunreinigungen reagiert als MALDI. Generell lässt sich sagen, dass RNA eine höhere Tendenz zur Kationenanlagerung besitzt als DNA, wobei sich dieser Effekt mit steigender Kettenlänge verstärkt und bei nano-ESI deutlicher auftritt als bei MALDI. Das hat zur Folge, dass bei RNA ein höherer Aufreinigungsgrad notwendig ist, um im Vergleich zu DNA vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dem entsprechend wurden neben der Aufreinigungsmethode mittels Ionenpaar-HPLC auch verschiedene Pipettenspitzen, die mit Chromatographiematerial gefüllt sind, zur Aufreinigung verwendet. Mit beiden Methoden konnte eine vergleichbare Reduktion der Kationenanlagerungen im Spektrum erreicht werden, wobei klar ist das die Verwendung von Pipettenspitzen die zeit- und kosteneffizientere Lösung darstellt. Durch ein neuartiges Aufreinigungsprotokoll für Pipettenspitzen konnte der Zeitaufwand noch einmal deutlich reduziert werden. Für die Untersuchung nichtkovalenter Oligonukleotid-Komplexe wurden „native“ Bedingungen gefunden, bei der die native Struktur des Komplexes soweit erhalten bleibt, dass ein spezifischer Nachweis mittels nano-ESI möglich ist. Diese Bedingungen stellen einen Kompromiss zwischen einerseits der Stabilität des Komplexes in Lösung und andererseits den optimalen Bedingungen für die Elektrospray-Ionisierung dar. Die erste untersuchte Komplexklasse waren Oligonukleotid-Dimere. Es wurden verschiedenste DNA-, RNA- sowie DNA-RNA-Hetero-Dimere mit Bindungsenergien zwischen 0 und -22,1 kcal/mol mittels nano-ESI vermessen. Es wurde eine klare Grenze ermittelt, bei der die Detektion nichtkovalenter Komplexe möglich ist. Spezifischen Dimere können im Spektrum nur dann detektiert werden, wenn deren Bindungsenergie mindestens -11,5 kcal/mol oder mehr beträgt. Als zweite Gruppe wurden Oligonukleotid-Dimere mit „Minor Groove Binding Ligands“ (MGBLs) mittels nano-ESI untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die MGBLs spezifisch und in der entsprechenden Bindungsstöchiometrie an DNA-Dimere binden. Für einen neusynthetisierten Ligand konnte erstmals die Bindungspräferenz an DNA-Dimere mit der Massenspektrometrie bestätigt werden. In allen Fällen wurde keine unspezifische Bindung an RNA-Dimere oder DNA-RNA-Hetero-Dimere beobachtet. Als letztes wurden RNA-Aminoglykosid-Komplexe mit nano-ESI untersucht. Hierbei konnten nur teilweise spezifischen Komplexe im Spektren nachgewiesen werden, da die Bindungsenergie einiger Komplexe deutlich unterhalb der Nachweisgrenze von -11,5 kcal/mol lag. Alle genannten nichtkovalenten Komplexe wurden auch mittels MALDI vermessen, allerdings konnten keine spezifischen Komplexe nachgewiesen werden. Durch direkten Vergleich von MALDI mit nano-ESI und entsprechende Kontrollexperimente konnte erstmals gezeigt werden, dass die nichtkovalenten Komplexe nicht wie vermutet während der MALDIKristallisation zerstört werden. Viel mehr werden die Komplexe im MALDI-Kristall unzerstört eingebaut und eine Zerstörung erfolgt erst während des Desorptions-/Ionisationsprozesses. Es besteht die berechtigte Vermutung, dass bei stärker bindenden Komplexen eine unzersetzte Ionisation mittels MALDI erfolgen kann. Daher sind weitere Untersuchungen in diese Richtung sinnvoll und es werden zur Zeit Komplexe, deren Bindungsenergie weit über -22,1 kcal/mol liegt, in der Arbeitsgruppe untersucht. Abschließend ist festzustellen, dass die Massenspektrometrie eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Analyse von DNA und RNA ist, die allerdings einen hohen Anspruch an die Sauberkeit und damit an die Aufreinigung der Probe stellt. Darüber hinaus ist die MS auch in der Lage nichtkovalente Oligonukleotid-Ligand-Komplexe zu untersuchen. Da in den letzten Jahren DNA und RNA als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze mehr und mehr an Bedeutung gewonnen haben, bietet sich die Massenspektrometrie als eine Möglichkeit zur Analyse von Oligonukleotid-Wirkstoff- Komplexe an.
In dieser Arbeit wurde der Gentransfer von Todesliganden als Ansatz zur Tumor-Gentherapie untersucht. Dazu wurde ein lentiviraler Vektor der zweiten Generationverwendet, der die Todesliganden CD95L oder TRAIL sowie das Markergen EGFP exprimiert. Dies ist die erste Beschreibung von CD95L- oder TRAILexprimierenden lentiviralen Vektoren. Der TRAIL-exprimierende Vektor erwies sich als geeignet für die therapeutische Induktion von Apoptose in humanen Tumorzelllinien auch bei geringen Vektordosen. Die Transduktion mit diesem Vektor bei niedriger MOI führte zu Todesrezeptor-spezifischer Induktion von Apoptose. Diese wurde ausschließlich durch membranständiges TRAIL bei Zell-Zell-Kontakt vermittelt. Die transduzierten Zellen waren zudem in der Lage, bei Kontakt mit nichttransduzierten Zellen in diesen Apoptose auszulösen. Durch den TRAIL-Gentransfer wurde jedoch spezifisch in den transduzierten Zellen Resistenz gegen TRAIL-induzierte Apoptose ausgelöst, während die CD95- oder Cisplatin-induzierte Apoptose nicht beeinflusst war. Dies führte zum Auswachsen einer vollständig TRAIL-resistenten Population. Bereits 72 Stunden nach Transduktion konnten Anzeichen der Resistenz detektiert werden. Der Grund für diese Resistenzinduktion lag in einer spezifischen Blockade der DISC-Bildung und Caspase-8-Aktivierung durch die TRAIL-Todesrezeptoren. Die Signaltransduktion durch den sehr ähnlichen CD95-Signalweg war gänzlich unbeeinflusst. Durchflusszytometrische und proteinbiochemische Untersuchungen der Expression von TRAIL-R1 und TRAIL-R2, sowie die Untersuchung der mRNA-Expression dieser Rezeptoren ergaben, dass beide TRAIL-Todesrezeptoren noch synthetisiert, jedoch intrazellulär zurückgehalten wurden. In fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass TRAIL-R2 intrazellulär in einem Komplex mit TRAIL vorlag, der sich im Bereich des ER/Golgi-Apparates befand. Diese Ergebnisse belegen, dass intrazelluläre Interaktion von TRAIL mit seinen Rezeptoren zur Retention dieser Proteine in der Zelle und damit zur Resistenzentwicklung führte. Bei Versuchen zur in vivo-Gentherapie durch lentivirale TRAIL-Expression in humanen Tumortransplantaten auf Nacktmäusen wurde nur ein transienter Effekt erzielt. Es konnte gezeigt werden, dass mit Vektorpartikeln assoziiertes TRAIL-Protein in den Tumoren Apoptose auslöste. Diese Induktion von Apoptose führte zu einer Wachstumsverzögerung. Dadurch wurde jedoch gleichzeitig eine effiziente Transduktion der Tumorzellen mit dem TRAIL-exprimierenden Vektor und ein langfristiger Effekt der TRAIL-Expression verhindert. Diese Ergebnisse zeigen, dass lentiviraler Gentransfer mit konstitutiv TRAIL-exprimierenden Vektoren ungeeignet zur in vivo-Transduktion von Tumoren ist. Gleichzeitig belegen die Ergebnisse der Transduktion mit einem Kontrollkonstrukt einen effizienten Gentransfer. Der hier charakterisierte Resistenzmechanismus ist zuvor nicht beschrieben worden und stellt eine neuartige Form der Therapie-induzierten Resistenz dar. Die proapoptotische Gentherapie durch konstitutive TRAIL-Expression in Tumoren muss nach diesen Ergebnissen neu bewertet werden. Der lentivirale Gentransfer in Tumore in vivo läuft prinzipiell effizient ab. Bei Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems und in Kombination mit Suizidgenen könnte eine therapeutische Nutzung des lentiviralen TRAIL-Gentransfers möglich sein.
Das Rauchen von Kokain („Crack“) hat sich in den letzten Jahren weltweit verbreitet und Crack hat eine wichtige Stellung in der Gruppe der harten Drogen eingenommen. Der inhalative Konsum unterscheidet sich von den anderen Formen der Kokain-Aufnahme durch seine schnelle und intensive Wirkung sowie durch einen sehr starken, unkontrollierten Drang zum erneuten Konsum. Schwere gesundheitliche Schäden sind die Folge sowie auch soziale Isolierung und zwischenmenschliche Konflikte. Da zur Finanzierung der Crack-Sucht häufig Straftaten begangen werden, sind diese Fälle forensisch von besonderem Interesse. Im Gegensatz zum nasalen oder intravenösen Konsum entsteht ausschließlich beim Rauchen das Pyrolyseprodukt Anhydroecgoninmethylester (AEME), welches deshalb als Marker für einen Crack-Konsum angesehen wird. Die toxikologischen Aspekte dieser Substanz sind nicht ausreichend untersucht, um dessen toxikologisches Potential abschätzen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten analytische Methoden entwickelt und der Metabolismus von AEME untersucht werden, um Daten an authentischen Proben von Kokainkonsumenten erheben zu können.
Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
Background: The flavin in its FMN and FAD forms is a versatile cofactor that is involved in catalysis of most disparate types of biological reactions. These include redox reactions such as dehydrogenations, activation of dioxygen, electron transfer, bioluminescence, blue light reception, photobiochemistry (as in photolyases), redox signaling etc. Recently, hitherto unrecognized types of biological reactions have been uncovered that do not involve redox shuffles, and might involve the reduced form of the flavin as a catalyst. The present work addresses properties of reduced flavin relevant in this context. Results: N(5)-H exchange reactions of the flavin reduced form and its pH dependence were studied using the 15N-NMR-signals of 15N-enriched, reduced flavin in the pH range from 5 to 12. The chemical shifts of the N(3) and N(5) resonances are not affected to a relevant extent in this pH range. This contrasts with the multiplicity of the N(5)-resonance, which strongly depends on pH. It is a doublet between pH 8.45 and 10.25 that coalesces into a singlet at lower and higher pH values. From the line width of the 15N(5) signal the pH-dependent rate of hydrogen exchange was deduced. The multiplicity of the 15N(5) signal and the proton exchange rates are little dependent on the buffer system used. Conclusion: The exchange rates allow an estimation of the pKa value of N(5)-H deprotonation in reduced flavin to be ≥ 20. This value imposes specific constraints for mechanisms of flavoprotein catalysis based on this process. On the other hand the pK ≈ 4 for N(5)-H protonation (to form N(5)+-H2) would be consistent with a role of N(5)-H as a base.
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die die Hydrolyse von ATP in der Regel an die Translokation unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen koppeln. Sie bilden eine der größten Familien von aktiven Transportern, werden in allen drei Reichen des Lebens gefunden und sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge beteiligt. Auf Grund ihrer zentralen Bedeutung für viele zelluläre Prozesse wurden in der hier vorliegenden Arbeit ausgewählte ABC-Transporter bzw. ihre Komponenten strukturell untersucht, mit dem Ziel einen Beitrag zur Aufklärung ihrer molekularen Mechanismen zu leisten. Das erste untersuchte System war der MDR-ABC-Transporter LmrA aus L. lactis, der auf Grund seiner funktionalen Austauschbarkeit mit dem humanen P-Glykoprotein ein geeignetes Modellsystem zur strukturellen Untersuchung dieser medizinisch relevanten Klasse von ABC-Transportern darstellte. In einem ersten Schritt zu seiner Kristallisation wurde durch die Analyse von 43 Protein-Detergens-Kombinationen eine für strukturbiologische Untersuchungen geeignete Proteinpräparation etabliert. Unter Verwendung von FOS-CHOLINE-16 wurde eine bis zur Homogenität gereinigte, monodisperse und stabile Proteinlösung zur Kristallisation gewonnen, mit der eine breit angelegte Analyse des n-dimensionalen Kristallisationsraums von LmrA durchgeführt wurde. Im Zuge der Analyse von insgesamt 9600 Bedingungen wurden vier verschiedene Kristallformen erhalten. Die Datenaufnahme lieferte für die Kristallform 2 unter Verwendung von Synchrotronstrahlung eine schwache Streuung bis zu einer Auflösung von 20 Å. In einem weiteren Projekt wurden die molekularen Grundlagen der Substratspezifität des ABC-Importers Ehu aus S. meliloti untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur seines Substratbindeproteins EhuB im Komplex mit den kompatiblen Soluten Ectoin bzw. Hydroxyectoin mit einer Auflösung von 1,9 Å bzw. 2,5 Å gelöst. Die beiden erhaltenen Strukturen zeigten einen für Substratbindeproteine der Gruppe II typischen Aufbau aus zwei globulären Domänen, die durch zwei Segmente der Polypeptidkette verbunden wurden. Die Substratbindungsstelle von EhuB war, wie für Substratbindeproteine erwartet, in der Spalte zwischen den beiden globulären Domänen lokalisiert. Ihre Analyse zeigte eine Interaktion des Proteins mit der negativ geladenen Carboxylat-Gruppe der Substrate durch die Bildung von Salzbrücken mit der Seitenkette von Arg85 sowie mittels Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hauptketten-Stickstoffatomen von Phe80 und Thr133. Im Unterschied dazu waren für die Bindung des kationischen Anteils der Substrate wesentlich seine Wechselwirkungen mit den aromatischen Resten Phe24, Tyr60 und Phe80 verantwortlich, die durch ihre räumliche Anordnung eine optimale Bindungsstelle für die delokalisierte positive Ladung der Substrate bildeten. Die Bedeutung dieser wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhenden Wechselwirkungen für die Substratbindung konnten – aufbauend auf der Kristallstruktur – in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. E. Bremer (Universität Marburg) bestätigt werden. Neben den beschriebenen Interaktionen wurde der kationische Anteil der Substrate durch zwei Salzbrücken mit der Seitenkette von Glu21 sowie durch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hauptketten-Carbonyl-Funktion von Gly78 gebunden. Bei der Bindung des Substrats Hydroxyectoin wurde im Vergleich zu Ectoin eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Seitenkette von Glu134 und der lediglich in diesem Substrat vorhandenen Hydroxyl-Gruppe beobachtet, die für die dreieinhalbfach höhere Bindungsaffinität von EhuB für Hydroxyectoin gegenüber Ectoin verantwortlich zu sein scheint. Der Vergleich der an der Substratbindung beteiligten Interaktionen in EhuB mit den ebenfalls für kompatible Solute spezifischen Substratbindeproteinen ProX aus E. coli, ProX aus A. fulgidus und OpuAC aus B. subtilis enthüllte gemeinsame Prinzipen der untersuchten Proteine zur Bindung dieser Klasse von Substraten. Von besonderer Bedeutung waren dabei die von bestimmten aromatischen Resten ausgehenden Wechselwirkungen mit dem kationischen Anteil der Substrate, die wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhen. Im Detail zeigten die Substratbindungsstellen der untersuchten Proteine jedoch signifikante Unterschiede, die eine Anpassung an die für ihre Aufgabe benötigte Bindungsaffinität und das zu bindende Substrat zu sein scheinen.
Struktur und Bindungsverhalten der N-terminalen p85-src-homology-2-Domäne mittels NMR-Spektroskopie
(2006)
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
One of the central research topics in the field of biophysical chemistry is the structure and function of membrane proteins involved in energy transduction. Both, the aerobic and the anaerobic respiration include electron transfer and proton translocation across the mitochondrial and bacterial membranes. These electron transfer processes lead to changes in oxidation states of cofactors some of which are paramagnetic. Therefore, EPR spectroscopy is the method of choice to obtain electronic and structural information directly related to the function of the respiratory chain proteins. In this work, multifrequency continuous wave (CW) and pulsed EPR spectroscopy has been used to characterize the molybdenum active site of polysulfide reductase (Psr) from the anaerobic bacterium Wolinella succinogenes and the protein-protein complex between cytochrome c oxidase (CcO) and cytochrome c from the aerobic bacterium Paracoccus denitrificans. Molybdenum in Psr-Psr is an enzyme essential for the sulfur respiration of Wolinella succinogenes. Biochemical studies suggested that the active site of this enzyme contains a mononuclear Mo center, which catalyzes the reduction of the substrate polysulfide to sulfide. Until now there is no crystal structure available for Psr. Consequently, current characterizations of this enzyme have to rely on biochemical and spectroscopic investigations. Within the present work, CW and modern pulsed EPR techniques were applied to investigate its catalytically active site. In the first part of this thesis, different redox agents have been used to generate paramagnetic states of Psr. Multifrequency CW-EPR spectroscopy was applied to identify the Mo(V) states. Using simulations of the experimental spectra, three spectroscopically distinct states have been identified based on the Mo hyperfine- and g-tensor values. Comparison of their EPR parameters with those of related enzymes indicated five or six sulfur ligands at the Mo center depending on the state. The state generated by addition of polysulfide is suggested to be the catalytically active form, in which the Mo is coordinated by a sulfur of the polysulfide chain as the sixth ligand. 33S (I = 3/2) labeled polysulfide was prepared to probe the proximity of the polysulfide to the molybdenum center via its hyperfine coupling. 1D-ESEEM and 2D122 HYSCORE spectroscopy was used to detect these hyperfine and quadrupole interactions, which are too small to be observed in conventional CW EPR spectra. To date there has been only one pulsed-EPR study involving a 33S nucleus [Finazzo et.al. 2003]. The reasons are that this nucleus has a high nuclear spin of I = 3/2 and a large nuclear quadrupole moment in addition to the low Larmor frequency. All these make the detection of sulfur and the extraction of structural information demanding. However, analysis of the 2D-data led to a Mo(V) 33S distance in a range of about 2 to 2.5 Å. Mo-S distances found in molybdenum enzymes of the same family are in a range of 1.8 to 2.8 Å suggesting that the 33S is indeed the sixth ligand of the Mo(V) center and demonstrating that polysulfide is the actual substrate for this enzyme. Thus HYSCORE experiments have been proved to be a powerful technique to gain further insight into the active site structures of molybdenum enzymes and the trafficking of substrate atoms during catalysis. Density functional theory (DFT) calculations together with quantitative numerical simulations of the 2D-data will help to obtain more structural details about the molybdenum binding site in Psr. CcO:cytochrome c complex Protein-protein complex formation is an important step in energy conversion biological processes such as respiration and photosynthesis. These protein-protein complexes are involved in long range electron transfer reactions and are known to be of transient nature. Within the bacterial and mitochondrial respiratory electron transport chains such a complex is formed between CcO and cytochrome c. Upon complex formation cytochrome c donates the electrons required for the CcO catalyzed reduction of dioxygen to water. Here, the protein-protein complex formation between CcO and cytochrome c from Paracoccus denitrificans was investigated by pulsed EPR spectroscopy. The idea was to use the relaxation enhancement due to the distance and orientation dependent magnetic dipole-dipole interaction between the paramagnetic centers in the different CcO constructs and cytochromes. Two-pulse electron spin echo experiments were carried out on mixtures of the CuA containing soluble subunit II or the full size CcO with the physiological partner cytochrome c552 or horse heart cytochrome c. Significantly enhanced relaxation of CuA due to specific protein-protein complex formation has been observed in all four cases. In contrast the non-binding cytochrome c1 showed only a very weak relaxation enhancement due to unspecific protein-protein interactions. The echo decays of the slowly relaxing observer spin (CuA of CcO) measured in the absence and presence of the fast relaxing spin (Fe(III) of cytochrome c) permitted the extraction of the pure dipolar relaxation contributions for the different complexes. Measurements at different temperatures proved the dipolar nature of the relaxation enhancement. Furthermore, it was demonstrated experimentally that this approach also works for the full-size CcO, which contains four paramagnetic metal centers, in complex with cytochrome c. Quantitative simulations of the data suggest a broad distribution in distances (2 - 4 nm) and orientations between the CuA and Fe(III) in the complex between CcO and cytochrome c. High-field EPR spectroscopy will be useful to further analyze and prove these complex structures. Within the present work, it has been shown that pulsed relaxation enhancement experiments can be used to investigate the distance and relative orientation between paramagnetic metal centers. Furthermore, it has been demonstrated on a qualitative level, that this method can be used complimentary to other biophysical approaches to study transient electron transfer protein-protein complexes. Finally, within this work it has been proven that this method can be applied also to biological systems where more than two paramagnetic centers are present. This is particularly interesting for supercomplexes between membrane proteins.
Septine bilden eine neue Klasse filamentbildender kleiner GTPasen, die ursprünglich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund ihrer Funktion in der Cytokinese entdeckt wurden. Mittlerweile wurde gezeigt, dass Septine nicht nur in Pilzen, sondern auch im gesamten Tierreich vorkommen. In Säugern sind bisher zehn Isoformen, die z. T. in mehreren Spleißvarianten auftreten, beschrieben worden. Die Tatsache, dass Septine auch in postmitotischen Geweben wie dem Hirn exprimiert werden, weist darauf hin, dass Septine zumindest in Säugetieren nicht nur in der Zellteilung eine Rolle spielen. Die nachgewiesene Interaktion eines Säugerseseptins mit dem für die Fusion sekretorischer Vesikel essentiellen Membranprotein Syntaxin-1 (Beites et al., 1999) und die Koimmunopräzipitation eines Septinkomplexes mit Antikörpern gegen den Sec6/8-Komplex (Hsu et al., 1998), der beim zielgerichteten Transport sekretorischer Vesikel eine Rolle spielt, deuten darauf hin, dass Säugerseptine ein Funktion bei Transportprozessen spielen könnten. Um weitere Hinweise über die Wirkungsweisen von Septinen zu erhalten, wurden in dieser Arbeit zwei Screening-Systeme angewendet, um Interaktionspartner von Septinen zu identifizieren. Bei einem Suppressor-Screen mit einer Hefe-Septinmutante (cdc1-11) wurden zwei andere Hefeseptine als Suppressoren identifiziert (Cdc3p und Cdc12p), was auf eine Redundanz in der Funktion dieser Septine hinweist. Außerdem wurden Hefe-Zwei-Hybrid-Screens durchgeführt, bei denen eine cDNA-Bank aus adultem Rattenhirn nach potentiellen Interaktionspartnern des N-Terminus und des C-Terminus des Säuger-Septins rSLPa durchsucht wurde, das wegen der oben genannten Koimmunpräzipitation mit Komponenten des Sec6/8-Komplexes möglicherweise eine Rolle in Transportprozessen spielt. Als möglicher Interaktionspartner des N-Terminus von rSLPa wurde die lange Isoform der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 identifiziert. Die Interaktion konnte in vitro mittels GST-Fusionsproteinen in Kopräzipitations-Experimenten zwar nicht eindeutig verifiziert werden. Jedoch wurde in Koexpressionsexperimenten eine Kolokalisation von rSLPa mit iPLA2 beobachtet, was zumindest auf eine mögliche Interaktion beider Proteine in vitro hindeutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die gefundene Interaktion eindeutig zu verifizieren. Als Interaktionspartner des C-Terminus von rSLPa wurden drei verschiedene Septine identifiziert: KIAA0202, Pntl2 und ein Klon mit hoher Homologie zu Septinen (DKFZp566C224). Die Interaktion von rSLPa und KIAA0202 wurde durch Kolokalisationsstudien in COS-7 Zellen bestätigt. Bei der weiteren Untersuchung verschiedener Säugerseptine und deren Interaktionen wurde die filamentbildende Eigenschaft der Septine näher charakterisiert. Mithilfe von Mutanten, die die Fähigkeit, GTP zu binden, verloren hatten, konnte nachgewiesen werden, dass die GTP-Bindung eine wichtige Funktion in der Filamentbildung hat. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der N-Terminus von rSLPa dessen Lokalisation an Aktinstressfasern vermittelt. Mit spezifischen Antiseren, die gegen rSLPa und Septin6 hergestellt wurden, wurde die Expression dieser Septine in verschiedenen Rattengeweben untersucht. Außerdem wurde gezeigt, dass beide Septine während der Entwicklung in etwa gleich bleibenden Mengen in verschiedenen Regionen des Gehirns exprimiert werden, was die Annahme unterstützt, dass diese Septine nicht ausschließlich eine Rolle in der Zellteilung spielen. Die Lokalisation von endogenem sowie überexprimiertem rSLPa wurde in hippocampalen Neuronen untersucht. rSLPa ist nicht synaptisch, sondern in Anreicherungen direkt neben synaptischen Kontakten, bzw. unterhalb von dendritischen Dornfortsätzen lokalisiert. Diese Lokalisation von rSLPa weist neben einer Funktion des Septins in Transportprozessen auch auf eine Rolle in der Kompartimentalisierung der Plasmamembran von Neuronen hin.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.