Biochemie und Chemie
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Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
Prostaglandin E2 is the major prostaglandin involved in colorectal carcinogenesis. The biosynthesis of prostaglandin E2 is accomplished by several terminal prostaglandin E synthases through catalytical conversion of the cyclooxygenase product prostaglandin H2. Among the known terminal prostaglandin E synthases, microsomal prostaglandin E synthase type 1 and type 2 were found to be overexpressed in colorectal cancer, however the role and regulation of these enzymes in this tumor entity are yet not fully understood. Here we report that the cyclopentenone prostaglandins 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 and prostaglandin A2, which have been shown to modulate cell growth and neoplasia, selectively down-regulate microsomal prostaglandin E synthase type 2 mRNA and protein expression in the human colorectal carcinoma cell lines Caco-2 and HCT 116. This effect appeared to be PPARgamma independent and was not found to require G-protein-coupled receptor activation. Instead, inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 by cyclopentenone prostaglandins may be mediated by covalent binding of the cyclopentenone ring to cysteine residues on signalling molecules or via a redox-dependent mechanism. Inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 was subsequently followed by decreased prostaglandin E synthase activity, which in turn contributed at least in part to the anti-proliferative action of cyclopentenone prostaglandins in HCT 116 cells. Collectively, these data unravel a novel mechanism for the growth-inhibitory effects of cyclopentenone prostaglandins and expose microsomal prostaglandin E synthase type 2 as a new potential target for pharmacological intervention in the treatment of colorectal cancer.
Nucleotide-binding domains (NBDs), roughly 27 kDa in size, are conservative components of the large family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, which includes importers, exporters, and receptors. NBDs or ABC-ATPases supply energy for the translocation of a vast variety of substrates across biological membranes. Despite their hydrophilic sequence, many NBDs tend to aggregate and precipitate in solution upon isolation from the complete transporter. The conditions stabilizing an extremely labile NBD component of the E.coli HlyA transporter, HlyB-NBD, were developed. As a result, the pure highly concentrated enzyme was protected from precipitation for months that allowed screening of the unlimited crystallization conditions in the presence of different substrates and performance of the reproducible functional assays. HlyB-NBD was characterized in regard to its uncoupled ATPase activity, oligomeric state, and stability in solution. Comparative analysis of protein stability and ATPase activity in various buffers suggested an inverse relationship between the two. Kinetic analysis of ATPase activity revealed ATP-induced protein dimerization. Gel-filtration experiments with the wild type protein and H662A-mutant of HlyB-NBD provided further evidence of protein dimerization in the presence of ATP. The crystal structures in post- and pre-hydrolysis nucleotide-bound states of HlyB-NBD were determined at 1.6Å and 2.5Å resolution, respectively. While the hydrolytically deficient H662A mutant of HlyB-NBD was crystallized as a stable dimer in the presence of ATP or ATP-Mg2+, with two nucleotide molecules sandwiched between the two monomers, the same protein was shown to be a monomer in the ADP-loaded state. The wild type protein failed to develop crystals with bound ATP, yet formed ADP-bound crystals identical to those of the H662A-mutant. The X-ray structures of HlyB-NBD in various states of the hydrolytic cycle and the functional studies of the enzyme have provided an opportunity to characterize enzyme-substrate complexes and protein-protein interactions between the NBD subunits in great detail. Comparison of the nucleotide-free, the ADP-, and the ATP-loaded states revealed oligomeric and conformational changes of the protein upon substrate binding and resulted in a molecular picture of the catalytic cycle. The correlated results of the structural and functional investigations of HlyB-NBD are discussed with relation to the mechanism of action of ABC transporters.
The 5'-terminal cloverleaf (CL)-like RNA structures are essential for the initiation of positive- and negative-strand RNA synthesis of entero- and rhinoviruses. SLD is the cognate RNA ligand of the viral proteinase 3C (3Cpro), which is an indispensable component of the viral replication initiation complex. The structure of an 18mer RNA representing the apical stem and the cGUUAg D-loop of SLD from the first 5'-CL of BEV1 was determined in solution to a root-mean-square deviation (r.m.s.d.) (all heavy atoms) of 0.59 A (PDB 1Z30). The first (antiG) and last (synA) nucleotide of the D-loop forms a novel ‘pseudo base pair’ without direct hydrogen bonds. The backbone conformation and the base-stacking pattern of the cGUUAg-loop, however, are highly similar to that of the coxsackieviral uCACGg D-loop (PDB 1RFR) and of the stable cUUCGg tetraloop (PDB 1F7Y) but surprisingly dissimilar to the structure of a cGUAAg stable tetraloop (PDB 1MSY), even though the cGUUAg BEV D-loop and the cGUAAg tetraloop differ by 1 nt only. Together with the presented binding data, these findings provide independent experimental evidence for our model [O. Ohlenschläger, J. Wöhnert, E. Bucci, S. Seitz, S. Häfner, R. Ramachandran, R. Zell and M. Görlach (2004) Structure, 12, 237–248] that the proteinase 3Cpro recognizes structure rather than sequence.
In order to further understand how DNA polymerases discriminate against incorrect dNTPs, we synthesized two sets of dNTP analogues and tested them as substrates for DNA polymerase a (pol alpha) and Klenow fragment (exo-) of DNA polymerase I (Escherichia coli ). One set of analogues was designed to test the importance of the electronic nature of the base. The bases consisted of a benzimidazole ring with one or two exocyclic substituent(s) that are either electron-donating (methyl and methoxy) or electronwithdrawing (trifluoromethyl and dinitro). Both pol a and Klenow fragment exhibit a remarkable inability to discriminate against these analogues as compared to their ability to discriminate against incorrect natural dNTPs. Neither polymerase shows any distinct electronic or steric preferences for analogue incorporation. The other set of analogues, designed to examine the importance of hydrophobicity in dNTP incorporation, consists of a set of four regioisomers of trifluoromethyl benzimidazole. Whereas pol a and Klenow fragment exhibited minimal discrimination against the 5- and 6-regioisomers, they discriminated much more effectively against the 4- and 7-regioisomers. Since all four of these analogues will have similar hydrophobicity and stacking ability, these data indicate that hydrophobicity and stacking ability alone cannot account for the inability of pol a and Klenow fragment to discriminate against unnatural bases. After incorporation, however, both sets of analogues were not efficiently elongated. These results suggest that factors other than hydrophobicity, sterics and electronics govern the incorporation of dNTPs into DNA by pol {alpha} and Klenow fragment.
In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Instituts konnte gezeigt werden, dass ein SIVsmmPBj-abgeleiteter Vektor Vorteile gegenüber HIV-1-abgeleiteten Vektoren aufweist, da auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte Zelllinien und Fibroblasten sowie primäre humane Monozyten transduziert werden können. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit wurden die besonderen Transduktionsfähigkeiten diese SIVsmmPBj Vektors eingehend untersucht. Zunächst wurden die transduzierbaren Monozyten morphologisch und biochemisch genauer charakterisiert; insbesondere wurde gezeigt, dass sich diese Zellen tatsächlich in der G0-Phase des Zellzyklus befinden und auch nach der Transduktion die Fähigkeit aufweisen, sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen auszudifferenzieren. Bei dem Versuch andere primäre humane Blutzellen zu transduzieren wurde gezeigt, dass SIVsmmPBj Vektoren für die Transduktion unstimulierter CD4+ T-Zellen nicht geeignet sind. Zum besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen die zur Transduktion arretierter Zellen und Monozyten durch SIVsmmPBj-abgeleitete Vektoren führen, wurde der Einfluss der akzessorischen viralen Proteine untersucht. Dazu wurde ein PBj-Knockout- Vektor, bei dem die Expression aller akzessorischen Gene (vif, vpx, vpr und nef) inhibiert war, generiert und zur Transduktion von arretierten Zellen und Monozyten eingesetzt. Keines der akzessorischen Proteine war für die Transduktion der in G0 arretierten Zellen notwendig. Für die Transduktion von Monozyten erwies sich das virale Protein Vpx jedoch als essentiell, da der Knockout-Vektor zur Transduktion von Monozyten nur nach Supplementierung mit diesem Protein in der Lage war. Die Supplementierung von HIV-1 Vektoren mit Vpx des SIVsmmPBj ermöglichte keine Transduktion von Monozyten, was darauf hindeutet, dass weitere Proteine von SIVsmmPBj oder aber auch die Fähigkeit der prinzipiellen Transduktion von Zellen der G0-Phase eine Rolle spielen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde ein auf SIVsmmPBj basierendes Dreiplasmid-Vektorsystem entwickelt. Für das Verpackungskonstrukt wurde das Verpackungssignal charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Bereich zwischen dem Promotor und dem Spleißdonor gelegene Bereich für eine effiziente Partikelbildung nötig ist und die Deletion der Region zwischen Spleißdonor und gag-Start-ATG zur Inaktivierung des Verpackungssignals ausreicht. Die aus dem Dreiplasmid-System generierten Vektoren erreichten Titer von bis zu 5 x 105 i.E./ml und waren nach Supplementierung mit Vpx dazu in der Lage, primäre humane Monozyten zu transduzieren. Der hier entwickelte, auf SIVsmmPBj basierende Vektor eröffnet neue Möglichkeiten in der Gentherapie. So sind nun auch Monozyten als wichtige Zielzellen der Tumortherapie einem Gentransfer durch lentivirale Vektoren zugänglich.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Charakterisierung zweier Systeme, bei denen schnelle photoinduzierte Ladungstransferreaktionen auftreten. Mittels Anregungs-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich wurde zum einen die bisher noch nicht charakterisierte Primärreaktion des erst vor wenigen Jahren entdeckten bakteriellen Retinalproteins Proteorhodopsin untersucht. Dieses Protein, das einen signifikanten Beitrag zur Energiebilanz der euphotischen Zone leisten kann, zeigt einen vektoriellen, pH-abhängigen und lichtgetriebenen Protonentransfer über die Zellmembran. Mittels zeitaufgelöster Femtosekundenspektroskopie wurde die Primärdynamik in saurer sowie in alkalischer Umgebung untersucht. Nach Photoanregung von Proteorhodopsin zeigt sich eine konzertierte Schwingung des all-trans-Retinals, die in einer biphasischen Reaktion zu einer Isomerisierung zum 13-cis-Zustand führt. Neben den genauen Zerfallszeiten wird auch das Besetzungsverhältnis des schnellen zum langsamen Zerfallskanal durch den Protonierungszustand des primären Protonenakzeptors gesteuert. In alkalischer Umgebung reagieren mehr Moleküle über den schnellen Reaktionskanal als in saurer Umgebung. Zusätzlich vergrößert sich die Quantenausbeute der Isomerisierungsreaktion vom all-trans- zum 13-cis-Retinal um den Faktor zwei beim Erhöhen des pH-Wertes von 6 auf 9. Durch die Reaktion des Chromophors auf die unterschiedlichen Ladungszustände des primären Protonenakzeptors zeigt sich, dass die Proteinumgebung elementar für die Funktion, speziell auch für die primäre Photodynamik, ist. Eine mögliche Erklärung berücksichtigt die räumliche Nähe der entsprechenden Aminosäure zur C13=C14 Bindung. Durch Deprotonierung an dieser Stelle kommt es zu einer Schwächung der genannten Bindung. Die energetische Barriere für die Isomerisierung wird herabgesetzt und diese Reaktion kann schneller und effizienter ablaufen als bei Gegenwart einer protonierten Aminosäure. Da die Ladung des Akzeptors die Reaktion „steuert“, kann von einer elektrostatischen Kontrolle der Reaktionsdynamik gesprochen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die photoinduzierte Dynamik von Merocyaninen sowohl frei in Lösung als auch an kolloidale Halbleiter gekoppelt untersucht. Für die freien Farbstoffe lassen sich zwei Deaktivierungskanäle unterscheiden. Nach der Photoanregung kann das Merocyanin an der zentralen konjugierten Polymethinkette isomerisieren. Die Entstehung des daraus resultierenden verdrehten Moleküls konnte innerhalb weniger zehn Pikosekunden beobachtet werden. Die andere Möglichkeit die aufgenommene Energie wieder abzugeben besteht in der Bildung eines angeregten Triplettzustandes. Die Besetzung dieses Zustandes lässt sich innerhalb weniger Pikosekunden beobachten und geht somit signifikant schneller vonstatten als die Isomerisierung. Durch Kopplung der Merocyanine an TiO2-Halbleiterkolloide werden andere Deaktivierungskanäle wichtig. Mit einer Zeitkonstante von wenigen zehn Femtosekunden kommt es zu einem schnellen Ladungstransfer aus dem Farbstoff in den Halbleiter. Parallel zu dieser ultraschnellen Elektroneninjektion bildet sich, wie für das ungekoppelte System auch, der verdrehte Zustand. Die Bindung an den Halbleiter führt jedoch zu einer Beschleunigung der Torsionsbewegung, sodass sich die Geometrieänderung innerhalb weniger Pikosekunden beobachten lässt. Auch aus diesem Zustand kommt es zur Elektroneninjektion aus dem Farbstoff in das Leitungsband des Halbleiters. Die Triplettbildung ist dagegen für das gekoppelte System nicht beobachtbar, was zu einer erhöhten Stabilität führt. Neben der Bildung der ladungsgetrennten Zustände konnte mittels der Femtosekundenspektroskopie auch die partielle Rückreaktion zu neutralen Systemen beobachtet werden. Die Reduktion des Merocyaninkations erfolgt innerhalb weniger 100 ps, ist aber nach einer Nanosekunde noch immer nicht vollständig abgeschlossen, sodass ein signifikanter Teil der Moleküle bzw. Kolloide geladen bleibt. Sämtliche Beobachtungen des Farbstoff-Halbleiter-Systems lassen sich in einem Reaktionsmodell zusammenfassen. Mit diesem lässt sich die Dynamik nach Photoanregung erklären, sowie die energetische Lage der beteiligten Zustände im Verhältnis zueinander betrachten. Ein bereits existierendes Reaktionsmodell des freien Farbstoffes konnte mittels der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse auf den Bereich unterhalb von einer Nanosekunde erweitert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit zum einen dazu dienen, natürliche Ladungstransferreaktionen zu verstehen. Durch die Aufklärung der Primärdynamik von Proteorhodopsin konnte ein weiterer Baustein zum Verständnis dieses erst kürzlich entdeckten und für die Energiebilanz der Meere wichtigen Proteins hinzugefügt werden. Zum anderen tragen die Resultate dieser Arbeit auch zum Verständnis eines künstlichen Photosynthesesystems (Grätzelzelle) bei und können zur Effizienzsteigerung sowie zur Optimierung genutzt werden.
Group III presynaptic metabotropic glutamate receptors (mGluRs) play a central role in regulating presynaptic activity through G-protein effects on ion channels and signal transducing enzymes. Like all Class C G-protein coupled receptors, mGluR8 has an extended intracellular C-terminal domain (CTD) presumed to allow for modulation of downstream signaling. To elucidate the function and modulation of mGluR8, yeast two-hybrid screens of an adult rat brain cDNA library were performed with the CTDs of mGluR8a and 8b (mGluR8-C) as baits. Different components of the sumoylation cascade (ube2a, sumo-1, Pias1, Pias gamma and Pias xbeta) and some other proteins were identified as mGluR8 interacting proteins. Binding assays using recombinant GST-fusion proteins confirmed that Pias1 interacts not only with mGluR8-C, but all group III mGluR CTDs. Pias1 binding to mGluR8-C required a region N-terminally to a consensus sumoylation motif and was not affected by arginine substitution of the conserved lysine K882 within this motif. Co-transfection of fluorescently tagged mGluR8a-C, sumo-1 and enzymes of the sumoylation cascade into HEK 293 cells showed that mGluR8a-C can be sumoylated in cells. Arginine substitution of lysine K882 within the consensus sumoylation motif, but not of other conserved lysines within the CTD, abolished in vivo sumoylation. The results are consistent with post-translational sumoylation providing a novel mechanism of group III mGluR regulation.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen der Excisionase (Xis) aus dem Bakteriophagen HK022 sowie des Proteinkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der CuA-Domäne aus T. thermophilus mittels NMR in wässriger Lösung bestimmt. Im Falle der Excisionase wurde mit Hilfe isotopenmarkierter Proteinproben die vollständige Zuordnung der 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen durchgeführt. Hierauf basierend wurden anhand verschiedener zwei- und dreidimensionaler NOESY Spektren insgesamt 902 Abstandsbeschränkungen identifiziert, mit deren Hilfe die räumliche Struktur des Proteins bestimmt werden konnte. Die Strukturrechnungen ergaben letztendlich ein Strukturensemble von 20 Konformeren, die aus 2 alpha-Helices und 5 beta-Faltblattsträngen aufgebaut sind. Die beta-Faltblattstränge bilden 2 antiparalelle beta-Faltblätter, während die beiden alpha-Helices eine L-Formation darstellen. Die letzten 12 Aminosäurereste am C-Terminus zeigten keine NOEs und besaßen folglich auch keine geordnete Struktur. Dennoch ist dieser C-terminale Teil der Sequenz möglicherweise von physiologischem Interesse, da für den Rest 66 eine Asn/IsoAsp- Isomerisierung beobachtet wurde, welche eine Rolle bei der Autoregulation dieses Proteins in vivo spielen könnte. Ein weiteres markantes Strukturelement der Excisionase ist das Triprolinsegment Pro32-Pro33-Pro34, das die beiden beta-Faltblätter miteinander verbindet. Diese drei Prolinreste liegen in einer cis-trans-trans Konformation vor; aufgrund von Ligandenwechselwirkungen verschiedener anderer Proteine, die ein solches Motiv besitzen, liegt die Vermutung nahe, daß diese Region in der spezifischen Protein-Protein-Interaktion, die während der exzisiven Rekombination stattfindet, eine Schlüsselrolle spielen könnte. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von Cytochrom c552 mit der CuA-Domäne wurden beide löslichen Fragmente mit dem 15N-Isotop angereichert. Daraufhin konnten für jedes Protein heteronukleare NMR-Experimente durchgeführt werden, die eine vollständige Zuordnung der Amidresonanzen sowohl im reduzierten als auch im paramagnetischen oxidierten Zustand ermöglichte. Basierend auf diesen Resonanzzuordnungen konnten Veränderungen der chemischen Verschiebungswerte aufgrund von Oberflächenkontakten mit dem jeweiligen Redoxpartner mittels 2D [15N, 1H]-TROSY Experimenten in beiden Redoxzuständen ermittelt werden. Die betroffenen Aminosäurereste, welche an der Moleküloberfläche die Kontaktzone definieren, wurden für eine Docking-Rechnung herausgezogen, um letztendlich die räumliche Struktur des Elektronentransferkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der ba3-Oxidase zu bestimmen. Interessanterweise traten beim Cytochrom c552 zusätzlich zu den Verschiebungseffekten auf der Moleküloberfläche im reduzierten Zustand auch noch sehr dominante Sekundäreffekte im hinteren Teil der Hämspalte an der Stelle auf, wo das Propionat A über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein verbunden ist. Analog zu dem System aus P. denitrificans befindet sich auch im Cytochrom c552 aus T. thermophilus in dieser Position ein aromatischer Ring, der vermutlich von elektronischen Veränderungen im Hämring beeinflußt wird und diese Effekte durch seinen somit veränderten Ringstrom an die unmittelbare Umgebung weitergibt. Diese experimentellen Daten unterstützen die Elektronendelokalisierungstheorie von Wikström und Mitarbeitern (Johansson et al., 2002a und b), wonach im reduzierten Häm ein Teil der Elektronenladung bis in die Peripherie des Hämrings delokalisiert ist, einschließlich der nichtkonjugierten Propionatreste. Aus vorangegangenen Studien ergab sich bereits, daß der Elektronentransferkomplex in T. thermophilus auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, im Gegensatz zum P. denitrificans System, in dem die Interaktion elektrostatischer Natur ist (Maneg et al., 2003). Tatsächlich weist die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des Elektronentranferkomplexes einen hohen Anteil (ca. 40%) an unpolaren Kontaktoberflächen auf. Das Cytochrom c552 bindet dabei an die CuA-Domäne nahe dem CuA-Zentrum, so daß der Abstand zwischen den Metallzentren von Donor und Akzeptor 15,6 Å beträgt. Der Hämring des Cytochrom c552 berührt die CuA-Domäne im Bereich von Phe86 und Phe88, wie bereits von Soulimane et al. (2000) aufgrund der Sequenzhomologie mit dem P. denitrificans System postuliert worden war. Wie jedoch aus dem berechneten Elektronentransferweg hervorgeht, ist die aromatische Seitenkette des Phe88 nicht unbedingt in die Elektronenübertragung einbezogen. Der ca. 19-20 Å lange Weg des Elektrons führt wahrscheinlich vom Häm über das Proteinrückgrat der CuAReste Ala87 und Phe88 zum CuA-Zentralliganden His114 und schließlich zum binuklearen Kupferzentrum. Dies erklärt auch, wieso eine F88L Mutation der CuA-Domäne (Maneg et al., 2003) nur zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität geführt hat. Hiermit ist nun für das T. thermophilus System der gesamte Weg der Elektronenübertragung vom Cytochrom c552 über die CuA-Domäne zur Untereinheit I der ba3-Oxidase in den Grundzügen aufgeklärt, da der Elektronentransfer vom CuA- zum CuB-Zentrum bereits zuvor beschrieben worden war (Soulimane et al., 2000).