Biochemie und Chemie
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Bei der in vitro Rückfaltung von entfaltetem, reduziertem Hirudin entstehen neben dem nativen Protein hauptsächlich zwei nicht-nativ gefaltete Konformere. Das Verhältnis von nativem und nicht-nativem Konformer lässt sich während der Rückfaltung durch verschiedene Parameter beeinflussen. Thiole wie reduziertes Glutathion (GSH), N-Acetylcystein (NAC) und Dithioerytritol (DTE) beeinflussten die in dieser Arbeit untersuchten Rückfaltungen auf verschiedene Weise. Während beim Zusatz von GSH sehr verstärkt die Bildung des nativen Konformers auftrat, wurde bei einem Zusatz von NAC und DTE einerseits ein leicht verbessertes Verhältnis von nativem zu nicht-nativem Konformer festgestellt, andererseits wurde aber eine stark vermehrte Oligomerbildung beobachtet. Die aufgestellte Theorie der Oligomerbildung konnte anhand graphischer Auswertung der zusätzlich auftretenden, im Nativgel höher laufenden Banden bestätigt werden. Bei Zusatz von GSH und GSSG (oxid. Glutathion) als Redoxpuffer im Molekülverhältnis 2:1 (10 mM) wurde bei 4°C eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin erreicht. Der Zusatz von 1 mM GSH bewirkte dagegen bei 28°C (höchste gewählte Temperatur) ebenfalls eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin-Konformer. Die Temperaturabhängigkeit der Rückfaltung zeigte sich auch in weiteren Untersuchungen. So ergaben die Rückfaltungen unter Zusatz von 1 mM DTE, NAC und 10 mM GSH bei 4°C eine wesentlich höhere Ausbeute an nativ gefaltetem Hirudin als bei höheren Temperaturen. Der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 8,0 veränderte das Rückfaltungsmuster von Hirudin in den durchgeführten Untersuchungen nicht, obwohl Literaturdaten auf ein pH-Optimum von 8-9 für erfolgreiche Rückfaltungen hindeuten. Nativ und nicht-nativ gefaltetes Hirudin sowie die ebenfalls während der Rückfaltung entstandenen Oligomere ließen sich HPLC-chromatographisch trennen. Die in den Nativgelen auftretende, sehr übereinanderliegende Doppelbande des nicht-nativen Hirudins konnte per HPLC in zwei verschiedenen Konformere getrennt werden. Eine positive Beeinflussung der in vitro-Rückfaltung von Hirudin durch einen Zusatz der Oxidoreduktase Thioredoxin konnte eindeutig nachgewiesen werden. Bei einem äquivalenten Gehalt an Tioredoxin wurde die Rückfaltung zum nativen Konformer eindeutig begünstigt. Ein katalytischer Gehalt an Thioredoxin (Thioredoxin:Hirudin im Verhältnis 1:10) bewirkte die Rückfaltung ausschließlich zu nativem Hirudin. Auch bei einem Zwanzigstel Äquivalent Thioredoxin war noch eine positive Beeinflussung feststellbar. Bei einer S. lividans-Expression von Hirudin über ein pAX5a-Derivat wurde fast ausschließlich nicht-nativ gefaltetes Hirudin produziert. Die nicht-native Faltung war in einem Nativgel deutlich von der nativen, aktiven Form des Inhibitors zu unterscheiden. Durch Zusätze von reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG) zum Wachstumsmedium konnte der Anteil an nativem Hirudin erhöht werden. Die Zusätze beeinflussten aber stark die Gesamtausbeute des sekretierten Proteins. So wurden unter Zugabe von 1 mM GSH Ausbeuten von 200 mg/L Hirudin erreicht, davon 2 mg/L natives Protein. Die Gegenwart von verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG (Gesamtkonzentration 1mM Thiol) reduzierte die Hirudinproduktion auf 20 – 32 mg/L, darunter war kein erkennbarer Anteil an nativem Hirudin. Ein Zusatz von gleichen Verhältnissen von GSH und GSSG in höherer Konzentration (10 mM) resultierte in einer Steigerung des Anteils an nativem Inhibitor auf 14 %, die Gesamtausbeute an Hirudin sinkt aber deutlich (15 mg/L insgesamt, 2 mg/L natives Protein). Die Oxidoreduktase Thioredoxin wurde ebenfalls über ein pAX5a-Derivat in S. lividans-Kultivierungen mit einer Ausbeute von 65 mg/L gewonnen. Eine Coexpression von Thioredoxin und Hirudin über ein bicistronisches Gen in einem pAX5a-Derivat resultierte in einer Proteinproduktion von 4 mg/L Thioredoxin und 20 mg/L Hirudin. Obwohl ein Verhältnis von 0,2:1 Moläquivalenten (Thioredoxin:Hirudin) in den in vitro-Rückfaltungen zu 100 % nativ gefaltetem Inhibitor führte, war in den Kultivierungen kein positiver Einfluß des Thioredoxins auf die Hirudinfaltung erkennbar. Die Expression von Thioredoxin setzte zeitlich sehr viel früher als die Hirudin-Expression. Die Produktion von Hirudin über einen integrativen Vektor erzielte 600 - 700 mg/L Protein. Wie in anderen Hirudinkultivierungen ohne Thiolzusatz wurde Hirudin ausschließlich in der inaktiven, nicht-nativen Struktur produziert. Kultivierungen der mit dem integrativen Thioredoxin-Vektor infizierten S. lividans-Zellen erzielten dagegen kein Protein. Die Coexpression von Hirudin und Thioredoxin scheiterte an dem nicht zu generierenden, bicistronischen integrativen Vektor. Um die Isomeraseaktivität des Thioredoxins zu erhöhen und somit eine größere Beeinflussung der Hirudinfaltung zu erzielen, wurden Thioredoxinmutanten hergestellt. Die redoxaktiven CXXC-Zentren der generierten Thioredoxine enthalten die Aminosäuresequenzen der CXXC-Motive von E. coli DsbA und DsbC und humanem PDI. Die Expression aller Mutanten gelang in zwei verschiedenen Medien. Eine Isolierung und Anwendung der gereinigten Mutanten in der Hirudinfaltung wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt. Die Konstrukte stehen für weitere Arbeiten zur Verfügung. In vergleichenden Expressionen mit fünf verschiedenen Signalsequenzen wurden sowohl das homologe Streptomyces-Protein Tendamistat als auch das heterologe Hirudin über jeweils alle Signalpeptide exprimiert. Tendamistat wurde schon zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase exprimiert Innerhalb der verschiedenen Kultivierungen wurden unterschiedlich hohe Expressionswerte erreicht. Eine ausgeprägte Anreicherung von Vorläufer-Proteinen in der Zelle fand nicht statt. Neben dem vorwiegend nativ prozessierten Tendamiastat zeigte eine Analyse der Massendaten eine teilweise falsche Prozessierung der AxeA-, CelB- und SnpA-Signalpeptide. Hirudin konnte ebenfalls über alle fünf Signalpeptide exprimiert werden. Dabei wurde fast quantitativ nicht-nativ gefaltetes Hirudin sekretiert. Die Höhe der Expression über die verschiedenen Signalpeptiden war unterschiedlich hoch, wobei die Unterschiede geringer als bei der Tendamistat-Expression waren. Die Massenanalytik belegte, dass die Prozessierung des heterologen Hirudins wesentlich uneinheitlicher erfolgte als die Prozessierung des homologen Tendamistats. Ein Zusammenhang zwischen der Expressionshöhe beider Proteine und verschiedener Strukturmerkmale der Signalpeptide konnte nicht festgestellt werden. So wurde die in der Literatur aufgestellte These, dass in der n-Domäne mindestens zwei Ladungen enthalten sein müssen, in dieser Arbeit nicht bestätigt. Weder die Struktur noch die unterschiedliche Ladung der n-Domäne der Signalpeptide zeigten einen eindeutigen Zusammenhang mit der Expressionshöhe der Proteine. Auch eine Verknüpfung zwischen der Länge der h-Domäne und der Expressionshöhe konnte weder für die Tendamistat- noch für die Hirudinexpression erstellt werden. Die Positionierung von Glutamin an Position –2 innerhalb der c-Domäne schien in der Tendamistatexpression bezüglich der Proteinausbeute von Vorteil zu sein. Bei der Expression von Hirudin wurde ein ähnlicher Trend nicht gefunden. Die Proteinproduktion über ein Signalpeptid mit enthaltenem TTALeu-Codon war entgegen Literaturaussagen möglich und verminderte - wie in der Hirudinexpression gezeigt - nicht automatisch die Expressionshöhe. Bei den Tendamistatkultivierungen wurde dieser Einfluss jedoch deutlich. Theoretische Betrachtungen zur Prozessierung anhand von Rechenmodellen waren hilfreich, um Beobachtungen zu erklären oder zu deuten. So wurde eine Erklärung der zusätzlichen falschen Prozessierung der Sigalpeptide vom homologen und auch vom heterologen Protein über theoretische Modelle wie z. B. eine Schnittstellenberechnung teilweise möglich. Die Überlegungen zum Transmembran-Bereich der Signalpeptide zeigen im Vergleich der Berechnungen für Tendamisitat und Hirudin, dass die Ladung des N-Terminus des anhängenden Proteins ein Rolle bei die Positionierung des Signalpaptids innerhalb der Membran spielt und somit auch für die Präsentation der Schnittstelle und eine erfolgreiche Prozessierung verantwortlich ist. Die bisher verfügbaren Literaturdaten lassen darauf schließen, dass es allgemeine Richtlinien in Bezug auf Aminosäurezusammensetzung, sowie Ladung und Länge der Signalpeptide gibt, deren Mißachtung eine Verringerung der Expressionshöhe von Proteinen bewirken. Diese Richtlinien scheinen aber hauptsächlich bei einzeln eingefügten Mutationen zu bestehen. Werden, wie in dieser Arbeit vorgestellt, ganze Signalpeptide ausgetauscht und die resultierende Expression beobachtet, können viele dieser Vorgaben nicht verifiziert werden oder stimmen nur in Einzelfällen überein. Trotzdem zeigt diese Arbeit, dass theoretische Betrachtungen für Vorhersagen zur Proteinexpression unabdingbar sind.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
A new experimental setup, for pump-probe fs DFWM measurements, which is based on a femtosecond laser system, has been constructed. It allows for the investigation of molecular species in the gas phase at different temperatures, from ~30 K in a seeded supersonic jet up to ~500 K in a heat-pipe oven. In comparison to other RCS methods the employed fs DFWM technique is less complicated and gives much higher signal-to-noise ratio [BFZ86, FeZ95a, CKS89, CCH90, HCF91, WRM02, Rie02]. A general computer code for the simulation of fs DFWM spectra of nonrigid asymmetric top molecules has been developed. This new DFWM code in combination with a non-linear fitting routine allows one to determine rotational and centrifugal distortion constants and obtain information on the polarizability tensor components from the experimental spectra. Fs DFWM spectroscopy was successfully applied to the medium-sized molecules benzene and benzene-d6 in a gas cell and in a supersonic jet. The spectrum from a seeded expansion has been measured up to delay time of 3.9 ns (restricted by the length of the delay stage) with excellent signal-to-noise ratio (102-103). In that way 87 and 72 J-type transients have been recorded for benzene and benzene-d6, correspondingly. A relative accuracy on the order of 10-5 has been achieved for the rotational constant. From the room temperature experiments, precise values of centrifugal distortion constants DJ and DJK have been extracted. The literature data for cyclohexane have been revised and a new precise rotational constant B0 has been obtained, which is (+5.5 MHz) shifted from the one reported in the former Raman investigation by Peters et al. [PWW73]. Additionally, high-level ab initio calculations of cyclohexane have been carried out using a large number of basis sets at several levels of theory. In particular, the vibrational averaging effects have been examined in order to critically compare the experimentally determined and theoretically evaluated rotational constants. The contribution of highly symmetric vibrational modes to vibrational averaging effects was clarified. More structural information could be obtained from fs DFWM measurements of asymmetric top species, since different type of rotational recurrences can appear, and all three rotational constants (A, B, C) can be extracted. On the other hand the analysis of the asymmetric top spectra is no longer trivial. In fact the simple formula for rotational recurrence periods of symmetric top species (Tab. 2.1) can not be applied to asymmetric top molecules. Thus, in order to extract high-resolution data for asymmetric species, a complete fitting of the experimental spectra is necessary. The fs DFWM and (1+2') PPI method have been applied to the asymmetric top molecules pyridine in the ground (S0) and pDFB in the S0 and electronically excited (S1) states. By fitting the measured fs DFWM spectra the rotational and centrifugal distortion constants have been extracted with good precision and the value of the parametrized polarizability angle of pDFB was obtained. In this work, the first application of fs DFWM spectroscopy to a molecular cluster has been reported. Also, the chemical equilibrium between monomeric and dimeric species was studied. In particular formic and acetic acid have been investigated in a gas cell and in a supersonic expansion. Many spectral features have been observed and analized in the fs DFWM spectrum of formic acid vapor in a gas cell at room temperature. Most of them were attributed to rotational recurrences of the formic acid monomer, but also spectral feature originating from the formic acid dimer of O-H×××O/O×××H-O type have been detected and analyzed. From the fitted simulation, the rotational and centrifugal distortion constants, and parametrized polarizability angle were extracted for the dimeric structure of O-H×××O/O×××HO type. With the assumption of unperturbed monomers a center-of-mass distance of R = 2.990 ± 0.001 Å for the monomers within the dimer has been calculated from the spectroscopic results. This distance is 0.028 Å smaller than that reported from electron diffraction [ABM69]. Thus, the centers-of-mass distance was assigned as the main point of disagreement between results of fs DFWM and electron diffraction experiments. In contrast to formic acid, acetic acid shows strong recurrences from dimeric species even in the fs DFWM spectra at room temperature. This is explained in terms of different symmetry of the moments-of-inertia tensor, which modulates the intensity of RRs (the fs DFWM signal is in general stronger from symmetric species). Due to the symmetric nature of the acetic acid dimer, only the sum (B+C) of the rotational constants has been extracted. The changes of geometrical parameters upon dimer formation have been analyzed for, both, formic and acetic acid. A heat-pipe oven has been used in order to overcome the main drawback of fs DFWM spectroscopy – the square dependence of the signal intensity on the sample number density. Two-ring molecules (cyclohexylbenzene, para-cyclohexylaniline and nicotine) with low vapor pressure (<0.1 mbar) at room temperature have been investigated. From the analysis of the experimental and ab-initio results for CHB and pCHA a nearly perpendicular conformation of the aromatic vs. cyclohexane ring for both system is inferred. The enlargement of the benzene ring of CHB in the electronically excited state (S1) has been found to cause the smaller rotational constants in S1. This conclusion has been drawn from the comparison of the ground and electronically excited state experimental rotational constants in combination with ab-initio calculations. The extraction of precise structural information for nicotine was not possible due to it weak fs DFWM signal. However, the fact that fs DFWM technique can be applied to conformational analysis of molecular species in an equilibrium mixture opens other applications for this kind of spectroscopy. In general the results obtained in this work show that the fs DFWM technique, being an experimental implementation of RCS, provides one with an important tool for structural analysis of molecular species in the gas phase in particular for the species to which microwave spectroscopy can not be applied. It gives spectra with excellent signal-to-noise ratio even at low number density samples expanded in a seeded supersonic jet. It provides an alternative and innovative approach towards rotational Raman spectroscopy of large polyatomic molecules applicable under various experimental conditions (broad temperature and pressure range). With the introduction of femtosecond (10-15s) laser pulses (usually picosecond (10-12s) laser pulses were used in RCS) an improvement in time-resolution and therefore in precision for the rotational constants by more than one order of magnitude has been achieved. Molecular systems in the ground electronic state without permanent dipole moment and chromophore can be studied with high precision, providing thereby molecular benchmark systems for the electronic structure theory. As has been shown, the study of molecular clusters by fs DFWM spectroscopy is possible, but its potential are restricted by the square dependence of the fs DFWM signal from the sample number density, which is even more important for supersonic jet expansions. Here, the application of near-resonant and resonant FWM schemes should help in order to compensate for the low sample concentration. With the introduction of the heat pipe oven for fs DFWM experiments, the investigation of large nonvolatile molecules under equilibrium conditions is possible now. In our laboratory the first results on the structural analysis of different conformers of pyrrolidine in the gas phase have been obtained [MaR04]. This method can have even more prospects for the structural investigations of large molecular species in combination with new non-thermal gas phase sources for nonvolatile molecules, like laser desorption [CTL89], laser oblation [MHL83], electrospray [FMM90], laser induced liquid beam ion desorption [KAB96, Sob00] etc. A very recent application of the fs DFWM technique is the investigation of the influence of strong laser fields on molecular gas phase sample, which could range from active alignment [PPB03] over molecular deformation to field ionization [CSD03]. In regards to future development in fs DFWM spectroscopy for more complex molecules one has to take into account, how large amplitude motions such as the van der Waals vibrations or internal rotation (see section 6.4.2) affect the rotational coherences. In any case, femtosecond Degenerate Four-Wave Mixing as experimental implementation of Rotational Coherence Spectroscopy can be considered as an innovative, developing, and powerful method for the structural investigation of the molecular species, which are hard to study by classical frequency-resolved spectroscopy [FeZ95a, Dan01, Rie02].
Nitric oxide (NO) represents a short-lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from a NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in the human keratinocyte cell line HaCaT. NO, serum, growth factors and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in murine skin, but rapidly down-regulated upon injury. The down-regulation appeared to be transient, as p68 protein expression increased again after the inflammatory phase of repair. However, p68 protein expression did not completely disappear during wound inflammation, as immunohistochemistry and cell fractiona tion analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. In line, cultured human (HaCaT) and murine (PAM 212) keratinocyte cell lines showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the keratinocytes. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participates in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA (siRNA) markedly attenuated serum-induced proliferation and VEGF expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
The detailed mechanism of the 20 S proteasome from Thermoplasma acidophilum is unknown. Substrates are degraded processively to small fragments without the release of intermediates, but the basis for this unique degradation mode remains obscure. The proteasome is a molecular machine, but how the different nanocompartments interplay and whether more than one substrate can be treated simultaneously has not been elucidated yet. To address these questions we had to disable the functionality of one aperture in order to dissect whether the other pore can compensate for the loss. As it is challenging to introduce mutations solely around one pore aperture of the highly symmetrical construct, we chose a novel approach by unique orientation of the proteasome at interfaces. For this purpose we purified recombinant 20 S proteasomes, where hexahistidine tags were fused either around the entrances or at the sides. According to electron microscopic studies we immobilized these constructs uniformly either end-on or side-on at metal-chelating interfaces (lipid vesicles, lipid monolayers and self-assembled thiol monolayers). Degradation of small fluorogenic peptides and large proteins like casein was analyzed. Small substrates were degraded with comparable activity by free and immobilized proteasomes, irrespective of their orientation. Thus it can be assumed that peptides can pass the sealed entrance of the 'dead-end' proteasome. However, larger substrates like fluorescently labeled casein were processed near the temperature optimum by side-on immobilized and soluble proteasomes with threefold activity compared to end-on immobilized proteasomes. Hence it can be concluded that one pore is sufficient for substrate entry and product release. In other words, the pore and antechamber can fulfil a triple function in the import and unwinding of substrates and the egress of products. With means of surface plasmon resonance the exact substrate/proteasome stoichiometry could be determined to ~1 for 'dead-end' proteasomes and ~2 for side-on immobilized (active and inactive) proteasomes. Most importantly, a fit with the Hill equation revealed positive cooperativity for side-on immobilized (Hill coefficient ~2) in contrast to end-on immobilized proteasomes (Hill coefficient ~1). Thus in case of soluble proteasomes two substrates bind presumably in opposite antechambers with positive cooperativity. The off-rate of casein as substrate is twofold for the active side-on immobilized proteasome in comparison to the end-on immobilized proteasome. The exact 2:1 stoichiometry of the off-rates equals the ratio of exit pathways amenable in case of side-on orientated versus 'dead-end' immobilized proteasomes. Thus crevices along the cylindrical body of the 20 S proteasome seem not to participate in the egress of small products. An inactive proteasome mutant displays a concentration-dependent off-kinetic against casein. Accordingly, the off-rate of the bisubstrate:proteasome complex can be attributed around half the value of the monosubstrate:proteasome complex. Consequently, substrates exit the inactive proteasome via the route of access due to obstruction of the trans side with an entering substrate. Hence the active proteasomes have to chop substrates down to small fragments prior to release through both pores. Thus the processive degradation mode might result from positive binding cooperativity. The on-rate constants for casein suggested that substrate association represents a two-step process comprising a rate-limiting translocation step and a fast binding step. As fluorescence cross-correlation revealed that two substrates can be co-localized in the proteasome and bind successively with increasing affinity (KD,1 = 8 µM versus KD,2 = 700 nM), an allosteric transition in the proteasome can be assumed. Combining our results with the data from other research groups led to a mechanistic model for the 20 S proteasome. Accordingly, the first substrate undergoes a slow translocation step, binds in the antechamber and diffuses subsequently to the catalytic centers, where it is degraded. By switching on the catalytic activity, the pores at both termini are dilated via conformational changes. Hence entry of the second substrate into the proteasome is facilitated due to omission of the rate-determining translocation step. The second substrate is either accommodated in the antechamber before it is processed (alternating degradation) or, most probably, is directly threaded into the central cavity (simultaneous degradation). As effusing peptides compete with entering proteins for binding in the antechamber, the pores are kept in an open state. After finishing digestion the pores are closed and a new degradation cycle can be reinitiated. In summary, substrate association with the proteasome underlies an ordered alternating binding mechanism in contrast to the random mode of degradation. Thus the two-stroke engine offers the advantage of speeding up degradation without enhancing complexity.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Schichten V/Al-Intermetallischer Phasen und Schichten aus V(Al) (Schichtdicken 150- 300 nm) wurden durch Interdiffusion von V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten bei 400-800°C im Vakuum bei 3 x 10-8 mbar hergestellt. Des Weiteren wurden V5Al8-Schichten durch Sputtern einer V5Al8-Legierung erzeugt. Die Gesamtstöchiometrie der Schichten lag zwischen Al0,86V0,14 und Al0,19V0,81. Als Substrat dienten einkristalline (012) Saphirwafer. Die V/Al-Intermetallischen Phasen und V(Al) wurden im RTP-System bei 600-1250°C mit NH 3 umgesetzt. Zum Vergleich der Reaktivität wurden die V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten auch ohne vorherige Vakuumtemperung in NH3 getempert. Die Proben wurden mittels XRD, SNMS, TEM/EFTEM, ESCA, XRR und AFM untersucht. Die V/Al-Mehrfachschichten besaßen eine starke Welligkeit, die von der starken Al-Schichtdickenschwankung herrührte. Trotz dieser Welligkeit zeigten die V- und Al-Schichten der V/Al-Mehrfachschicht eine ausgeprägte Textur. Die V-Schichten waren (110) und die Al-Schichten (111) texturiert. Die Bildung von (112) texturiertem Al3V erfolgte bereits bei 400°C, die Bildung von (110) texturiertem V 5Al8 und V(Al) bei 700°C. In der Nähe der Oberfläche durchmischten sich die V- und Al-Schichten aufgrund von O- und C-Einlagerung während der Vakuumtemperung nicht vollständig, und man beobachtete die Bildung von V-Oxiden. Je größer der V-Gehalt der Intermetallischen Verbindung bzw. V(Al), desto größer war die Reaktivität gegenüber Sauerstoff. Bei der Nitridierung der durch Interdiffusion gewonnen Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 beobachtete man die Bildung von (001) texturiertem AlN an der Oberfläche. Durch die Nitridierung verarmte die Intermetallische Phase an Aluminium und es bildeten sich die V-reicheren Intermetallischen Verbindungen. Weitere Nitridierung führte zur Bildung von (001) texturiertem V2N. Bei der Nitridierung von V0,81(Al)0,19 bildete sich zunächst V(Al)(N), das bei weiterer Nitridierung zunächst in V2N und schließlich in VN und AlN überging. Das Reaktionsverhalten der Intermetallischen Phasen und der V(Al)-Phase stimmte weitestgehend mit dem von Yong Du et al. berechneten ternären Al/V/N-Phasendiagramm überein. Bei der Nitridierung von V0,61(Al)0,39 beobachtete man jedoch ebenfalls die Bildung von V2N. Dies widerspricht dem berechneten V/Al/N-Phasendiagramm, nachdem sich bei dieser Zusammensetzung auch AlN bilden sollte. Möglicherweise ist das Zweiphasengebiet V(Al)(N) + V2N breiter. Die Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 zeigten im Vergleich zu reinem Vanadium eine stark verminderte Reaktivität gegenüber NH3. Dies ist auf die Passivierung der Oberfläche durch die AlN-Bildung zurückzuführen. Die ebenfalls schwächere Reaktivität der V(Al)-Phase lässt sich mit der geringen Löslichkeit an Stickstoff in V(Al) und der sehr wahrscheinlich höheren Aktivierungsenergie für die V2N-Bildung erklären. Die Reaktivität der V/Al-Mehrfachschichten war deutlich größer als die der Intermetallischen Phasen. Hierfür ist mit Sicherheit der höhere Anteil an Korngrenzendiffusion verantwortlich. Zum anderen könnte Vanadium die AlN-Bildung katalysieren. Bei der direkten Nitridierung wurde die oberste V-Schicht zu einer VN-Schicht umgesetzt. Die Nitridierung ist also nahe der Oberfläche schneller als die Interdiffusion der Metalle. In Richtung der Oberfläche beobachtete man eine stark ansteigende Al-Konzentration, wofür die im Vergleich zu VN höhere Freie Enthalpie von AlN verantwortlich ist. Durch das Sputtern einer V5Al8-Legierung konnte das Problem der Oxidbildung bei der Interdiffusion umgangen werden. Eine dünne Aluminiumoxidschicht bildete sich jedoch bereits schon bei der Lagerung an Luft. Die Reaktivität der gesputterten V5Al8-Schichten unterschied sich nicht wesentlich von der interdiffundierter V/Al-Mehrfachschichten vergleichbarer Stöchiometrie. Tiefenprofilanalysen an nitridierten V5Al8-Schichten machten deutlich, dass zwischen 600 und 900°C eine bemerkenswerte Menge an Sauerstoff in die AlN-Schicht eingebaut wurde. Ab 900°C stieg die Dicke der Aluminiumoxinitridschicht stark an. Eine weitere Temperaturerhöhung auf 1250°C führte zu keiner sign ifikanten Zunahme der AlN-Schichtdicke, jedoch zu einer starken Reduktion des O-Gehalts im AlN. Gleichzeitig beobachtete man bei 1250°C eine partielle Ablösung der AlN-Schicht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen sind hochspezialisierte Zellen des Immunsystems, die durch Sekretion der Serin-Protease Granzym B (GrB) und des membranolytischen Proteins Perforin Virusinfizierte, körperfremde oder auch Tumorzellen durch Induktion von apoptotischem Zelltod eliminieren. Während Perforin für die Aufnahme von Granzym B in Zielzellen verantwortlich ist, wirkt Granzym B im Zytosol als aktive Effektor-Caspase und spaltet Caspase-3 und andere zelluläre Caspasen sowie verschiedene zentrale Caspasen-Substrate. Granzym B aktiviert damit wie Caspase-3 Apoptose-Signalwege am unteren Effektorende und umgeht daher die meisten Kontrollmechanismen, die in Tumorzellen häufig dereguliert sind und zur Resistenz gegenüber klassischer Chemo- und Strahlentherapie führen. Beide Proteasen stellen damit vielversprechende Enzymaktivitäten für die Verwendung als Effektorfunktion in Tumorzell-spezifischen zytotoxischen Fusionsproteinen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Formen von Granzym B und Caspase-3 hergestellt und daraufhin untersucht, ob beide Enzyme mit dem ErbB2-spezifischen "single chain" Antikörper scFv (FRP5) als Tumorzell-spezifischer Zellbindungsdomäne fusioniert werden können, ohne dadurch die Faltung der Proteasen zu verhindern, um eine gezielte Applikation in Tumorzellen und Eliminierung der Zellen durch Apoptose zu ermöglichen. Die Herstellung von Granzym B als rekombinantes Protein im präparativen Maßstab war bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte humanes aktives Granzym B in der Hefe Pichia pastoris mit Ausbeuten von 1 bis 4 mg/l Kultur exprimiert werden. Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurde ein in vitro Assays etabliert, bei dem rekombinante Procaspase-3 als Substrat für Granzym B eingesetzt wurde. Nach intrazellulärer Applikation mit einem synthetischen Transduktionsreagens induziert das gereinigte Protein Apoptose in HeLa Zellen. Wie für endogenes Granzym B in der Literatur beschrieben, wird rekombinantes Granzym B aus Pichia pastoris sehr schnell in HeLa Zellen aufgenommen, lokalisiert aber in vesikulären Strukturen, in denen die enzymatische Aktivität eingeschlossen ist. Aus verschiedenen Expressionskulturen wurden jedoch zwei unterschiedliche Proteine isoliert, die bei vergleichbarer molarer Masse und enzymatischer Aktivität in Zellen aufgenommen wurden bzw. nicht internalisierten, was darauf hinweist, daß eine posttranslationale Modifikation der Protease für die Bindung von Granzym B an Zielzellen verantwortlich ist. Während für die Freisetzung von Granzym B aus den Membranvesikeln und Induktion von Apoptose Perforin erforderlich ist, konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, daß Kulturen verschiedener etablierter Tumorzellinien nach Behandlung mit Granzym B auch in Abwesenheit von Perforin-Aktivität auffallende morphologische Veränderungen zeigen, die mit dem partiellen Verlust des Kontakts zum Kultursubstrat verbunden sind. Dies deutet darauf hin, daß Granzym B auch extrazellulär auf Zellen einwirkt, indem es Komponenten der extrazellulären Matrix spaltet, und so indirekt Apoptose durch Anoikis induziert. Dieser Effekt ist jedoch für eine mögliche therapeutische Verwendung von Granzym B nicht von Bedeutung, da relativ hohe Proteinkonzentrationen erforderlich sind. Um Granzym B selektiv gegen Tumorzellen zu richten, wurden verschiedene Fusionen mit dem "single chain" Antikörper scFv(FRP5) sowie einer bakteriellen Translokationsdomäne von Exotoxin A oder Diphtherietoxin konstruiert und in E. coli oder Pichia pastoris exprimiert. Während verschiedene in E. coli hergestellte Fusionsproteine nicht enzymatisch aktiv waren, konnte im Überstand einer Pichia Expressionskultur volle-Länge GrB-scFv(FRP5) sowie Granzym B Aktivität nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war allerdings so gering, daß eine präparative Isolierung nicht möglich war. Es konnte damit aber gezeigt werden, daß die Fusion heterologer Proteindomänen an den C-Terminus von Granzym B unter Erhalt der enzymatischen Aktivität prinzipiell möglich ist, während zusätzliche Peptidsequenzen am N-Terminus der Protease zumindest partiell zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen. Aktive Caspase-3 besteht aus zwei Peptiden p12 und p17, die im aktiven Enzym ein Tetramer (p12 p17)2 bilden. Um Caspase-3 selektiv in Tumorzellen zu applizieren, wurden ebenfalls Möglichkeiten untersucht, eine der beiden Untereinheiten mit dem scFv(FRP5) als Tumorzell-spezifische Zellbindungsdomäne zu fusionieren. Während aus den beiden separat in E. coli exprimierten p12 und p17 Untereinheiten durch gemeinsame Rückfaltung enzymatisch aktive Caspase-3 rekonstituiert werden konnte, führte die Fusion heterologer Proteindomänen an den N- und C-Terminus der p12 Untereinheit sowie an den C-Terminus der p17 Untereinheit zum Verlust der enzymatischen Aktivität, wahrscheinlich aufgrund der Verhinderung der korrekten Faltung des Protease-Tetramers. Dagegen konnte an den N-Terminus der p17 Untereinheit eine bakterielle Translokationsdomäne unter Erhalt der enzymatischen Aktivität fusioniert werden; ein entsprechendes Konstrukt, das zusätzlich den "single chain" Antikörper scFv(FRP5) enthielt, wurde aber in E. coli vollständig degradiert. Nachdem die Idee, Granzym B oder aktive Caspase-3 zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen für therapeutische Zwecke einzusetzen, bereits seit längerem diskutiert wird, es jedoch bisher praktisch nicht möglich war, entsprechende rekombinante Fusionsproteine in funktionaler Form herzustellen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige grundlegende Informationen, wie die weitere Entwicklung solcher Moleküle erfolgreich durchgeführt werden könnte.
The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyzes ATP to energize the transport of antigenic peptides from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum. TAP forms a heterodimeric complex composed of TAP1 and TAP2 (ABCB2/3). Both subunits contain a hydrophobic transmembrane domain and a hydrophilic nucleotide-binding domain. The aim of this work was to study the ATP hydrolysis event of the TAP complex and gain further insights into the mechanism of peptide transport process. To analyze ATP hydrolysis of each subunit I developed a method of trapping 8- azido-nucleotides to TAP in the presence of phosphate transition state analogs followed by photocross-linking, immunoprecipitation, and high-resolution SDS-PAGE. Strikingly, trapping of both TAP subunits by beryllium fluoride is peptide-specific. The peptide concentration required for half-maximal trapping is identical for TAP1 and TAP2 and directly correlates with the peptide-binding affinity. Only background levels of trapping were observed for low affinity peptides or in the presence of the herpes simplex viral protein ICP47, which specifically blocks peptide binding to TAP. Importantly, the peptideinduced trapped state is reached after ATP hydrolysis and not in a backward reaction of ADP binding and trapping. In the trapped state, TAP can neither bind nor exchange nucleotides, whereas peptide binding is not affected. In summary, these data support the model that peptide binding induces a conformation that triggers ATP hydrolysis in both subunits of the TAP complex within the catalytic cycle. The role of the ABC signature motif (C-loop) on the functional non-equivalence of the NBDs was investigated. The C-loops of TAP transporter contain a canonical C-loop (LSGGQ) for TAP1 and a degenerated ABC signature motif (LAAGQ) for TAP2. Mutation of the leucine or glycine (LSGGQ) in TAP1 fully abolished peptide transport. TAP complexes with equivalent mutations in TAP2 showed however still residual peptide transport activity. To elucidate the origin of the asymmetry of the NBDs of TAP, we further examined TAP complexes with exchanged C-loops. Strikingly, the chimera with two canonical C-loops showed the highest transport rate whereas the chimera with two degenerated C-loops had the lowest transport rate, demonstrating that the ABC signature motifs control the peptide transport efficiency. All single-site mutants and chimeras showed similar activities in peptide or ATP binding, implying that these mutations affect the ATPase activity of TAP. In addition, these results prove that the serine of the C-loop is not essential for TAP function, but rather coordinates, together with other residues of the C-loop, the ATP hydrolysis in both nucleotide-binding sites. To study the coupling between the ATP binding/hydrolysis and the peptide binding, the putative catalytic bases of the TAP complex were mutated to generate the so-called EQ mutants. The mutations did not influence the peptide-binding ability. Dimerization of the NBDs of EQ mutants upon ATP binding does not alter the peptide binding property. At 27°C, both ATP and ADP could induce the loss of peptide-binding ability (Bmax) only in the variants bearing a mutated TAP2. Further studies are required to deduce at which stage in the catalytic cycle the peptide-binding site is affected. In addition, mutation of the putative catalytic base of both subunits showed a magnesium-dependent peptide transport activity, demonstrating these mutants did not abolish the ATP hydrolysis. Thus, the function of this acidic residue as the catalytic base is not likely to be universe for all ABC transporters.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Krebspatienten Tumorspezifische Gedächtnis T-Zellen im Verlauf einer Tumorerkrankung generiert und erhalten werden. Dies konnte sowohl für einen soliden Tumor, das Mammakarzinom, als auch für eine hämatologische Neoplasie, das Multiple Myelom, verifiziert werden. Dabei konnte zum ersten Mal belegt werden, dass im Verlauf einer MM-Erkrankung MUC-1 als autologes Tumor-assoziiertes Antigen immunologisch erkannt wird und zur Generierung von Gedächtnis T-Zellen mit einer Anreicherung im Knochenmark der Patienten führt. Weiterhin konnte eine Anreicherung TAA-spezifischer Gedächtnis T-Zellen innerhalb der EM Zellpopulation bei Mammakarzinom-Patientinnen demonstriert werden. Die Analyse der Funktionalität und Langlebigkeit von EM und CM T-Zellen im Hinblick auf ihre klinische Relevanz zeigte wesentliche Unterschiede zwischen beiden Gedächtniszell- Populationen. So war eine IFN-gamma Induktion und Proliferation in CM T-Zellen in stärkerem Ausmaß von einer zusätzlichen Costimulation abhängig verglichen zu EM T-Zellen. Außerdem fiel eine Apoptose-Induktion in CM stärker aus als in EM T-Zellen. Unterschiede in Funktion und Viabilität von CM und EM T-Zellen korrelierten dabei mit der Expression des Chemokinrezeptors CCR7. ELISpot-Analysen der Polarisierung induzierter TH-Antworten beim Mammakarzinom ergaben eine große Heterogenität zwischen den Patienten. So exhibierte ein Teil der Patienten dominante TH1-Antworten, während bei einem anderen Teil lediglich TH2- oder toleranzinduzierende IL-10-Antworten induziert werden konnten. Darüber hinaus traten auch gemischt-polarisierte TH-Antworten auf. Eine Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver und immunstimulatorischer Zytokine im Tumorgewebe, wobei die Zytokinprofile interindividuell stark schwankten und kein einheitliches Muster erkennen ließen. Interessanterweise bestand jedoch eine inverse Korrelation zwischen der Induktion einer TH1-Antwort im ELISpot und dem erhöhten Vorkommen immunsuppressiver Zytokine im autologen Tumorgewebe von Mammakarzinom-Patienten. Eine derartige Korrelation impliziert, dass das vorherrschende Milieu der Tumorumgebung bei einer tumorspezifischen Aktivierung einen Einfluss auf infiltrierende Dendritische Zellen und ihre nachfolgende Polarisierung von T-Zellantworten hat. Folglich könnte die Untersuchung eines breiten Spektrums an Zytokinen in der Tumor-Mikroumgebung zu relevanten Zeitpunkten einer Tumorentwicklung, einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Tumor-Immun Interaktionen liefern.
Zur Generierung der transmembranären elektrochemischen Ionengradienten kann in den Archaea die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin Lichtenergie in einen aktiven, auswärtsgerichteten Protonentransport konvertieren. In Vertebraten erlaubt die Aktivität der Na+, K+-ATPase den Aufbau von Ionengradienten, indem sie unter ATP-Hydrolyse Na+-Ionen aus der Zelle und K+-Ionen in die Zelle transportiert. Die molekularen Mechanismen, die es diesen Ionenpumpen ermöglicht, primär aktiven, gerichteten Ionentransport zu bewerkstelligen sind fein abgestimmten und ortsspezifischen Konformationsänderungen. Die Untersuchung der Dynamik und der Ortsspezifität der Konformationsgleichgewichte der Na+,K+-ATPase und des Bakteriorhodopsin, sowie eines homologen bakteriellen Proteins, sind Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Na+,K+-ATPase: Die Methode der Voltage-Clamp-Fluorometrie auf Basis zielgerichteter Fluoreszenzmarkierung erlaubte es Konformationsänderungen der Na+,K+-ATPase zeitaufgelöst und ortsspezifisch nachzuweisen und diese partiellen Reaktionen des Na+,K+-ATPase Reaktionszyklus zuzuordnen. Dazu wurden elektrophysiologische Messungen an heterolog exprimierter Na+,K+-ATPase durchgeführt, in der einzelne Cysteine in vermutlichen Reporter-Positionen im Bereich extrazellulär orientierter Schleifen eingebracht werden. Nach Fluoreszenzmarkierung mit TMRM bildete die Mutante N790C einen molekularen Sensorkomplex und reagierte auf K+-Zugabe und Spannungssprünge mit Änderungen in der Fluoreszenzintensität, welche durch Zugabe des spezifischen Na+,K+-ATPase Inhibitors Ouabain gehemmt werden konnten. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse erlauben - in situ unter physiologischen Bedingungen - erstmalig Einblicke in die molekularen Details der Konformationsänderungen der Na+,K+-ATPase. Bakteriorhodopsin: Spannungsklemme-Experimente an heterolog exprimiertem Bakteriorhodopsin ergaben Einblicke in die Regulation des Protonenpumpens durch das elektrochemische Membranpotential. Messungen am Wildtyp und den Mutanten D96N, D96G, F171C, F219L und der "Tripel"-Mutante BRD96G,F171C,F219L zeigten, dass das Protonenpumpen von Bakteriorhodopsin maßgeblich durch die Lebensdauer und Spannungsabhängigkeit des M-Intermediats geregelt wird und resultierten in einem Modell für die Erklärung effizienten, vektoriellen Transports auf der Grundlage fein abgestimmter Konformationsänderungen. Proteorhodopsin: Mit Hilfe zeitaufgelöster UV/VIS- und FT-IR-spektroskopischen Messungen, sowie Photostrom-Messungen an künstlichen Lipidmembranen und spannungsgeklemmten Xenopus-Oozyten - die Proteorhodopsin heterolog exprimierten - konnte gezeigt werden, dass Proteorhodopsin als eine pH-abhängige einwärts- oder auswärtsgerichtete Protonenpumpe fungieren kann. Dieses Verhalten steht im Gegensatz zu Bakteriorhodopsin, für das nur unidirektionaler Transport nachgewiesen werden konnte.
Ligands of Iron-Sulphur Cluster N2: In this work the ubiquinone reducing catalytic core of NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Y. lipolytica was studied by a series of point mutations replacing conserved histidines or arginines in the 49-kDa subunit. Although the missing 4th ligand of cluster N2 could not be found in the 49-kDa subunit of complex I, it was clearly demonstrated that iron-sulphur cluster N2 resides directly on the interface between the PSST and 49-kDa subunits. The results presented in this work show that residues in the 49-kDa subunit have strong influence on this redox centre and also on catalytic activity. The strong influence of Arg-141 and His-226 residues in 49-kDa subunit on this cluster can be deducted from complete loss of N2 signals in EPR spectra such as in case of mutants H226A and R141A. In the case of mutant H226M the EPR signal from cluster N2 was shifted and cluster N2 even lost the pH dependence of its redox midpoint potential and became more similar to the other so called 'isopotential' clusters. Specifically in the case of mutants R141M and R141K the characteristic signature of cluster N2 became undetectable in EPR spectra. However, specific dNADH:DBQ oxidoreductase activity that could be inhibited with the specific complex I inhibitors DQA and rotenone was not absolutely abolished but rather reduced. These reductions in complex I activity did not correspond to similar reductions in the specific EPR signal of cluster N2 as it was observed in the His-226 mutant series. No indications could be found that these mutations had modified the magnetic properties of cluster N2, resulting in different EPR spectra. From these observations it could be concluded that both mutants R141K and R141M virtually or entirely lack iron-sulphur cluster N2. The rates in complex I activity could be reconciled with electron transfer theory: After removal of a single redox centre in a chain, electron transfer rates are predicted to be still much faster than steady-state turnover of complex I. These results from mutants R141K, R141M and also the result from mutant H226M that protons are being pumped even if the redox midpoint potential of cluster N2 is not pH dependent questions the prominent role in the catalytic mechanism of complex I that has been ascribed to cluster N2. Histidine 91 and 95 were found to be absolutely essential for activity of complex I since in both mutants complex I was fully assembled and artificial NADH:HAR activity was parental whereas complex I specific dNADH:DBQ activity was abolished. The signal from cluster N2 in EPR spectra was parental for all His-91 and -95 mutants. Mutations at the C-terminal arginine 466 affected ubiquinone affinity and inhibitor sensitivity but also destabilised complex I. All these results provide further support for a high degree of structural conservation between the 49-kDa subunit of complex I and the large subunit of water soluble [NiFe] hydrogenases. Remodelling of Human Pathogenic 49-kDa Mutations in Y. lipolytica: Y. lipolytica has been proven a good system for studying complex I properties and thus also for studying defects that occur in humans. In this work pathogenic mutations in the 49-kDa subunit of complex I were recreated and studied. The P232Q mutant showed non-assembly of complex I and this is probably the cause why this mutation was lethal in patients. The mutants R231Q and S416P were parental for the content, artificial and also specific complex I activity, Km for DBQ and IC50 for DQA. From these results we can conclude that these two residues Arg-228 and Ser-413 in mammalian cells have specific structural importance for the 49-kDa subunit even if they are not directly involved in catalytic process.
Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung der Einsatzmöglichkeiten eines mikrostrukturierten Reaktorsystems in der heterogenen Katalyse. Hierzu wurde eine Reaktion herangezogen, welche typische Problemstellungen der heterogenen Katalyse abbildet. Zu diesen Problemen gehören Temperaturkontrolle, sichere Handhabung von explosiven Gasgemischen und das Erzielen von zufriedenstellenden Selektivitäten. Die Reaktion sollte außerdem bereits gut untersucht worden und die Prozessparameter aus der Literatur bekannt sein. Aus diesem Grund wurde die Partialoxidation von Ethen zu Ethenoxid an Silberkatalysatoren gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass die Reaktion in einem Mikrostrukturreaktorsystem sicher durchführbar ist. Vor allem wurde an einer ganzen Reihe von Beispielen veranschaulicht, dass eine herausragende Eigenschaft des Mikrostrukturreaktors seine inhärente Explosionssicherheit ist. Gasgemische, welche sich mitten im explosiven Gemischbereich befanden, konnten bei Drücken von 2 bis 20 bar und Temperaturen von 230 bis 310 °C sicher gehandhabt werden. So konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor sich dazu eignet Reaktionen mit explosiven Gasgemischen durchzuführen. Die Verwendung von Mikrostrukturreaktoren in der heterogenen Katalyse befindet sich noch im Anfangsstadium. Um Probleme bei der Übertragung von Katalysatorsystemen auf ein System mit Mikrostruktur zu vermeiden, erfolgte zunächst der Einsatz von Vollsilberkatalysatoren. Die Mikrostruktur wurde deshalb aus dem katalytisch aktiven Material selbst hergestellt. Die Herstellung wurde auf drei unterschiedliche Weisen (LIGA-, Ätz- und Sägeverfahren) durchgeführt. So konnte gezeigt werden, dass eine Kostenreduzierung bei der Darstellung von Mikrostrukturen möglich ist. Der Nachteil der Nutzung von Vollsilber war, dass sich deutlich schlechtere Selektivitäten bei der Partialoxidation von Ethen ergaben. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass mit dem Mikrostrukturreaktor die Selektivitäten für Vollsilber im Schnitt 10 % über denen für Rohrreaktorexperimenten bei gleichen Umsätzen lagen. Die effektive Wärmeabführung und die homogene Verteilung der Wärme über den Mikrostrukturreaktor scheinen eine Verbesserung der Selektivität zu erbringen. Kinetische Untersuchungen zeigten, dass sowohl durch Anheben des Partialdrucks von Ethen als auch von Sauerstoff eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden kann. Dabei wurde für Ethen eine formale Reaktionsordnung bei der Bildung von Ethenoxid von 0,53 gefunden, während sie für Sauerstoff 0,78 betrug. Mit diesen Untersuchungen wurde verdeutlicht, dass ein Erhöhen des Sauerstoffpartialdrucks einen positiven Einfluss auf die Selektivität hat. So konnte durch Anheben der Sauerstoffkonzentration von 5 %, wie es in industriellen Prozessen aus Sicherheitsgründen notwendig ist, auf bis zu 95 % eine Verbesserung der Selektivität von bis zu 15 % erzielt werden. Über diesen Sachverhalt wurde zwar bereits in der Literatur (16) berichtet, jedoch erfolgten die Untersuchungen hierfür unter Hochvakuumbedingungen. Der Mikrostrukturreaktor ermöglichte einen Nachweis dieses Phänomens auch unter Hochdruckbedingungen, wie sie für industrielle Reaktoren üblich sind. Damit konnte ein in der heterogenen Katalyse bekanntes Problem, nämlich die Übertragung von Erkenntnissen aus Ultrahochvakuumexperimenten auf Hochdruckbedingungen (pressure-gap), untersucht werden. Eine wissenschaftliche Prüfung, ob dem Ergebnis die gleichen Ursachen sowohl im Ultrahochvakuum als auch bei Hochdruckbedingungen zugrunde liegen, muss noch erfolgen. Es zeigte sich aber auch, dass durch eine Verweilzeiterhöhung keine weitere Verbesserung der Raum-Zeit-Ausbeute möglich ist. Vielmehr wurde klar, dass Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität mit längeren Verweilzeiten abnehmen. Als Grund hierfür konnte die Bildung von elementarem Kohlenstoff an der Silberoberfläche festgestellt werden. Aufgrund der Limitierung bei der Verweilzeit wurden maximale Umsätze von 24 % erzielt. Der Einsatz von 1,2-Dichlorethan als Oxidationsinhibitor für Vollsilber wurde ebenfalls untersucht. Dabei konnte die Selektivität auf bis zu 69 % gesteigert werden. Es erfolgte jedoch eine Einbuße an Aktivität von etwa 42 %. Es ist bekannt, dass die Oberflächenmorphologie von Silberkatalysatoren unter Reaktionsbedingungen starke Veränderungen erfährt. (68) Es wurde aufgezeigt, dass dies für die Oberfläche von mikrostrukturierten Silberfolien ebenfalls festzustellen ist. Dabei wurde gleichzeitig festgestellt, dass die Katalysatoren trotz unterschiedlicher Herstellungsmethoden und den daraus resultierenden unterschiedlichen Oberflächenmorphologien vergleichbare Aktivitäten aufweisen. Industriell verwendete Katalysatoren basieren auf alpha-Aluminiumoxid als Trägermaterial. Dabei wurde bereits seit vielen Jahren an Optimierungen des Katalysators gearbeitet. Durch das Einstellen der spezifischen Oberfläche und Partikelgröße des Silbers und den Einsatz von Alkali- und Erdalkalimetallen als Promotoren werden so Katalysatoren hergestellt, welche eine Selektivität von 80 % besitzen. Die Übertragung dieser Erkenntnisse auf ein Mikrostrukturreaktorsystem kann nicht ohne weiteres vorgenommen werden. Es wurden verschiedene Darstellungsmöglichkeiten für eine alpha-Aluminiumoxidschicht in einem Mikrostrukturreaktor untersucht. Dabei zeigte sich, dass nur die direkte Darstellung von alpha- Aluminiumoxid ohne Phasenumwandlung aus anderen Modifikationen erfolgversprechend ist. Eine Darstellung der Aluminiumoxidschicht durch Sol-Gel- oder CVD-Prozesse war nicht erfolgreich, da die für die Phasenumwandlung von gamma-Aluminiumoxid nach alpha-Aluminiumoxid notwendige Temperatur von 1100 °C die Ausbildung einer Eisenoxidschicht an der Oberfläche der mikrostrukturierten Edelstahlfolien zur Folge hatte. Diese eignete sich nicht als Träger. Alternativ wurde erfolgreich der Einsatz von aluminiumhaltigen Edelstählen untersucht. Diese bilden beim Ausheizen bei 1100 °C eine alpha-Aluminiumoxidschicht an der Oberfläche aus, welche mittels Sputtern mit Silber geträgert wurde. Katalytische Untersuchungen zeigten, dass mit dem Einsatz von alpha-Aluminiumoxidträgern eine Verbesserung der Selektivität im Vergleich zu Vollsilber von 17 % erreicht werden kann. Gleichzeitig konnte anhand eines Gegenüberstellens von katalytischen Daten mit TEM-Aufnahmen der Sputterschichten festgestellt werden, dass eine geschlossene Silberschicht an der Oberfläche notwendig ist, um eine zufriedenstellende Aktivität und Selektivität zu erzielen. Während bei Schichtdicken von 1 nm noch einzelne Silberinseln an der Oberfläche zu finden sind, liegt bei einer Schichtdicke von 5 nm eine fast geschlossene Silberschicht vor. Ein Anheben der Schichtdicke ergab keine weitere Verbesserung der Aktivität oder Selektivität. Dagegen ergab der Einsatz von 1,2-Dichlorethan eine weitere Steigerung der Selektivität auf 77 %. Industriell eingesetzte Rohrbündelreaktoren erreichen im Sauerstoffverfahren eine Selektivität von 80 %. Die hier erzielten 77 % Selektivität bei vergleichbaren Umsätzen zeigt, dass der Einsatz eines Mikrostrukturreaktors für die Synthese von Ethenoxid möglich ist, vor allem unter dem Gesichtspunkt, dass Potenzial für die Optimierung von Reaktoren und die Katalysatorpräparation besteht. Die Nutzung von Reaktionsbedingungen, wie Ethen in reinem Sauerstoff, und der daraus resultierenden Verbesserung für Aktivität und Selektivität, ermöglichen Raum-Zeit-Ausbeuten, die über denen von Industriereaktoren liegen. Ob Mikrostrukturreaktoren in industriellen Prozessen jemals eingesetzt werden, hängt allein von ökonomischen Faktoren ab. Dazu müsste die Selektivität über die bestehenden 80 % angehoben werden. Zur Zeit entfallen 80 % der Produktionskosten von Ethenoxid auf den Rohstoff Ethen, so dass jeder Prozentpunkt, um den die Selektivität angehoben werden könnte, eine deutliche Kosteneinsparung mit sich brächte und darüber entschiede, ob ein neuer Prozess eingeführt wird. Hierzu wäre es auch notwendig, die Kosten für die Produktion der Mikrostrukturreaktoren pro Volumeneinheit um mehrere Größenordnungen zu reduzieren. Außerdem müssten Lösungen entwickelt werden, welche die Peripherie des Reaktors betreffen, vor allem die Heizung und die Gasversorgung. Im Rahmen dieser Arbeit sollte überprüft werden, welche Leistungsfähigkeit ein Mikrostrukturreaktorprozess im Vergleich zu einem bestehenden Prozess besitzt. Es konnte dargestellt werden, dass Raum-Zeit-Ausbeuten über denen eines Industriereaktors erzielt werden können bei vergleichbareren Selektivitäten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor ein geeignetes Werkzeug ist, welches helfen kann, Reaktionen unter bisher nicht einfach zugänglichen Bedingungen durchzuführen.
Die Übergangsmetalle Vanadium und Niob wurden in einer neuartigen Thermowaage bzw. mit dem Rapid Thermal Processing (RTP) unter Verwendung von Ammoniak und Stickstoff als Prozessgas nitridiert. In der Thermowaage, die die in situ Aufzeichnung von Massenänderungen während der Reaktion möglich macht, wurde die Nitridierung hauptsächlich an pulverförmigen Proben durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass sowohl Temperatur- und Druckerhöhung, als auch eine Verlängerung der Temperzeit zu größeren Massenzunahmen führten. Die Bildung der unterschiedlichen Nitridphasen war aber allein von der Temperatur während des Versuches und dem verwendeten Prozessgas abhängig. Die detektierten Massenzunahmen bei der Erhöhung von Temperzeit und Druck wurden nur von der vermehrten Einlagerung von Stickstoff bzw. Sauerstoff in das Metall verursacht, die keine neue Phasenbildung zur Folge hatte. Sauerstoff wurde in allen getemperten Proben gefunden, was die Untersuchung von dünnen Schichten in der Thermowaage verhinderte, da aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehaltes die Schichten vollständig oxidierten. Der Sauerstoff wurde hauptsächlich von dem Glasreaktor geliefert. Ein dort abgelagerter Belag, der sich durch Korrosion der Edelstahlgasleitung gebildet hatte, wirkte vermutlich katalytisch. Aus diesem Grund war die Thermowaage in dieser Konfiguration nicht für Nitridierungsversuche geeignet und konnte ihren eigentlichen Zweck, die genaue Untersuchung des Reaktionsmechanismus mit Hilfe der Massenänderung und der anschließenden massenspektrometrischen Untersuchung des Prozessgases nach der Reaktion, nicht erfüllen. 200 nm und 500 nm Vanadium- und Niob-Schichten wurden im RTP nitridiert. Auch hier konnte man eine Bildung von Oxiden bzw. Oxynitriden beobachten, diese bildeten sich aber durch die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat in die Metallschicht, was anhand von SNMS- und TEM/EFTEM/EELS-Untersuchungen eindeutig belegt werden konnte. Um dieses Phänomen zu untersuchen wurden Schichten auch auf Saphir-Substrat, welches gegenüber der Ausdiffusion von Sauerstoff inert sein sollte, aufgebracht. Für die beiden verwendeten Metalle wurden unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Während bei den Vanadium-Schichten nur aus dem SiO2-Substrat Sauerstoff ausdiffundierte, wurde dies bei den Niob-Schichten bei beiden Substraten festgestellt. Die Temperatur während der Versuche (V: 600 und 700°C; Nb: 800°C) scheint also auch einen Einfluss auf die Ausdiffusion von Sauerstoff zu haben. Dabei zeigt Saphir eine etwas größere Temperatur-Stabilität als SiO2. Ein Einfluss des Prozessgases auf die Reaktion an der Grenzfläche Metall/Substrat konnte nicht nachgewiesen werden. Zwar kam es bei der Verwendung von Wasserstoff zur Bildung von mehr und sauerstoffreicheren Phasen, was dafür spricht, dass die Substrate stärker angegriffen werden, aber auch beim Einsatz von Inert-Gas (N2) wurde eine Ausdiffusion von Sauerstoff aus den Substraten beobachtet. Allerdings wirkte sich die Schichtdicke der Probe auf die Ausdiffusion von Sauerstoff und die Bildung der Oxid-Phase aus. Da von der Oberfläche der Schicht eindiffundierender Stickstoff die Diffusion von Sauerstoff behindert, kann Sauerstoff mit zunehmender Schichtdicke weiter in das Metall vordringen. Bei dünneren Schichten wird er eher aufgestaut und es bilden sich Oxide mit höherem Sauerstoffgehalt. Ein Einfluss der unterschiedlichen Herstellungsverfahren (Elektronenstrahlverdampfung / Magnetronsputtern) für die Ausgangsschichten auf die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat konnte, trotz der größeren Kristallinität der gesputterten Proben, nicht nachgewiesen werden.
Für bestimmte Gentherapiestrategien bieten sich retrovirale Vektoren auf Grund der stabilen Integration der von ihnen übertragenen genetische Information an. Mit bisher vorhandenen retro- und lentiviralen Vektorsystemen kann jedoch kein effizienter Gentransfer in ruhende primäre Zellen wie unstimulierte PBMC oder undifferenzierte Monozyten erreicht werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, retrovirale Vektorsysteme zu etablieren, die naive primäre Zellen effizient transduzieren können. Zunächst wurden HIV-1-Vektoren mit den Hüllproteinen (Env) des amphotropen MLV, des MLV-Klons 10A1, des felinen endogenen Retrovirus RD114 und des VSV sowie einem modifizierten GaLV-Env pseudotypisiert, um ihre Eignung für die Transduktion von primären T-Lymphozyten zu untersuchen. Mit diesen Vektoren konnten primäre stimulierte humane T-Lymphozyten mit ähnlichen Transduktionsraten von ca. 20% transduziert werden. Im Gegensatz dazu wurden mit MLV-Vektoren, die mit den gleichen Hüllproteinen pseudotypisiert waren, bei gleichem Transduktionsprotokoll untereinander deutlich unterschiedliche Transduktionsraten zwischen 1 - 45% erreicht. Dieser unerwartete Unterschied ist möglicherweise auf eine längere, dabei untereinander ähnliche Halbwertszeit der HIV- 1-abgeleiteten Vektoren zurückzuführen. Unstimulierte PBMC konnten allerdings unabhängig vom verwendeten Hüllprotein weder von den MLV- noch von den HIV-1-abgeleiteten Vektoren transduziert werden. Demgegenüber hatte sich in meiner vorangegangenen Diplomarbeit die Transduzierbarkeit ruhender humaner Zellen durch Vektoren angedeutet, die von dem akut pathogenen simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj1.9 abgeleitet waren. In der hier vorgestellten Arbeit zeigten die PBj-Vektoren, die nur im env-Gen eine Deletion aufwiesen, dass sie auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte GHOST-Indikatorzellen oder diploide Fibroblasten effizient und unabhängig von dem zur Pseudotypisierung verwendeten Hüllprotein transduzieren können. Die korrespondierenden HIV-1-Vektoren waren dazu nicht in der Lage. Auch PBj- und HIV-1-Vektoren, die egfp als Markergen transferieren, zeigten das gleiche Transduktionsverhalten. Die egfp-transferierenden SIVsmmPBj-Vektoren konnten schließlich im Unterschied zu den entsprechenden HIV-1-Vektoren auch frisch isolierte primäre humane Monozyten sehr effizient transduzieren. Mit Nef-deletierten Mutanten wurde schließlich gezeigt, dass die beschriebenen Fähigkeiten PBj-abgeleiteter Vektoren nicht vom viralen Nef-Protein abhängen, obwohl dieses regulatorische Gen die pathogenen Eigenschaften und die Replikationsfähigkeit von SIVsmmPBj-Viren bestimmt. Für alle mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren transduzierten Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit ferner die chromosomale Integration des Transfervektors gezeigt werden. Schließlich gelang die Konstruktion eines ersten 3-Plasmid-Vektorsystems, mit dem transduktionsfähige Vektorpartikel generiert werden können. Mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren steht somit ein neues retrovirales Vektorsystem zur Verfügung, mit dem auch ruhende primäre Zellen stabil genetisch modifiziert werden können. Durch die Erschließung dieser wichtigen Zielzellen werden die Perspektiven einer dauerhaften Gentherapie in vitro und in vivo beträchtlich erweitert.
An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Entwicklung von Methoden zur Konformationsanalyse supramolekularer Komplexe in Kraftfeldprogrammen
(2003)
Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde mit dem SUPRA-Algorithmus ein Verfahren zur Berechnung der Struktur Supramolekularer Komplexe programmiert und in das Kraftfeldprogramm MOMO implementiert. Bei der Konformationsanalyse Supramolekularer Komplexe ergibt sich das Problem, dass die Anzahl der notwendigen Rechenschritte mit der Größe der zu berechnenden Struktur, genauer mit der Anzahl vorhandener Torsionsfreiheitsgrade, exponentiell ansteigt. Dieses Problem wurde umgangen, indem die Rechnung in drei kleinere Abschnitte aufgeteilt wurde. Es werden nacheinander drei Konformationsanalysen durchgeführt. Zuerst erfolgt jeweils eine Konformationsanalyse für die beiden beteiligten Einzelmoleküle. Deren Strukturen dienen dann wiederum als Eingabe für die dritte, eigentliche Konformationsanalyse des Supramolekularen Komplexes. Ziel dieser Arbeit war dann unter anderem zu überprüfen, ob trotz der Vereinfachungen diese Vorgehensweise effiziente Ergebnisse liefert. Zu Beginn wurden Berechnungen für den Komplex Adenin-Uracil durchgeführt, die Resultate stimmten mit experimentell gefundenen Paarungsmustern (Watson-Crick, reverse Watson- Crick, Hoogsteen, reverse Hoogsteen) überein. Eine weitere Rechnung am Komplex Cytosin- Guanin fand als Ergebnis Watson-Crick- und reverse Watson-Crick-Paarung. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung des Ladungsmodells von Gasteiger und Marsili sowie der Wasserstoffbrücken-Potenzialfunktion von Vedani und Dunitz ohne Berücksichtigung der van-der-Waals-Wechselwirkungen erhalten. Diese Kraftfeldeinstellungen wurden im weiteren Verlauf der Arbeit als die optimalen Parameter für den SUPRA-Algorithmus beibehalten. Anschließend wurden zwei Komplexe fluormodifizierter Basenpaare berechnet, um die in einem RNA-Duplex experimentell aufgefundenen C-H...F-C-Brücken rechnerisch zu reproduzieren. Nur für eines der beiden Basenpaare konnte dieses Wasserstoffbrücken- Bindungsmuster erhalten werden, für das andere Dimer wurde die erwartete Struktur nicht gefunden. Es sollte deshalb der gesamte RNA-Duplex berechnet werden. Hierzu war das Programm MOMO nur sehr bedingt geeignet, und zwar sowohl was den Aufbau des Doppelstranges betraf als auch die Energie- und Geometrieberechnung. Trotz umfangreicher Versuche gelang es nicht, die Doppelhelixstruktur im Verlauf der Energieminimierung beizubehalten. Durch Anpassung der Kraftfeldparameter konnte aber eine stark aufgeweitete Helixstruktur berechnet werden, in welcher die modifizierten Basen nach dem experimentell gefundenen Muster gepaart waren. Außerdem wurde der SUPRA-Algorithmus anhand eines Dipyridon-Komplexes auf seine Fähigkeit getestet, Moleküle mit mehreren Torsionsfreiheitsgraden zu berechnen. Hier ergab sich wegen der konformationellen Flexibilität eine Rechenzeit von über drei Wochen. Das Ergebnis der Rechnung stimmte gut mit der experimentell gefundenen Struktur überein. Am Beispiel zweier Komplexe selbstkomplementärer Diketopiperazine sowie eines Komplexes aus N,N'-Di(tert-butyl)-melamin und 5,5-Dimethylbarbitursäure wurden Rechnungen von Komplexen aus mehr als zwei Molekülen durchgeführt. Es zeigte sich eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse mit den bekannten Kristallstrukturen. Als letztes wurden anhand zweier selbstkomplementärer Acetylhydrazon- und dreier Diketon- Diol-Komplexe fünf unbekannte Strukturen doppelt wasserstoffbrücken-gebundener Dimere vorhergesagt. Anschließend sollte jeweils die Kristallstruktur bestimmt und mit dem Ergebnis der Vorhersage verglichen werden. Im Fall der Diketon-Diol-Komplexe gelang bisher keine Züchtung eines entsprechenden Mischkristalls, sondern die beteiligten Komponenten kristallisierten einzeln aus. Bei den zwei Acetylhydrazonen dagegen konnten Kristalle erhalten werden. Eine der Kristallstrukturen wies das mit dem SUPRA-Algorithmus vorhergesagte Dimer auf. Im Verlauf der Arbeit zeigte sich des Öfteren, dass die gewählte Strategie, die Anzahl der Startstrukturen bei der Konformationsanalyse zu begrenzen, um ein exponentielles Ansteigen der Rechenschritte zu verhindern, erfolgreich war. Mehrmals fanden sich als Ergebnis der Rechnung Strukturen von komplexgebundenen Molekülen, die sich stark von der Startkonformation eines Einzelmoleküls unterschieden, so zum Beispiel im Falle des Dipyridon-Komplexes oder der Diketon-Diol-Komplexe. Für die Zukunft sind weitere Kristallisationsversuche der Acetylhydrazone geplant, um eventuelle Polymorphe aufzufinden, bei denen sich auch eine Übereinstimmung mit der zweiten vorhergesagten Struktur zeigt. Weiterhin ist beabsichtigt, die Packungsenergien der gefundenen Kristallstruktur sowie einer theoretischen Kristallstruktur, die in ihrem Wasserstoffbrückenbindungs-Muster der mit MOMO gemachten Vorhersage entspricht, zu berechnen und zu vergleichen. Durch Einführung verschiedener Liganden in das Acetylhydrazon und Vergleich der daraus resultierenden Packungsmuster sollen Regeln über die den Kristallisationsprozess bestimmenden Einflussfaktoren abgeleitet werden. Weiterhin soll eine Reihe von anderen Verbindungsklassen synthetisiert, strukturell untersucht und berechnet werden, um so weitere Vergleiche zwischen theoretischen Vorhersagen und Kristallstruktur anstellen zu können. Für das Programm MOMO wäre wünschenswert, den Multipol-Ansatz in die Vollversion zu integrieren, um eine exaktere Berechnung von Basenstapelungs- und anderen p-p- Wechselwirkungen zu erreichen. Darüber hinaus sollte eine Parametrisierung des von S. Monz verbesserten Abraham-Ladungsmodells vorgenommen werden. Beides würde zu einer Verbesserung der Beschreibung intermolekularer Wechselwirkungen führen, welche für den SUPRA-Algorithmus relevant sind.
Der Elektronentransfer von NADH zu Sauerstoff ist ein essentieller Bestandteil im Energiehaushalt der Zelle und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. Hohe Geschwindigkeit und Spezifität dieser Reaktionen sind dabei von großer Bedeutung. In der Atmungskette von Paracoccus denitrificans und Thermus thermophilus wird Sauerstoff durch Cytochrom c Oxidasen umgesetzt. Beide Enzymkomplexe erhalten die für diese Reaktion notwendigen Elektronen von einem Cytochrom c552 in einer sehr schnellen bimolekularen Reaktion bei hoher Selektivität für das Partnerprotein. Hauptziel dieser Arbeit war es, lösliche Module der elektronenakzeptierenden CuA-Domäne der Cytochrom c Oxidasen zu generieren, das Kupferzentrum zu rekonstituieren und die Proteine für Wechselwirkungsstudien mit den Cytochrom c-Partnern zugänglich zu machen. Die Charakterisierung der Elektronentransferreaktionen erfolgte durch stopped-flow Spektroskopie und ermöglichte die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten unter verschiedenen Ionenstärkebedingungen. Ein Vergleich zwischen dem mesophilen Reaktionspaar aus P. denitrificans mit dem thermophilen aus T. thermophilus zeigte die unterschiedlichen Interaktionsmechanismen auf. Während die Reaktion in T. thermophilus weitgehend auf Ladungsinteraktionen verzichtet, wurde für die Reaktanden aus P. denitrificans eine Beteiligung von 2 - 3 Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen auf jedem Protein festgestellt. Die Interaktionen wurden weiterhin durch chemical-shift-perturbation Experimente mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Isotopenanreicherung des Cytochroms c552 aus P. denitrificans konnten für dieses Protein Aminosäurereste identifiziert werden, die an einer direkten Bindung mit dem CuA-Partnerprotein beteiligt sind. In einem ähnlichen Ansatz wurde auch die Interaktionsfläche der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus charakterisiert. Für das Cytochrom c552 aus P. denitrificans konnte gezeigt werden, daß bei direkten Kontakten zwischen den Proteinen fast keine Ladungen beteiligt sind und primär ungeladene Reste die Wechselwirkung dominieren. Ein ähnliches Bild wurde auch für die Interaktion der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus mit ihrem Substrat ermittelt. Für die lösliche CuA-Domäne aus P. denitrificans konnte aufgrund der geringen Stabilität keine Zuordnung durchgeführt werden, so daß eine Charakterisierung der Interaktionsfläche nicht möglich war. Weiterhin wurde ein für T. thermophilus bisher nicht beschriebener Komplex III aufgrund von Sequenzdaten identifiziert. Eine lösliche Domäne des membranständigen Cytochrom c1 wurde in E. coIi heterolog exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Elektronentransferkinetiken zum Cytochrom c552 wurden durch stopped-flow Spektroskopie aufgenommen, und das Cytochrom c1 wurde als effizienter Elektronendonor für das Protein identifiziert. Für spätere Mutageneseansätze wurde ein Plasmid-basiertes Expressionssystem für das extrem thermophile Eubakterium T. thermophilus etabliert, um Schwierigkeiten, die bei der Expression von Cofaktor-tragenden Membranproteinen auftreten können, zu umgehen. Durch Expression eines löslichen c-Typ Cytochroms und der ba3-Cytochrom c Oxidase in T. thermophilus konnte gezeigt werden, daß dieses homologe Expressionssystem funktional ist und damit rekombinante Proteine exprimiert werden können. Durch die Konstruktion von Histidin-Tags konnte die Aufreinigung der Proteine erleichtert werden und eine notwendige Abgrenzung von chromosomal kodierten Wildtyp-Formen erfolgen.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
In dieser Arbeit wurde das Potential von CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen (HSC) und Endothelprogenitorzellen (EPC) aus peripherem Blut bzw. Nabelschnurblut sowie von aus diesen Vorläuferzellen differenzierten Zellen als Zielzellen für die Gentherapie der Hämophilie A untersucht. Der Gentransfer erfolgte mit einem lentiviralen Vektorsystem der zweiten Generation, das einen bicistronischen Transfervektor mit internem CMV-Promotor, einer FVIII-cDNA mit Deletion der B-Domäne, einem IRES-Element und dem EGFP-Gen als Markergen enthielt. Das Vektorsystem wurde zunächst für die Transduktion humaner hämatopoetischer Zellinien verwendet, die verschiedene Leukozytentypen repräsentierten, um es in bezug auf Gentransfereffizienz und FVIII-Expressionsstärke zu evaluieren. Im Rahmen dieser Versuchsreihe konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß hämatopoetische Zellen grundsätzlich in der Lage sind, FVIII zu sezernieren. Zugleich verwiesen die Befunde auf mögliche Expressionsprobleme, da trotz durchweg erfolgreichen Gentransfers und FVIII-Transkription nur in den Überständen von vier der sechs charakterisierten Zellinien FVIII-Protein meßbar war. In anschließenden Experimenten mit humanen und murinen HSC sowie humanen Granulozyten und Makrophagen konnte nach lentiviralem Gentransfer keine Sezernierung von FVIII-Protein detektiert werden. In expandierten humanen HSC wurden jedoch FVIII-mRNA und intrazelluläres FVIII-Protein detektiert, so daß in diesen Zellen ein Exportdefekt für das FVIII-Protein vorzuliegen schien. Da hämatopoetische Zellen und Endothelzellen mit dem Hämangioblasten eine gemeinsame Vorläuferzelle besitzen, wurde zudem geprüft, ob aus CD34-positiven Stammzellen generierte Endothelprogenitorzellen (EPC) in der Lage sind, therapeutisch relevante FVIII-Mengen zu sezernieren. In Anwesenheit von VEGF, FGF-2, SCF und SCGF-beta wurden adhärente Zellen gewonnen, die aufgrund des Musters der Expression von Oberflächenmarkern und durch ihr Verhalten im Matrigel-Assay einen eindeutig endothelialen Phänotyp besaßen. Diese Zellen wurden (bezogen auf die Zahl der eingesetzten CD34-positiven Zellen) um bis zu neun Größenordnungen expandiert. Nach lentiviraler Transduktion der Zellen, die weder das Proliferationspotential der Zellen noch ihren Phänotyp veränderte, wurde eine hocheffiziente FVIII:C-Sezernierung (7,0-7,8 IU/10 hoch 6 Zellen/48 Std.) gemessen. Im ELISA fielen leicht erhöhte FVIII:Ag-Werte auf, und eine nachfolgende Western Blot- Analyse legte nahe, daß dies auf unvollständige intrazelluläre Spaltung des FVIII-Polypeptids in schwere und leichte Kette zurückführbar sein könnte, die sich wegen der weiteren proteolytischen Aktivierung im Plasma jedoch nicht negativ auf die Gerinnungsaktivität in vivo auswirken sollte. Die Befunde dieser Arbeit identifizieren EPC aus CD34-positiven Nabelschnurblutzellen als potentielle Zielzellen für eine FVIII-Substitution nach ex vivo-Gentransfer, da sie sich nicht nur durch ihr hohes Expansionsvermögen auszeichnen, sondern auch durch die Fähigkeit zur rekombinanten FVIIISezernierung auf sehr hohem Niveau, das nur wenig unter dem FVIII-Sekretionspotential humaner Hepatozyten liegt. Primäre hämatopoetische Zellen sind aufgrund eines Exportdefektes zwar nicht direkt für eine FVIII-Substitution, möglicherweise aber für eine Toleranzinduktion geeignet.
Funktionelle und strukturelle Untersuchungen an der Diisopropylfluorophosphatase aus L.vulgaris
(2003)
Das Ziel dieser Arbeit war, mittels gezielter Mutagenese den postulierten Reaktionsmechanismus der durch die DFPase katalysierten Reaktion zu untermauern und gegebenenfalls weitere an der Hydrolysereaktion beteiligte Reste zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Rolle der Ca-1 Liganden untersucht. Hierbei ergab sich, dass sowohl die Nettoladung an der Ca-1-Bindungsstelle als auch die Positionen der Ladungen für den Erhalt der katalytischen Aktivität des Enzyms von Bedeutung sind. Die Einführung einer dritten negativen Ladung in der Bindungsstelle führte zum nahezu kompletten Aktivitätsverlust, was, wie die kristallographischen Untersuchungen der N175D-Mutante ergaben, hauptsächlich auf die veränderte Elektrostatik in der Bindungsstelle zurückzuführen ist. Durch eine Reihe von Mutationen des für die katalytische Aktivität als essentiell beschriebenen His287-Restes konnte gezeigt werden, dass auch andere, hydrophobe Reste an dieser Position die Katalyse ermöglichen. Die Fähigkeit dieser Reste, Wasserstoffbrücken mit Trp244 auszubilden, könnte für die Katalyse zwar förderlich sein, ist aber nicht unbedingt notwendig. Außerdem scheint die vom His287 vermutlich durchgeführte Aktivierung des hydrolytischen Wassermoleküls ebenfalls nicht essentiell für die enzymatische DFP-Spaltung zu sein. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte der von Scharff et al. (2001a) vorgeschlagene Reaktionsmechanismus zumindest teilweise bestätigt werden. Gleichzeitig konnte jedoch gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion auch ohne einige der in der Wildtyp-DFPase gegebenen Voraussetzungen - wie das Bestehen einer Wasserstoffbrücke zwischen His287 und Trp244, sowie eine durch das His287 durchgeführte Wasseraktivierung - ablaufen kann. Es konnte außerdem mittels gezielter Mutagenese gezeigt werden, dass die hydrophoben Anteile in der gesamten Substratbindungstasche und speziell an der Position 173 für die Substratbindung und -umsetzung eine wichtige Rolle spielen. Wie bereits bekannt, ist das Ca-2 Ion für die Stabilität der DFPase von großer Bedeutung. Mit Hilfe einer Mutation an der Ca-2-Bindungsstelle konnte gezeigt werden, dass der Verlust einer negativen Ladung die Koordination des Ca-2 Ions offensichtlich abschwächt. Die Position des Calciumions konnte in der D232S-Mutante nicht eindeutig definiert werden, obwohl die Struktur und die Aktivität des Enzyms intakt geblieben sind. Außerdem wurden, bedingt durch die Einführung dieser Mutation, geringe strukturelle Veränderungen im aktiven Zentrum des Enzyms hervorgerufen, was auf Wechselwirkungen zwischen den beiden Calciumbindungsstellen hindeutet. Dies könnte auf das ausgedehnte Wasserstoffbrückennetzwek im Inneren des die DFPase durchspannenden Tunnels zurückzuführen sein. Die Untersuchung verschiedener anderer, im zentralen Tunnel der DFPase gelegener Reste deutet ebenfalls auf die Existenz eines solchen Wasserstoffbrückennetzwerks hin, welches für die Aufrechterhaltung der katalytischen Funktion sowie der Strukturstabilität der DFPase von erheblicher Bedeutung zu sein scheint. Die für die Reste His287, Glu37, Ser271 postulierte Beteiligung an der katalytischen Reaktion konnte durch die Bestimmung der kinetischen Parameter dieser Mutanten untermauert werden. Die H287N-Mutante besitzt sehr niedrige KM- und Vmax-Werte, was die Bedeutung dieses Restes für die Katalyse unterstreicht. Kinetische Messungen wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal mit dem rekombinanten Enzym und außerdem auch den DFPase-Substraten Sarin, Soman und Tabun durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Messungen haben gezeigt, dass die DFPase auch zur Dekontamination dieser letztgenannten Organophosphate effizient eingesetzt werden kann. Schließlich konnte mittels Gleichgewichtsdialyse das niederaffin gebundene Calciumion der DFPase gegen Co2+ und Tm3+ ausgetauscht werden. Da die Verwendung dieser Metalle für NMR-spektroskopische Messungen von "residual dipolar couplings" gedacht war, wurden 15N-angereicherte Proben des derivatisierten Proteins hergestellt, welche die für die NMR-Experimente notwendige Stabilität besassen.
Die Messung von heteronuklearen 15N-Relaxationszeiten (Longitudinale, transversale sowie heteronukleare NOE) bei verschiedenen Magnetfeldstärken (500, 600 und 800 MHz 1H Larmorfrequenz) ergeben Informationen über interne dynamische Prozesse in Biomolekülen. Diese verschiedenen Relaxationsraten sind voneinander abhängig und über die spektrale Leistungsdichtefunktion miteinander gekoppelt. Die mikrodynamischen Parameter des NH-Peptidrückgratvektors (der Ordnungsparameter S2 und die effektive interne Korrelationszeit te) sowie der Beitrag des konformationellen Austausches zur transversalen Relaxationsrate der Austauschparameter Rex wurden für einige Proteine errechnet und angepaßt. Das Human ILBP gehört zur Familie der intrazellulären Lipidbindungsproteine (LBP), die in der Lage sind, Fett- und Gallensäuren spezifisch zu binden und in Cytosol zu transportieren. Viele verschiedene Typen von LBPs sind bis heute identifiziert worden. Diese Proteine enthalten 127 - 135 Aminosäurereste und werden nach dem Gewebe benannt, aus dem sie isoliert wurden. Human-ILBP enthält 127 Aminosäurereste und besteht haupsächlich aus 10 antiparallelen beta-Faltblattsträngen, die eine beta-Fassstruktur mit einer großen Bindungstasche bilden, und zwei alpha-Helices. ILBP hat die Tendenz, Gallensäuren oder Fettsäuren zu binden. Diese geringe Tendenz zur liganden Spezifität ist entweder in der Struktur oder in seiner Dynamik begründet. Aus diesem Grund kann die Untersuchung der Dynamik des Human ILBP (apo- und holo-Form) in zwei Zeitfenstern zum besseren Verständnis der Funktion führen. Für die nicht-terminalen Peptidrückgratgruppen wurde ein S2-Parameter> 0,8 mit einen Durchschnitt von 0,88 beobachtet, was auf eine niedrige Mobilität im ganzen Protein in einem Nano- zu Picosekunden-Zeitfenster deutet, wobei eine Korrelationszeit von tc = 6.25 ns für ILBP (apo-form) und tc = 6.10 ns für ILBP (holo-Form) beobachtet wurde. Apo- und holo-Form (mit Taurocholat als Ligand) zeigen eine ähnliche Dynamik in diesem Zeitfenster. Überdurchschnittliche S2-Werte der alpha-Helix I deuten eine geringe Flexibilität des Peptidrückgrats an, während alpha-Helix II als Teil der Portalregion eine höhere Beweglichkeit zeigt. Austauschparameter Rex wurden hauptsächlich in den Regionen der Ligandenbindung nachgewiesen. Die hier beschriebenen Eigenschaften unterscheiden sich von denen des H-FABP und des E-FABP. Offensichtlich unterscheiden sich verschiedene Mitglieder der LBP-Familie wie ILBP (Human oder Schwein), H-FABP und E-FABP in der Funktion und Dynamik des Peptidrückgrats. In der vorliegenden Arbeit wurden die transversalen 15N CSA/DD-kreuzkorrelierten Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Für die Bestimmung der Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors wurde des Verhältnis zwischen den Auto- und Kreuzrelaxationsraten in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke genutzt, wobei es möglich war, die Orientierung und Größe des CSA-Tensors einzelner Aminosäurereste zu bestimmen. Bei dieser Methode (wie auch in vielen anderen Studien gezeigt) wurde keine Korrelation zwischen der Sekundärstruktur des Proteins und den 15N CSA-Werten festgestellt. Zum Vergleich der CSA-Konstanten der ILBP-Spezies wurden die entsprechenden Parameter der RNaseT1 gemessen. Alle Daten wurden im Hinblick auf strukturelle Details kritisch diskutiert.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Synthese, Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von Arylalkyl-Rückgrat modifizierten DNA-Oligonucleotiden untersucht. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, lipophile, arylalkylmodifizierte Oligonucleotide zu synthetisieren und die Auswirkungen der absoluten Konfiguration der Modifikationen auf die Eigenschaften der resultierenden Duplexe zu untersuchen. Als zweites sollten die Modifikationen in Antisense-Oligonucleotide eingebaut werden um diese auf ihre Anwendbarkeit für die lnhibierung der HCV Genexpression zu testen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 18 unterschiedliche Rückgrat-Modifikationen synthetisiert. Dabei wurde die Alkylkettenlänge wie auch die Größe des aromatischen Systems variiert. Zudem wurde untersucht, welchen Einfluss Ringsubstituenten auf die Eigenschaften der resultierenden Oligonucleotide ausüben. Die Rückgratmodifikationen wurden über die Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode in Oligonucleotide eingebaut. Als Ausgangsverbindungen für die modifizierten Phosphoramidite dienten die Arylalkylhalogide. Diese wurden in einer dreistufigen in situ Reaktion - über das Grignard-Reagenz zu der entsprechenden cadmiumorganischen Verbindung und deren weitere Reaktion mit Phosphortrichlorid - zu den Arylalkyldichlorphosphanen umgesetzt. Die als Phosphorylierungsreagenzien fungierenden (Arylalkyl)(diisopropylamin)-chlorphosphane konnten durch Umsetzung mit N,N-Diisopropylamin erhalten werden. Die folgende Reaktion mit den 5'-hydroxyl- und aminogeschützten, natürlichen Nucleosiden führte zu den modifizierten Phosphoramidit-Bausteinen. Diese wurden mittels der OligonucleotidFestphasensynthese selektiv, an verschiedenen Positionen in sehr guten Ausbeuten in ModellOligonucleotide eingebaut und die erhaltenen Diastereoisomeren mittels RP-HPLC getrennt. Die einfach modifizierten, diastereoisomerenreinen Oligonucleotide zeigten eine signifikant erhöhte Lipophilie im Vergleich zu den unmodifizierten Strängen. Die Lipophilie nahm bei der Verlängerung der Alkylkettenlänge und der Vergrößerung des aromatischen Ringsystems pro (CH2)-Gruppe sowie pro weiterem Sechsring in konstanten Schritten zu, wodurch die Lipophilie gezielt gesteuert werden kann. Um den Einfluss der Modifikationen im Doppelstrang zu untersuchen wurden die Tm-Werte der Duplexe bestimmt und diese zudem CD- und Fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Tm-Werte variierten sehr stark in Abhängigkeit der Alkylkettenlänge, der Ringgröße und der absoluten Konfiguration. Mit den Rp-konfigurierten benzyl- (B), (naphth-1-yl)methyl- (I) und 2,4-difluorbenzylmodifizierten (M) Oligonucleotid-Duplexen konnte eine Schmelzpunktserhöhung erzielt werden. Auch konnte mit den 3-(Anthracen-9-yl)propylphosphonaten K eine signifikante Tm-Wert Steigerung aufgrund eines "Dangling-End-Effektes" beobachtet werden. Die erhaltenen Tm-Werte korrelierten hervorragend mit den erhaltenen CD- und Fluoreszenz-Daten. Für die Zuordnung der absoluten Konfiguration der Modifikation wurden drei 3-Phenylpropylphosphonat-Dimere E synthetisiert. Die Zuordnung erfolgte mittels der 2D-ROESY-NMR-Spektren und den berechneten Protonenabständen der diastereoisomerenreinen Dimere sowie über empirische Regeln die von den Methylphosphonaten S abgeleitet wurden. Diese Ergebnisse lassen sich auf längere Oligonucleotide übertragen. Neben den Untersuchungen der Charakteristika der Arylalkyl-Rückgrat modifizierten Oligonucleotide wurden während dieser Arbeit einige Modifikationen gezielt auf ihre Einsetzbarkeit für den Antisense-Einsatz getestet. Als RNA-Zielsequenz wurden die Nucleotide 326-342 der 5'-nicht codierenden Region des Hepatitis C Virus gewählt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf unterschiedlich modifizierte Antisense-Oligonucleotide synthetisiert. Die arylalkylmodifizierten Oligonucleotide zeigten gute Hybridisierungseigenschaften gegenüber der sense-DNA bzw. sense-RNA und eine deutlich erhöhte Stabilität gegenüber der Nuclease Pl. Ferner konnte die Lipophilie der Oligonucleotide signifikant gesteigert werden. Die 2-Phenylethylphosphonate (D) und 2,4-Difluorbenzylphosphonate (M) sind zudem in der Lage die RNase H zu aktivieren. Alle dargestellten Antisense-Oligonucleotide wurden in einem zellfreien in vitro- sowie in einem in vitro-Zellkultur-Translations-Assay auf ihr lnhibierungspotential gegen die Hepatitis C Virus Genexpression getestet. Dabei zeigten die Benzylphosphonate (B), Phosphorthioate (Ps) und die 2-Phenylethylphosphonate (D) im zellfreien in vitro Testsystem hohe, spezifische Inhibierungsraten (>87%), bei einer Oligonucleotid-Konzentration von 5 µM. Auch erwiesen sich die arylalkylmodifizierten Antisense-Oligonucleotide, mit Ausnahme der 4-Phenylbutylphosphonate F, als sehr gute lnhibitoren der HCV-Genexpression in CCI13- und HepG2-Zellen.
Ausgangslage der Dissertation war die an vielen Universitäten unbefriedigende Lehr- und Lernsituation im Chemiepraktikum für Medizinstudierende. Auf der Basis einer umfassenden Untersuchung der Lernausgangslage sollten Ansätze zu einer Verbesserung der Ausbildung entwickelt und am Beispiel des Praktikums an der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main erprobt werden. In einer Voruntersuchung wurde eine bundesweite Bestandsaufnahme der Chemiepraktika für Medizinstudierende durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten überraschend große Unterschiede in der praktischen Ausbildung bezüglich der Inhalte und des Umfangs. Leider wurde auch deutlich, dass die äußerst wünschenswerten medizinischen Bezüge nur vereinzelt hergestellt wurden. Zentraler Teil der Bestandsaufnahme war die Ermittlung der Lernausgangslage der Medizinstudierenden vor Praktikumsbeginn. Hierzu wurde in einem ersten Schritt ein Fragebogen auf der Grundlage eines für die Gegebenheiten eines Laborpraktikums angepassten Modells der Lehrveranstaltungsqualität entwickelt. Die anschließende Datenerhebung umfasste über 700 Studierende der Human- und Zahnmedizin an drei bundesdeutschen Hochschulen. Die Ergebnisse zeigen u.a., dass die meisten Studierenden nur über wenige chemische Kenntnisse verfügen, insgesamt aber sehr motiviert für die universitäre Ausbildung sind, was auch die Chemie mit einbezieht. Die angenommene negative Einstellung gegenüber dem schulischen oder universitären Chemieunterricht konnte hier nicht bestätigt werden. Die folgende Lehrevaluation während des Praktikums sowie dessen Neukonzeption wurden am Beispiel der Universität Frankfurt durchgeführt. Bei zwei Befragungen im WS 99/00 und 00/01 (N = 231) kristallisierten sich als verbesserungswürdige Punkte der Umfang der medizinischen Bezüge sowie des Übungsmaterials heraus. Auch eine stärkere Verknüpfung von Fachinhalten und den durchzuführenden Versuchen schien wünschenswert, um die im Praktikum erlebte Transparenz zu erhöhen. Die anschließende Neukonzeption des Chemiepraktikums erfolgte aufgrund der gewonnenen Evaluationsergebnisse sowie chemiedidaktischer und lernpsychologischer Erkenntnisse, wobei dem Praktikumskript als (Kurz-)lehrbuch und Arbeitsbuch eine zentrale Rolle zukommt. Bedingt durch die völlige Umstrukturierung des vorklinischen Studienabschnitts an der Universität Frankfurt wurde gleichzeitig die Anpassung an die veränderten Rahmenbedingungen notwendig. Das neu konzipierte Praktikum wurde erstmals im WS 2001/2002 mit über 500 Studierenden erprobt. Es erwies sich mit seinen Versuchen und dem Praktikumkskript als tragfähig und wird, bis auf wenige Änderungen, auch in Zukunft in dieser Form an der Universität Frankfurt durchgeführt werden. Die parallel durchgeführte Evaluierung zeigte, dass vor allem die Lehr- und Praktikumserfahrung der Assistentinnen und Assistenten zu einem wichtigen Kriterium dafür wird, wie die Studierenden die Veranstaltung erleben. In der Schulung und Unterstützung der Assistentinnen und Assistenten liegt demnach das größte Potential im Hinblick auf eine Qualitätssteigerung. Weiterhin wurde deutlich, dass die gegebenen engen zeitlichen und organisatorischen Rahmenbedingungen einem besseren Lernerfolg in der Chemieausbildung der Medizinstudierenden entgegenstehen.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient in mehrzelligen Organismen nicht nur als mechanische Stütze, sondern nimmt direkten Einfluss auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Die Discoidin-Domain-Rezeptoren (DDR) 1 und 2 sind die bisher einzig bekannten ECM-bindenden Rezeptoren mit einer intrinsischen Kinaseaktivität. Rezeptor- Tyrosinkinasen spielen bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Sie nehmen durch Bindung spezifischer Liganden Signale außerhalb der Zelle auf und initiieren eine Signalkaskade, die letzlich zur Transkription oder Repression von Zielgenen führt. Nach Bindung von nativem Kollagen an die Rezeptoren DDR1 und DDR2 kommt es zu einer Homodimerisierung, die zur Autophosphorylierung der Rezeptoren führt. Eine generierte DDR1-Knock-out-Maus zeigt einen Defekt in der Differenzierung der Brustdrüse und ist nicht in der Lage, ihre Jungen zu säugen, die genauen Ursachen hierfür sind jedoch bislang unbekannt. Ebenso sind die Zielgene der aktivierten Rezeptoren und insbesondere die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse bislang wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde nach Zielgenen, die durch die Signalkaskade von DDR1 und DDR2 in ihrer Transkription beeinflusst werden, gesucht. Außerdem wurde die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse im Detail analysiert. Zur Auffindung von Zielgenen wurden Zelllinien generiert, in denen die Expression von DDR durch Doxycyclin reprimierbar ist und mit Hilfe von Microarrays auf die Deregulation von Matrixgenen sowie Matrix-assoziierten und -modifizierenden Genen untersucht. Agrin und alpha 3-Integrin konnten als gemeinsame, reprimierte Zielgene von DDR1 und 2 identifiziert werden. Der P-Selectin-Ligand PSGL-1 und das Proteoglykan Decorin wurden von beiden Rezeptoren induziert. Weiterhin wurde das Brustdrüsengewebe trächtiger DDR1-Knock-out-Mäuse mit dem Brustdrüsengewebe heterozygoter Mäuse verglichen. Dazu wurden Microarrays verwendet, auf denen 15.000 Gene abgebildet waren. Die Analyse zeigte eine Repression von MDGI (Mammary derived growth inhibitor), Osteopontin und WDNMI in DDR1-Knock-out-Mäusen, während die Transkription des IGF-Bindeprotein IGFBP-5 erhöht war. Die Deregulationen konnten mittels Real-time-PCR verifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von DDR1 in der nichttransformierten Brustepithelzelllinie HC11 und in primären Brustepithelzellen aus DDR1-Knock-out Mäusen untersucht. Dabei konnte ein Defekt von DDR1-Knock-out Zellen in der terminalen Differenzierung beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu differenzierten DDR1 überexprimierende HC11-Zellen schneller als HC11-Wildtyp-Zellen und bildeten größere Mengen des Differenzierungsmarkers beta-Kasein. Die Analyse verschiedener Signalwege, die bei der Differenzierung von Brustepithelzellen angeschaltet werden, zeigte, dass DDR1 eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion von Stat5a/b spielt. Die Prolaktin induzierte Stat5a/b-Phosphorylierung war in DDR1 exprimierenden HC11 Zellen stärker und länger anhaltend als in parentalen HC11 Zellen. Dieser Effekt konnte nach Aktivierung von DDR1 durch Typ I Kollagen noch verstärkt werden. In der vorliegenden Arbeit konnten PSGL-1, Decorin, Agrin und Integrina3 als Zielgene in DDR1 und DDR2 überexprimierenden Zellen identifiziert werden. Ferner wurde im Brustdrüsengewebe von DDR1-Knock-out-Mäusen eine Repression von MDGI, Osteopontin und WDNMI sowie eine Induktion von IGFBP-5 gefunden. Die Analyse DDR1 überexprimierender HC11 Zellen und primärer DDR1-Knock-out-Brustepithelzellen zeigte, dass DDR1 eine essentielle Rolle in der terminalen Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Dabei konnte erstmals ein Einfluss von DDR1 auf die Prolaktin-induzierte Aktivierung von Stat5a/b gezeigt werden.
Etablierung, Charakterisierung und Anwendung eines In-vitro-Zellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke
(2001)
Es wurde durch die Optimierung der Isolierung und Kultivierung von cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen (BCEC) ein in vitro-Zellkulturmodell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) etabliert, das bezüglich seiner Permeabilitäts-Charakteristiken spezifische und herausragende Eigenschaften aufwies. Nach Abschluss der Etablierungs- und Optimierungsphase konnten im bovinen System wiederholt und reproduzierbar transendotheliale elektrische Widerstände (transendothelial electrical resistance, TEER) von zum Teil deutlich oberhalb 1000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, und die parazelluläre Permeabilität der bovinen BCEC-Monolayer für Sucrose lag annähernd auf dem niedrigen Niveau hochimpermeabler MDCK-Epithelzell-Monolayer und der entsprechenden in vivo-Parameter. Die per se niedrige Permeabilität des in vitro-BHS-Zellkulturmodells konnte sowohl durch Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels der BCEC als auch durch Kokultur der BCEC-Monolayer mit C6-Glioma- Zellen zusätzlich deutlich verringert werden. In Kombination konnte dabei ein TEER von über 3000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, einem Wert, der deutlich über dem TEER cerebraler pialer Kapillaren in vivo (1000-2000 Ohm mal cm hoch 2) liegt und in BHS-Zellkultursystemen bisher nicht einmal annähernd erreicht wurde. Der Vergleich des im Rahmen dieser Arbeit etablierten in vitro-BHS-Modells mit gut etablierten und charakterisierten BHS-Modellen bestätigten eindeutig dessen hohe Qualität und herausragende Eigenschaften. Im Rahmen eines indirekt-Kontakt-Kokultursystems konnte in zahlreichen Experimenten eindeutig und reproduzierbar gezeigt werden, dass eine Kokultur von postkonfluenten bovinen oder humanen BCECMonolayern mit humanen Makrophagen zu einer durch deutliche Erhöhung des TEER nachweisbaren Verringerung ihrer Permeabilität führte. Die bei den BCEC durch die Makrophagen induzierte TEER-Erhöhung war mit der durch die Kokultur mit C6-Glioma-ZeIlen bewirkten vergleichbar. Eine proinflammatorische Stimulation der Makrophagen vor Beginn der Kokultur zeigte keine eindeutige Beeinflussung ihrer Wirkung auf die mit ihnen kokultivierten BCEC-Monolayer. Eine Infektion der Makrophagen mit zwei verschiedenen HIV-1-Isolaten zeigte trotz Vorhandenseins einer produktiven HIV-1-lnfektion keine Auswirkung auf die von ihnen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayer, es konnten diesbezüglich keine Unterschiede zwischen uninfizierten und infizierten Makrophagen festgestellt werden. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels führte bei den mit Makrophagen kokultivierten BCECMonolayern wie bei den mit C6-Glioma-Zellen kokultivierten BCEC-Monolayern zu einer zusätzlichen Steigerung des TEER. Die Inhibition der Adenylat-Cyclase und verschiedener Protein-Kinasen (Protein-Kinasen A, C, G und MLCK) zeigte keine Auswirkung auf die von Makrophagen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayern; die Aktivierung der Protein-Kinase C führte zu dem gleichen Ergebnis. Die Inhibition der Phospholipase C und der Ca2~-vermittelten Aktivierung des Calmodulins zeigte ebenfalls keine Auswirkung auf die durch die Makrophagen- beziehungsweise C6-Kokultur bewirkte TEER-Erhöhung bei den BCEC-Monolayern. Eine Beteiligung der untersuchten Signaltransduktionswege an dem von Makrophagen oder 06 ausgeübten Einfluss auf die BCEC erscheint somit unwahrscheinlich. Der Befund, dass hämatogene Makrophagen in der Lage sind, bei kultivierten BCEC BHS-spezifische Eigenschaften zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten, ist überaus bemerkenswert, da diese Wirkung bislang ausnahmslos Zellen neuroektodermalen Ursprungs (beispielsweise Astrocyten) sowie glialen Zelllinien zugeschrieben wurde. Hämatogene Makrophagen oder davon abgeleitete Zellen des Hirnparenchyms könnten damit ein Teil der Mikroumgebung sein, die in vivo die charakteristischen Eigenschaften von Hirnendothelzellen modulieren, beispielsweise in Form der perivaskulären Mikrogliazellen, die in engem Kontakt mit den cerebralen Blutgefäßen stehen und höchstwahrscheinlich durch aus dem Blutstrom in das Gehirn einwandernde Monocyten/Makrophagen kontinuierlich ersetzt werden. Das in vitro-BHS-Zellkulturmodell wurde weiterhin für pharmakologische Studien eingesetzt, um den Einfluss von Nanopartikeln, die als potentielle brain targeting-Trägersysteme für Arzneistoffe diskutiert werden, auf die Barriere-Eigenschaften postkonfluenter cerebraler Endothelzellen zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die Zugabe verschiedener Nanopartikel-Präparationen zu postkonfluenten BCECMonolayern zu einer deutlichen und konzentrationsabhängigen Erhöhung deren Permeabilität für Elektrolyte und makromolekulare Substanzen führte.
Durch die beiden Ionisationstechniken Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) und Electrospray-Ionization (ESI) sind Biopolymere für die Massenspektrometrie zugänglich geworden und die Zahl der biochemischen Applikationen ist sprunghaft angestiegen. Dagegen sind die zugrundeliegenden Prozesse der Ionenbildung nur zum Teil bekannt. Bei MALDI wird die Laserstrahlung durch die Matrix absorbiert, wodurch es zur explosiven Auflösung der festen Phase unter Bildung von geladenen Molekülen kommt. Der genaue Mechanismus vom Festkörper zum gasförmigen Ion ist nur teilweise aufgeklärt und Gegenstand vieler Diskussionen. Eine wichtige Funktion der Matrix ist die räumliche Separierung und Isolierung der Analyte beim Einbau in die Matrixkristalle. Während der Einschluß von Molekülen in Wirtskristalle schon früh als wesentliches Merkmal von MALDI erkannt wurde, ist bisher noch nicht systematisch untersucht worden, in welcher Form die Analyte im Kristall vorliegen. Genau diese Information ermöglicht jedoch Aussagen über die Relevanz verschiedener Mechanismen der Ionenbildung bei MALDI. Die Bestimmung des Ausgangszustandes des Analyten im Matrixkristall und die Abschätzung möglicher Reaktionen bei der nachfolgenden Freisetzung der Analytionen ist das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit. In dieser wurde insbesondere der Ladungszustand der Analyte sowie der Einschluß von Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurden Experimente zur Zahl und Koordination möglicher Gegenionen, zur Neutralisation dieser Ionenpaare und zur Adduktbildung bei MALDI durchgeführt. Die Ergebnisse erlauben Aussagen über primäre und sekundäre Ionisationsreaktionen, die zu einem stimmigen Bild der Ionenbildung bei MALDI zusammengefaßt wurden. Grundlage des vorgestellten Modells sind bereits veröffentlichte Modelle, deren wesentliche Aspekte teilweise schon in den ersten Jahren nach der Einführung von MALDI, zu einem erheblichen Teil aber erst in jüngster Zeit erkannt wurden. Einen erneuten Anstoß für die Diskussion um den Mechanismus von MALDI gab die Hypothese, daß die Ionisation eng mit der Bildung von Clustern verbunden ist und dabei sowohl eine Freisetzung präformierter Ionen als auch nachfolgende Reaktionen unter Transfer von Protonen und Elektronen erfolgen. Der Ausgangspunkt für all diese Prozesse ist der Analyt im Matrixkristall. Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente zeigen, daß einige wesentliche Postulate des "Cluster-Modells" richtig sind. Insbesondere konnte der Beweis geführt werden, daß Analyte geladen im Matrixkristall existieren und daß die gelöste Form des Analyten weitgehend im Matrixkristall konserviert wird. Als einfache Testsysteme wurden Matrixlösungen mit verschiedenen pH-Indikatoren versetzt und die Farbe der Kristalle dokumentiert. Dabei zeigte sich, daß in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung sowohl Moleküle mit einer positiven oder negativen Nettoladung als auch neutrale Zwitterionen gleichermaßen effizient in Matrixkristalle eingebaut werden. Die Ladung aller sauren und basischen funktionellen Gruppen des Analyten im Kristall ist damit durch den pH-Wert der Matrixlösung bestimmt. Wenn eine Nettoladung vorhanden ist, muß zudem diese Ladung durch Gegenionen kompensiert sein, so daß Ionenpaare entstehen. Aber auch bei Zwitterionen können Gegenionen vorhanden sein. Darüber hinaus gelang durch 1H-NMR-Spektroskopie der Nachweis, daß Lösungsmittel im Kristall eingeschlossen ist und selbst nach Trocknen der Kristalle bei erhöhter Temperatur oder im Vakuum dort verbleibt. Dies führt zu dem anschaulichen Bild, daß Analyte in Abhängigkeit vom pH-Wert als "Multi-Ionenpaare" und partiell solvatisiert im Matrixkristall konserviert werden. Ausgehend von diesen präformierten, solvatisierten Ionenpaaren wird durch den plötzlichen Energieeintrag des Laserpulses die explosive Bildung von Clustern ausgelöst. Für die Bildung von geladenem Clustern gibt es zwei plausible Erklärungsansätze. Durch die Existenz der geladenen Analyte im Kristall ist eine besonders einfache Ionisation unter Freisetzung "präformierter" Ionen durch die Trennung eines Ionenpaares denkbar. Eine zweite Möglichkeit wäre die Photoionisation eines Matrixmoleküls mit nachfolgendem Protonentransfer. Da aber stets negative Ladungen vorhanden sind (entweder im Analyten selbst oder als Gegenion), wird bevorzugt ein Anion neutralisiert. In beiden Fällen entsteht ein Cluster, der durch ein fehlendes oder neutralisiertes Gegenion geladen ist. Die Freisetzung des Analytions erfolgt durch Verdampfen von Neutralmolekülen (Matrix, Lösungsmittel). Ionenpaare werden durch Protonentransfer neutralisiert, so daß kleine Neutralmoleküle abdampfen und mit Ausnahme von Metallkationen keine ionischen Addukte detektiert werden. Der Protonierungsgrad des Analyten beim Einbau hat einen erheblichen Einfluß auf die detektierten Ionen. Sind bereits in Lösung und damit im Kristall positiv geladene Gruppen vorhanden, werden besonders leicht protonierte Molekülionen gebildet. Dagegen entstehen aus deprotonierten Vorläuferionen (in der Regel negativ geladen) verstärkt kationisierte Molekülionen. Dabei ist nicht die Nettoladung entscheidend, sondern die Existenz und Anzahl positiver und negativer Gruppen im Analyten. Die Kationisierung erfolgt bereits im Kristall, da die Ionen eine hohe, MALDI-typische Anfangsgeschwindigkeit zeigen. Die Koordination der Kationen an der negativen Ladung verhindert die Neutralisation durch Protonierung, die wesentlich für die Freisetzung von protonierter Molekülionen ist. Diese Neutralisation von Ionenpaaren ist auch die Ursache dafür, daß Anionenaddukte normalerweise nicht nachgewiesen werden. Durch Zugabe einer sehr starken Säure wird jedoch diese Zwischenstufe stabilisiert und erscheint in Form von Anionenaddukten im Spektrum. Dabei zeigte sich, daß die Anzahl der detektierten Addukte mit der Zahl der basischen Stellen im Analytmolekül korreliert, welches den Einbau von (mehrfach) geladenen Analytionen zusammen mit ihren Gegenionen bestätigt. Neben der Koordination der Anionen an positiv geladenen Stellen des Analyten ist die Energiebilanz des Protonentransfers dafür entscheidend, ob die Anionenaddukte den MALDI-Prozeß überstehen, so daß Anionen mit einer vergleichsweise geringen Gasphasenbasizität zur Adduktbildung neigen. Des weiteren kann die Konkurrenz verschiedener Anionen bei der Bildung der Ionenpaare eine Verschiebung der Adduktverteilung bewirken. Aber auch eine höhere Energiezufuhr (z.B. durch höhere Laserenergie) bewirkt eine verstärkte Neutralisation der Ionenpaare, wobei ein erheblicher Anteil metastabiler Fragmentierungen auftritt. Die Koordination von Gegenionen und die "metastabile Neutralisation" führt bei Verbindungen, die zur Ionenpaarbildung neigen, zur Peakverbreiterung und zu einer begrenzten Auflösung. Darüber hinaus sind bei MALDI weitere Sekundärreaktionen beteiligt. Dazu zählt die Übertragung von Wasserstoffatomen, die wahrscheinlich auch die Ursache für prompte Fragmentierungen ist (in-source decay, ISD). Ob eine Ladungsreduktion mehrfach geladener Vorläuferionen durch Elektronen auch bei Biopolymeren eine wesentliche Rolle spielt, bleibt dagegen weiterhin offen. Durch die in Abhängigkeit von der Nettoladung zunehmende Coulomb- Anziehung der koordinierten Gegenionen werden vermutlich erst gar keine hochgeladenen Ionen in die Gasphase freigesetzt. Die vorgestellten Ergebnisse ergeben ein plausibles, qualitatives Bild der Ionenbildung bei MALDI. Es wurde gezeigt, daß die gelöste Form des Analyten inklusive Ladungen, Gegenionen und Solvathülle bei der Kristallisation weitgehend erhalten bleibt, und daß diese Ausgangssituation entscheidend für die Art der letztendlich gebildeten Gasphasenionen ist. Zudem ist nicht die Protonierung neutraler Analyte, sondern eine Neutralisation von Ionen(paaren) durch Protonentransfer ein zentraler Bestandteil von MALDI.
Über lange Zeit wurden in der EPR-Spektroskopie hauptsächlich cw-Experimente bei einer Mikrowellenfrequenz von 9 GHz durchgeführt. In den letzten 10 bis 15 Jahren aber haben zwei verschiedene Entwicklungen immer stärkere Verbreitung gefunden. Dies sind zum einen die Verwendung von immer höheren Magnetfeldern und damit Mikrowellenfrequenzen, und zum anderen die Anwendung von Puls-Experimenten. Hochfeld-EPR bietet zwei wesentliche Vorteile gegenüber den klassisch verwendeten Magnetfeldstärken. Dies ist einerseits die erhöhte spektrale Auflösung bei Systemen mit anisotropen g-Tensoren, andererseits die höhere absolute Empfindlichkeit in Verbindung mit einem geringeren Probenvolumen. Puls-Experimente andererseits bieten die Möglichkeit, Informationen zu gewinnen, die mit cw-EPR Spektroskopie nicht oder nur sehr schwer zu erhalten sind. Die Kombination dieser beiden Weiterentwicklungen der EPR-Spektroskopie eröffnet die Möglichkeit, mittels mehrdimensionaler Spektroskopie detaillierte orientierungsabhängige Informationen zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Puls EPR-Spektrometer aufgebaut, welches bei einer Mikrowellenfrequenz von 180 GHz und einem statischen Magnetfeld von 6,4 T arbeitet. 180 GHz ist derzeit weltweit die höchste Mikrowellenfrequenz, bei der routinemäßig ein zylindrischer Hohlraumresonator verwendet wird und bei der Puls EPR-Experimente durchgeführt werden. Da bei solchen Mikrowellenfrequenzen einige benötigte Bauteile nicht mehr in konventioneller Bauweise erhältlich sind, wurden quasioptische Elemente verwendet, um einen Zirkulator aufzubauen. Der Transport der Mikrowellenstrahlung von der Quelle zur Probe und von dort zurück zur Detektion geschieht mittels überdimensionierter Hohlleiter, um die Verluste zu minimieren. Ein zylindrischer Hohlraumresonator wird in einer fundamentalen Mode betrieben, um am Probenort die für Puls-Experimente notwendige Mikrowellenleistung zu erzeugen. Mit der erreichten Mikrowellenleistung und der Ankopplung des Resonators werden Pulslängen von ca. 60 bis 80 ns für Systeme mit S=1/2 erzielt. Die Eigenschaften des aufgebauten Spektrometers wie die Empfindlichkeit oder die Totzeit im Pulsbetrieb werden ausführlich dargestellt und diskutiert. Ebenso werden die Eigenschaften der implementierten Spektrometersteuerung, insbesondere im Hinblick auf das Zeitverhalten bei Puls-Experimenten, dargestellt und diskutiert. Im letzten Teil der Arbeit wird ein ausführliches Anwendungsbeispiel für Hochefeld-EPR diskutiert. Das Ras-Protein spielt eine wichtige Rolle in der intrazellulären Signalweiterleitung und reguliert solche Prozesse wie Zellwachstum, Differentiation und Apoptose. In ca. 30 % aller menschlicher Tumore werden Mutationen dieses Proteins gefunden, was die wichtige Rolle dieses Proteins demonstriert. Trotz dieser wichtigen Funktion ist der genaue Mechanismus des Aktivierungszykluses noch nicht im Detail aufgeklärt worden. Mittels cw-EPR Spektroskopie wurden die GDP-gebundenen inaktiven Proteinkomplexe verschiedener Mutanten untersucht. Durch Messungen in H217O-angereichertem Wasser konnte gezeigt werden, dass bei Raumtemperatur beim Wildtyp ein Wasserligand weniger am aktiven Zentrum der Proteinkomplexe vorliegt als bei einer onkogenen Mutante. Dieses Ergebnis widerspricht den bisher durch verschiedene Röntgenstrukturuntersuchungen gewonnen Erkenntnissen. Es wird ausführlich darüber diskutiert, dass diese unterschiedlichen Ergebnisse vermutlich auf Kristallbildungseffekte zurückzuführen sind.
Durch Substitution der vier Cysteine des a-Amylase-Inhibitors Tendamistat wurden Disulfidmutanten erzeugt. Zur Herstellung wurde im Rahmen dieser Arbeit die statistische Mutagenese angewandt. Die beiden Mutanten 11H27I45R73T und 11H27N45S73D wurden mit einem kombinierten Verfahren aus Olignukleotidsynthese und PCR erzeugt. Dieses hat als Grundlage die Genkassette, die in pT136 und pAX5a enthalten ist. Durch die gleichzeitige Veränderung beider Cysteine einer Disulfidbrücke sind Probleme mit der Einschränkung in der Variantenvielfalt nicht vorhanden, sowie mehrfache Mutationszyklen nicht notwendig. Die 4-fach-Mutanten wurden in Streptomyces lividans kloniert und exprimiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß stabiles Tendamistat erhalten wird. Damit wurde Disulfidbrücken-freies Tendamistat erhalten, ohne zusätzliche Mutationen einführen zu müssen.
In the recent years, high-resolution conditions have been established in solid-state NMR by the combination of magic angle spinning, state-of-the-art r.f. pulse schemes and the introduction of ultra-high magnetic fields. Similar to what is now routine in solution-state NMR, this has opened the way for structure determination by HR-SSNMR methods. Complete structural or dynamical characterization of the biomolecule of interest is most easily achieved if multiple or even uniformly [13C, 15N]-labeled versions are studied. In a first step, experiments that allow the complete assignment of the 13C and 15N resonances have been recently designed. To date, nearly complete chemical shift assignments were reported for two well-ordered proteins, the ±-spectrin SH3 domain and the Crh protein. The SSNMR analysis of the later protein has been presented in Section 4.1. For SSNMR applications, not the molecular size or solubility, but the spectral resolution can be of crucial importance. Experimental parameters and sample inherent conditions such molecular disorder may reduce the overall spectral dispersion. In these circumstances, techniques that allow for spectral simplification without the need of elaborated biochemical procedures (of isotopelabeling) are of special importance. In Section 2, several spectral editing methods have been proposed. These methods not only select resonances due to changesin the physical and chemical environment of the nucleus but they can also directly probe molecular properties such as dynamics and conformational heterogeneity. Once the chemical shifts are available for the biomolecule of interest, methods that permit to obtain structural restraints can be applied. In the case of multiply isotope labeled proteins, such techniques can in principle result in multiple structural parameters. In Section 3.1, we have shown that, similar to solution-state NMR, secondary chemical shifts can be readily employed to study the local backbone conformation. Inaddition, distance constraints between protons may be encoded in high-resolution on rare spins like 13C and 15N and measured. Finally, carbon-carbon constraints may be probed by employing frequency selective r.f. pulse schemes. These dihedral and distance constraints may subsequently lead to the determination of protein secondary to tertiary structure from a single protein sample. In Section 4.2,we have shown that high-affinity ligand binding to membrane proteins can be investigated with solid-state NMR. Here, the neuropeptide neurotensin which binds to the Gprotein coupled receptor NTS1 in sub-nanomolar affinity was investigated.Except for the case of rhodopsin, there is currently no information on the high-resolution structure of any other GPCR or a corresponding high-affinity ligand.Our SSNMR results identify, for the first time, a distinct binding mode of neurotensin that could be of considerable relevance for further pharmacological studies. As exemplified in section 4.3, HR-SSNMR based structural studies can also assist in refining existing (X-ray or solution-state NMR) membrane-protein structures. The presented results provide, for the first time, direct experimental evidence for a double occupancy of the Q0 binding site in the ubiquinone-bc1 complex and may provide the basis for the complete 3D structural determination of the ubiquinone binding pocket. Advancements regarding sample preparation (for example, including modular labeling, in vitro expression and intein technology) and improvements in NMR hardware instrumentation could open up new areas of solid-state NMR research such as the investigation of large protein-protein complexes or the complete 3D characterization of larger membrane proteins. Solid-state NMR studies of multiply-labeled biomolecules will furthermore profit from improved procedures for calculating 3D structures, in particular in the presence of ambiguousor a limited number of structural constraints. Unlike X-ray crystallography, protein motion does not hinder solid-state NMR methods. In fact, complementary to solution-state NMR, it may provide a very efficient means to study protein folding, flexibility and function under biologically relevant conditions. Hand in hand with solution-state techniques and crystallographic methods, solid-state NMR could provide insight into protein function and the chemistry of life with unprecedented accuracy and flexibility.
Die Dissertationsarbeit mit dem Titel "Aufhebung der peripheren Immuntoleranz durch Kopplung eines Melanomantigens mit immunogenen Fremdproteinen" befasst sich mit der Weiterentwicklung einer effektiven Melanomvakzine im tierexperimentellen Modell im Hinblick auf die spätere klinische Anwendung im Patienten. Als Antigen wurde das in Melanomzellen und in Melanozyten natürlicherweise exprimierte Protein TRP2 verwendet. Dieses Antigen kann bei Mäusen und Menschen von zellulären Komponenten des Immunsystems erkannt werden. Durch die Fusion des wenig immunogenen Selbstantigens mTRP2 mit dem immunogenen Fusionspartner EGFP gelang es bei C57BL/6 Mäusen, die körpereigene Toleranz gegen Selbstantigene zu umgehen und so eine antigenspezifische Immunantwort zu induzieren. In den mit der cDNA von EGFPmTRP2aa30-519 immunisierten Mäusen konnte eine vitiligoartige Felldepigmentierung nachgewiesen werden, die nach Immunisierung mit der cDNA von mTRP2 nicht beobachtet wurde. In diesen Tieren ließen sich auch im Elispot TRP2-spezifische T-Zellen nachweisen. Tiere, die mit Ad-EGFPmTRP2aa30-519 immunisiert wurden waren gegen das Wachstum von transplantierten Melanomzellen geschützt. Eine Immunantwort und ein Tumorschutz konnte jedoch nur induziert werden, wenn eine direkte Fusion zwischen dem Selbstantigen TRP2 und dem immunogenen Fusionspartner EGFP besteht. In Versuchen mit knockout Mäusen und Depletionsexperimenten konnte gezeigt werden, das CD4+ T-Zellen eine entscheidende Rolle in der Primingphase CD8+T-Zellen von die Induktion von antigenspezifischen CD8+T-Zellen spielen. In weiteren Experimenten nach Immunisierung mit dem Fusionskonstrukten EGFPmTRP2aa30-188, EGFPmTRP2aa30-179 und EGFPmTRP2aa180-188 konnte gezeigt werden, dass das Peptidepitop mTRP2 aa180-188 für die Induktion einer Felldepigmentierung und für eine effektive Abwehr von transplantierten Melanomzellen vorhanden sein muss. Um den Einfluss von kompetitiven MHC-Klasse I bindenden Peptidepitopen auf die Induktion einer Immunantwort zu untersuchen wurden Mäuse mit dem Fusionskonstrukt ß-Galaktosidase-mTRP2aa180-188 immunisiert. In diesen Mäusen konnte eine vtiligoartige Felldepigmentierung der beschossenen Bauchhaut und im Elispot-Test gleichzeitig TRP2 und ß-gal spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Arbeiten anderer Arbeitsgruppen scheint in diesem System keine kompetitive Hemmung zwischen dem ß-gal und dem TRP2 Peptid zu bestehen. Um den Einfluss der Kopplung auf die intrazelluläre Lokalisation zu charakterisieren wurden Fusionskonstrukte bestehend aus EGFP und mTRP2 mit unterschiedlichen Lokalisationssequenzen generiert, DCEK-Zellen stabil transfiziert und die intrazelluläre Lokalisation mit konfokaler Mikroskopie bestimmt. Nach Immunsisierung von Mäusen mit diesen Fusionskonstrukten konnte gezeigt werde, das die intrazelluläre Lokalisation keinen Einfluss auf die Entstehung einer Immunantwort hat. Für die spätere Anwendung der Kopplung in klinischen Studien wurde ein Fusionskonstrukt bestehend aus mTRP2 und dem gut charakterisiertem Antigen des humanen Cytomegalovirus pp65 generiert. Nach Gene-Gun Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit pp65mTRP2 zeigte sich ähnlich wie bei EGFPmTRP2 eine vitiligoartige Felldepigmentierung. Im Elispot-Test ließen sich TRP2 spezifische T-Zellen nachweisen. Das Ergebnis bestätigt die Annahme, dass auch pp65 zur Verstärkung einer antigenspezifischen Immunantwort gegen ein wenig immunogenes Selbstantigen in der Lage ist.
Mitogen activated protein kinases (MAPKs) are found in all eukaryotic cells and represent crucial elements in the signal transduction from the plasma membrane to the nucleus. Although a broad variety of extracellular stimuli activate MAPKs, they evoke very distinct cellular responses. The amplitude and duration of MAPK activation determine signal identity and ultimately cell fate. A tight and finely tuned regulation is therefore critical for a specific cellular response. The role and the regulation of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5), a MAPK with a large and unique C-terminal tail, were studied in different cellular systems. The study highlights two aspects of ERK5 regulation: control of the phosphorylation state and regulated protein stability. In analogy to other MAPKs ERK5 is activated by dual phosphorylation of threonine and tyrosine residues in its activation motif. A first part of the study concentrates on whether and how the protein tyrosine phosphatase PTP-SL is involved in the downregulation of the ERK5 signal. The direct interaction of both proteins is shown to result in mutual modulation of their enzymatic activities. PTP-SL is a substrate of ERK5 and, independent of its phosphorylation, binding to the kinase enhances its catalytic phosphatase activity. On the other hand, interaction with PTP-SL does not only downregulate enzymatic ERK5 activity but also effectively impedes its translocation to the nucleus. The second part of this study focuses on the interaction of ERK5 with c-Abl and its oncogenic variants Bcr/Abl and v-Abl. In this study these tyrosine kinases are demonstrated to regulate ERK5 by two mechanisms: first, by induction of kinase activity and secondly, by stabilisation of the ERK5 protein. Stabilisation involves the direct interaction of unique ERK5 domains with Abl kinases and is independent of MAPK cascade activation. The level of ERK5 and its intrinsic basal activity – rather than its activation – are essential for v-Abl-induced transformation as well as for survival of Bcr/Abl-positive leukaemia cells. Stabilisation of ERK5 thus contributes to cell survival and should therefore be considered as an additional aspect in therapy of chronic myeloid leukaemia. Taken together, the results obtained in this study demonstrate that diverse pathways regulate ERK5 signalling by affecting kinase activity, localisation and protein stability. While the phosphatase PTP-SL is involved in negative regulation of ERK5, Abl kinases potently activate ERK5 and increase its half-life. Protein stabilisation thus is presented as a novel mechanism in the regulation of MAPKs.
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Bemerkenswerte Fortschritte in der rekombinanten Antikörpertechnologie und die Entwicklung unterschiedlichster Antikörperformate zur Expression in Bakterien, niederen und höheren Eukaryonten haben Antikörperderivaten vielfältige Anwendungsbereiche eröffnet. Hierzu gehört beispielsweise ihr Einsatz als experimentelle Wirkstoffe in der Tumortherapie, wo einige dieser Ansätze bereits in klinischen Studien evaluiert werden. Daneben könnten rekombinante Antikörperderivate aber auch eine zunehmend wichtige Rolle in der funktionellen Genomik spielen, beispielsweise bei der Aufklärung der Funktion medizinisch relevanter Genprodukte. So stellt der gezielte Einsatz intrazellulär exprimierter single-chain Fv Antikörperfragmente (scFvs) grundsätzlich einen viel versprechenden Ansatz zur selektiven Interferenz mit der Funktion intrazellulärer Proteine dar. Solche scFv Fragmente sind jedoch nach Expression im Zytosol aufgrund des dort vorherrschenden reduzierenden Milieus häufig inaktiv, was auf die nicht erfolgte Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken zurückzuführen ist, die normalerweise in den variablen Domänen von Antikörpern vorliegen. Nur wenige, bisher meist sehr aufwendig durch individuelle Analyse einzelner Moleküle identifizierte scFvs weisen eine ausreichend hohe intramolekulare Stabilität auf, um den Verlust der Disulfidbindungen kompensieren zu können und unter diesen Bedingungen aktiv zu sein. Dies steht bislang einer breiten Anwendung zytoplasmatischer scFvs entgegen. Ziel dieser Arbeit war es, ausgehend von hochdiversen scFv Antikörper-Bibliotheken ("Libraries") direkt solche selten auftretenden scFv Antikörperfragmente zu isolieren, die trotz des reduzierenden Milieus im Zytosol von Säugerzellen aktiv sind und hochspezifisch an die intrazellulären Domänen von ErbB-Rezeptoren wie dem Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) oder dem nahe verwandten ErbB2 Molekül binden. Diese ErbB-Rezeptoren sind in einer Reihe humaner Tumore überexprimiert. Als wichtige signalleitende Moleküle tragen sie zur malignen Transformation von Zellen bei und spielen eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung und -progression. Sie stellen daher viel versprechende Zielstrukturen für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe dar. Auf der Grundlage des Yeast Two-Hybrid Systems wurde ein in vivo Assay etabliert, der das Screening von scFv Libraries nach ErbB-spezifischen scFvs unter intrazellulären Bedingungen in Hefezellen erlaubt. Während es nicht möglich war, in einer im Rahmen der vorliegenden Arbeit generierten anti-ErbB2 scFv-Library und einer mit 8 x 10 hoch 5 unabhängigen Klonen wenig diversen anti-EGFR scFv-Library intrazellullär aktive ErbBspezifische scFv Antikörper nachzuweisen, konnte eine zweite anti-EGFR scFv-Library aufgrund ihrer großen Komplexität von 2 x 10 hoch 8 nicht komplett in Hefezellen gescreent werden. Die Library wurde daher zunächst durch wenige Runden Phagen Biopanning präselektioniert, um so die Diversität der Library auf ein Maß zu reduzieren, das eine weitere Selektion in vivo durch Yeast Two-Hybrid Screening zuließ. Mit Hilfe dieser Kombination aus in vitro Präselektion und in vivo Assay gelang es, verschiedene intrazellulär aktive EGFR-spezifische scFv Fragmente aus einer anti-EGFR scFv-Library zu isolieren. Durch GST "pull-down" Experimente und Koimmunpräzipitationsexperimente konnten deren Spezifität und intrazelluläre Aktivität in Säugerzellen in vitro und in vivo verifiziert werden. Wie durch Konfokale Laserscanning Mikroskopie gezeigt wurde, kolokalisieren die isolierten scFv Antikörper mit EGFR an der Zellmembran EGFR-überexprimierender humaner Tumorzellen. Ein direkter Effekt der Expression der EGFR-spezifischen scFvs auf die Autophosphorylierung des Rezeptors und auf die Proliferation von EGFRexprimierenden Mausfibroblasten wurde jedoch nicht beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass mit Hilfe des hier entwickelten Konzepts intrazellulär aktive EGFR-spezifische scFv Fragmente aus einer hochdiversen scFv-Library isoliert werden konnten. Prinzipiell sollte diese Strategie auch auf die Gewinnung intrazellulär aktiver scFv Antikörperfragmente anwendbar sein, die spezifisch an andere zytoplasmatische Zielmoleküle binden. Daneben könnten die Spezifität und intrazelluläre Aktivität der bereits isolierten EGFR-spezifischen scFv Fragmente genutzt werden, um z.B. durch Fusion mit Lokalisierungssignalen, Enzymen oder bestimmten Protein-Protein-Interaktionsdomänen die Signalleitung des EGFR gezielt zu beeinflussen. Entsprechende Ansätze werden gegenwärtig in der Arbeitsgruppe weiter verfolgt.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
AML1/ETO liegt bei 12% aller Patienten mit einer AML vor. Bei der Translokation t(8;21) kommt es zur Fusion der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors AML1 mit dem starken transkriptionellen Repressor ETO. Über den ETO-Anteil wird einen aktiver Korepressorkomplex rekrutiert, der zur transkriptionellen Repression AML1 relevanter Zielgene führt. Die dysregulierte Genexpression führt in AML1/ETO-transformierten Zellen möglicherweise zusätzlich zur Aktivierung anderer Signaltransduktionswege. Untersuchungen in der hämatopoetischen Zellinie TF-1 hatten diesbezüglich gezeigt, daß die Expression von AML1/ETO zu einer verlängerten STAT5-Aktivität führte. Durch ein synthetisches Phosphopeptid konnte die Proliferation AML1/ETO-transformierter Zellen, nicht aber normaler CD34+-Zellen gehemmt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde PLCgamma als ein Zielmolekül des Phosphopeptids identifiziert. Weiterführende Untersuchungen hatten gezeigt, daß PLCgamma nicht zur Transformation AML1/ETOexprimierender Zellen beiträgt. Die Synthese des Phosphopeptids bereitete aufgrund der Phosphorylierung Schwierigkeiten, so daß die Untersuchungen dadurch eingeschränkt waren. Ziel war es dennoch, Peptide identifizieren zu können, die in der Lage sind die transformierenden Eigenschaften in AML1/ETO-exprimierenden Zellen spezifisch zu blockieren. Hierfür wurden zwei Selektionssysteme in einer humanen Zellinie aufgebaut, die es ermöglichen sollen ETO-inhibierende Peptide aus einer Peptid-Bibliothek identifizieren zu können. Das erste Selektionssystem basierte auf der Produktion viraler Partikel, die von einer Gal4-ETO-regulierten VSV-G-Expression abhängig ist. Unter anderem bestätigte die Kompetition von Gal4-ETO durch die Koexpression der Gal4-DNA-bindenden- Domäne, daß die drastisch verminderte Virusproduktion allein auf eine ETO-vermittelte transkriptionelle Repression des VSV-G-Hüllproteins zurückzuführen war. Für die Durchmusterung einer Peptid-Bibliothek war der Hintergrund an viralen Partikeln (1.5x10 hoch 4 TU/ml), die trotz der Gal4-ETO-Expression produziert wurden, allerdings zu hoch. Im Gegensatz dazu verfügt das zweite Selektionssystem über ein tkneo- Reporterkonstrukt, dessen Expression ebenfalls durch Gal4-ETO reguliert wird. Es wurden zwei Zellklone etabliert (#61, #157), bei welchen die ETO-vermittelte Repression des tkneo-Fusionsproteins durch Butyrat und durch die Koexpression der Gal4-DNA-bindenden- Domäne spezifisch aufgehoben werden konnte. Neben dem gewünschten Wachstumverhalten der Klone unter den verschiedenen Selektionsbedingungen (ETO "on": G418-sensitiv; GCV-resistent; ETO "off": G418-resistent; GCV-sensitiv) wurde die stabile Integration des tkneo-Reporterkonstrukts und des Gal4-ETO-Plasmids in einer semiquantitaiven PCR nachgewiesen. Es wurde zum ersten Mal ein Selektionssystem etabliert, welches den Mechanismus der AML1/ETO-vermittelten Repression eines Gens genau wider spiegelt und die Selektion ETO-inhibierender Peptide aus einer Peptid- Bibliothek unter physiologischen Bedingungen ermöglicht.
Die Lösung unbekannter Strukturen aus Pulverbeugungsdaten ist keineswegs eine Routineanwendung, und es steht noch einiges an Arbeit an, um die vorhandenen Methoden so weit zu automatisieren, daß sie von Nichtspezialisten, auch solchen mit kristallographischen Kenntnissen, direkt verwendet werden können. In dieser Arbeit konnte überzeugend dargelegt werden, daß die Anwendung des älteren Verfahrens der Fragmentsuche eine sehr gute Möglichkeit bietet, den Schwierigkeiten der Strukturlösung aus Pulverdaten erfolgreich zu begegnen. Durch graduelle Steigerung des Schwierigkeitsgrads bzw. der Komplexität der Strukturlösung von der anfänglichen Verwendung simulierter Pulverbeugungsdaten bekannter Strukturen über die Messung von Pulverbeugungsdiagrammen bekannter Strukturen bis hin zur Lösung unbekannter Strukturen konnte die sinnvolle Anwendbarkeit des Fragmentsuchprogramms PATSEE zweifelsfrei belegt werden. Die in den einzelnen Stadien der Untersuchungen diskutierten Einflüsse, wie die benötigte minimale Fragmentgröße oder die Fragmentqualität, lieferten entscheidende Hinweise für das Aufstellen einer einfachen Strategie zur Strukturlösung aus Pulverdaten mit PATSEE. So konnte gezeigt werden, daß für einen sinnvollen Strukturlösungsversuch in der Regel mehr als 50% des relativen Streubeitrags aller Atome in der asymmetrischen Einheit benötigt werden und daß sich diese Grenze nur durch die Verwendung qualitativ hochwertiger Pulverbeugungsdaten, wie sie an modernen Synchrotronringen erhalten werden können, durchbrechen läßt. Auch die Variation eines Torsionsfreiheitsgrads im Zuge der Rotationssuche kann entscheidende Vorteile verschaffen, wenn zwei für sich genommen zu kleine starre Bereiche miteinander kombiniert werden. Außerdem konnte die prinzipielle Verwendbarkeit sowohl mittels Kraftfeldmethoden berechneter als auch experimentell bestimmter Fragmente, wie sie in der CSD in großer Zahl bereitstehen, bestätigt werden. Die in PATSEE verwendete Vielzahl an Gütekriterien zur Beurteilung einer Lösung konnte auch im Falle von Pulverdaten im wesentlichen überzeugen. Zwar ist die Diskriminierung zwischen richtigen und falschen Lösungen bei weitem nicht so eindeutig in bezug auf alle Gütekriterien, aber zumindest wird eine sehr gute Bewertung hinsichtlich von CFOM - dem Gütekriterium, nach dem die Lösungen sortiert werden - und den beiden R-Werten RE(1) und RE(2) erreicht. Als etwas problematisch hat sich die Rotationssuche erwiesen, die nur auf der Beurteilung eines einzigen Gütekriteriums beruht. Da aber gerade der Rotationssuche als erstem Schritt der Fragmentsuche eine wichtige Bedeutung zukommt, ist der Anwender zu großer Sorgfalt bei deren Durchführung verpflichtet. Eine Grenze für Strukturlösungsversuche mit PATSEE stellen derzeit Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit dar. Da im einfachsten Fall (Z'= 2) bereits ein komplettes Molekül als Suchfragment einen relativen Streubeitrag von unter 50% aufweist, wird eine erfolgreiche Orientierung und Positionierung mit PATSEE nur noch für hervorragende Datensätze möglich sein. Für noch schwierigere Fälle (Z'> 2) oder für Verbindungen, bei denen nicht das gesamte Molekülgerüst als Suchfragment verwendet werden kann, bestehen dann praktisch keine Aussichten mehr auf eine erfolgreiche Strukturlösung mit PATSEE. Basierend auf diesen Ergebnissen, konnten PATSEE-Parameter empfohlen werden, die sowohl für große Fragmente als auch für den Grenzbereich der minimal benötigten Fragmentgröße gute Erfolgsaussichten für die Strukturlösung gewährleisteten. Dabei wichen die empfohlenen Parameter nur in geringem Maße von den für Einkristalldaten optimierten Werten ab. Anhand zweier unbekannter Strukturen konnte die empfohlene Strategie verifiziert werden. Zusätzlich wurde für eine der beiden Strukturen eine Einkristallstrukturbestimmung vorgenommen, welche die aus Pulverdaten gelöste Struktur bestätigte. Auch wenn einerseits die prinzipielle Anwendbarkeit der Fragmentsuche mit PATSEE auf Pulverbeugungsdaten bewiesen werden konnte und andererseits eine allgemeine Strategie zur Vorgehensweise geliefert wurde, sind doch noch nicht alle interessanten Fragestellungen geklärt. Hier sind zum einen die unbefriedigenden Möglichkeiten bei Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit zu nennen. Eine sinnvolle Erweiterung der Zahl simultan suchbarer Fragmente in PATSEE könnte diesen Schwachpunkt beheben. Zugleich könnte mit dieser Erweiterung die Anwendbarkeit auf flexiblere Molekülgeometrien ausgedehnt werden, so daß im Endeffekt eine Steigerung der einsetzbaren Fragmentgröße erreicht wird. Diese Erweiterung sollte bei der enormen Rechenleistung moderner Computersysteme kein unüberwindliches Hindernis darstellen, so daß die benötigte Zeit für einen PATSEE-Lauf mit mehreren zu suchenden Fragmenten auf maximal einige wenige Stunden ansteigen würde. Alternativ wäre zu überlegen, ob nicht das Aufheben der strikten Trennung von Rotationssuche und Translationssuche, also eine 6-dimensionale Fragmentsuche, die bisweilen zu beobachtenden Probleme der Rotationssuche beheben würde. Auch bei dieser Änderung der Vorgehensweise in PATSEE könnten moderne Computer sinnvoll eingesetzt werden. Vorteilhaft für die Strukturlösung wäre hier die Kombination der sehr erfolgreichen Diskriminierung der Gütekriterien bei der Translationssuche mit der bisher kritischen Bestimmung der Orientierung. Eine zweite Fragestellung, die im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden konnte, betrifft die Anwendbarkeit auf makromolekulare Verbindungen, die über eine große interne Regelmäßigkeit verfügen, wie beispielsweise kleinere Peptide mit alpha-helikaler Struktur oder einer beta-Faltblattstruktur. Verschiedene Testreihen an derartigen Verbindungen belegen die prinzipielle Machbarkeit, und außerdem konnte bereits in mindestens einem ähnlich gelagerten Fall [17] gezeigt werden, daß derartige Strukturlösungsversuche bei sehr großen Verbindungen durchführbar sind. Insbesondere wegen der erheblichen Schwierigkeiten bei der Kristallisation derartiger Verbindungen und dem großen wissenschaftlichen Interesse an ihrer Struktur könnten erfolgversprechende Ansätze zur Strukturlösung aus Pulverdaten einen wichtigen Beitrag in der Pharmazie, der Pharmakologie, der Biologie und nicht zuletzt in der Medizin leisten.
Die Mehrzahl der akuten B-Zell Leukämien (B-ALL) im Kindesalter kann heutzutage geheilt werden (ca. 80%). Es gibt jedoch eine Untergruppe, die sog. Hochrisiko-Leukämien, der ein anderer Pathomechanismus zu Grude liegt und für die keine effektive Therapie zur Verfügung steht. Diese Form tritt fast ausschliesslich bei Kleinkindern im ersten Lebensjahr und bei älteren Patienten als Sekundärleukämie nach Chemotherapie auf. Diese akuten Hochrisiko-Leukämien sind zu 80% mit Translokationen des MLL Gens, Chromosom 11, Bande q23, assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11), bei der das MLL Gen mit dem AF-4 Gen fusioniert wird, hat die Expression der zwei funktionellen Derivatproteine MLL.AF-4 und AF-4.MLL und gleichzeitig eine Dosisreduktion des nativen MLL Proteins um 50% zur Folge. Das Zusammenspiel dieser Fakoren scheint die Grundvoraussetzung für die pathologische klonale Expansion leukämischer Blasten zu sein. Aus Untersuchungen in Drosophila melanogaster und im Maussystem ist bereits bekannt, dass das Wildtyp MLL Protein eine essentielle Funktion in der Steuerung von Genexpression durch Histon- und Chromatinregulation ausübt. Daraus stellte sich als Gegenstand dieser Arbeit die Frage nach der bislang überwiegend unbekannten Wildtyp-Funktion des MLL Proteins, und inwieweit das native Expressionsmuster einer Zelle durch die MLL Dosisreduktion beeinflusst, bzw. verändert wird. Zunächst wurden die MLL Targetgene identifiziert, und zwar anhand von je zwei DNA-Microchip-Hybridisierungen mit cRNA aus den MLL+/+ und MLL-/- Fibroblasten-Zelllinien. Der Expressionsvergleich dieser Datensätze ergab insgesamt 197 differentiell exprimierte Gene, die sich in der Expressionsstärke um mind. den 2,5-fachen Wert unterscheiden. Davon wurden 136 Gene bei völliger Abwesenheit des MLL Proteins, im Vergleich zum Normalzustand der Wildtyp-Zellen, um mind. den 2,5-fachen Wert transkriptionell aktiviert, die übrigen 61 Targetgene um mind. diese Stärke transkriptionell deaktiviert. Die Entdeckung dieser transkriptionell reprimierenden Eigenschaften des MLL Proteins, von dem bislang ausschliesslich aktivierende und transkriptionsaufrechterhaltende Eigenschaften bekannt waren, ist eines der wesentlichen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit. Ein Teil der, durch die Abwesenheit des MLL Proteins hochregulierten 136 Gene ist bereits als Tumormarker bekannt oder an folgenden onkogenen Mechanismen beteiligt: Proliferation durch Fehlsteuerung des Zellzyklus mit gesteigerter Nukleotid-Biosynthese, erhöhte Migrationsaktivität durch veränderte extrazelluläre Matrix mit der Folge von Metastasierung/Organinfiltration, erhöhter Schutz vor proteolytischem Abbau nukleärer (Onko-) Proteine, und der Generation von Spleiss-Varianten mit z.T. negativem Einfluss auf essentielle Differenzierungswege. Zu diesen, in der Summe das Krebsrisiko erhöhenden Effekten, kommt noch hinzu, dass eine Gegenregulation durch MLL induzierte Expression von Tumorsuppressoren (verschiedene Zellzyklus- Inhibitoren) fehlt. Da bei Leukämie-Zellen die MLL Proteindosis reduziert ist, liegt der Schluss nahe, den oben genannten 136 identifizierten Genen eine mögliche direkte Beteiligung an der Leukämogenese beizumessen. Die meisten der 61 Gene, die durch das MLL Protein transkriptionell aktiviert wurden, kodieren für Faktoren, die zum größten Teil in embryonale Differenzierungsprozesse involviert sind. Dabei spielt die Entwicklung von meso- und ektodermalen Geweben eine besondere Rolle. Das MLL Protein ist somit für die Organogenese von Herz, Leber, Nieren, sensorischen Organen, hämatopoietischen Zellen und ebenso für Knochen und Muskeln essentiell. Die gewonnenen Daten wurden durch verschiedene Experimente (subtraktive Klonierung und RT-PCR) verifiziert und die wenigen, bereits publizierten MLL Targetgene konnten durch diese Arbeit bestätigt werden. Neben den Targetgenen des MLL Proteins sollten auch diejenigen der beiden Derivatproteine MLL.AF-4 und AF-4.MLL identifiziert werden. MLL+/+ Zellen wurden mit den humanen Derivatkonstrukten stabil transfiziert und im Vergleich zur Leervektor-Kontrolle per DNA-Microchips analysiert. Wieder Erwarten wurden keine unterschiedlichen Transkriptionsmuster erhalten. Daraufhin wurden Komplementationsexperimente zur Eignungsüberprüfung des Testsystems durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass das humane MLL Expressionskonstrukt die MLL-/- Zellen funktionell nicht komplementieren konnte. Dafür gibt es verschiedene Erklärungsansätze, wobei jedoch die Hypothese, dass das "transkriptionelle Gedächtnis" in den murinen embryonalen Fibroblasten (Entwicklungsstatus Tag 10,5 p.c.), bereits stabil etabliert und nur noch marginal veränderbar ist, die Wahrscheinlichste ist. Sollte sich herausstellen, dass die epigenetische Programmierung der Zellen verantwortlich für die hier erhaltenen Ergebnisse ist, hätte das einen dramatischen Einfluss auf unser Verständnis vom Leukämie-Pathomechanismus. Es würde nämlich bedeuten, dass MLL und davon abgeleitete reziproke Derivatproteine nur in einem engen Zeitfenster Einfluss auf Genexpressionsmuster haben und nach einen "hit and run" Mechanismus die Leukämie auslösen.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Polo-Like Kinase 1 (PLK 1), eine Kinase aus der Familie der hochkonservierten Serin/Threonin-Kinasen in ihrer Funktion zu hemmen. Alle Zellen des Säugetier-Organismus benötigen für ihre Zellteilung PLK1. PLK1 wird vor allem in der G2/M-Phase des Zellzyklus exprimiert und wird in malignen Geweben, verglichen mit normalem, primärem Gewebe überexprimiert. Hier liegt ein differentieller Unterschied zwischen normalem, primärem Gewebe und malignem Tumorgewebe vor, denn in normalem Gewebe sind nur sehr niedrige PLKI -Spiegel vorhanden, so dass eine Krebstherapie, die über die Hemmung von PLKI wirkt, keine bzw. geringe Auswirkungen auf das normale gesunde Gewebe haben sollte. Insgesamt bietet sich PLKI daher als interessantes Ziel für eine molekularbiologisch basierte Krebstherapie an. Die im Rahmen dieser Arbeit angewandten Techniken waren die Antisense-Technologie und die RNA-Interferenz (mittels synthetischer small interfering RNAs [siRNAs]) und rekombinanter Plasmide zur Expression von hairpin-RNAs [shRNAs]). Antisense-Oligonukleotide (ASOs) sind schon seit ca. einem Jahrzehnt im Einsatz, um verschiedene Zellzykluselemente zu hemmen, auch bereits in verschiedenen Phasen der klinischen Prüfung, doch mit PLKI ist erstmals die Hemmung eines späten Elements der Signaltransduktionskaskade, das essentiell für die Mitose ist, gelungen. Hierbei sind die Auswirkungen auf die Zellen wesentlich stärker als bei weiter am Anfang der Signaltransduktionskaskade gelegenen Elementen, bei denen die Zelle noch die Möglichkeit hat, die Hemmung durch alternative parallele Signalwege zu umgehen. siRNAs bzw. shRNA-exprimierende Plasmide sind erstmals zum Einsatz gekommen, um in Mammalia-Zellen die Krebszellproliferation bzw. das Tumorwachstum im humanen Krebs-Xenograft-Modell durch Hemmung eines endogenen Gens zu hemmen. Bei Anwendung der RNA-lnterferenz konnte darüber hinaus ein für die Anwendung am Menschen wichtiger differentieller Unterschied zwischen primären Zellen und Krebszelllinien in vitro beobachtet werden, denn für die Hemmung der Proliferation und für die Reduktion der PLK1-mRNA und des PLK1-Proteins in primären humanen Mammaepithelzellen war eine 350-fach höhere siRNA-Konzentration nötig als in den Krebszelllinien. Die Konzentrationen, mit denen die Krebszellproliferation signifikant gehemmt werden konnte, hatten auf die primären Zellen überhaupt keine Auswirkungen, womit ein Meilenstein auf dem Weg zu einer spezifischen Krebstherapie erreicht werden konnte. Dabei konnten mit allen drei eingesetzten Techniken die PLK1-mRNA- und -Protein-Expression in vitro und die Zellproliferation in vitro gehemmt werden. Das Tumorwachstum konnte mit ASOs und mit den rekombinanten Plasmiden in vivo in Krebs-Xenograft-Modellen an Nacktmäusen erfolgreich gehemmt werden. Mit U6-Promoter-basiert exprimierten shRNAs konnten im humanen Xenograft-Modell auch die Expression der PLK1-mRNA und das PLK 1-Protein reduziert werden. Auf diese Weise kam es zu einem starken Antitumor-Effekt in vivo, der nach Behandlung mit den Expressionsplasmiden vier Wochen über das Ende der Therapie hinaus anhielt. Ausgehend von diesen Daten sollte für beide Techniken - sowohl für die Antisense-Strategie als auch für die RNA-Interferenz mit dem Target PLK1 - über Toxizitätsuntersuchungen und Ausweitung auf weitere Tumormodelle der Weg in die präklinische Phase eingeschlagen werden, um möglichst schnell die Grundlagen für einen Heilversuch oder eine klinische Studie zu schaffen.
Fest ins Genom integrierte und durch Vererbung (vertikal) weitergegebene endogene Retroviren stellen ein Risiko im Rahmen einer therapeutischen Übertragung von tierischen Zellen, Geweben oder Organen auf den Menschen dar. Bei Verwendung der als Spender bevorzugten Schweine sind zwei Klassen von C-Typ-Retroviren (PERV) bekannt, die zumindest in vitro humane Zellen infizieren können. Deshalb sind eine molekulare Kenntnis und eine genetische bzw. immunologische Kontrolle dieser Viren zur Vermeidung einer potentiellen Infektion von Xenotranplantat-empfängern wünschenswert. Die Analyse einer genomischen Bibliothek des "large white"-Schweins führte zur Charakterisierung von vier nativen proviralen Vollängensequenzen, von denen drei in der Lage sind, auf humanen Zellen zu replizieren, während ein Provirus zwei Stop- Mutationen im Polymerase-Gen trägt. Die Klone PERV-A(Bac-130A12), PERVA( Bac-151B10) und PERV-A(Bac-463H12) gehören zur Klasse A, der Klon PERVB( Bac-192B9) wird der Klasse B zugeordnet. Alle vier Klone weisen hohe Homologien zu bereits beschriebenen Sequenzen (Czauderna et al., 2000; Krach et al., 2001) auf, sind mit diesen jedoch nicht identisch. Die Bestimmung der flankierenden genomischen Sequenzen ermöglicht den spezifischen Nachweis der Proviren in genomischer DNA und zeigt, daß die vom "large white"-Schwein abgeleiteten Sequenzen zur Untersuchung verschiedener Schweinerassen geeignet sind. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß die im Klon PERV-B(Bac-192B9) beobachteten Punktmutationen in einigen der untersuchten Individuen revertiert sind. Die Untersuchung von 86 einzelnen Proben aus 5 verschiedenen Rassen zeigt eine sehr heterogene Verteilung der PERV und würde damit eine Züchtung (in Bezug auf replikationskompetente Viren) PERV-freier Schweine ermöglichen. Dies erübrigt sich aber durch die Tatsache, das Miniaturschweine des d/d-Haplotyps für die getesteten Proviren bereits negativ sind. Faßt man die vier hier und die in der Literatur beschriebenen Proviren (Czauderna et al., 2000; Krach et al., 2001) zusammen, scheinen von den etwa 30-50 Integrationsorten im porcinen Genom (LeTissier et al., 1997; Patience et al., 1997) zwischen sechs und zehn replikations-kompetente Proviren zu enthalten. Für den Fall, daß bei einer XTx Partikel freigesetzt werden, geben die Versuche mit den Pseudotypvektoren Hinweise darauf, daß eine Infektion schon nach wenigen Minuten stattfinden kann und damit auch nach einer raschen Entfernung des Organs persistieren könnte. Diese freigesetzten Partikel lassen sich aber durch Antikörper neutralisieren, so daß es möglich erscheint, Patienten sowie deren Ärzte und Kontaktpersonen zu impfen, um einer potentiellen Infektion vorzubeugen. Darüber hinaus scheinen die phylogenetisch jüngeren Viren mit der "repeat"-losen LTR die Fähigkeit verloren zu haben, xenotrop Zellen zu infizieren, da Proviren mit dieser LTR-Struktur weder aus einer 293-PERV-PK-Bibliothek isoliert werden konnten (Czauderna et al., 2000), noch konnten solche Elemente in genomischer DNA dieser Zellinie nachgewiesen werden. Mit der Untersuchung des Infektionsverhaltens von PERV und durch die Möglichkeit, in der XTx verwendete Schweine auf die Präsenz replikations-kompetenter PERV hin zu testen und die chromosomal lokalisierten Proviren eventuell durch Züchtung zu entfernen, leistet die vorliegende Arbeit einen Beitrag dazu, zukünftige Xenotransplantationen in virologischer Hinsicht sicherer zu machen.
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
Periplasmic Sud protein encoded by the Wolinella succinogenes catalyses the transfer of bound polysulfide-sulfur to the active site of the membrane bound polysulfide reductase. The homodimeric protein consists of 131 residues per monomer, each with one cysteine residue in the active site. Polysulfide-sulfur is covalently bound to the catalytic Cys residues of the Sud protein. In order to understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by heteronuclear multidimensional NMR techniques are reported here. The first step of structure determination leads to resonance assignments using 15N/13C/2H- and 15N/13C-labeled protein. The sequential backbone and side chain resonance assignments have been successfully completed. Structure calculations were carried out using the ARIA program package. The structure is based on 2688 NOE-derived distance restraints, 68 backbone hydrogen bond restraints derived from 34 slow-exchanging backbone amide protons and 334 torsion angle restraints obtained from the TALOS program as well as 158 residual dipolar coupling restraints for the refinement of relative vector orientations. The three-dimensional structure of the Sud protein was determined with an averaged rootmean- square deviation of 0.72 Å and 1.28 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the poorly defined segment between residues 90-94 the average r.m.s.d. value drops down to 0.6 Å and 1.14 Å. The ensemble refined with residual dipolar coupling (rdc) restraints shows good convergence. The r.m.s.d. value for the backbone heavy atoms, excluding residues 90- 94, drops down from 0.97 to 0.66 for the rdc-refined ensemble. The relative orientation of the two monomers in the protein structures refined with residual dipolar coupling restraints are also different from those without residual dipolar coupling restraints. The structure determination of the dimeric protein has been hampered by the high molecular mass (30 kDa), severe peak degeneracy, and by the small number of experimental intermonomer NOEs (relative orientation problem of two monomers). For the resonance assignments of aliphatic side chain, many resonances were ambiguously assigned because of severe overlap of signals. The Sud dimer protein contains 17 Lys, 14 Leu and one His tag for each monomer. It complicated the resonance assignments. The conventional 3D 15N-separated TOCSY HSQC experiment failed because of the large molecular weight which results in line broadening and hence made the resonance assignments of side chains more difficult. The determined structure contains a five-stranded parallel ß-sheet enclosing a hydrophobic core, a two-stranded anti-parallel ß-sheet and seven a-helices. The dimer structure is stabilized predominantly by hydrophobic residues. Sud catalyses the transfer of the polysulfide-sulfur to cyanide, similar to rhodanese encoded by Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000). The two proteins are similar in the active site environment primarily owing to the main-chain conformation of the active-site loop with the cysteine residue and with respect to the surrounding positively charged residues. The active-site loop (residues 89-95) in the Sud protein appears to be flexible, reflected by few assigned proton resonances of residues 90-94 in the active site. Despite their similarity in function and their similar structure in active site, the amino acid sequences and the folds of the two proteins are remarkably different. The negatively charged polysulfide interacts with positively charged R46, R67, and R94 and hence may be stabilized in structure. The mutation of one of the three arginines that are also conserved in rhodanese from A. vinelandii leads to a loss of sulfur-transfer activity. The polysulfide chain extends from inside of Sud protein to outside, where Sud may form contacts with polysulfide reductase. These contacts provide the possible polysulfide-sulfur transfer from Sud protein to the active site of polysulfide reductase.
An der chemischen Synapse des Nervensystems führt ein präsynaptisches Aktionspotential zur Freisetzung eines Neurotransmitters, der über den synaptischen Spalt diffundiert und an die Rezeptoren der postsynaptischen Membran bindet. Die ionotropen Rezeptoren sind an dieser Membran zu Clustern aggregiert. Entstehung und Dynamik dieser Rezeptoraggregate sind für Funktion und Plastizität der Synapse essentiell. Für die Aggregation der inhibitorischen Glyzin- und der meisten Subtypen der GABAA-Rezeptoren ist das periphere Membranprotein Gephyrin notwendig. Es ist ein Schlüsselfaktor für die Genese und Aufrechterhaltung der glyzinergen postsynaptischen Membran. Dabei bindet es direkt an den GlyR und verbindet diesen über die Bindung von Mikrotubulie an das Zytoskelett. Auch andere Bindungspartner wurden nachgewiesen. Gephyrin ist in einer zweiten Funktion in die Synthese des Molybdän-Cofaktors involviert und weist Sequnezhomologien zu Proteinen anderer Spezies auf, die in diesen Syntheseweg eingebunden sind. Gephyrin ist ubiquitär exprimiert und wird alternativ gespleißt. Möglicherweise existieren verschiedene Varianten mit unterschiedlichen Funktionen. Die Untersuchung der Domänen und Bindungseigenschaften Gephyrins ist daher für das weitere Verständnis über Aufbau und Funktion der Synapse unerlässlich. In dieser Arbeit wurde ein Testsystem etabliert, mit dem sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Gephyrin über die hoch-affine Bindung an den GlyR aufgereinigt werden konnte. Mit diesem System konnten erstmals unterschiedliche Varianten Gephyrins nachgewiesen werden. In verschiedenen Organen der adulten Ratte wurden dabei Gephyrinmoleküle mit Molekulargewichten zwischen 52 und den bekannten 93 kDA identifiziert. Auch Bestandteile des GlyR-Komplexes lassen sich mit dieser Methode anreichern. So wurde gezeigt, daß Gephyrin und Collybistin in einem trimeren Komplex mit dem GlyR vorliegen können. Hiermit ist es künftig möglich, in einem proteomischen Ansatz weitere aus dem GlyR-Konmplex anzureichern und zu identifizieren. Mit dem gleichen System wurde auch die Bindungsregion Gephyrins für den GlyR gefunden. Diese diskontinuierliche Bindungsstelle wird aus einer a-Helix der Aminosäuren 164 bis 184, sowie aus hydrophoben Resten gebildet, die von Aminosäure 15 bis 163 unregelmäßig über den gesamten N-Terminus Gephyrins verteilt sind. Zur Bindung an den GlyR werden beide Elemente benötigt. Das kleinste GlyR-bindende Gephyrinfragment erstreckt sich somit über die Aminosäuren 1-184. Mit einem Kosedimentationsassay wurde die Bindung Gephyrins an Mikrotubuli untersucht. Es stellte sich heraus, daß die vermutete Bindungsstelle nicht zur Bindung an Mikrotubuli benötigt wird. Vielmehr ist der C-terminale Abschnitt Gephyrins hierzu ausreichend. Um Regionen Gephyrins zu finden, die die Autoaggregation vermitteln, wurden Bindungsstudien mit dem Zwei-Hybrid-System und ein heterologes Expressionssystem in Zellkulturen durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß sowohl die N- als auch der C-terminal gelegene Bereich in der Lage sind, mit Gephyrin zu aggregieren. Im C-Terminus wurde die Domäne auf 62 Aminosäuren eingegrenzt. Zur Erfüllung der verschiedenen Funktionen Gephyrins sind die hierfür notwendigen Domänen offensichtlich in modularer Art organisiert. So lässt sich durch alternatives Spleißen eine Variante exprimieren, die den speziellen Erfordernissen der Zelle gerecht wird. In dieser Arbeit wurden mehrere Domänen und Regionen Gephyrins eingegrenzt, deren Aufgaben von der GlyR-Bindung über die Autoaggregation zur Bildung glyzinerger Proteinkomplexe und der Verknüpfung mit dem Zytoskelett reichen. Somit konnte ein Beitrag zum weiteren Verständnis über die glyzinerge Synapse geleistet werden.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
Rezeptortyrosinkinasen der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) sind in vielen Krebsarten dereguliert und ursächlich an der malignen Transformation beteiligt. Da die Aktivierung vom Rezeptor ausgehender Signaltransduktionskaskaden auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen basiert, kann durch gezielte Interferenz mit diesen Interaktionen das proliferative Signal ausgeschaltet und das Tumorwachstum angehalten werden. Für diese gezielte Interferenz wurde in der vorliegenden Arbeit das Peptid-Aptamer-System eingesetzt, mittels dem Peptide, die in ein Gerüstprotein inseriert sind, aufgrund ihrer Affinität zu einem Zielprotein selektiert werden können. Drei Peptid-Aptamere (KDI1, KDI3, KDI4), die spezifisch mit dem EGF-Rezeptor interagieren, konnten isoliert werden. lntrazelluläre Expression von Peptid-Aptamer KDI1 oder Einbringung des bakteriell exprimierten Peptid-Aptamers KDI1 mittels einer Proteintransduktionsdomäne führte zu reduzierter EGF-abhängiger Proliferation und Transformation. Durch Interferenz des Aptamers mit dem EGF-Rezeptor war die EGF-induzierte Phosphorylierung von Tyrosin 845, 1068 und 1148, sowie die Aktivierung von p46 Shc und STAT3 reduziert. Daher wurde gefolgert, dass das Peptid-Aptamer die EGF-abhängige Rekrutierung der zytoplasmatischen Kinase c-Src an den Rezeptor inhibiert. Durch Fusion einer zusätzlichen Domäne wie der SOCS-Box-Domäne konnte den Peptid-Aptameren eine zusätzliche inhibitorische Funktion gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eine Domäne, die spezifisch Kontakt mit E3-Ubiquitin-Ligasen aufbauen kann. Es konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion eines solchen Peptid-Aptamers der Rezeptor spezifisch ubiquitinyliert und damit degradiert wird. Das Peptid-Aptamer-System eignet sich somit dazu, Inhibitoren für vorgegebene Zielmoleküle zu isolieren, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Tumortherapie Anwendung finden können.
In dieser Arbeit wurde die Kinetik von zwei Ca2-plus-aktivierten Membranproteinen untersucht: zum einen des endogenen Ca2-plus-aktivierten Chloridkanals der Xenopus-Oozytenmembran, zum anderen des heterolog in Oozyten exprimierten Na-plus-Ca2-plus-Austauschers NCX1, kloniert aus dem Meerschweinchen-Herzen. Der Ca2-plus-aktivierte Chloridkanal wird durch intrazelluläres Ca2-plus im submikromolaren Konzentrationsbereich (KD = 0.5 µMCa2-plus) aktiviert und hat eine hohe Permeabilität für Chloridionen. In der ausgereiften Eizelle spielt er eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Fertilisationspotentials und verhindert durch eine Depolarisation der Membran eine Polyspermie. Der Na-plus-Ca2-plus-Austauscher ist in der Herzmuskelzelle für die Ausbildung des Exzitations- Kontraktions-Zyklus von Bedeutung, indem er für die Aufrechterhaltung des Ca2-plus- Gradienten (freies Ca2 intrazellulär ungefähr gleich 100 nm, extrazellulär ungefähr gleich 2 mM) über die Plasmamembran verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen transportiert der Na-plus- Ca2-plus-Austauscher ein Ca2-plus-Ion im Austausch gegen drei Na-plus-Ionen aus der Zelle hinaus, und nutzt somit den Na-plus-Gradienten neben dem Membranpotential als treibende Kraft. Als Messmethode wurde die Patch-Clamp-Technik in der inside-out-Makro-Patch- Konfiguration verwendet. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt definierte ionale Bedingungen auf beiden Seiten der Membran. Cytoplasmatische Ca2-plus-Konzentrationssprünge wurden zum einen durch Lösungswechsel, insbesondere aber durch die Photolyse von DM-Nitrophen, einem photolabilen Ca2-plus-Chelator, hervorgerufen. Die Photolyse von DM-Nitrophen erlaubte, im Vergleich zum Lösungswechsel, sehr schnelle Ca2-plus- Konzentrationssprünge (Ca2-plus-Freisetzungsrate mindestens 38000 s-1). Die kinetischen Untersuchungen am Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal haben neue, über bisherige aus dem Lösungswechselexperiment bekannte hinausgehende, Erkenntnisse ergeben: Nach einem schnellen Ca2-plus-Konzentrationssprung geht dem Signalanstieg auf einen stationären Wert eine deutlich schnellere Verzögerungsphase (lag-phase) voraus. Sowohl der Signalanstieg als auch die Verzögerungsphase zeigen eine starke Ca2-plus-Abhängigkeit, sind aber nur sehr schwach spannungsabhängig. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Signalanstieg den spannungsabhängigen Ca2-plus-Bindungs-/Dissoziationsschritt von mindestens zwei Ca2-plus-Ionen widerspiegelt, während das spannungsunabhängige Kanalöffnen/ -Schließen durch die Verzögerungsphase repräsentiert wird. Bei Spannungssprungexperimenten mit hoher Zeitauflösung konnte eine schnelle Inaktivierung nach einer Depolarisation der Membran gesehen werden, die in Gegenwart von sättigenden intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationen zu einer Einwärtsgleichrichtung der Strom-Spannungskennlinie des stationären Stroms führt. Mit diesen Erkenntnissen konnte ein Reaktionsmodell für den Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal aufgestellt werden, mit dem sich die experimentellen Daten simulieren ließen. Die heterologe Expression des Na-plus-Ca2-plus-Austauschers in Oozyten hat zu einem deutlich verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu früheren Messungen am nativen Austauscher in Cardio-Myocyten-Membranen geführt. Mit Hilfe der Photolyse von DM-Nitrophen konnte erstmals eine vollständige Ca2-plus- und Spannungsabhängigkeit des vorstationären Einwärtsstroms, hervorgerufen durch einen cytoplasmatischen Ca2-plus-Konzentrationssprung, durchgeführt werden. Sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus- Austauschmodus zeigt sich ein transientes Einwärtsstromsignal (Anstieg messtechnisch nicht auflösbar), das sehr schnell relaxiert. Im Ca2-plus-Ca2-plus-Austauschmodus zeigt sich nur ein transientes Stromsignal (kein Nettoladungstransport im stationären Zustand), während im Na-plus-Ca2-plus-Austausch sich ein stationärer Einwärtsstrom einstellt. Das transiente Stromsignal hat eine deutliche Ca2-plus-Abhängigkeit sowohl für den Spitzenstrom (KM = 30.9 ± 3.0 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 57 ± 10 µM im Ca2-plus- Ca2-plus-Austausch) als auch für die Geschwindigkeitskonstante 1/t des Signalabfalls (KM = 98.5 ± 21.3 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 76 ± 11 µM im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch) gezeigt. Die Relaxation des Stromtransienten erfolgt sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus-Austausch mit einer maximalen Geschwindigkeitskonstanten von ungefähr gleich 10000 s -1 nach sättigenden Ca2-plus-Konzentrationssprüngen. Der Signalabfall hat sich über den gesamten untersuchten Ca2-plus-Konzentrationsbereich als spannungsunabhängig herausgestellt, während der Spitzenstrom bei positiven Membranpotentialen deutlich abnimmt. Dies führt zu einer Spannungsabhängigkeit der verschobenen Ladung (Integral des transienten Stromsignals) im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch. Aus diesen Erkenntnissen konnte für den Ca2-plus- Translokationszweig (im Rahmen eines konsekutiven Transportmodells) folgendes Reaktionsschema aufgestellt werden: Einem spannungsunabhängigen, sehr schnellen Ca2-plus- Bindungs/-Dissoziationsschritt (diffusionskontrolliert) auf der intrazellulären Membranseite folgt ein ebenfalls spannungsunabhängiger, aber ratenlimitierender Schritt (intrazellulärer Okklusionsschritt, asymmetrische Raten: 10000 vs. 1000 s-1). Der nachfolgende Ca2-plus-Translokationschritt muss sehr hohe Hin- und Rückraten aufweisen (ungefähr gleich 20000 s-1). Die Ca2-plus-Dissoziation/-Bindung auf der extrazellulären wird als sehr schnell (diffusionskontrolliert) und spannungsunabhängig angenommen. Weitergehende Einblicke haben der Sr2-plus-Ca2-plus- und der Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch geliefert. Während der Sr2-plus-Ca2-plus-Austausch nahezu das gleiche Verhalten wie der Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch gezeigt hat, konnte nach einem intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationssprung im Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch erstmals eine zusätzliche langsame Phase im Abklingen des transienten Einwärtsstromsignals beobachtet werden. Das transiente Signal hat im Vergleich zum Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch eine signifikant höhere Ladungsverschiebung aufgewiesen. Dies deutet auf einen zusätzlichen elektrogenen Reaktionsschritt hin (extrazelluläre Ca2-plus-Okklusion). Weitere elektrogene Schritte müssen im Na-plus-Translokationszweig (Na-plus-Bindungs- und Na-plus-Translokationsschritt) liegen. Mit den aus diesen Erkenntnissen aufgestellten Reaktionsschemata ließen sich die experimentellen Daten erfolgreich simulieren. Die Gesamttransportrate im Na-plus-Ca2-plus- Austausch liegt demnach bei ungefähr gleich 1000 s-1 bei Raumtemperatur und stimmt damit mit Literaturwerten von mehreren 1000 s-1 bei physiologischer Temperatur überein.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
The light-harvesting chlorophyll a/b protein complex (LHC-II) is the major collector of solar energy in all plants and it binds about half of the chlorophyll in green plants. LHCII is a trimer in the photosynthetic membrane; each monomer consists of 232 amino acids, binds and orients a minimum of 12 chlorophyll molecules and three caroteinoids (two luteins and one neoxanthin) for light-harvesting and energy transfer. Although, the structure of LHC-II has been determined at 3.4 Å resolution by electron microscopy of two-dimensional crystals (Kühlbrandt et al., 1994), this is not sufficient to allow a complete understanding of the mechanism of energy transfer from LHC-II to the reaction centre, since the effective resolution in the z dimension is 4.9 Å. In fact, the chemical difference between Chl a and Chl b, which has a formyl group instead of the methyl group at the 7-position in the chlorin ring, is too small to be detected at this level of resolution. In addition, the orientation of the chlorophyll tetrapyrroles have not been determined unambiguously. This information is essential for a detailed understanding of the energy transfer within the complex and to the reaction centres of photosystem II and I (PSII and PSI). X-ray crystallography of three dimensional (3D) crystals may yield a more complete structure at high resolution. 3D crystals have been grown from LHC-II isolated from pea leaves using a standard purification procedure (Burke et al., 1978). The thylakoid membranes are solubilised in Triton X-100 and further purified by sucrose gradient ultra centrifugation. The LHC-II fraction is salt precipitated and pellets resuspended at the chlorophyll a/b ratio 2.8 mg/ml in 0.9 % Nonyl-glucoside. Crystals are currently obtained by vapour diffusion in hanging drops. These crystals are thin hexagonal plates, have a fairly large unit cell and diffract quite weakly. The high level of the background is due both to the detergent, necessary for protein solubilisation, and lipids, required for the trimer and crystals formation. However, three data sets, each from one single crystal have been collected up to 3.2 Å resolution over a rotation range of 135°. The crystals were exposed to a very highly collimated and brilliant beam (ID-14 EH1 at ESRF, Grenoble, France) and were kept under a stream of cold nitrogen to prevent radiation damage. Data were successfully integrated using the program XDS by Kabsch (1993). The crystals were found to belong to the space group P6 22 3 and have unit cell dimensions of a=128.45, b=128.45, c=135.32, a= ß=90º, ?=120. The solution of the phase problem was tackled by molecular replacement using, as a search model, the LHC-II structure solved by electron cryo-microscopy studies of twodimensional crystals (Kühlbrandt et al. 1994). Three different programs were tested: the most used AMoRe (Navaza et al., 1994) and the brute force based program Brute (Fujinaga
In der vorliegenden Dissertation wurden Antikörperfragmente, um sie zu oligomerisieren, an alpha-Helixbündel rekombinant fusioniert und die Fusionsproteine sowie deren Produktion untersucht. Dabei wurde durch Fusion eines Fv-Antikörperfragmentes an das trimere alpha-Helixbündel "Coil-Ser" das Fusionsprotein "Fv7E2-CS" entwickelt. Wegen der Fusion an Coil-Ser liegt das Ev-Fragment selbst in trimerem Zustand vor und kann auch sein Antigen, eine Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitri/icans, binden und dadurch trimersieren. Antikörper gehören zur Immunabwehr der Wirbeltiere und sind Proteine, die in den Organismus eingedrungene, fremde Moleküle als "Antigene" spezifisch binden. Im momentan stark expandierenden Forschungsgebiet des "Antikörper-Designs" werden Antikörper und ihre Fragmente modifiziert, was besonders für die Entwicklung medizinischer Diagnostiken und Therapien vielversprechend ist. Eines der vielen Ziele ist die Steigerung der Bindungsaffinitäten, was unter anderem über die Vervielfältigung der natürlichen Bindestellen innerhalb eines künstlichen Antikörpermoleküls erreicht werden kann. Weiterhin möchte man Bindestellen gegen unterschiedliche Antigene in einem einzigen Antikörpermolekül vereinen, um dem Antikörper komplexere Funktionsfähigkeiten zu verleihen. Beide Ziele können durch Oligomerisierung der bindenden Antikörperfragmente verwirklicht werden. Zur künstlichen Oligomerisierung von Antikörperfragmenten wurde, neben anderen Strategien, die rekombinante Fusion an alpha-Helixbündel bereits einige Male erfolgreich angewandt. alpha-Helixbündel bestehen aus zwei bis etwa acht alpha-helikalen, längsseitig miteinander oligomerisierenden Peptidketten und können auch in natürlichen Proteinen als Oligomerisierungseinheiten fungieren. In der vorliegenden Dissertation wurden drei Fv-Antikörperfragmente und ein SchwerkettenAntikörperfragment mit drei verschiedenen alpha-Helixbündeln in unterschiedlichen Kombinationen rekombinant fusioniert und anschließend ihre Produktion und Funktion untersucht. Als Helixbündel zum Einsatz kamen das heterotetramere alpha-Helixbündel des neuronalen "SNARE"-Komplexes, die homo- als auch mit "Fos" heterodimerisierende Helix des AP-1-Transkriptionsfaktors ".Jun" und das synthetische, antiparallel homotrimerisierende Peptid "Coil-Ser". Die Expressionsprodukte vieler Fusionen konnten in Zellaufschlüssen mit Western Blots gefunden werden, nur einige aber ließen sich mit Affinitäts-Chromatographie in geringen Mengen (<0,1 mg/L Kultur) anreichern. Andere Produkte, bzw. bei einigen Fv-Fragmenten die Untereinheiten mit Peptid, waren durch die Fusion in ihrer Produktion deutlich gestört bis gar nicht vorhanden. Alle drei an Coil-Ser fusionierten Ev-Fragmente ließen sich in Mengen bis 0,5 mg/L Kultur anreichern. In der Gelfiltration zeigten sie sich mit vollständig assoziierten Untereinheiten, als auch mit vergrößerter, apparenter Molmasse im Vergleich zu den Fv-Fragmenten ohne fusioniertes Peptid. Von zweien der Coil-Ser-Fv-Fragmente konnte Antigenbindung beobachtet werden und davon bei Fv7E2-CS die Entstehung eines Fv-Antigen-Komplexes mit einer gegenüber dem ursprünglichen Antigen-Komplex sehr stark vergrößerten apparenten Molmasse. Mit analytischer Ultrazentrifugation wurde die Oligomerisierungsfähigkeit von Fv7E2-CS näher untersucht und für das ungebundene Fv-Fragment sowie für seinen Antigen-Komplex eine Massenkomponente mit im Vergleich zum jeweiligen Monomer dreifacher Molmasse gefunden. Für die Probe des Fv7E2-CS alleine wurde dabei ein Anteil an Komponenten trimerer Größenordnung von gut 95% ermittelt, also nahezu Homogenität, und in der Probe des Antigen-Komplexes zu 35 - 50 % Komponenten trimerer, sonst monomerer Größenordnung. Die Ursache für den niedrigeren Anteil an trimeren Komponenten in der Probe des Komplexes könnte hauptsächlich das hier vorhandene Detergenz sein, welches für das als Antigen fungierende Membranprotein Cytochrom-c-Oxidase nötig ist. Denn schon für das Fv7E2-CS alleine wurde in Kontrollen mit Detergenz eine Verringerung des Anteils an trimerer Komponente bzw. seiner mittleren Molmasse festgestellt. Das Fv-Fragment Fv7E2 ohne Peptid als auch dessen Antigen-Komplex zeigten in der Ultrazentrifuge keine bzw. nur unbedeutende Anteile an trimeren Massenkomponenten. Die Experimente deuten somit daraufhin, daß durch die Fusion des trimerisierenden Peptides Coil-Ser an Fv7E2 sowohl die Trimerisierung des Fv-Fragmentes, als auch bei Bindung des Antigens dessen Trimerisierung bewirkt wird. Das alpha-Helixbündel Coil-Ser ist folglich potentiell in der Lage, als Oligomerisierungseinheit für Fv-Antikörperfragmente eingesetzt zu werden. Wegen der aus Röntgenstrukturanalysen bekannten und für in Lösung prognostizierten Antiparallelität der Peptide im Coil-Ser-Bündel werden für die drei Fv-Fragmente bzw. die drei Bindestellen im Coil-Ser-Fusionsprotein einander entgegen-gesetzte Orientierungen vermutet, was für spätere Anwendungen von Bedeutung ist.
Das Angiotensin konvertierende Enzym (ACE) ist als eine der zentralen Komponenten des ReninAngiotensin-Systems entscheidend an der Regulation der vaskulären Funktion und Homöostase sowie an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushaltes beteiligt. Dabei katalysiert die Zinkmetallopeptidase ACE vor allem die Bildung des vasokonstriktorisch wirkenden Angiotensins II und die Degradation des vasodilatorisch wirkenden Bradykinins. Die Hemmung des ACE zur antihypertensiven Therapie ist klinisch weit verbreitet, wobei die zahlreichen protektiven Eigenschaften der eingesetzten, hochpotenten ACE-lnhibitoren nicht allein durch die Beeinflussung des Metabolismus der zwei beschriebenen vasoaktiven Peptide zu erklären sind. Vielmehr wird seit einiger Zeit angenommen, dass ACE beispielsweise durch eine Interaktion mit dem Bradykinin-B2-Rezeptor aktiv an der Regulation intrazellulärer Signaltransduktionsprozesse beteiligt ist. Da ACE als plasmamembranäres Ektoenzym in seiner kurzen cytoplasmatischen Sequenz fünf potentiell phosphorylierbare Serinreste besitzt, deren posttranslationale Modifikation durch Phosphorylierung möglicherweise intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden beeinflussen könnte, wurde die potentielle Phosphorylierung von ACE sowie die Assoziation von ACE mit intrazellulären Proteinen analysiert. Mittels 32P-Markierung humaner Endothelzellen und ACE-überexprimierender Schweineaortenendothelzellen konnte erstmals die Phosphorylierung des ACE gezeigt werden, sowie unter Verwendung spezifischer Kinaseinhibitoren und anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten die Proteinkinase CK2 als ACE-phosphorylierende Kinase identifiziert werden. Dies wurde zudem durch die Assoziation der CK2 sowohl mit ACE, als auch mit einem dem cytoplasmatischen Anteil von ACE entsprechenden Peptid bestätigt. Drei der intrazellulären Serinreste des ACE liegen innerhalb Konsensusse1uenzen bekannter Proteinkinasen, wobei nach Punktmutation der Serinreste Ser1253, Ser1263 oder Ser1270, entsprechend in Konsensussequenzmotiven für die PKC, PKA oder CK2 lokalisiert, der Ser1270-Rest als Hauptphosphorylierungsstelle des ACE identifiziert werden konnte. Die Reduktion der ACE-Phosphorylierung nach Mutation des Ser1270 zu Alanin sowie nach Hemmung der CK2 durch Einsatz des spezifischen lnhibitors 5,6-Dichloro-1-ß-D-ribofuranosylbenzimidazol (DRB) resultierte in einer verstärkten proteolytischen Spaltung des ACE, weiche extrazellulär in der juxtamembranär gelegenen "Stalk"-Region des Enzyms erfolgt, so dass vermehrt sekretiertes lösliches ACE in den Zellkulturüberständen der untersuchten Zellen zu finden war. Neben der CK2 fanden sich auch die schwere Kette nicht-muskulären Myosins (NMMHC), ß-Aktin, Annexin 2, die c-Jun NH2-terminalen Kinase (JNk) und die Proteinphosphatase PP1 assoziiert mit ACE oder einem dem intrazellulären Anteil von ACE entsprechenden Peptid. Da die an ACE gebundenen Proteine mehr oder minder in die Regulation intrazellulärer Signaltransduktionskakaden involviert sind, wurde überprüft, inwiefern die Aktivität oder Phosphorylierung dieser Proteine durch die Hemmung des ACE beeinflusst werden kann. Die Behandlung P-markierter Endothelzellen mit dem ACE-lnhibitor Ramiprilat resultierte deutlich nicht nur in einer transient gesteigerten Phosphorylierung des ACE selbst, sondern auch in einer verstärkten Phosphorylierung des ACE-gebundenen NMMHC. Dabei werden beide Proteine durch die ACE-assoziierte CK2 phosphoryliert, deren Aktivität deutlich nach Hemmung des ACE zunahm. Die Identität des ACE als aktives Signaltransduktionsmoleküi wurde zudem sehr überzeugend durch die Messung der JNK-Aktivität bestätigt, da die Stimulation mit Ramiprilat nur in Wildtyp-ACE exprimierenden Endothelzelien in einer Aktivierun dieser Kinase resultierte, wohingegen nach Mutation der ACE-Phosphorylierungsstelle (Ser1270) keine durch Ramiprilat gesteigerte JNK-Aktivität zu verzeichnen war. Ebenso führte neben der Hemmung des ACE die Stimulation mit dem ACE-Substrat Bradykinin zur lnitiation der beschriebenen Prozesse. Die durch ACE-lnhibitoren induzierte Signaltransduktion scheint auch an der Potenzierung und Reaktivierung der durch Bradykinin vermittelten Zellaktivierung beteiligt zu sein, da nur in ACE-exprimierenden Zellen die Hemmung der CK2 in einer verminderten Bradykinin-induzierten Endothelzellaktivierung resultierte und der ACE-lnhibitor diese Reduktion vollständig umkehrte. Die Entdeckung der posttranslationalen Modifikation des ACE durch Phosphorylierung zur Regulation der Sekretion des Enzyms sowie zur lnitiation intrazellulärer Signalkaskaden eröffnet eine neue molekulare Basis für das Verständnis und die Charakterisierung der zahlreichen protektiven Eigenschaften der ACE-lnhibitoren. Zudem liefert die Identifizierung des ACE als aktives Signaitransduktionsmolekül mit der Fähigkeit zum "Outside-In-Signaling" möglicherweise neue Ansatzpunkte für die Entwicklung antihypertensiver Therapien.
Enzyme der Cytochrom P450 (CYP) 2C Familie werden extrahepatisch vor allem in Endothelzellen exprimiert und liefern durch Metabolisierung der Arachidonsäure zu Epoxyeicosatriensäuren (EET) einen den Gefäßtonus modulierenden Faktor, den sogenannten endothelialen hyperpolarisierenden Faktor (EDHF), der zur Relaxation des glatten Gefäßmuskels führt. Neben dieser wichtigen Funktion als EDHF-Synthase beeinflussen diese Enzyme (CYP-Epoxygenasen) weitere zentrale Signalwege der Endothelzellen und tragen so zur vaskulären Homöostase bei. So wurde beschrieben, dass EET u.a. antiinflammatorische und fibrinolytische Eigenschaften besitzen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung weiterer Funktionen der CYP Epoxygenasen in Endothelzellen. Zunächst wurden physiologisch und pharmakologisch relevante Einflüsse auf die Expression der endothelialen CYP 2C lsoformen untersucht. Im Gegensatz zu der deutlichen CYP 2C Expression in nativen Endothelzellen, ist die Expression in kultivierten Endothelzellen drastisch reduziert. Es wurde gezeigt, dass kultivierte Endothelzellen, die einer kontinuierlichen, rhythmischen Dehnung (18 Stunden) ausgesetzt waren, eine signifikant höhere CYP 2C Expression verglichen mit unter statischen Bedingungen kultivierten Endothelzellen aufweisen. Ebenso bewirkte zyklische Dehnung (sechs Stunden) von endothelintakten Koronarsegmenten eine Induktion der endothelialen CYP 2C Expression. Diese Befunde zeigen, dass pulsatile Dehnung von Endothelzellen, ein kontinuierlicher hämodynamischer Stimulus in vivo, wesentlich zu dem physiologischen Expressionsniveau von CYP Epoxygenasen beiträgt. Auch eine Reihe kardiovaskulärer Pharmaka beeinflussen die Expression von CYP Epoxygenasen. Inkubation kultivierter Endothelzellen bzw. endothelintakter Gefäßsegmente mit dem lnsulinsensitizer Troglitazon und den Statinen Cerivastatin und Fluvastatin ergab eine deutliche Expressionserhöhung der endothelialen CYP 2C Isoformen. Die physiologische Bedeutung der verstärkten Expression konnte mit der einhergehenden, verbesserten EDHF-vermittelten glattmuskulären Relaxation demonstriert werden. Der Effekt endothelialer CYP 2C9 Expression auf die Proliferation wurde in weiteren Experimenten untersucht. Hierzu wurden kultivierte Endothelzellen eingesetzt, die mit CYP 2C9 Expressionsvektoren (adenovirale Infektion bzw. liposomale Transfektion) transfiziert wurden. In diesen CYP 2C9 überexprimierenden Endothelzellen konnte der proliferative Effekt des Enzyms demonstriert werden, da sie sowohl eine verstärkte DNA-Synthese als auch eine erhöhte Zellzahl im Vergleich zu Kontrollvektor-behandelten Zellen zeigten. Als weiteren Marker einer Proliferation ließ sich eine erhöhte Expression des zellzyklusregulierenden Proteins Cyclin Dl nachweisen. Eine verstärkte Phosphorylierung und Aktivierung des EGF Rezeptors in CYP 2C9 überexprimierenden bzw. EET behandelten Zellen gab einen deutlichen Hinweis auf die Beteiligung des EGF Rezeptor-Signalweges an diesem proliferativen Prozess. Diese Hypothese wurde durch den Befund belegt, dass lnkubation mit dem EGF Rezeptor lnhibitor AG 1478 zur Hemmung der CYP 2C9-induzierten Proliferation führte. Die Aktivierung des EGF Rezeptors bewirkte des weiteren die verstärkte Phosphorylierung der Proteinkinase B/Akt. Neben dem proliferativen Effekt konnte sowohl für CYP 2C9 als auch für EET ein angiogenetischer Effekt demonstriert werden. Im in vitro Angiogenese-Assay führten CYP 2C9-Uberexpression und exogene Stimulation mit 11,12-EET zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen, die bei Kontrollzellen nicht zu finden waren. Ebenso bewirkten 11,12-EET in vivo (chick chorioallantoic membrane-assay) eine signifikant verstärkte Gefäßneubildung, die sich, wie die induzierte Endothelzellproliferation, als EGF Rezeptor-vermittelt erwies. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des CYP 2C9 als endotheliale Quelle physiologisch relevanter Mengen reaktiver Sauerstoffspezies analysiert. Mit unterschiedlichen Methoden konnte in kultivierten Endothelzellen sowie in endothelintakten Koronarsegmenten gezeigt werden, dass CYP 2C9 nicht nur EET, sondern auch Sauerstoffradikale bildet. Diese Erhöhung des oxidativen Stress führte in Endothelzellen zur Aktivierung des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors NF-KB und zur verstärkten Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Expression von CYP 2C9 in Endothelzellen relevante, physiologische Funktionen wie Induktion von Proliferation und Angiogenese sowie Modulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren bedingt. Da EET über die Hemmung der NF-KB Aktivierung antiinflammatorische Effekte ausüben, die CYP 2C9-abhängige Bildung von O2- durch Aktivierung von NF-KB jedoch proinflammatorisch wirkt, sind grundsätzlich gegenläufige, CYP 2C9-induzierte Effekte möglich. Unter welchen Bedingungen EET oder Sauerstoffradikale eine funktionelle Dominanz ausüben, müssen weitere Studien klären.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.
Im ersten Abschnitt der Doktorarbeit wurden kurze alpha-helikale Modellpeptide mit Oligosacchariden, die Teile der Core-Region der N-Glycane bilden, N-glycosyliert, um den konformationellen Effekt der N-Glycosylierung auf das Peptidrückgrat zu untersuchen. CD- und NMR-Untersuchungen ergaben, daß die Konformation der N-Glycopeptide durch die Größe der angehängten N-Glycanreste und die Wahl der Aminosäurereste nahe der Glycosylierungsstelle beeinflußbar war. Die signifikantesten konformationellen Änderungen ergaben die N-Glycosylierung mit einem Monosaccharid beziehungsweise einem Pentasaccharid. Die Kombination von organischer Synthese mit biologischen Methoden ermöglicht es heute, neben den 20 natürlichen Aminosäuren, auch unnatürliche Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine einzubauen. Dabei wird das Codon für die jeweilige Aminosäure durch Oligonucleotid-Mutagenese durch das Nonsense-Codon UAG ersetzt. Für dieses spezielle Codon wird eine Suppressor-tRNA hergestellt und in vitro chemisch mit der gewünschten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Mit dem späteren Ziel einer in vitro-N-Glycoproteinsynthese wurde hier die Darstellung von N-glycosylierten Aminosäuren und der Versuch der Anknüpfung an ein Dinukleotid pdCpA beschrieben. Die für die Aminoacylierung des Dinukleotids geeigneten Zuckeraminosäuren trugen Nterminal die photochemisch abspaltbare NVOC-Schutzgruppe, Acetylgruppen an den Zucker-OH-Funktionen und eine Cyanomethylaktivesterfunktion am C-Terminus. Die Aminoacylierungsreaktionen führten nicht zu dem gewünschten N-Glycosylaminoacyldinukleotid. Insbesondere durch die Wahl anderer Zuckerschutzgruppen sollte dennoch die Acylierung des Dinukleotids pdCpA mit einer N-glycosylierten Aminosäure gelingen. Der dritte Teil der Doktorarbeit beinhaltete die Synthese eines Prionen-N-Glycoproteins über chemische Ligation eines Thioesters mit einem Cystein-Peptid. Die Verknüpfung von Peptidfragmenten erlaubt die selektive Isotopen-Markierung, was die Strukturaufklärung mit Hilfe der NMR-Spektroskopie enorm vereinfacht. Die Funktion der Glycosylierung des Prionenproteins scheint in wenigen Aspekten geklärt zu sein. Unklar ist, ob die N-Glycosylierung auch die Konformation des Prionenproteins verändern kann. Ein kurzes Prionen-N-Glycopeptidfragment SHA PrP172-194 aus der Helix B des Prionenproteins wurde der Strukturanalyse unterzogen, wobei ein Effekt der NGlycosylierung auf die Konformation des Peptidrückgrats verzeichnet werden konnte. Motiviert durch diese Ergebnisse wurden in der Doktorarbeit das Prionenproteinfragment SHA PrP12l-178 als N-terminales Thioesterfragment und das Fragment SHA PrP179-231 als C-terminales Cystein-Peptid mit Festphasenpeptidsynthese dargestellt. Mit diesen wasserlöslichen Proteinfragmenten wurde erfolgreich eine chemische Ligation unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Da man selektiv Isotopen-markierte Proteine herstellen wollte, war man auf die biochemische Expression des N-terminalen Thioesterfragments SHA PrPl2l-178 angewiesen. Dr. S. Becker (Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen) gelang die Expression eines unmarkierten Prionen-Inteinfusionsproteins, aus dem durch Thiol-vermittelte Inteinspaltung ein Thioester generiert werden konnte. Auch mit diesem biochemischen Ligationsansatz konnte das Fragment SHA PrP121-23l erhalten werden. Ein N-glycosyliertes Prionenfragment SHA PrP179-231 wurde in der vorliegenden Doktorarbeit ebenfalls dargestellt und steht für Intein-vermittelte Ligationsreaktionen zur Verfügung.
Mit Hilfe der direkten Nachweismethode von Singulettsauerstoff über die 1O2-Phosphoreszenzemission bei 1270 nm wurden zeitabhängige Messungen durchgeführt, mit denen größtenteils die jeweiligen Reaktionsmechanismen der Perhydrolyse von Nitrilen, Chlorameisensäureestern und Acetamid sowie von Natriumcyanat und teilweise von Benzoylsäurechloriden ermittelt werden konnten. Über den Mechanismus der erstmals von Radziszewski durchgeführten Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Nitrilen (Radziszewski 1885) bestand bis heute noch keine endgültige Gewißheit. Es konnte nun gezeigt werden, daß im Gegensatz zu dem bisher allgemein akzeptierten Mechanismus von Wiberg (Wiberg 1953) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in wäßriger alkalischer Lösung der heterolytische Zerfall der intermediär gebildeten Peroxoiminosäure ist. Diese Zerfallsreaktion läuft nach einer Reaktion zweiter Ordnung ab und ist stark vorn pN-Wert abhängig. Durch die ph-Abhängigkeit konnten erstmals sowohl die pKs-Werte sowie auch die heterolytischen Zerfallskonstanten kZ, der untersuchten Peroxoiminosäuren abgeschätzt werden. In Gegenwart eines Ketons wird diese Reaktion bei Verwendung von Acetonitril stark beschleunigt. Verwendet man reaktivere Ketone wie zum Beispiel Fluoraceton wird das Zeitgesetz so komplex, daß eine quantitative Auswertung allein anhand der Singulettsauerstoffbildung nicht mehr möglich ist. Im Rahmen der Untersuchung der Nitrile wurde auch die Perhydrolyse des anorganischen Natriumcyanats in alkalischer Pufferlösung untersucht. Der hierbei gefundene Mechanismus unterscheidet sich allerdings von dem der Nitrile. In der ersten Reaktion pseudo-erster Ordnung wird die bisher unbekannte Peroxocarbaminsäure (H2N-C(O)OOH) gebildet, die dann unter Bildung von Ammoniak und dem instabilen Kohlenstoffperoxid (C03) zerfällt. Kohlenstoffperoxid (C03) wird als die Verbindung angesehen, deren Zerfall zur Bildung von Kohlenstoffdioxid und Singulettsauerstoff führt. Bei der Perhydrolyse des Acetamids im basischen Bereich konnten nur bei einem großen Überschuß an Wasserstoffperoxid auswertbare 1O2-Phosphoreszenz-Zeit-Kurven gefunden werden. Weiterhin wurde in THF die Perhydrolyse einiger Chlorameisensäureester in Abwesenheit und Gegenwart von Pyridin studiert. Die Perhydrolyse der Ester führte in Abwesenheit von Pyridin überwiegend zur Ausbildung eines konstanten 1O2-Phosphoreszenzsignal, dem Soge nannten "Chloridsignal", das eindeutig auf die in saurer Lösung durch Chloridionen katalysierte Zerfallsreaktion von Wasserstoffperoxid zurückzuführen ist. Die Induktionszeit, das heißt die Zeit nach der ein Singulettsauerstoffsignal beobachtet wird, korreliert mit der Stärke der elektronenziehenden Estergruppe. Wird die Perhydrolyse der genannten Ester in Gegenwart von Pyridin untersucht, wird die Reaktion bei dem Chlorameisensäuremethylester (CAME), dem Chlorameisensäureethylester (CAEE), dem Chlorameisensäurebenzylester (CABE) und dem Chlorameisensäure-4-nitrobenzylester (CANBE) durch Pyridin sehr stark beschleunigt. Nach Zugabe von Pyridin wird ohne lnduktionsperiode ein intensives 1O2-Phosphoreszenzsignal beobachtet, das nach einer Reaktion pseudo-erster Ordnung abklingt. Vermutlich wird bei den genannten Estern intermediär das N-Peroxocarboxylpvridiniumkation gebildet, welches auf Grund des in alpha-Stellung zur Peroxocarhoxylgruppe stehenden positiv geladenen Stickstoffatoms ein starkes Oxidationsmittel ist. Ferner wurde die Umsetzung von Säurechloriden mit Wasserstoffperoxid untersucht, bei der ebenfalls intermediär eine Peroxosäure gebildet wird, Jedoch war es nicht möglich, den Reaktionsmechanismus tatsächlich aufzuklären.
Das Photosystem II (PSII) und die F1Fo-ATP-Synthase, zwei Membranproteinkomplexen der Energieumwandlung, wurden im Rahmen dieser Dissertation bearbeitet. Mittels zweidimensionaler (2D) Kristallisation und elektronenkristallographischen Methoden sollte die dreidimensionale (3D) Struktur aufgeklärt werden. PSII katalysiert den ersten Schritt der Lichtreaktion der Photosynthese. Es ist für das Einfangen von Lichtquanten, die Anregung von Elektronen, die Freisetzung von Sauerstoff aus Wasser verantwortlich. Über 25 Untereinheiten sind an diesem Prozess in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten beteiligt. Ziel des ersten Projekts war die Verbesserung der 8 Å-Struktur des CP47-RC-Subkomplexes durch neue oder bessere 2D-Kristalle. Die Aufreinigung aus Spinat lieferte reproduzierbar eine gute Ausbeute an aktivem PSII. Das solubilisierte PSII enthielt genug endogenes Lipid, um es ohne den Zusatz von weiterem Lipid direkt durch Mikrodialyse zu rekonstituieren. Während der Rekonstitution verlor der PSII-Komplex CP43 und andere Untereinheiten, wahrscheinlich durch das Detergenz begünstigt, und ergab hoch geordnete Membranen aus CP47-RC. Die besten vesikulären 2D-Kristalle hatten eine tubuläre Morphologie und waren bis zu 1 µm breit und 3 µm lang. Elektronenmikroskopische Bilder unter Cryo-Bedingungen von ihnen aufgenommen zeigten nach der Bildverarbeitung Daten bis 6 Å. Durch Erhöhung der Zinkazetatkonzentration im Dialysepuffer konnten dünne 3D-Kristalle gezüchtet werden, die aus 2D-Kristallstapeln bestanden. Obwohl Elektronenbeugungsmuster Reflexe bis 4,5 Å aufwiesen, konnte auf Grund der unbekannten und veränderlichen Anzahl von Schichten keine 3D-Struktur erstellt werden. Weitere Versuche die Qualität der 2D-Kristalle von CP47-RC zu verbessern waren nicht erfolgreich. Durch die kürzliche Veröffentlichung der Röntgenkristallstruktur des dimeren PSII-Komplexes aus Synechococcus elongatus wurden weitere Untersuchungen eingestellt. Im letzten Schritt der Energieumwandlungskette bildet die F1Fo-ATP-Synthase unter Ausnutzung eines elektrochemischen Gradienten schließlich ATP, die universelle Energieeinheit der Zelle. Die Struktur und Funktion des löslichen, katalytischen F1-Teils sind seit einigen Jahren im Detail bekannt. Im Gegensatz zeichnet sich die Struktur des membranintegrierten, Ionen-translozierenden Fo-Teiles aus den Untereinheiten ab2cx erst langsam ab. Der c-Ring besteht in Hefe aus 10 und in Spinatchloroplasten aus 14 Untereinheiten. Ziel des zweiten Projekts war die Aufklärung der 3D-Struktur des sehr stabilen, undecameren c-Rings aus dem Bakterium Ilyobacter tartaricus, welches Na als Kopplungsion nutzt. Große, tubuläre 2D-Kristalle mit einer Einheitszelle von 89,7 x 91,7 Å und p1-Symmetrie bildeten sich nach der Rekonstitution von gereinigten c-Ringen mit dem Lipid Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin, nachdem das Detergenz durch Mikrodialyse entzogen wurde. Bilder von in Trehalose eingebetteten 2D-Kristallen wurden im Elektronenmikroskop JEOL 3000 SFF bei 4 K aufgenommen. Ein 3D-Datensatz, bestehend aus 58 Bilder bis zu einem Kippwinkel von 45°, ermöglichte die Berechnung einer 3D-Dichtekarte mit einer Auflösung von 4 Å in der Membranebene und 15 Å senkrecht dazu. Die elffach symmetrisierte Karte eines c-Rings zeigt einen taillierten Zylinder mit einer Höhe von 70 Å und einem äußeren Durchmesser von 50 Å, der aus zwei konzentrischen Ringen von transmembranen (-Helices besteht. Ein C-(-Modell der c-Untereinheit, die eine helikale "hair pin" bildet, konnte in die Dichte eingepaßt werden. Die inneren Helices sind nur 6,5 Å (Zentrum-zu-Zentrum-Abstand) von einander entfernt um eine zentrale Öffnung von 17 Å Durchmesser angeordnet. Die dichte Helixpackung wird durch ein konserviertes Motiv aus vier Glycinresten ermöglicht. Jede innere Helix ist mit einer äußeren, C-terminalen Helix über einen kurzen, wohl geordneten Loop auf der cytoplasmatischen Seite verbunden. Die äußere Helix weist in der Nähe der Ionenbindungsstelle einen Knick auf, der gleichzeitig in der Mitte der Membran liegt, wo sich die äußeren und inneren Helices am nächsten kommen. Dadurch wird es möglich, dass die Ionenbindungsstelle aus den Resten von zwei äußeren (Glu65, Ser66) und einer inneren Helix (Pro28) geformt wird. Zur Unterstützung der Ein-Kanal-Modell der Ionentranslokation konnte ein Zugang von der Ionenbindungsstelle zum Cytoplasma durch polare Reste in der c-Untereinheit vorgeschlagen werden. Des Weiteren kann spekuliert werden, dass drei Ionenbrücken zwischen den c-Untereinheiten für die hohe Temperaturstabilität des Oligomers von I. tartaricus verantwortlich sind. Die Vorstellung dieses 3D-Modells des c-Rings ist ein erster Schritt hin zum Verständnis der Kopplung der Ionentranslokation an die Rotation der F1Fo-ATP-Synthase. Wenn die Struktur der a-Untereinheit gelöst worden ist, wird hoffentlich auch der Mechanismus des kleinsten, biologischen Rotationsmotors entschlüsselt werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit unterschiedlichen Aspekten der Faltung von Tendamistat, einem aus 74 Aminosäuren bestehenden a-Amylase lnhibitor aus Streptomyces tendae. Bei der oxidativen Rückfaltung des Tendamistats konnten bisher drei kinetische Phasen (t1, t2 und t3) identifiziert werden. Die mittlere (t2) bzw. langsame (ti) kinetische Phase, resultiert als Folge einer cis/trans lsomerisierung um eine der drei Xaa-Pro Bindungen im Tendamistat. Wie im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, entsteht die prolinabhängige lsomerisierungsreaktion während der Rückfaltung (t3) als Folge einer trans -> cis Umlagerung um die A1a49-Pro50 Amidbindung nach Entfaltung des Proteins. Der Nachweis einer solchen lsomerisierung gelang auf rekombinantem Weg, durch gezielten Austausch der einzelnen Proline. Im Gegensatz dazu resultiert die mittlere kinetischen Phase (t2) als Folge einer Prolin-unabhängigen cis/trans-lsomerisierungsreaktion um mindestens eine vorhandenen nicht-Prolinbindungen im Protein. Diese Schlußfolgerung konnte durch Vergleich mit zahlreichen Literaturdaten und Experimenten weiter gestützt werden. Tendamistat ist damit das erste Protein in der Literatur, bei dem es gelang, eine solche Prolin-unabhängige lsomerisierungsreaktion experimentell nachzuweisen. Wie mit Hilfe von weiteren Substitutionsexperimenten im zweiten Teil der Arbeit gezeigt werden konnte, tragen hydrophobe Oberflächencluster entscheidend zur Stabilisierung des lnhibitors bei. Die dabei gemessenen Stabilisierungsbeiträge stehen in einem linearen Verhältnis zum Seitenkettenvolumen der eingeführten Aminosäurereste (Alanin << Valin << Isoleucin). Hierdurch ließ sich zeigen, daß der stabilisierende Einfluß solcher Cluster im Wesentlichen auf das Vorhandensein von hydrophoben Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Für die Faltung von Proteinen, die wie das Tendamistat ausschließlich aus ß-Faltblättern bestehen, spielt die Bildung von ß-Hairpinstrukturen eine entscheidende Rolle Die in dieser Arbeit untersuchten ß-Hairpinmutanten L14A bzw. N25A zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine extreme Destabilisierung der ß-Faltblattstruktur. Durch Vergleich der Aktivierungsenergien (DeltadeltaGD-TS) mit den freien Enthalpien (DeltadeltaG0N-D) konnte die strukturelle Entwicklung des ß-Hairpins im Übergangszustand an den beiden Positionen 14 bzw. 25 mitverfolgt werden (~-Wert Analyse). Entgegen den Erwartungen zeigen diese Untersuchungen, daß beide Positionen im Übergangszustand noch weitestgehend solvatisiert vorliegen. Damit scheint die nativ-ähnliche Zusammenlagerung des ersten ß-Hairpins erst nach Erreichen des Übergangszustands stattzufinden. Alle in dieser Arbeit vorgelegten Daten über die Faltung des alpha-Amylase lnhibitors sind konsistent mit dem Nukleations-Kondensations Modell. Analog der Tröpfchenbildung bei unterkühlten Gasen kommt es nach dem kollabieren der Proteinkette als Reaktion auf die veränderten Lösungsmittelbedingungen zur intramolekularen Suche nach Nukleationsstellen. Der Übergangszustand wird erreicht, wenn sich eine kritische Zahl stabilisierender Kontakte (unspezifische Nukleation) ausbilden konnte. Ob an einem solchen Nukleationskern stets bestimmte Seitenketten beteiligt sind (spezifische Nukleation), bleibt an dieser Stelle noch offen.
Die vorgelegte Arbeit beschäftigte sich zunächst mit der Synthese von neuen 3'- und basenmodifizierten Nukleotiden und deren Markierung mit Fluoresceinisithiocyanat. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der synthetisierten Verbindungen auf ihre Eignung als Terminatoren für die enzymatische DNA-Sequenzierung. Die Synthese des neuen Thioamidtriphosphats 3'- [[6-Amino- 1 -thioxohexyl) amino] -3'-konnte in 10 Schritten ausgehend vom Thymidin erfolgreich durchgeführt werden. Zunächst erfolgte die Umsetzung zum 3'-Amino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-desoxythymidin, an dessen 3'-Aminofunktion ein Aminocapronsäurelinker angekuppelt wurde. Der Schlüsselschritt der Synthese war die Beschwefelung der so generierten 3'-Amidfunktion mittels Lawesson's Reagenz. Dabei konnte durch Optimierung der Synthesebedingungen die Ausbeute der Beschwefelungsreaktion um 30 % gesteigert werden. Das Thioamid 3' -Desoxy-5 '-0- (4,4'-dimethoxytrityl) -3'- {{6-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)-carbonyl] -amino}-1-thioxohexyl}amino}thymidin wurde zum Triphosphat umgesetzt und anschliessend FITC markiert. Für die Synthese des N2-modifizierten 2-Pentylamin-2',3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphats 43 wurden Synthesewege beschritten. Schliesslich führte der Trick des Ausnutzens von Desmethylwyosin als Schutzgruppe zum Erfolg. Ausgehend vom 2'-Desoxyguanosin konnte die Synthese der unmarkierte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 41 in 8 Schritten und die des Triphosphats 2-Pentylamin-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 43 und dessen FITCMarkierung in 12 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Die 5'-entschützte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde erfolgreich zum Triphosphat umgesetzt. Die Verbindung 5'-0- (tert-Butyldimethylsilyl)-2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde Azid überführt. Das anschliessend synthetisierte Triphosphat 2-Pentylazid-2',3-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 42 wurde reduziert und über die entstandene freie Aminofunktion mit FITC markiert. Alle neuen Triphosphate konnten durch optimierte Aufreinigungsbedingungen in hochreinem, salzreien Zustand isoliert werden. Vor dem Einsatz als Terminatoren für die DNA-Sequenzierung wurden alle Triphosphate als Na-Salze gefällt. Die synthetisierten Thioamidtriphosphate sind im Laufe dieser Arbeit als neue Verbindungen synthetisiert und veröffentlicht worden. Die hergestellten N2 - modifizierten Didesoxyguanosintriphosphate sind bisher nicht beschrieben und neue Vertreter ihrer Verbindungsklasse. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die neuen, modifizierten Triphosphate 39, 40, 41, 43 und 44 auf ihre Eignung als Terminatoren für die Sanger-DANN-Sequenzierung getestet. Dabei wurden fünf verschiedene Polymerasen eingesetzt: Die thermostabilen Polymerasen AmpliTaq, Taq(exo-), Vent(exo-), Bst und die nicht thermostabile T7 Polymerase. Die besten Ergebnisse konnten mit der T7 Polymerase erreicht werden. Alle getesteten Terminatoren wurden als Terminatoren von der T7 Polymerase akzeptiert. Die entsprechenden Sanger-Abbruchfragmente konnten mittels des Cy5-markierten Primers detektiert werden. Die Verbindung 39 wurde auch von der AmpliTaq und der Taq(exo-) Polymerase akzeptiert. Die Terminatoren 41 und 43 wurden von der Taq(exo-) Polymerase eingebaut. Entsprechende Abbruchfragmente konnten in schwacher Konzentration detektiert werden. Mit der Bst- und der Vent(exo-)-Polymerase konnten keine positiven Ergebnisse erzielt werden. Mit Sicherheit können alle getesteten Triphosphate als Substrate zumindest für die positiv getesteten Polymerasen T7, AmpliTaq und Taq(exo-) bezeichnet werden. In Zukunft sollten mit beiden FITC-markierten Nukleotiden Sequenzierversuche mit einem geeigneten Laser durchgeführt werden, um Klarheit darüber zu bekommen, ob der Farbstoff nach dem enzymatischen Einbau am Terminator verbleibt und zur Dye-TerminatorSequenzierung eingesetzt werden kann. Ausserdem ist mit der Synthese des N2 -modifizierten ddG's die Grundlage für ein Sequenziersystem mit den bereits existierenden modifizierten ddA- und ddC-Terminatoren geschaffen.
Die Kombination aus proteolytischer Spaltung, massenspektrometrischer Analyse und Datenbanksuche ist eine etablierte Methode zur Identifizierung von Proteinen. Ist die Identität eines Proteins geklärt, dann stellt sich im Anschluß daran häufig die Frage nach den posttranslationalen Modifikationen des Proteins. Auch hierfür ist die Massenspektrometrie eine prädestinierte und häufig angewandte Methode. Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen eukaryotischer Proteine ist die Phosphorylierung an Ser-, Thr- und Tyr-Resten. In der vorliegenden Arbeit ist die Weiterentwicklung und Anwendung zweier massenspektrornetrischer Methoden zur Analyse der Proteinphosphorylierung beschrieben: i) der Neutralverlust-Scan zur selektiven Detektion von Ser/Thr-phosphorylierten Peptiden, und ii) die Metallaffinitätschromatographie zur selektiven Anreicherung von Phosphopeptiden. Bei der Optimierung der Analytik der Proteinphosphorylierung mittels Neutralverlust-Scan hatte sich am Beispiel der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A gezeigt, dass die Verwendung einer Protease mit geringer Spaltungsspezifität (Elastase) wesentliche Vorteile gegenüber einer Protease mit hoher Spaltungsspezifität (Trypsin) besitzt. Die kleineren Elastase-generierten Phosphopeptide zeigen im Vergleich zu den Trypsin-generierten Phosphopeptiden eine effektivere Phosphorsäure-Abspaltung und lassen sich im Neutralverlust-Scan mit deutlich besserer Empfindlichkeit detektieren. in weiterer Vorteil der Elastase ist in ihrer Eigenschaft partiell überlappende Peptide zu generieren begründet. Die Metallaffinitätschrornatographie wurde eingesetzt, um die Elastase-generierten Phosphopeptide selektiv anzureichern. Es konnte gezeigt werden, dass die Metallaffinitätschromatographie eine geeignete Methode ist, um die Komplexität des Elastase-generierten Peptidgemischs drastisch zu reduzieren, so dass eine automatische Fragmentionen-Analyse aller angereicherten Peptide mittels nanoESl möglich ist. Die Leistungsfähigkeit der Kombination aus Elastase-Verdau, Metallaffinitätschromatographie und Q-TOF- Tandem-MS wurde am Beispiel des Transkriptionsinitiationsfaktors IA unter Beweis gestellt, wo mit Hilfe dieser Analysen-Strategie drei bislang unbekannte in-vivo-Phosphorylierungsstellen nachgewiesen werden konnten. Neben der Proteinphosphorylierung wurden in dieser Arbeit auch eine Reihe anderer kovalenter Modifikationen untersucht. Bei der Analyse der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A konnten neben einer bislang unbekannten fünften Phosphorylierungsstelle an Ser259 auch die Modifikation von Cys343 durch Glutathion und die N-terminale Modifikation durch Gluconsäure nachgewiesen werden. Mittels Q-TOF-Tandem-MS wurde die in-vivo-Myristoylierung des humanen Proteins GAPR 1 nachgewiesen. Mittels der sog Top-Down-Analyse wurde am Beispiel des Proteins Dynamin A gezeigt, wie mittels dieser Strategie eine vollständige Charakterisierung aller kovalenten Modifikationen eines Proteins erreicht werden kann. Im Falle von Dynamin A konnte die Acetylierung des N-terminalen Methionins nachgewiesen werden. Andere kovalente Modifikationen konnten ausgeschlossen werden. Im letzten Kapitel der vorliegenden Arbeit wird am Beispiel von Dynamin A gezeigt, wie sich die Kombination aus partieller proteolytischer Spaltung, Tandem-MS und Datenbanksuche effektiv zur Charakterisierung der Domänenstruktur von Proteinen einsetzen lässt.
Das Ziel von Gentherapie ist die Behandlung bzw. Heilung einer Erkrankung durch das Einbringen eines oder mehrerer Gene. Dazu werden Gentransfervektoren benötigt, die effizient therapeutische Gene in die zu behandelnden Zellen einbringen. Für eine systemische Applikation müssen Gentransfervektoren die Eigenschaft besitzen, ausschließlich die erkrankten Zellen zu transduzieren. Der Tropismus retroviraler Vektoren wird durch das Envelopeprotein (Env) festgelegt. Maus Leukämie Virus (MLV) basierende Kapsidpartikel können mit dem Envelopeprotein des humanen Immundefizienzvirus Typ-1 (HIV-1) pseudotypisiert werden. Diese MLV/HIV-1 Pseudotypvektoren besitzen einen Tropismus für humane CD4 positive T-Helferzellen. Diese Vektoren sind geeigneten Kandidaten für die gen-therapeutische Behandlung der HIV-lnfektion und von kutanen T-Zell Lymphomen, einer lymphproliferativen Erkrankung von CD4 Zellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden MLV/HIV Pseudotypvektoren exprimierende Verpackungszelllinien mit Hüllproteinen verschiedener Subtypen etabliert und charakterisiert. Die verwendeten Subtypen waren das T-trophe HIV-1 Isolat BH10, das T-trophe HIV-2 Isolat ISY und das dualotrophe SHIV Isolat 89.6P. Dabei zeigte sich eine Abhängigkeit der Vektortiter vom Subtyp. Die höchsten Titer wurden mit der MLV/HIV-1 Pseudotypvektoren exprimierenden Verpackungszelllinie FLY-HIV-87 erhalten und lagen in Abhängigkeit vom retroviralen Vektor zwischen 1 x 10 hoch 5 und 1 x 10 hoch 6 IU/ml. Die Transduktionsspezifität entsprach dem Korezeptorgebrauch des HIV-Subtyps. Da für die geplanten in vivo Experimente höhere Titer notwendig waren, wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung MLV/HIV-1 pseudotypisierter Vektoren zunächst getestet, sowie die Beste dieser Methoden für die Konzentrierung der Partikel optimiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde an zwei Mausmodellen die in vivo Applikation MLV/HIV-1 pseudotypisierter Vektoren untersucht. An transgenen hCD4 Mäusen wurde der Gentransfer nach systemischer Applikation von MLV/HIV-1 LacZ Pseudotypvektoren untersucht. In den transduzierten Mäusen konnte Gentransfer in Lymphknoten und Thymus beobachtet werden. Durch subkutane Implantation der humanen kutanen T-Zell Lymphomzellen MyLa in Nacktmäuse wurde ein Tiermodell Modell für humane kutane T-Zell Lymphome etabliert. Die intratumorale Applikation von MLV/HIV-1 Partikeln, deren Vektorgenom für das grüne Fluoreszenzprotein (EGFP) kodiert ergab, daß es zum effektiven und spezifischen Gentransfer in die CD4 positiven MyLa Zellen kam. In dem anschließend durchgeführte Therapieversuch mit Herpes Simplex Virus Thymidinkinase kodierenden Vektoren und darauf folgender systemischer Ganciclovir Behandlung konnte eine Verlangsamung des Tumorwachstums erzielt werden Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, daß MLV/HIV-1 Pseudotypvektoren für den spezifischen und effizienten Transfer von Genen in primäre humane CD4 T-Helferzellen geeignet sind und daß sowohl die systemische als auch die intratumorale Applikation dieser Vektoren möglich ist.
Endogene Retroviren des Schweines (PERV), die vertikal auf die Nachkommen vererbt werden, stellen ein potentielles Infektionsrisiko bei der Transplantation porziner Zellen, Gewebe oder solider Organe auf den Menschen (Xenotransplantation) dar. Bislang sind zwei PERV- Klassen des C-Typs bekannt, die in-vitro humane Zellen produktiv infizieren können. Voraussetzung einer produktiven Infektion ist neben dem Rezeptor-vermittelten Eindringen des Virus in die Wirtszellen die transkriptionelle Aktivität des retroviralen Promotors (LTR), welcher die zweite Determinante des Wirtstropismus darstellt. Mittels eines Luciferase Reportergen Assays wurde die Aktivität verschiedener PERV LTRs in humanen und anderen Säugerzellen im Vergleich zu bekanntermaßen starken Promotoren untersucht. Dabei zeigten LTRs, welche in der die Transkription regulierenden Region U3 eine aus 39-bp Repeats bestehende Repeatbox trugen, in nahezu allen getesteten Zellinien eine außerordentlich starke Promotoraktiviät. Diese wurde insbesondere durch die Repeatbox vermittelt und korrelierte direkt mit der Anzahl der 39-bp Repeats. Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnte die Aktivität heterologer und Repeat-loser homologer Promotoren durch eine 4-fach 39-bp Repeatbox unabhängig von deren Lage und Orientierung über weite Distanzen hinweg signifikant erhöht werden. Die Repeatbox stellt damit einen klassischen Enhancer dar. Als die Transkription regulierende zelluläre Komponente konnte der ubiquitäre, in der Evolution konservierte Transkriptionsfaktors NF-Y identifiziert werden, dessen Bindung an Sequenzabschnitte des 39-bp Repeats nachgewiesen wurde. Weitere cis-aktive Elemente konnten in der U3 Region stromaufwärts der Repeatbox sowie in der R Region lokalisiert werden. Im Verlauf einer seriellen Passagierung in infizierten humanen Zellen erfolgte eine rasche Adaptation der Repeatzahl und damit der transkriptionellen Aktivität an den neuen Wirt. Wie die Ergebnisse einer neu etablierten quantitativen Real- Time PCR zeigten, korrelierte die Anzahl der von einer infizierten Zelle freigesetzten Viruspartikel direkt mit der Aktivität der LTR. Durch Adaptation der LTR Aktivität kann somit eine maximale, für die Wirtszelle verträgliche Virusproduktion erfolgen. Ausgehend von den beschriebenen Eigenschaften der PERV LTR ergeben sich für die Xenotransplantation spezifische Risiken, die Infektion des möglichen Transplantatempfängers vorausgesetzt. Diese betreffen durch mögliche Aktivierung von Protoonkogen oder Disruption zellulärer Gene den Empfänger selbst, durch die mögliche Rekombination von PERV mit humanen endogenen Sequenzen oder anderen exogenen Erregern und der Ausbildung potentiell hochpathogener Formen aber auch sein soziales Umfeld. Wie in-vitro Studien mit zwei routinemäßig in der Transplantationsmedizin eingesetzten Immunsuppressiva belegen, werden diese Risiken durch deren unvermeidlichen Einsatz im Falle einer Xenotransplantation nicht potenziert. Ausgehend von der starken transkriptionellen Aktivität Repeat-tragenden LTRs könnten diese geeignete Werkzeuge für molekularbiologische Anwendungen darstellen, bei denen, wie im Falle des Gentransfers oder der Gentherapie, starke Promotoren benötigt werden. In einem zweiten Projekt der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Expression des humanen endogenen Retrovirus HERV-K in einem transgenen Mausmodell Auswirkungen auf den Phänotyp der Tiere hat. HERV-K kodiert im Gegensatz zu den meisten anderen HERV-Familien für komplette virale Proteine, deren Bedeutung für den menschlichen Organismus jedoch weitgehend unbekannt sind. Zur Etablierung transgener Tiere waren zwei verschiedene Transgen-Konstrukte verwendet worden, von denen eines die komplette provirale Sequenz exklusive der LTRs beinhaltete, das andere lediglich das env-Gen. Für beide Konstrukte war die Etablierung homozygot transgener Tiere gelungen, der Nachweis der RNA Expression konnte jedoch nur bei jenen Linien erfolgen, die das komplette virale Genom trugen. Immuno Blot-Analysen und indirekte Immunfluoreszenz belegten die Expression viraler Proteine in verschiedenen Organen juveniler und adulter Tiere dieser Linien. Die transgenen Mäuse zeigten einen normalen Phänotyp und einen normalen Lebenszyklus mit einer unveränderten Reproduktionsrate. Eine auftretende Tumorgenese konnte stets auf das hohe Alter der betroffenen Tiere zurückgeführt werden, histologische oder anatomische Auffälligkeiten traten nicht auf. Ausgehend von diesen Beobachtungen in einem Tiermodell kann der Schluß gezogen werden, daß die HERV-K Expression im humanen Organismus keine große Bedeutung hat.
Diese Zusammenfassung ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im Abschnitt 6.1. wird die physiologische Bedeutung der Glutamatrezeptoren (GluR) und ihr biologischer Hintergrund kurz erklärt. Am Ende dieses Abschnitts wird der Stand der Strukturanalyse des GluR-B Ionenkanals zu Beginn des Projektes zusammengefasst. Im nachfolgenden Abschnitt 6.2. sind die wesentlichen Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit zusammengefasst. 6.1. Die Bedeutung von Glutamatrezeptoren - Stand der Strukturanalyse zum Beginn dieser Arbeit Die Kommunikation zwischen Nervenzellen erfolgt vorwiegend an hochspezialisierten Kontaktstellen den chemischen Synapsen. Der enge Raum zwischen sendender und empfangender Nervenzelle wird auch als synaptischer Spalt bezeichnet. Der Prozess der synaptischen Übertragung beruht auf der präsynaptischen Freisetzung von chemischen Botenstoffen, sogenannten Neurotransmittern in den synaptischen Spalt. Die Aminosäure L- Glutamat (Glu) ist der wichtigste erregende Neurotransmitter im menschlichen Gehirn und Rückenmark. Dementsprechend bedeutend ist die Rolle der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs), die sie bei der elektrochemischen Erregungsübertragung am synaptischen Spalt spielen (Seeburg, 1993), (Hollmann and Heinemann, 1994), (Dingledine et al., 1999). Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch ein elektrisches Signal (Aktionspotential) ausgelöst, das sich entlang der Nervenfaser, dem Axon, bis zur Nervenendigung, der Synapse, fortpflanzt. Nach der Freisetzung diffundieren die Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und binden an sogenannte Rezeptoren. Ionotrope Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die in die Membran der nachgeschalteten (postsynaptischen) Nervenzelle eingebaut sind. Sie zählen deshalb zu den Membranproteinen. Als ligandgesteuerte kationenselektive Ionenkanäle machen Glutamatrezeptoren (GluRs) die postsynaptische Membran nach Aktivierung durch Ligandbindung für bestimmte Kationen durchlässig. Der Einstrom von Ionen bewirkt eine Änderung des Membranpotentials. Die Stärke der synaptischen Übertragung ist lebenslang modulierbar; die sogennante synaptische Plastizität wird als eine entscheidende Grundlage für die Erklärung von Lernen und Gedächtnis angesehen. Drei synthetische Agonisten aktivieren die GluRs selektiv und wurden deshalb für die Klassifizierung der ionotropen Glutamatrezeptoren herangezogen. Bei den Agonisten handelt es sich um -Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-4-propionat (AMPA), Kainat and N- Methyl-D-Aspartat (NMDA). Die ersten beiden Subtypen werden auch als non-NMDA- Rezeptoren zusammengefasst. Die Aktivierung und Desensitivierung der non-NMDA Rezeptoren ist schneller als die der NMDA-Rezeptoren. Aus molekularbiologischer Sicht (siehe Kapitel 1.3.2.) zeigen die drei Klassen der ionotropen Glutamatrezeptoren eine beträchliche Diversität. So gibt es vier verschiedene Unterheiten vom AMPA-Subtyp, nämlich GluR-A, GluR-B, GluR-C und GluR-B. In dieser Arbeit steht die Strukturanalyse eines aus GluR-B Untereinheiten bestehenden AMPA-Rezeptors im Vordergrund. (Die weitere Unterteilung der NMDA- und Kainatrezeptoren kann dem Kapitel 1.3.2. auf Seite 6 entnommen werden.) Bestimmte Abschnitte der Aminosäurensequenz von Glutamatrezeptoren sind durch hydrophobe Bereiche gekennzeichnet ((M1-M4) in Abbildung 6.1.A (A.)). Das durch verschiedene Untersuchungen etablierte Modell der Glutamatrezeptor-Topologie zeigt 3 Transmembrandomänen (M1, M3 und M4) und eine Membranschleife (M2) (Hollmann et al., 1994), (Kuner et al., 1996). Der Aminoterminus ist extrazellulär, der Carboxyterminus hingegen intrazellulär. Daraus ergibt sich die in Abbildung 6.1.A (B.) abgebildete Topologie (Paas, 1998). S1 und S2 kennzeichnen die Ligandbindungsdomäne. Glutamatrezeptoren (GluR) sind Oligomere, die sich mit grosser Wahrscheinlichkeit aus vier Untereinheiten (Rosenmund et al., 1998), (Ayalon and Stern-Bach, 2001) zusammensetzen (siehe Kapitel 1.3.3.). Die Zusammenlagerung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal setzt voraus, dass die Untereinheiten zum gleichen Subtyp gehören, d.h. AMPA Untereinheiten können nur mit anderen AMPA Untereinheiten einen Ionenkanal bilden. Das gleiche gilt für die Zusammensetzung von NMDA und Kainat-Rezeptoren. Das Modell eines tetrameren Glutamatrezeptors ist im Bild C. der Abbildung 6.1.A zu sehen. Die Bestimmung der Quartärstruktur eines vollständigen Glutamatrezeptors ist bislang nicht veröffentlicht. Die strukturelle Analyse von Proteinen erfordert die Isolierung von reinem und funktionellem Protein. Im Vergleich zu den meisten löslichen Proteinen erfordert die Isolierung von Membranproteinen oft besonderer Optimierung. Falls das Vorkommen des Proteins in natürlichem Gewebe gering ist, so kann die strukturelle Analyse durch rekombinante Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus zugänglich gemacht werden. Die Isolierung von Milligramm-Mengen eines rekombinanten homomeren GluR-B Rezeptors aus dem entsprechenden Baculovirusexpressionssystem (Keinänen et al., 1994) wurde in unserem Labor etabliert (Safferling et al., 2001) und wurde im ersten Jahr dieses Projektes fortgeführt. Durch zonale Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass die molekulare Masse des GluR-B Proteinkomplexes ca. 495 kD beträgt. Dieser Wert liegt in der Nähe des theoretischen Molekulargewichts eines tetrameren Ionenkanals, dessen Molmasse sich aus vier GluR-B Untereinheiten (104 kD) und einer Detergenzmizelle von ca. 63-97 kD zusammensetzt (Safferling et al., 2001). Die elektronenmikroskopische Analyse des Proteinkomplexes von W. Tichelaar aus unserer Gruppe erfolgte 1999 durch Negativfärbung. Für die Strukturanalyse mit Hilfe der Software IMAGIC wurden 10 000 Proteinteilchen selektiert. Das Ergebnis der Bildrekonstruktion ist in der folgenden Abbildung 6.1.B gezeigt. Die projezierten Dimensionen des Models entsprechen einem Molekül mit den Dimensionen 17 nm × 11 nm × 14 nm. Das Model zeigt keine ausgezeichnete Symmetrie, die auf die Stöchiometrie des GluR hinweisen könnte. Das Molekül zeigt mit Färbemittel gefüllte Vertiefungen und innere Strukturen, die vielleicht an der Ionenleitung beteiligt sind. 6.2. Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des GluR-B Ionenkanals In der Fortsetzung des oben beschriebenen Projektes wurden für die rekombinante Expression desselben Rezeptors (GluR-B homomer) stabil transformierte Insektenzellen eingesetzt. Dazu wurde die für die GluR-B Untereinheit kodierende und in Plasmiden enthaltene DNA in Insektenzellen transformiert (siehe APPENDIX A.2.2.). Im Vergleich zu dieser auf Dauerhaftigkeit angelegten Integration der Rezeptor DNA wird die Proteinexpression beim Baculovirusexpressionssystem durch Infektion mit rekombinanten Baculoviren initiiert. Der Vergleich zeigte, dass die mit Baculoviren erzielten Ausbeuten bei GluR-B etwa doppelt so hoch waren als bei stabil transformierten Zellen. Allerdings fallen bei stabil transformierten Zellen die eventuellen Nachteile der viralen Belastung auf die zellulären Sekretionsprozesse weg. Im Verlauf der elektronenmikroskopischen Analyse von baculoviral erzeugtem GluR-B Protein hat sich gezeigt, dass Proteine viralen Ursprungs unter Umständen selbst doppelt aufgereinigte GluR-B Proben verunreinigen können (siehe APPENDIX A.2.1.). Dieser Punkt ist bei einer Einzelbildverarbeitung von grosser Relevanz, falls die virusspezifischen Proteinverunreinigungen eine ähnliche Grösse haben wie das eigentliche Zielprotein. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, das Potenzial stabil transformierter Insektenzellen für die Expression von homomeren GluR-B Ionenkanälen zu bewerten und dabei die Stöchiometrie der Untereinheiten in diesem Ionenkanal aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden biochemische und elektronenmikrosopische Techniken eingesetzt. Zur Isolierung des GluR-B Ionenkanals aus stabil transformierten Insektenzellen wurde das bestehende Aufreinigungsprotokoll für die Affinitätchromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) (Safferling et al., 2001) optimiert, indem das Chargenverfahren durch das Durchflussverfahren ersetzt wurde (zur genaueren Erklärung der Optimierung siehe RESULTS 4.1.2.). Abbildung 6.C zeigt ein silbergefärbtes Gel mit den Eluaten der IMAC und Eluaten der abschliessenden Affinitätschromatographie mit immobilisiertem M1-Antikörper. Die auf den Bahnen 5-8 aufgetragen GluR-B Proben wurden auch für die Einzelteilchenanalyse mittels Elektronenmikroskopie verwendet. Die Ligandbindungsaktivität von GluR-B wurde durch Filterbindungsexperimente mit dem Radioliganden [3H]-AMPA vor und nach der Isolierung aus den Membranfragmenten bestimmt. Die KD-Werte sind für beide Proben ähnlich gross. Der Bmax-Werte ist für die aufgereinigte Probe wie erwartet sehr viel (mehr als 200×) höher. Die Ergebnisse der Ligandbindungsexperimente sind im Kapitel 4.2.1 tabellarisch zusammengefasst. Die oligomere Struktur des isolierten Ionenkanals wurde durch Quervernetzungsexperimente (Cross-linking) und Einzelteilchenanalyse von negativ gefärbten Proteinmolekülen bewertet. Die Quervernetzungsexerimente selbst erbrachten kein eindeutiges Ergebnis im Hinblick auf oligomere Struktur des komplett zusammengesetzten Rezeptors. Kontrollexperimente mit dem Lysat vom Rattenhippocampus zeigten, dass mit DTSSP ein geeigneter Cross-Linker verwendet wurde (siehe RESULTS 4.3.2.). Neben einem aus 4 Banden bestehenden Muster (siehe RESULTS 4.3.1.) lieferten die Quervernetzungsexperimente mit isoliertem GluR-B aber einen deutlichen Hinweis auf die Stabilität von dimeren GluR-B Strukturen, die im Einklang mit einer jüngst veröffentlichten Arbeit stehen (Ayalon and Stern-Bach, 2001). Diese Veröffentlichung liefert zusätzliche (Armstrong et al., 1998) Hinweise auf die Bedeutung von Dimeren in der Glutamatrezeptorstruktur und postuliert, dass sich ein kompletter Glutamaterezeptor aus einem Dimer-Paar zusmmensetzt, wobei die Dimere zuerst gebildet werden. Die nachfolgende Abbildung 6.2.B zeigt negativ gefärbte GluR-B Ionenkanäle bei einer 46000× Vergrösserung. Die Aufnahme stammt von einem Philips EM 400 Elektronenmikroskop. Für die 3D Rekonstruktion wurden 500 der in Abbildung 6.2.B gezeigten Rezeptormoleküle ausgewählt. Dieser relativ kleine Datensatz besteht aus GluR-B Ionenkanälen deren Präservierung in Uranylacetat als besonderes vielversprechend eingeschätzt wurde. Dieser positive Effekt wurde auf die Verwendung frisch von einer Wasseroberfläche aufgefischter Kohlefilme zurückgeführt (siehe RESULTS 4.4.3.3.). Während der Klassifizierung dieses Datensatzes fiel auf, dass die beim Band-Pass-Filtern für die niedrigen Frequenzen gesetzten Cut-offs einen deutlichen Einfluss auf die erste Klassifizierung der unterschiedlichen zweidimensionalen Ansichten des Proteinkomplexes haben (siehe RESULTS 4.4.3.4.). Aus diesem Grund wurde der gleiche Datensatz mit 5 verschiedenen low-frequency cut-offs (LFCO) gefiltert (siehe Table 4.4.3.4.) und getrennt klassifiziert. Von den 5 resultierenden Klassifikationen wurden 3 (LFCO 0,005, 0,03 und 0,05) für die weiterführende 3D Rekonstruktion ausgewählt. Die Evaluierung der resultiernden 3D Modelle ergab, dass der mit einem LFCO von 0,03 gefilterte Datensatz eine Klassifikationen erlaubte, die zu einem 3D Modell (Modell GluR-BII/a siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H) führte, das im Vergleich zu den beiden anderen Rekonstruktionen konsistenter war. Am stärksten spricht für dieses Modell die Übereinstimmung der Input-Projektionen mit den Reprojektionen der 3D Rekonstruktion (siehe siehe RESULTS Figure 4.4.3.4.H). Zur Verfeinerung des Modells GluR-BII/a wurden die beiden Projektionen mit der höchsten Standardabweichung vom Klassendurchschnitt (class average) eliminiert. Die verbleibenden 11 Projektionen bildeten die Input-Projektionen für die Berechung eines verfeinerten Modells, GluR-BII/b, das auf einer neuen Zuordnung der Euler-Winkel beruht. Das Ergebnis dieser Berechung ist in der nachfolgenden Abbildung gezeigt. Das Modell in Abbildung 6.2.C zeigt einen zentralen Kanal und hat die Dimensionen 18 nm × 14 nm × 11 nm. Die Stöchiometrie der Untereinheiten ist aus dem Modell, das mit grosser Wahrscheinlichkeit einen komplett zusammengesetzten GluR darstellt, nicht ablesbar. Ebensowenig zeigt das Modell eine eindeutig vierzählige oder fünfzählige Symmetrie. Allerdings ist die erkennbare zweizählige Symmetrie im Einklang mit dem vorgeschlagenen Pair-of-Dimer Modell (Ayalon and Stern-Bach, 2001), das auf eine teramere Struktur des oligomeren Ionenkanals schliessen lässt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass stabil transifzierte Insektenzellen eine durchaus geeignete Quelle für GluR-B Ionenkanäle sind. Nachteilig sind die geringen Ausbeuten. Allerdings kann durch weitere Selektion der Zellen die GluR Expression noch gesteigert werden (siehe APPENDIX A.2.2.). Bei höheren GluR-B Ausbeuten könnte zukünftig auch die Detektion des Rezeptors in vitrifizierten Proben in Verbindung mit Kryo-Elektronen- mikroskopie und auch die 2D-Kristallisation gelingen. Die während dieses Projekts gemachten Kristallisationsexperimente (siehe APPENDIX A.3.) und Kryo-Experimente mit GluR-B Protein aus dem Baculovirusexpressionssystem (siehe RESULTS 4.4.1. und 4.4.2.) ergaben negative Ergebnisse. Das Potential der Kryo-Methode konnte allerdings in Kontrollexperimenten mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) gezeigt werden. Kryo-Daten von GluR-B würden die Berechnung eines genaueren Strukurmodells erlauben. Die Reprojektionen des hier besprochenen Strukturmodells GluR-BII/b aus der Abbildung 6.2.C könnten als Referenzen für das Alignment der vitrifizierten GluR Ionenkanäle dienen. Für das langfristige Ziel der Rekonstituition des Rezeptors in Liposomen sollte die Delipidierung des Membranproteins während der Aufreinigung möglichst reduziert werden. Hier erscheinen zwei Ansätze sinnvoll. Die Aufreinigung des Proteins in einem Schritt durch die Erweiterung des tags am Carboxyterminus von nur 6 auf 10 Histidin-Reste. Ausserdem gibt es Hinweise, dass die Anwesenheit von Lipiden während der Aufreinigung für seine Rekonstituierbarkeit förderlich ist (Huganir and Racker, 1982).
Seit langem gibt es ein großes Interesse daran, den zeitlichen Ablauf von chemischen Reaktionen zu untersuchen. Ein wichtiges Instrument hierfür ist die Kurzzeitspektroskopie, die in jüngerer Vergangenheit parallel zum rasanten technischen Fortschritt mit immer kürzeren Laserpulsen bis hinein in den Femtosekunden-Bereich einen neuen Boom erlebt hat. Durch die extrem hohe Zeitauflösung ist es heutzutage möglich geworden, die Reaktionsdynamik eines Moleküls quasi in Echtzeit zu verfolgen, weil man durch die Femtosekunden-Pulse die Bewegung der Atomkerne wie mit einer schnellen Kamera beobachten kann. Mit wachsender Anzahl der Experimente gibt es gleichzeitig einen steigenden Bedarf, die Vielzahl der gemessenen und in vielen Aspekten noch unverstandenen Signale auf mikroskopischer Ebene theoretisch zu beschreiben und zu erklären. Besonders interessant dabei ist, dass dies u.a. für komplexe Systeme möglich wird, weil auf den extrem kurzen Zeitskalen auch in sehr großen Molekülen nur einige wenige Freiheitsgrade eine Rolle spielen. Thema dieser Arbeit war die überwiegend klassische Modellierung von nicht-adiabatischer Kurzzeitdynamik in molekularen Quantensystemen, deren Beschreibung über die Born-Oppenheimer-Näherung hinausgeht. Dabei wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit neue Methoden und Rechenverfahren entwickelt, die einerseits eine verbesserte. physikalisch intuitive Anschauung vermitteln und andererseits aufgrund geeigneter Näherungen deutlich Rechenzeit einsparen und dadurch den Zugang zu Modellen größerer Moleküle ermöglichen können. Zunächst wurde die Simulation von zeitaufgelösten Pump-Probe-Spektren mit Hilfe der Franck-Condon-Approximation durchgeführt, bei der die nukleare. Dynamik während des Laserpulses vernachlässigt wird. Diese bekannte Näherung konnte im Rahmen der Arbeit erstmals auf nichtadiabatisch gekoppelte Potentialflächen angewandt werden. Anschließend wurde für das interessierende Quantensystem mit Hilfe des Mapping-Formalismus ein klassisches Analogon eingeführt und dessen Dynamik eingehend studiert. Dies ist deshalb bemerkenswert, weil dadurch erstmals eine Anwendung von klassischen Methoden aus dem Bereich der nichtlinearen Dvnamik auf nichtadiabatische Quantensvsteme möglich wurde. Schließlich konnten klassische periodische Bahnen des Systems identifiziert werden. Dabei handelte es sich im hier betrachteten Fall nichtadiabatisch gekoppelter Potentiale um eine völlig neue Art von vibronischen periodischen Orbits, die sowohl aus einem nuklearen als auch einem elektronischen Freiheitsgrad bestehen. Dadurch konnte in einem nächsten Schritt mit Hilfe einiger weniger Orbits die Kurzzeitdynamik des Systems modelliert werden. Den Schlusspunkt dieser Untersuchungen bildete die klassische Simulation von zeitaufgelösten Pump-Probe-Spektren. Nachdem diese neue Methode mit periodischen Orbits an einem einfachen, stark idealisierten Modell erfolgreich getestet werden konnte, stellte sich jedoch schnell heraus, dass es in mehrdimensionalen Modellen mit einer Torsionsmode zur Beschreibung von Photoisomerisierungs-Prozessen nicht mehr so leicht möglich ist, solche einfachen periodischen Bahnen zu finden, weil die Zeitskalen von nuklearer und elektronischer Bewegung in diesen Systemen sehr unterschiedlich sind. Es ist deshalb in diesem Fall sinnvoll, das Konzept periodischer Orbits dahingehend zu erweitern, die klassische Dynamik in unterschiedliche allgemeine Bewegungstypen einzuteilen, die dann zur Interpretation von quantenmechanischen Ergebnissen herangezogen werden können. Dies stellt eine neue Möglichkeit dar, die komplizierte Wellenpaketdynamik auf physikalisch intuitive Weise zu veranschaulichen. Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Arbeit Beiträge für das Verständnis nichtadiabatischer Quantendynamik liefert: Zum einen werden Fragestellungen von prinzipiellem Interesse diskutiert, wie z.B. der klassische Limes von Quantensystemen insbesondere bei chaotischem Verhalten, zum anderen werden durch die Anwendung von Analyseverfahren der klassischen nichtlinearen Dynamik auf vibronisch gekoppelte Molekülmodelle neue Gebiete erschlossen, die ein verbessertes theoretisches Verständnis experimenteller Ergebnisse im Bereich der Kurzzeitspektroskopie ermöglichen.
Im Rahmen einer genomumfassenden Suche nach biologisch aktiven Proviren des Typs HERV-K konnten insgesamt zwei Genorte den humanen Chromosomen C7 bzw. C19 zugeordnet werden. Beide Proviren weisen ORF für die retroviralen Gene gag, pol und env auf. Während der Genort HERV-K(C19) infolge eine Punktmutation ein defektes Proteasegen trägt und durch eine Deletion der 5´LTR transkriptionell inaktiv ist, besitzt der Genort HERV- K(C7) zwei intakte LTRs, deren Homologiegrad auf ein phylogenetisch junges Alter hindeutet. Mit Ausnahme eines Aminosäureaustausches innerhalb eines hochkonservierten Sequenzmotivs der reversen Transkriptase, der den Verlust der enzymatischen Aktivität zur Folge hat, kann der Genort HERV-K(C7) als das derzeit intakteste Provirus der Familie HERV-K angesehen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine HTDV- Partikelproduktion durch Komplementation unterschiedlicher Genorte und gegen die Existenz eines funktionellen und vermehrungsfähigen HERV-K Provirus mit allen retroviralen Charakteristika im menschlichen Genom. Desweiteren wurden mit HERV-K10 und HERV-K18 zwei bekannte Vertreter der Familie HERV-K eingehend untersucht. Zusätzlich zu der chromosomalen Zuordnung der Proviren gelang der experimentelle Nachweis eines intakten gag Genes für HERV-K10. Für HERV- K18 konnten ausgeprägte Homologien zu dem Superantigen-kodierenden Provirus IDDMK1,222 festgestellt werden. Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Klonen pPERV-B(33), pPERV-A(42) und pPERV- B(43) handelt es sich um die ersten intakten Proviren der xenotropen Klassen PERV-A und PERV-B. Die vollständige Sequenzierung ermöglichte eine eingehende molekularbiologische Charakterisierung dieser C-Typ Viren. Computergestützt konnte eine PBS für eine tRNAGly4 sowie das Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Der Sequenzvergleich offenbarte ein repetitives 39 bp Motiv, welches in unterschiedlicher Anzahl in den jeweiligen LTRs vorzufinden ist. Experimentell wurden der Transkriptionsstart und die verwendeten Spleißstellen identifiziert. Durch Rekombination konnten die molekularen Klone pPERV- B(33)/ATG und pPERV-B(43)/LTR generiert werden, die nach Transfektion in 293 Zellen zur Produktion infektiöser Partikel führten, welche sich seriell passagieren liessen. Mit Kenntnis der Genomorganisation und der RNA Expressionscharakteristika von PERV wurde eine RT PCR Virusdiagnostik etabliert mit deren Hilfe hochsensitiv differentiell PERV-A und PERV-B Transkripte detektiert werden können.
Der erste Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Etablierung und Validierung eines in vitro Testsystems zur Auffindung von Substanzen, die selektiv die Interaktion der mitogenen Signalmoleküle Ras und Raf inhibieren können. Die Deregulation der Ras-Signalkaskade spielt in einer Vielzahl maligner Transformationen eine bedeutende Rolle. Daher besteht in der pharmazeutischen Forschung großes Interesse an der Auffindung von Inhibitoren, die in der Lage sind, solche proliferativen Signale zu unterbinden und möglicherweise Ras- vermittelte Malignität einzudämmen. Das im Rahmen dieser Promotionsarbeit entwickelte Testsystem zur Detektion von Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion basiert auf der intracistronischen ß-Galaktosidase Komplementation. Hierbei werden zwei sich nicht komplementierende Deletionsmutanten der ß-Galaktosidase, deren Affinität zueinander sehr niedrig ist, mit interagierenden Proteinpaaren fusioniert, wodurch es zur Ausbildung eines aktiven Enzymkomplexes kommen kann, dessen Aktivität sich über die Umwandlung eines fluorogenen Substrats nachweisen lässt. Bei Expression der interagierenden Fusionsproteine im E.coli Stamm ER2507 zeigte sich in intakten Zellen eine spezifische Komplementation der Interaktionspartner. Eine in vitro Komplementation der Fusionsproteine konnte trotz nativer Aufreinigung nicht beobachtet werden, da die Proteine im zellfreien System unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur sehr schwach miteinander interagierten. Das zelluläre Testsystem ließe sich in dieser Form für die Wirkstoffsuche nach Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion einsetzen. Die Evaluierung und Validierung muss aber für jedes interagierende Proteinpaar gesondert erfolgen. Der zweite Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Entwicklung und Charakterisierung zellulärer Systeme zur Validierung von PKB/Akt als Zielstruktur für die Entwicklung neuartiger anti-tumoraler Strategien. PKB/Akt wird in der Literatur als zentraler Mediator von zellulären Überlebenssignalen beschrieben. Zudem weisen verschiedene Tumore eine konstitutive Aktivierung und/oder eine Überexpression von PKB/Akt auf, was möglicherweise mit dem Auftreten von Chemoresistenz korreliert. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte durch die Etablierung eines geeigneten zellulären Modells die Bedeutung von PKB/Akt bei der Verhinderung des Auftretens von Anoikis herausgestellt werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, einen kausalen Zusammenhang zwischen konstitutiver Aktivierung von PKB/Akt und der Vermittlung von Chemoresistenz in vitro als auch in vivo darzulegen. Bei der molekularen Untersuchung der PKB/Akt- vermittelten Desensitivierung von Lungenkarzinomzellen gegenüber Zytostatika zeigte sich, dass PKB/Akt Chemoresistenz durch breit gefächerte Eingriffe in die apoptotischen Hauptsignalwege über eine Vielzahl von Mechanismen wie beispielsweise die verstärkte Phosphorylierung der Initiator-Caspase 9, die erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL oder die verlangsamte Induktion von p53 vermittelt. Die selektive Inhibition der Kinaseaktivität von PKB/Akt stellt somit einen interessanten Ansatz für neuartige therapeutische Strategien dar, die darauf abzielen, Tumorzellen, die Chemoresistenz aufgrund einer hohen intrinsischen Aktivität von PKB/Akt aufweisen, durch Applikation eines PKB/Akt-Inhibitors gegenüber Standard-Chemotherapeutika zu resensitivieren und auf diese Weise eine Vielzahl von chemoresistenten Tumoren einer Therapie zugänglich zu machen.
Für verschiedene gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der HIV-Infektion oder anderer erworbener oder angeborener Krankheiten wie z. B. der angeborenen Immunschwäche SCID ist ein hocheffizienter Gentransfer in CD4-positive T- Lymphozyten erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurden daher geeignete retrovirale Pseudotypvektoren weiterentwickelt. Unter Einsatz von Markergenen wurden Methoden der Transduktion primärer humaner Lymphozyten optimiert. Schließlich wurden verschiedene potentielle therapeutische anti-HIV-Gene durch retroviralen Gentransfer in humane T-Zelllinien übertragen und hinsichtlich der Hemmung der in-vitro Replikation verschiedener HIV-Stämme verglichen. Zunächst wurden stabile Verpackungszelllinien zur Herstellung von [MLV(HIV-1)]- und [MLV(GaLV)]-Pseudotypvektoren entwickelt, die ein für die Analyse der Transduktionseffizienz geeignetes Markergen übertragen. [MLV(HIV-1)]-Vektoren konnten mit Titern bis zu 2 x 10 hoch 5 i.E. / ml hergestellt werden. Die Optimierung der Kultivierung primärer humaner T-Lymphozyten vor dem ex- vivo Gentransfer ergab, dass eine 24-stündige PHA/IL-2 Stimulation mit anschließender 48-stündiger Kultivierung in IL-2 Medium optimal für die Transduktion primärer CD4-positiver T-Lymphozyten unter weitgehender Erhaltung des Expressionsmusters der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 ist. Bei längerer Stimulation mit PHA und IL-2 verändert sich sowohl das CD4/CD8-Verhältnis als auch die CCR5-Expression gegenüber nativem Blut signifikant. Die Analyse der Expression des übertragenen Markergens und anderen Oberflächenmarkern der Zellen nach der Transduktion zeigte eine strikte Abhängigkeit der Transduktion der [MLV(HIV-1)]-Vektoren vom HIV-Rezeptor CD4, während herkömmliche [MLV(GaLV)]-Vektoren sowohl CD4-positive als auch CD4-negative Zellen transduzierten. Die Effizienz von [MLV(HIV-1CXCR4)]- Vektoren für CD4-positive Zellen war signifikant höher als die der [MLV(GaLV)]-Vektoren, während die Transduktionseffizienz der [MLV(HIV-1CCR5)]-Vektoren aufgrund der geringen Anzahl CCR5-positiver CD4-T-Zellen am niedrigsten war. Zwei Tage nach der Transduktion wurde eine reduzierte Korezeptorexpression in den Zellen nachgewiesen. Gründe hierfür könnten die Internalisierung der Korezeptoren nach der Transduktion oder eine durch die Kultivierung der Zellen bedingte Änderung der Expression sein. Nach weiterer Optimierung des retroviralen Gentransferprotokolls, u.a. durch Verwendung autologen Plasmas, konnten schließlich bei einmaliger Transduktion mit einer m.o.i. von 5 mit den [MLV(HIV-1CXCR4)]-Vektoren Transduktionsraten von bis zu 80 % erreicht werden. Zum Vergleich der Wirkung potentieller anti-HIV-Gene, die mit den neuen Vektoren in der Gentherapie des Immunschwächesyndroms AIDS eingesetzt werden könnten, wurden fünf verschiedene HIV-Inhibitoren (zwei intrazellulär exprimierte Antikörperfragmente (scFv) gegen HIV-1 Integrase und Reverse Transkriptase, zwei Ribozyme, die die HIV-1 RNA in der 5´-LTR oder im Pol- Leserahmen spezifisch spalten, sowie Interleukin-16) in den gleichen Transfervektor kloniert und durch retroviralen Gentransfer in die T-Zelllinie SupT1 übertragen. In Infektionsversuchen mit zwei unterschiedlichen HIV-1 Stämmen vermittelte jedoch keiner der potentiellen Inhibitoren eine signifikante Resistenz gegenüber HIV-1. Erst nach Sortierung der Kulturen auf starke Expression der übertragenen Gene konnte in den sortierten Zellen eine geringe Hemmwirkung des 5´-LTR-spezifischen Ribozyms auf die in-vitro Replikation des Stammes HIV-1IIIB, nicht jedoch auf die des Stammes HIV-1NL4-3 gezeigt werden. Die Signifikanz dieser Beobachtung muß über den Vergleich der Hemmwirkung weiterer Inhibitorgene geklärt werden.
In bestimmten methanogenen Archaea wurde vor einigen Jahren eine metallfreie Hydrogenase gefunden, die den reversiblen und stereoselektiven Transfer eines Hydridions von Wasserstoff auf die an den C1-Carrier Tetrahydroniethanopterin (H4MPT) gebundene Methenyl-Gruppe katalysiert. Damit stellt dieses Enzym den ersten und einzigen rein organischen Hydrogenierungskatalysator dar, den man in der Natur kennt. Ziel der vorgelegten Arbeit war die kristallographische Bestimmung der Enzymstruktur. Versuche zur Strukturlösung des in aktiver Form aus M. marburgensis isolierten Enzyms durch mehrfachen isomorphen Ersatz, über die anomale Dispersion an nicht-isomorphen Quecksilberderivaten und die des Selens an mit Selenomethionin markiertem Enzym verliefen nicht erfolgreich. Ursächlich hierfür war die perfekte meroedrische Zwillingsbildung der Kristalle. Für die beiden heterolog produzierten, inaktiven Apoenzyme aus den Hyperthermophilen M. jannaschii und M. kandleri wurden in dieser Arbeit effektive Expressions- und Reinigungsprotokolle entwickelt. Für das Enzym aus M. jannaschii wurden Mikrokristalle erhalten, die lediglich ein Proteolysefragment von etwa der halben Masse des Vollängenproteins enthalten. Kristalle des Enzyms aus M. kandleri konnten durch serielles Microseeding so weit verbessert werden, daß die Durchführung eines MAD-Experiment möglich wurde. Erst unter Verwendung vor kurzem entwickelter direkter Methoden (Shake-and-Bake) gelang die Strukturlösung bei einer Auflösung von 2.8 Å. Die Monomere bilden ein sehr eng assoziiertes Homodimer; zwei dieser Dimere sind zu einem locker assoziierten Tetramer verbunden. Jedes Monomer besitzt zwei Domänen. Die N-terminale Domäne von etwa 255 Resten besitzt eine Faltung, wie sie für Dinukleotid-bindende Enzyme typisch ist, mit einem zentralen, verdrehten achtsträngigen beta-Faltblatt. Die C-terminale Domäne von etwa 100 Resten besitzt dagegen weitgehend alpha-helikale Struktur und ist für die außerordentlich enge Assoziation des Homodimers verantwortlich. Beide Domänen sind durch eine gestreckte, flexible Verbindung verknüpft. Im Dimer entstehen dadurch zwei tiefe Spalten, die von Anteilen der N-terminalen Domäne eines und der C-terminalen Domäne des jeweils anderen Monomers begrenzt werden. Das aktive Zentrum liegt wahrscheinlich in dieser Spalte, wobei postuliert wird, daß der fest gebundene Cofaktor eher mit der größeren N-terminalen Domäne assoziiert ist und das Substrat zwischen den Domänen bindet. An der Bindung dürfte die C-terminale Domäne und möglicherweise auch direkt der Cofaktor beteiligt sein. Die Struktur zeichnet sich durch außergewöhnlich hohe Tenmperaturfaktoren ans. Für das Enzym aus M. marburgensis konnte eine Lösung durch molekularen Ersatz erhalten werden. Da der für die Katalyse benötigte, noch unbekannte Cofaktor nicht in der Struktur enthalten ist, ist eine weitergehende Diskussion des enzymatischen Mechanismus noch nicht möglich. Die Verfügbarkeit eines ersten Strukturmodells der metallfreien Hydrogenase stallt aber bereits einen entscheidenden Schritt auf dem Weg zum Verständnis dieses ungewöhnlichen Hydrogenierungskatalysators dar.
Der lentivirale Gentransfer in humane blutbildende Stammzellen ist in Hinblick auf eine kurative Gentherapie von angeborenen und erworbenen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und er Krebstherapie von Bedeutung. Die Fähigkeit, sowohl zu proliferieren als auch in alle hämatopoetische Linien zu differenzieren, macht die pluripotenten CD34 - Stammzellen zu einem idealen Ziel für die dauerhafte Präsenz von Transgenen. Der Erfolg einer Gentherapie ist nicht nur abhängig von der Effizienz des Transfers des therapeutischen Gens in hämatopoetischen Stammzellen, sondern auch von der dauerhafte Expression des Transgens. Ein Modell zur Entwicklung einer somatischen ex vivo Gentherapie in hämatopoetischen Stammzellen ist die chronische Granulomatose (CGD). Die Krankheit beruht auf der genetisch bedingten Fehlfunktion der NADPH-Oxidase und ist mit wiederkehrenden, schweren und lebenslang auftretenden Infektionen verbunden. Eindringende Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien werden aufgenommen, können jedoch in den phagozytierenden Vakuolen nicht abgetötet werden, da keine Sauerstoffradikale, Wasserstoffperoxid oder Folgeprodukte gebildet werden. Eine somatische Gentherapie, die eine autologe Knochenmarktransplantation mit genetisch modifizierten Zellen vorsieht, könnte CGD-Patienten die Möglichkeit einer kurativen Therapie eröffnen. Als Grundlage für die Entwicklung einer lentiviralen Gentherapie wurden zunächst lentivirale Vektoren konstruiert und mit diesen die Bedingungen der transienten Transfektion im Hinblick auf einen hohen Virustiter optimiert. Diese Vektoren wurden auf Basis des humanen Immundefizienzvirus (HIV) konstruiert und waren alle aufgrund von Deletionen in 3´ LTR selbst-inaktivierend. Das bedeutet, daß nach der reversen Transkription kein viraler Promotor mehr enthalten war, und damit die Transgen-Expression über einen internen Promotor initiiert wurde. Der pSIN-GFP Vektor enthielt grünes Fluoreszenzprotein (GFP) als Markergen und einen internen Cytomegalievirus(CMV)-Promotor. Durch Austausch der Promotor- /"Enhancer"-Sequenzen in der 5´LTR entstand der pCGWS Vektor, der unabhängig vom Tat- Transaktivator war. Die Expressionsrate konnte durch Insertion des posttranskriptionell regulatorisch wirkende Element (WPRE), das hinter das Transgene kloniert wurde, erhöht werden. Der pCIGWS Vektor wurde durch Einfügen einer multiple Klonierungsstelle und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) zwischen dem internen Promotor und dem Transgen generiert. Dieser Vektor erlaubte jedoch nicht, wie gewünscht, die gleichzeitige Detektion der Expression eines Transgens und des Markerproteins. Die im Rahmen der Optimierung der Transfektionsbedingungen wurden unterschiedliche Verhältnisse der zur Virusproduktion notwendigen drei Plasmide zueinander ausgetestet. Die beobachteten Schwankungen des Virustiters waren bei den gewählten Verhältnissen nicht signifikant. Mit der Erhöhung der DNA-Menge an Hüllprotein Plasmid konnte auch in diesem Versuch eine vermehrte Bildung von Synzytien beobachtet werden, die sich negativ auf den Titer auswirkte. Die Behandlung der Transfektionsansätze mit Natriumbutyrat (NaBut) ergab eine deutliche Steigerung des Virustiters, wobei die Steigerung nicht mit dem Titer, der ohne NaBut erreicht wurde, korrelierte. Im Experiment zur Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Kulturmedien auf den Titer, wurden für die verwendeten Medien keine großen Unterschiede festgestellt. Bei den Experimenten zur Konzentrierung von infektiösen Viruspartikeln haben sich Ultrazentrifugation, "Low Speed"-Zentrifugation und Anionenaustauschchromatographie als Methoden bewährt. Mit diesen Verfahren konnten konzentrierte Viruslösungen generiert werden, die sehr hohe Transduktionseffizienzen auf Zellinien zeigten. Mit den angereicherten Viruspartikellösungen konnten auch CD34 -Stammzellen erfolgreich transduziert werden. Im Hinblick auf Angaben aus der Literatur konnten vergleichbare Transduktionseffizienzen erzielt werden, wobei hier fast ausschließlich ultrazentrifugierter Virusüberstand verwendet wurde. Mit der Etablierung des chromatographischen Verfahrens zur Anreicherung von Viren konnte ein alternatives System aufgezeigt werden. Am Modell der X-chromosomal gebundenen chronischen Granulomatose (X-CGD) konnte durch lentiviralen Transfer eines therapeutischen Gens (gp91phox) die funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase nachgewiesen werden. Dazu wurden lentivirale Vektoren konstruiert, die gp91phox als therapeutisches Gen enthielten. In molekularbiologischen Untersuchungen konnte zum einen die Integration des Transgens und zum anderen eine hohen Expression des gp91phox-Proteins gezeigt werden. In der durchflußzytometrische Untersuchung konnte für weniger als die Hälfte Zellen einer Modellzellinie (X-CGD PLB-985-Zellen) eine Transduktion nachgewiesen werden. In den funktionellen Untersuchungen wurde eine Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität von 80% und mehr im Vergleich zu PLB-985-Wildtypzellen detektiert. Die hohe funktionelle Rekonstitution bei geringer Transduktionseffizienz war auf eine hohe Expression aufgrund von Mehrfachintegration des Transgens zurückzuführen. Die Untersuchungen mit den lentiviralen gp91phox-Vektoren haben gezeigt, daß diese gute Voraussetzungen für die Entwicklung einer somatischen Gentherapie für CGD-Patienten mitbringen. Studien mit CD34 -Zellen und Stammzellen von X-CGD Patienten sind im weiteren notwendig, um die therapeutische Relevanz zu belegen. Neben der Fortentwicklung des Vektors muß auch die Methodik zur Generierung und Anreicherung der viralen Partikel, sowie das Transduktionsprotokoll der Stammzellen weiter optimiert werden.
In dieser Arbeit erfolgt eine Untersuchung der intrazellulären Transporteigenschaften des Na /Glucose Cotransporters SGLT1 aus dem Kaninchen. Der Transporter wird dazu heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die hohe Expressionsdichte erlaubt die Anwendung der "giant excised patch clamp"-Technik in der inside-out Konfiguration. Die Patches mit Durchmessern von 20-30 µm enthalten ca. 2,5 - 5·10 hoch 6 Transportern bei einem durchschnittlichen Strom von 20-40 pA. Der Transport des Substrats Glucose bzw. des hier verwendeten alpha MDG wird angetrieben durch den elektrochemischen Gradienten für das Cosubstrat Na . Bei 0 mV Haltepotential wird zuerst die reine Konzentrationsabhängigkeit des Auswärtstransports durch die Bestimmung der apparenten intrazellulären Affinität für alpha MDG bei verschiedenen festen Na -Konzentrationen untersucht. Es kann eine deutliche Abhängigkeit des KM alpha MDG von der Na -Konzentration festgestellt werden. Eine Erhöhung der intrazellulären Na -Konzentration von 10 mM auf 400 mM führt zu einer ca. 12fachen Abnahme des KM alpha MDG. Experimente mit symmetrischer Na -Verteilung zeigen, dass auch ohne Na -Konzentrations-Gradient Transport stattfinden kann, allerdings mit einer deutlich geringeren Affinität für alpha MDG. Verglichen mit Literaturwerten für die extrazelluläre alpha MDG-Affinität ist die intrazelluläre Affinität 10-15mal geringer ist als die extrazelluläre. Die Untersuchung der Abhängigkeit von der Na -Konzentration bei verschiedenen festen MDG-Konzentrationen zeigt, dass KM Na eine geringe Abhängigkeit von der alpha MDG- Konzentration besitzt. Die 10fache Erhöhung der alpha MDG-Konzentration von 25 mM auf 250 mM führt nur zu einer leichten Erniedrigung des KM Na. Die intrazelluläre Na - Affinität liegt in der gleichen Größenordnung wie die extrazelluläre. Zur Untersuchung der intrazellulären Bindungsreihenfolge werden die gemessenen Abhängigkeiten des KM alpha MDG und des I Max von der Na -Konzentration mit Simulationen für die 3 möglichen Bindungsreihenfolgen (2Na :G), (Na :G:Na ) und (G:2Na ) verglichen. Mit den hier gemachten Annahmen für die intrazellulären Bindungskonstanten für MDG und Na wird die beste Übereinstimmung für die intrazelluläre Bindungsreihenfolge (2Na :G) gefunden. Zur Untersuchung des spannungsabhängigen Verhaltens der Affintitäten für alpha MDG und Na werden Spannungssprünge unter denselben Konzentrationsbedingungen wie vorher durchgeführt. Die Strom-Spannungs-Kennlinien zeigen eine Zunahme der zuckerinduzierten Stromamplituden zu positiven Potentialen hin. Dabei wird weder bei hyperpolarisierenden noch bei depolarisierenden Potentialen eine Sättigung erreicht. Dies läßt den Rückschluss, dass im betrachteten Spannungsbereich ein spannungsabhängiger Schritt im Transportzyklus geschwindigkeitsbestimmend ist. Die apparenten Affinitäten für alpha MDG und Na besitzen eine geringe Spannungsabhängigkeit. Der KM alpha MDG bei annähernd sättigender Na -Konzentration fällt zwischen 40 mV und 40 mV um einen Faktor 4,4. Bei verringerter Na -Konzentration beeinflusst das Membranpotential die MDG-Affinität stärker. Der KM Na fällt unter sättigenden Zuckerbedingungen im gleichen Spannungsbereich auf die Hälfte ab, wobei der Hill-Koeffizient konstant bleibt. Die Erniedrigung der alpha MDG-Konzentration verursacht keine Veränderung des spannungsabhängigen Verlaufs. Die Ergebnisse zeigen, dass SGLT1 ein reversibler Transporter ist, der sowohl Einwärts-, aber auch Auswärtstransport von Glucose generieren kann. Er zeigt dabei eine starke Abhängigkeit von der Na -Konzentration und eine geringe Abhängigkeit vom Membranpotential. Die hier bestimmten Eigenschaften zeigen aber auch, dass unter physiologischen Bedingungen ein Auswärtstransport von Glucose sehr unwahrscheinlich ist. Das Zusammenwirken der Faktoren Richtung des Na -Gradient, geringe Zuckeraffinität, negatives Membranpotential und geringe intrazelluläre Na - Konzentration verhindern den Auswärtstransport. Der physiologische Na -Gradient ist dem Auswärtstransport entgegengerichtet. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration und das negative Membranpotential verursachen eine sehr geringe intrazelluläre Zuckeraffinität von ca. 75 mM alpha MDG, so dass ein merklicher Auswärtstransport nur bei einer hohen Zuckerkonzentration innerhalb der Epithelzellen stattfinden kann. Dies wird jedoch durch basolaterale Glucose-Transporter verhindert. Das negative Membran- potential führt zu einer geringen Aktivität des Auswärtstransports. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration liegt weit unterhalb es KM Na , so dass auch hier die Transporteraktivität gering ist. Die asymmetrische Funktionsweise des SGLT1 gewährleistet, dass der Glucose- Transport nur in eine physiologisch sinnvolle Richtung, nämlich der Aufnahme von Glucose in die Epitheltzellen, stattfindet.
Bei einer HIV-1-Infektion ist die Krankheitsprogression zum Vollbild AIDS mit dem Auftreten von Virusvarianten assoziiert, die den Chemokinrezeptor CXCR4 zum Zelleintritt verwenden. Dagegen nutzen SIV ein breites Korezeptorspektrum, vor allem CCR5. Im Verlauf einer SIV-Infektion findet kein Korezeptorwechsel von CCR5 zu CXCR4 statt. In dieser Arbeit wurde der Einfluß einer solchen Änderung der Korezeptornutzung auf die SIVagm-Infektion in-vitro und auf den Verlauf der apathogenen SIV-Infektion in-vivo nach Infektion von Schweinsaffen untersucht. Um die Korezeptorspezifität eines SIV zu CXCR4 zu verändern, wurde das in AGM und Schweinsaffen apathogene SIVagm3mc verwendet, das als Korezeptoren zum Zelleintritt CCR5, BOB und BONZO nutzt. Die potentielle Korezeptorbindungsstelle, der zu HIV-1 homologe V3-Loop des Oberflächen-Hüllproteins gp130-SU des SIVagm3mc wurde durch den V3-Loop des CD4 / CXCR4-tropen HIV-1-Klons BH10 ersetzt. Das resultierende SIVagm3-X4mc erwies sich als replikationskompetent und verwendete zum Zelleintritt ausschließlich CD4 / CXCR4. Die Replikation wurde durch den natürlichen Liganden des CXCR4, SDF-1a, dosisabhängig gehemmt. Überraschenderweise besaß SIVagm3-X4mc die Eigenschaft, in-vitro nicht nur in IL2 / PHA-stimulierten sondern auch in unstimulierten PBMC von Schweinsaffen und AGM replizieren. Nach Infektion von je zwei Schweinsaffen (Macaca nemestrina) mit SIVagm3mc bzw. SIVagm3-X4mc konnte bis zu 14 Monate nach Inokulation keine Krankheitsentwicklung und kein Abfall der absoluten Anzahl der CD4 -T-Lymphozyten beobachtet werden. Die Virusbelastung der Tiere war vergleichbar und die Korezeptornutzung blieb auch nach in-vivo Replikation erhalten. Interessanterweise konnte SIVagm3-X4mc, nicht aber das Wildtypvirus SIVagm3mc, durch Sera von SIVagm3mc und SIVagm3-X4mc infizierten Schweinsaffen neutralisiert werden. HIV-1-spezifische Antikörper konnten in Sera eines mit SIVagm3-X4mc infizierten Tieren nachgewiesen werden. Diese Studie beschreibt zum ersten Mal den erfolgreichen Austausch eines V3-Loops bei SIV. Das resultierende SIVagm3-X4mc, das wie beabsichtigt CD4 / CXCR4-positive Zellen infizierte, war im Gegensatz zum Ausgangsvirus in der Lage, in nicht-stimulierten PBMC zu replizieren und zeigte Sensitivität gegenüber neutralisierenden Antikörpern, die in SIVagm3mc- und SIVagm3-X4mc-infizierten Schweinsaffen induziert wurden.
Für eine zukünftige Gentherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist ein effizienter, spezifischer und sicherer Gentransfer in CD4-positive Zellen des peripheren Blutes erforderlich. Hierzu bieten sich vom murinen Leukämievirus (MLV) abgeleitete retrovirale Pseudotypvektoren an, die das Hüllprotein (Env) des HIV-1 oder des simianen Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm) tragen und daher einen selektiven Gentransfer in CD4-positive Zielzellen bewirken (Transduktion). [MLV(SIVagm)]-Vektoren haben gegenüber [MLV(HIV-1)]-Vektoren den Vorteil, daß sie von Seren HIV-1-positiver Patienten nicht neutralisiert werden und daher auch in HIV-1-infizierten Patienten angewendet werden könnten. Jedoch kann aufgrund des Tropismus von SIVagm mit [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren nur die kleine Subpopulation der CCR5-positiven Zellen innerhalb der humanen CD4-positiven Lymphozyten (3 bis 15%) transduziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Tropismus des SIVagm Env so zu modifizieren, daß auch die Mehrzahl der CD4-positiven Lymphozyten, die den CXCR4-Korezeptor exprimieren (70 bis 95%), transduziert werden kann. Hierzu wurde die putativ für die Korezeptorbindung verantwortliche V3- Loop-Region im Env des SIVagm durch die homologe Region eines CXCR4-tropen HIV-1-Stammes ersetzt. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [MLV(SIVagm-X4)]- Pseudotypvektoren herzustellen, die spezifisch CD4/CXCR4-positive Zellen transduzieren können. Neben der Bedeutung für die Generation neuer Vektoren für die Gentherapie beweist dieses Ergebnis die bisher nicht gezeigte Äquivalenz der V3- Loops der Hüllproteine von HIV-1 und SIVagm für die Korezeptornutzung. Um die neuen [MLV(SIVagm)]-Vektoren charakterisieren zu können und für eine spätere Anwendung weiterzuentwickeln, wurden stabile Zellinien etabliert, die große Vektormengen mit Titern zwischen 6x103 und 7,6x105 i.E./ml produzierten. Mittels Ultrazentifugation konnten Vektorpräparationen mit Titern bis zu 108 i.E./ml hergestellt werden. Die neu generierten [MLV(SIVagm-X4)]-Vektoren erwiesen sich wie die [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren als resistent gegenüber der Neutralisierung durch Seren HIV-1-infizierter Spender und könnten damit in vivo angewendet werden. In Experimenten zur Bestimmung der Transduktionseffizienz in primären peripheren Blutlymphozyten humaner Spender konnte der selektive Gentransfer mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren in CD4-positive Zellen gezeigt werden, während herkömmliche, amphotrope Vektoren CD4-positive und -negative Lymphozyten gleichermaßen transduzierten. Beide [MLV(SIVagm)]-Vektoren erlaubten im Vergleich zu den eingesetzten amphotropen MLV-Vektoren eine höhere Transduktionseffizienz in CD4-positiven Zellen. Neben Zielzell-Spezifität und Effizienz ist die Sicherheit neuer Vektorsysteme entscheidend für die Anwendbarkeit in der humanen Gentherapie. Eine Übertragung replikationskompetenter Retroviren (RCR) gilt hierbei als das Hauptrisiko bei der Nutzung retroviraler Vektoren. Auch bei der Herstellung von [MLV(HIV-1)]- oder [MLV(SIVagm)]-Pseudotypvektoren könnten durch Rekombinationsereignisse in den Verpackungszellen replikationsfähige Hybridviren entstehen. Bei der Untersuchung dieser Vektorsysteme wurde allerdings bisher keine spontane Bildung von RCR nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, durch molekulare Klonierung gezielt derartige Hybridviren zu generieren, um zu klären, ob solche Onko/Lenti-Hybridviren replikationsfähig sein können, zudem sollte gegebenenfalls das pathogene Potential dieser Viren untersucht werden. Dazu wurden die vollständigen Leserahmen des rev- und des env-Gens des HIV-1 bzw. SIVagm anstelle des MLV env-Gens in das Genom eines infektiösen molekularen Klon des MLV inseriert. Die Klonierungsstrategie wurde dabei so gewählt, daß alle notwendigen mRNAs gebildet werden konnten. Die Hybridvirusklone waren nach Transfektion in 293T-Zellen tatsächlich in der Lage, neben den MLV-Genen auch HIV-1 bzw. SIVagm env und rev funktionell zu exprimieren. Es konnten infektiöse Partikel nachgewiesen werden, die das Hybridvirusgenom auf Zielzellen übertragen konnten. In den infizierten Zielzellen wurde jedoch nur die Expression von MLV/SIVagm nachgewiesen werden. Keines der beiden Hybridviren erwies sich als replikationskompetent. Dies deutet darauf hin, daß die Bildung replikationskompetenter Onko/Lenti-Hybridviren unwahrscheinlich ist. Mit den [MLV(SIVagm)]-Vektoren steht somit ein Vektorsystem zur Verfügung, das sich für In-vivo-Anwendungen im HIV-infizierten Patienten eignet. Es konnte gezeigt werden, daß humane CD4-positive Lymphozyten mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren spezifisch, aber auch effizienter und sicherer transduziert werden als unter Verwendung bisher beschriebener amphotroper MLV-Vektoren.
Im Rahmen der Aufgabenstellung, Propenoxid durch eine heterogen initiierte homogene Autoxidation herzustellen, wurde ein neuer Reaktortyp konzipiert. Die wesentliche Anforderungen an die Reaktionsführung war dabei nach dem Katalysator einen steilen Temperaturgradienten im Abgasstrom zu verwirklichen. Die komplexen Wechselwirkungen der Autoxidation und deren Mechanismus sind nicht zweifelsfrei aufgeklärt. Insbesondere das Ausmaß der Radikalbildung ist nur unter NichtReaktionsbedingungen quantitativ bekannt. Anhand der verfügbaren Daten konnten daher keine quantitativen Rückschlüsse hinsichtlich Reaktorauslegung und erforderlichen Katalysatormengen bzw. Katalysatoraktivitäten gezogen werden. Basierend auf der postulierten Initiierung der Autoxidation durch Allylradikale wurde das Konzept des Reaktors entwickelt und dieser modular ausgelegt, um eine Nachoptimierung zu ermöglichen. Wegen der Unsicherheiten über das Ausmaß von Radikalbildung und Radikalreaktionsgeschwindigkeiten wurde der Reaktor modular ausgelegt und weite Bereiche an Reaktionsbedingungen (Temperatur und Verweilzeiten am Katalysator und im postkatalytischen Volumen) für verschiedene Katalysatorpräparationen ausgetestet. Aktivität wurde außer im Falle von Strontiumnitrat als Katalysator nur unter Reaktionsbedingungen gefunden, die bereits eine Leeraktivität bedingen. Die These, daß die von Keulks et al. [21,22] beobachtete Aktivität von Bismutoxid in der heterogen initiierten Autoxidation auf die von verschiedenen Autoren [26,27,29] beobachtete Allylradikalbildung über Bismutoxid zurückzuführen ist, ließ sich im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigen. Die Erkenntnis aus Arbeiten von Maier et al. [17], daß die Reaktion bei hohen Drücken (größer 10 bar) schneller und selektiver verläuft, stellt das Konzept einer heterogenen Initiierung bzw. Katalyse grundsätzlich in Frage. Durch die Druckerhöhung wurden sehr respektable RaumZeitAusbeuten erreicht und die Selektivität zu Propenoxid gesteigert, wobei letzteres auf die Umsetzung bei niedrigeren Temperaturen zurückzuführen sein dürfte, die durch die erhöhten Reaktionsraten ermöglicht wird. Im Rahmen von in dieser Arbeit durchgeführten Leertests unter Druck im mikrostrukturierten Reaktor konnte diese Reaktionsbeschleunigung bereits bei Drücken von 3 bar nachgewiesen werden. Beim Übergang auf 4,5 bar verdoppelte sich die Selektivität zu Propenoxid auf 15% bei fünffach erhöhtem (1,6%) Propenumsatz. Dieser Druckbereich war in den Arbeiten von Maier et al. nicht untersucht worden. Eine weitere Drucksteigerung bedingte aufgrund des hohen Sauerstoffpartialdrucks eine Explosion. Angesichts der Tatsache, daß bereits ohne Katalyse bei höheren Drücken hohe RaumZeitAusbeuten erreichbar sind, wurde das Vorhaben nicht weiter verfolgt und eine homogene Katalyse der Autoxidation durch das Abgas der Propandehydrierung getestet, die über Propylradikale verläuft. Diese hätte aufgrund der Verwendung von Propan anstelle eines Teils des Propens den Vorteil geringerer Rohstoffkosten. Auch hier konnte keine Übertragung der Reaktion auf die postkatalytische Zone, deren Temperatur auf unter 250°C begrenzt war, belegt werden. Lediglich die bekannte thermische Oxidation von Propen und Propan unter Nettoumsatz von Propan zu Propenoxid konnte in der Katalysatoraufnahme durchgeführt werden, wobei die Katalysatoraufnahme hier die Funktion eines Rohrreaktors erfüllte. Mit allen drei entwickelten Reaktortypen konnte ein steiler Temperaturgradient im Abgasstrom des Katalysators durch Zumischen kalter Gasströme bedingt verwirklicht werden, wobei die Limitierungen hinsichtlich der Höhe des Gradienten durch Wärmeleitungseffekte des Gehäuses hervorgerufen wurden. Dieses Reaktorschema erwies sich zwar als untauglich in der angestrebten Reaktion könnte aber für andere Reaktionen, die entsprechende Anforderungen an Temperaturgradienten haben, sinnvoll eingesetzt werden. Beispielsweise stellt die selektive Methanoxidation diese Anforderung, findet aber bei wesentlich höheren Temperaturen statt (>1000°C). Die Propenoxidation mit Wasserstoff/Sauerstoffgemischen, die zuvor nur über auf Titanoxid geträgerten Goldkatalysatoren beschrieben wurde, konnte erfolgreich an auf Titanoxid gefällten Silberkatalysatoren durchgeführt werden. Parallel zu dieser Arbeit wurden allerdings Patente der BAYER AG offengelegt, die die Aktivität von mit SilbernitratAmmoniaklösungen imprägnierten Titanoxid und TS1Katalysatoren beschreiben. Erstmalig wurde jedoch ein Titanoxid geträgerter Silberkatalysator in dieser Reaktion hinsichtlich verschiedener Beladungsgraden mit Silber, Calcinierungstemperaturen und den Reaktionsparametern Temperatur, Verweilzeit und Gaspartialdrücken untersucht. In allen Aspekten war eine erstaunliche Ähnlichkeit des Silber/TitanoxidSystems mit dem Gold/TitanoxidSystem festzustellen, welches in den letzten Jahren von verschiedenen Arbeitsgruppen gründlich untersucht wurde. So findet sich eine optimale Aktivität für die Silberkatalysatoren bei 2% Beladung mit Silber und einer Calcinierungstemperatur von 400°C. Diese betrug mit 4,14 g kg(Kat.) 1 h 1 nahezu die Hälfte der von Goldkatalysatoren (10,4 g kg(Kat.) 1 h 1 ) und die im TEM beobachteten Partikelgrößen des Silbers entsprechen mit 2 bis 4 nm denen der Goldpartikel [46]. Mit XRD konnte eine mit zunehmender Calcinierungstemperatur zunehmende Primärpartikelgröße bzw. Kristallisation des Titanoxids nachgewiesen werden. Mit zunehmender Temperatur findet eine schnellere Desaktivierung der Katalysatoren statt. Auch bei der üblichen Reaktionstemperatur von 50°C findet eine Desaktivierung über mehrere Tage statt. Mit zunehmender Verweilzeit am Katalysator sinkt die Reaktionsrate trotz differentieller Umsätze aufgrund der Produktinhibierung der Reaktion. Diese Produktinhibierung bewirkt durch Folgereaktionen die Belegung der Silberkatalysatoren mit verschiedenen Oligomeren des Propenoxids, die in TGMSExperimenten erst oberhalb 400°C vollständig desorbieren und auch die Desaktivierung bewirken. Die Reaktionsrate ist ungefähr proportional sowohl dem Propen, als auch dem Wasserstoffpartialdruck und unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck. Auch die von Goldkatalysatoren berichtete Aktivität in der Tieftemperaturoxidation von CO und Propan konnte bei den Silberkatalysatoren gefunden werden. Eine Verbesserung hinsichtlich Standzeit des Katalysators könnte durch den Einsatz von TS1 als Trägermaterial erzielt werden, welches im Falle der Goldkatalysatoren keiner Desaktivierung unterlag. Dieses wurde mit der hohen Verdünnung der Titanzentren erklärt [47]. Auch durch den Zusatz von Gold bzw. anderen Dotierungsmetallen könnte eine weitere Verbesserung der Katalysatoren möglich sein. Ein Ansatz dazu wäre die chloridfreie Coimprägnierung mit Cyano Komplexen des Silbers und Goldes. Die bisher erzielten Ergebnisse sind jedoch noch sehr weit von technisch relevanten Umsätzen und Standzeiten entfernt. Die Erkenntnis, daß Silberkatalysatoren ähnliche Eigenschaften wie die von Haruta beschriebenen Goldkatalysatoren haben, eröffnet jedoch neue Perspektiven für die Untersuchung dieser Katalysatorklasse.
Natürliche Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung - Schlüssel zur Echtheit ätherischer Öle
(2002)
Als Grundlage für die Beurteilung der Echtheit ätherischer Öle können zwei biochemische Prinzipien Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung während der Biosynthese herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die enantioselektive Kapillargaschromatographie sowie die online-Kopplung der Gaschromatographie mit der Isotopenmas- senspektrometrie zur Authentizitätsbewertung verschiedener ätherischer Öle eingesetzt. Die Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen mittels Multidimensionaler Gaschromatographie-Massenspektrometrie (MDGC-MS) sowie von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS (Gaschromatographie-Combustion- Isotopenmassenspektrometrie) sind etablierte Methoden, die in der Authentizitätsbewertung von Aroma- und Duftstoffen eingesetzt werden. Dagegen ist die Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS (Gaschromatographie-Pyrolyse-Isotopenmassenspektrometrie) eine relativ neue Methode. In der vorliegenden Arbeit wurden Strategien zur Bestimmung von zuverlässigen 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS entwickelt. Die Kalibrierung des Referenzgases mit Hilfe von internationalen Standards kann nur mittels eines Elemental Analyzers (EA-IRMS) erfolgen, da für die Gaschromatographie geeignete Standards nicht zur Verfügung stehen. Daher ist insbesondere der Vergleich von Isotopenverhältnissen von Standardsubstanzen, die mittels TC/EA-IRMS und GC- P-IRMS bestimmt wurden, von Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, dass eine Konditionierung (Einbringen einer Kohlenstoffschicht) des Pyrolysereaktors im GC- P-IRMS-System notwendig ist, um für die untersuchten Aromastoffe mittels GC-P- IRMS zum Elemental Analyzer vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Von zwei verschiedenen getesteten Methoden zur Konditionierung des Pyrolysereaktors war die Konditionierung durch Einleiten von Methan in den Pyrolysereaktor die geeignetere und effektivere Methode. Weiterhin wurden der Einfluss des Trägergasflusses des Gaschromatographen auf die bestimmten Isotopenwerte sowie der lineare Bereich der Methode untersucht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die mittels GC-P-IRMS bestimmten Isotopenverhältnisse von verschiedenen Parametern abhängig sind. Richtige Ergebnisse zu erzielen setzt folgende Konditionen voraus: Konditionierung des Pyrolysereaktors, optimaler Trägergasfluss sowie Mindestmenge des Analyten (> 0,3 µg on column). Die neuen Möglichkeiten, die die online-Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen in der Authentizitätsbewertung von Lavendelölen, Anis- und Fenchelölen sowie Kümmelölen bietet, wurden erstmalig untersucht. Darüber hinaus wurden die enantioselektive Kapillargaschromatographie und die Bestimmung von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Bereiche der 2HV-SMOW-Werte von Linalool und Linalylacetat aus authentischen Lavendelölen deutlich vom Bereich der Isotopenverhältnisse kommerziell erhältlicher, synthetischer Analoga unterscheiden und somit eine Verfälschung von Lavendelölen mit synthetischem Linalool und/oder Linalylacetat nachweisbar ist. Mit dieser Methode konnten diverse Handelsöle eindeutig als verfälscht beurteilt werden. Über die Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Linalool und Linalylacetat dieser Öle konnte die Aussage bestätigt werden (hohe Reinheit zugunsten des (R)-Enantiomeren in genuinen Lavendelölen). Anhand der unterschiedlichen 13C/12C-Isotopenverhältnisse ist eine Unterscheidung zwischen synthetischem und Linalylacetat aus Lavendel möglich. Die 13CV-PDB-Werte von synthetischem und natürlichem Linalool aus Lavendelölen liegen im gleichen Bereich und sind somit zur analytischen Differenzierung natürlich/naturidentisch nicht geeignet. Mittels GC-C(P)-IRMS Analyse von trans-Anethol aus Fenchel- und Anisölen wurden die authentischen Bereiche der 13C/12C- und 2H/1H-Isotopenverhältnisse ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass sich einige der synthetischen trans-Anethol- Muster nur aufgrund eines der beiden bestimmten Isotopenverhältnisse von dem authentischen Bereich abgrenzen lassen. Somit konnte gezeigt werden, dass die integrale Betrachtungsweise der 13CV-PDB-Werte und der 2HV-SMOW-Werte biogener Stoffe für die Authentizitätsbewertung von großer Bedeutung ist. Zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen wurden die Enantiomerenverhältnisse, die 13C/12C- und die 2H/1H-Isotopenverhältnisse der Hauptkomponenten Limonen und Carvon bestimmt. Aufgrund der 2HV-SMOW-Werte von Limonen lassen sich keine Unterscheidungen zwischen kommerziell erhältlichen Limonen und Limonen aus Kümmelölen treffen. Dagegen können die 13CV-PDB-Werte von Limonen zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen herangezogen werden. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Bestimmung von 2H/1H- Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS neue Möglichkeiten in der Echtheitsbewertung ätherischer Öle bietet. Insbesondere die integrale Betrachtung von 2HV- SMOW- und 13CV-PDB-Werten ( 2H/ 13C-Korrelation) wird eine Authentizitätsbewertung künftig noch wesentlich differenzierter möglich machen. Weitere Perspektiven wird die Bestimmung von 18O/16O-Isotopenverhältnissen bieten. Die Authentizitätsbewertung anhand der Multielement-Analyse mittels GC- IRMS eröffnet gerade für achirale Aromastoffe Perspektiven, stellt aber auch eine Ergänzung zur enantioselektiven Analytik dar.
Vanille ein tropisches Orchideengewächs liefert eines der bedeutendsten Aromen weltweit. Die stetig wachsende Nachfrage und das hohe Preisniveau sind allerdings häufig die Ursache für Verfälschung von Vanilleextrakten und -aromen. Ziel der Arbeit war es daher, die Methoden zur Echtheitsbewertung von Vanille weiter zu entwickeln. Daneben sollten Untersuchungen im Hinblick auf aromaaktive Minorkomponenten durchgeführt werden. Als Basisdaten für die Authentizität von Vanille dienen häufig Verhältniszahlen, die aus den Gehalten der Hauptinhaltsstoffe Vanillin, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillinsäure und 4-Hydroxybenzoesäure gebildet werden. Um diese Verhältniszahlen zuverlässig bestimmen zu können, wurden eine hochdruckflüssigkeits-chromatographische (HPLC) und zum ersten Mal eine gas-chromatographische (GC) Methode entwickelt. Unter Verwendung von internen Standards konnte mit beiden Methoden eine zuverlässige Quantifizierung erzielt werden. Die ermittelten Werte erwiesen sich als unabhängig von der Analysenmethode, von Erntejahrgang und Herkunft der Schoten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die bisher zur Bewertung herangezogenen Richtwerte im Vergleich mit den im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Werte durchweg zu enge Spannbreiten aufweisen. Die neu bestimmten Daten zur quantitativen Zusammensetzung von Vanilleschoten stellen daher wertvolle Basiskriterien für eine Echtheitsbewertung von Vanille dar. Für eine weitergehende, noch zuverlässigere Authentizitätsbewertung wurden die 13C/12C-Verhältnisse von Vanillin und der zweiten Hauptkomponente 4- Hydroxybenzaldehyd ermittelt. Als grundlegende Voraussetzung für die Bestimmung korrekter Isotopenwerte wurde zum einen die Gerätekonfiguration optimiert, um eine vollständige Verbrennung zu gewährleisten, zum anderen wurde der Einfluss der Schotenaufarbeitung untersucht. Durch Korrelation der Delta13CV-PDB-Werte der beiden Komponenten konnten klare Authentizitätbereiche festgelegt werden. Insbesondere durch die integrale Betrachtungsweise beider Kriterien Verhältniszahlen und Isotopenwerte konnte die Authentizitätsbewertung von Vanille erheblich verbessert werden. Neben den Hauptkomponenten kommen in der Vanille aber auch eine große Zahl von aromaaktiven Minorkomponenten vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher auch Untersuchungen zu einigen dieser Minorkomponenten durchgeführt werden. Dabei ermöglichte es der Einsatz der neuen, hochempfindlichen Methode der Stir Bar Sorptive Extraction, eine enantioselektive Analyse von - Nonalacton und verschiedenen Monoterpenen durchzuführen. -Nonalacton konnte dabei in allen untersuchten Proben mit einem nahezu racemischen Enantiomerenverhältnis nachgewiesen werden. Die Enantiomerenreinheit und die Schwankungen der Enantiomerenverhältnisse für die untersuchten Monoterpene waren stark variierend. Es konnte dabei aber weder eine Herkunfts- noch eine Jahrgangsabhängigkeit festgestellt werden. Die sehr geruchsaktive Substanz Guajacol wurde in Schoten der Gattungen V. planifolia und V. tahitensis semiquantitativ untersucht. Es konnte aber auch hier keine Abhängigkeit von der Herkunft der Schoten festgestellt werden. Um weitere geruchsaktive Minorkomponenten zu identifizieren, wurde ein Headspace- Extrakt von Vanilleschoten mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie untersucht. Es konnten dabei die beiden Substanzen Kreosol und 4- Hydroxybenzylamin identifiziert werden. Letztgenanntes war bisher als natürlicher Aromastoff nicht bekannt. Obwohl beide Komponenten nur im ppb- Bereich vorkommen, leisten sie dennoch eine Beitrag zum Gesamtaroma von Vanille. Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Wege im Hinblick auf die Analytik und Authentizitätsbewertung von Vanille aufgezeigt werden.
Der Cytochrom-bc1-Komplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubihydrochinon auf Cytochrom c in der Atmungskette und in der bakteriellen Photosynthese. Das Enzym stellt somit das Bindeglied zwischen den Ubihydrochinon bildenden Dehydrogenasen und der Cytochrom c oxidierenden Cytochrom-c-Oxidase dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen des Cytochrom-bc1-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mit seinen Substraten Ubichinon und Cytochrom c sowie mit Phospholipiden der inneren Mitochondrienmembran untersucht. Durch Analyse von Gesamtlipidextrakten aus Proben des Cytochrom-bc1-Komplexes konnte gezeigt werden, daß das Enzym in Anwesenheit von vier verschiedenen Phospholipiden gereinigt und kristallisiert werden kann. In der Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å Auflösung wurden fünf Bindungsstellen für Phospholipide und eine Bindungsstelle für ein Detergensmolekül identifiziert. Die Bindungsstelle für eines der Phospholipide, ein Cardiolipin-Molekül, liegt am Eingang eines von zwei Protonierungspfaden für die Ubichinon-Reduktionsstelle (Qi-Bindungsstelle). Ein Phosphatidylinosit-Molekül befindet sich in einer außergewöhnlichen Position unweit der flexiblen "Linker"-Region des Rieske Eisen-Schwefel-Proteins und trägt vermutlich zur Stabilisierung dieser katalytischen Untereinheit bei. Durch Röntgenbeugung an Kokristallen bestehend aus Cytochrom-bc1-Komplex und gebundenem Cytochrom c konnte die dreidimensionale Struktur dieses transienten Enzym-Substrat-Komplexes bei 2,97 Å ermittelt werden. Die Kristallstruktur ist die erste Struktur des Cytochrom c im Komplex mit einem seiner beiden Redoxpartner aus der Atmungskette. Sie zeigt, daß das Cytochrom c hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen an das Cytochrom c1 bindet und daß die Nähe der beiden c-Typ Hämgruppen eine schnelle Reduktion des Cytochrom c erlaubt. Im homodimeren Cytochrom-bc1-Komplex ist nur eine der beiden Bindungsstellen für Cytochrom c besetzt. Diese hälftige Substratbindung zeigte sich auch für das Ubichinon in der Qi- Bindungsstelle und weist darauf hin, daß die beiden Monomere des Enzyms unabhängig voneinander oder sequentiell arbeiten können. Möglicherweise dient dies der Regulation der Enzymaktivität des Cytochrom-bc1-Komplexes. Durch partielle Reduktion des Cytochrom-bc1-Komplexes in Anwesenheit von Ubichinon konnte ein proteingebundenes Ubisemichinonradikal erzeugt und durch Schockgefrieren stabilisiert werden. Die spektralen Eigenschaften dieses Radikals sind typisch für ein Ubisemichinon an der Qi-Bindungsstelle. Durch Spektroskopie an einer Probe, die einem Wasserstoff/Deuterium-Austausch unterzogen wurde, konnte gezeigt werden, daß dieses Radikal von Protonen koordiniert wird, die mit dem Solvens im Austausch stehen. Dies steht in Übereinstimmung mit der Theorie des Q-Zyklus und wurde durch die hochauflösenden Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å vorhergesagt. Die erzielten Ergebnisse zeigen neue Informationen zum Wechselspiel des Cytochrom- bc1-Komplexes mit Phospholipiden aus der inneren Mitochondrienmembran. Die Bestimmung der Struktur des transienten Komplexes bestehend aus Enzym und Cytochrom c erweitert das Bild über den Elektronentransfer durch Cytochrom c zwischen dem Cytochrom-bc1-Komplex und der Cytochrom-c-Oxidase. Das mögliche Zusammenwirken der Bindungstellen für Cytochrom c und Ubichinon ist ein neuer mechanistischer Aspekt, der auf eine Regulation der Enzymaktivität schließen läßt.
Nichtmethan-Kohlenwasserstoffe sind in Gegenwart von Stickstoffoxiden (NO, NO2) wichtige Vorläufersubstanzen von troposphärischen Photooxidantien (z. B. Ozon), die beim photochemischen Metabolismus gasförmiger organischer Verbindungen durch Hydroxylradikale (OH) unter Einwirkung von Sonnenlicht gebildet werden. Experimenteller Beitrag dieser Arbeit ist die Charakterisierung, Modifizierung, Optimierung und Qualitätssicherung des zur Messung von leichtflüchtigen atmosphärischen C2-C10 Kohlenwasserstoffen verwendeten mobilen Gaschromatographen (GC) mit Flammenionisationsdetektor (AirmoVOC HC2010). Im Rahmen des vom BIvIBF geförderten Berlin Ozonexperiments BERLIOZ, das im Sommer 1998 im Großraum Berlin/Brandenburg stattfand, wurden an einer ländlichen Bodenstation in Blossin, 40 km südöstlich Berlins, in situ Messungen von 69 Nichtmethan-Kohlenwasserstoffen durchgeführt. im Vorfeld der Feldkampagne wurde der GC einer umfangreichen Qualitätssicherung unterzogen. Bei einer Immissionsvergleichsmessung, die unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen stattfand, ergab sich eine mittlere konzentrationsabhängige Abweichung des HC-2010 von ± 16% und ein konstanter Offset (Bias) von 0,71 nmol/m3 (16 pptv) vom Referenzmeßverfahren des Forschungszentrums Jülich. Die Geräteblindwerte waren für die meisten Analyten kleiner 0,3 nmol/m3 (6 pptv). Aus der dreifachen Standardabweichung der Blindwerte ergaben sich die für Außenluftuntersuchungen geforderten Nachweisgrenzen um 0,4 nmol/m3 (10 pptv). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der BERLIOZ-Datensatz hinsichtlich einer Bestandsaufnahme ausgewertet. Die beobachteten Konzentrationen der einzelnen Kohlenwasserstoffe wiesen jeweils eine logarithmische Normalverteilung auf, die Charakterisierung des Datensatzes erfolgte deshalb nicht anhand von arithmetischem Mittelwert und Standardabweichung, sondern mit geometrischem Mittelwert und multiplikativer Standardabweichung. Anhand der OH-Verlustrate wurde der Einfluß der verschiedenen Kohlenwasserstoffe auf die lokale Bildung von Photooxidantien untersucht. Der natürliche Kohlenwasserstoff Isopren lieferte mit 70% den weitaus größten mittleren Beitrag zur Photooxidantienproduktion am Boden. In der Grenzschicht verlor isopren allerdings seine dominante Rolle. Sein Beitrag schrumpfte mit zunehmender Höhe auf 20-40%. in der in 200 m Höhe beobachteten Abluftfahne Berlins verursachten anthropogene Kohlenwasserstoffe rund 2/3 der OH-Verlustrate, wobei die reaktiven C3/C4-Alkene alleine bereits 50% beitrugen.
Regulation des CFTR
(2002)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation des humanen CFTR an isolierten Makropatches von Xenopus-Oozyten untersucht. Die inside-out-Konfiguration ermöglicht den einfachen Zugang zu den zytosolischen Domänen, welche die CFTR- Aktivität steuern. Daher ist es mit dieser bewährten Methode möglich, die Interaktion des CFTR mit Nukleotiden, insbesondere unter dem Einfluss der Phosphorylierung, weitergehend zu charakterisieren. Die Strom-Spannungskennlinie des ATP-induzierten CFTR-Chloridstroms weicht bei zunehmendem Haltepotenzial von dem Verlauf ab, der aufgrund der Goldmann- Hodgkin-Katz-Gleichung zu erwarten ist. Dies weist auf einen hemmenden Einfluss des in der Badlösung vorhandenen Aspartats hin. Die transienten Ströme bei schnellen Chloridkonzentrationswechseln bestätigen diese Hemmung und legen einen inhibitorischen Einfluss auf das CFTR-Gating nahe. Die Koexpression des CFTR mit dem Fusionsprotein Bakteriorhodopsin-PKA katalytische Untereinheit (BR-PKA) erm glicht die Kanalaktivierung durch einfache ATP-Zugabe. Es wurde gezeigt, dass diese Koexpression die apparente Affinität für MgATP erhöhte. Eine naheliegende Vermutung ist, dass diese Affinitätszunahme durch einen erhöhten Phosphorylierungsgrad hervorgerufen wird, was durch die Messungen mit dem Proteinkinaseinhibitor PKI unterstützt wird. Durch die Aktivierung der koexprimierten membrangebundenen cGMP-abhängigen Proteinkinase II (cGKII) kann der CFTR sowohl in Ganzzellmessungen, als auch in Makropatches phosphoryliert werden. Der Vergleich der ATP-Konzentrationsabhängigkeiten des CFTR unter permanenter (KM = 29 µM) und vorübergehender cGKII-Stimulierung (KM = 64 µM) belegt eine Abnahme des apparenten KM bei kontinuierlicher Kinaseaktivität und somit vermutlich erhöhter Phosphorylierung. Die Öffnungs- und Schlieflkinetik des Kanals wird durch diese permanente Kinaseaktivität nicht beeinflusst. Die zeitabhängige Abnahme des CFTR-Chloridstroms, der Rundown, kann nicht durch eine permanente Proteinkinaseaktivität von BR-PKA oder cGKII aufgehoben werden. Die Signalabnahme tritt auch unter Bedingungen auf, bei denen mögliche vorhandene Phosphatasen (v.a. PP2C) inaktiv sind. Daraus folgt, dass der Rundown des CFTR nicht nur durch Dephosphorylierung verursacht wird. Für Einzelkanalmessungen wird eine Verringerung der Offenwahrscheinlichkeit des epithelialen Natriumkanals ENaC durch den aktivierten CFTR beschrieben. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Makropatchmessungen bestätigen diese Inhibition nicht. Die CFTR- und Natriumkanal-vermittelten Ströme sind, unabhängig von dem Verhältnis der Einzelströme und dem anliegenden Haltepotenzial, generell additiv. Der präphosphorylierte CFTR kann auch durch ATP-Zugabe geöffnet werden, wenn die Badlösung kein Magnesium enthält. Da unter diesen Bedingungen keine ATP- Hydrolyse erfolgen kann, muss eine Kanalaktivierung durch einfache ATP-Bindung möglich sein. Es tritt eine Verringerung der apparenten ATP-Affinität, nicht aber des maximalen Chloridstroms auf, wenn das Magnesium aus der Badlösung entfernt wird (KM[MgATP] 70 µM; KM[ATP]> 1 mM). Die Möglichkeit der nichthydrolytischen Aktivierung wird dadurch bestätigt, dass auch mit dem nicht-hydrolysierbaren ATP- Analog AMP-PNP eine Kanalöffnung erfolgt. Magnesium ist nicht nur an der ATP-Hydrolyse beteiligt, sondern beeinflusst darüber hinaus die Kanalaktivität. Aus den Messungen bei unterschiedlichen freien Mg2 - Konzentrationen in der Badlösung geht ein inhibitorischer Einfluss dieses Kations auf den stationären Maximalstrom und ein komplexer Einfluss auf die Öffnungskinetik hervor. Die Walker-A und die Walker-B-Dom nen von Nukleotidbindestellen sind an der Bindung und Hydrolyse von MgATP in ATPasen beteiligt. Mit CFTR- Mutanten, in denen die Walker-A (K1250A), bzw. die Walker-B (D1370N)-Domäne der zweiten Nukleotidbindestelle (NBD2) mutiert sind, kann die Beteiligung der NBD2 an der Kanalöffnung belegt werden. Die langsame K1250A-Mutante öffnet in Abwesenheit von Magnesium nicht. Dagegen ist sowohl die Öffnungs- und Schließkinetik, als auch die ATP-Affinität der D1370N-Mutante mit der des Wildtyps vergleichbar, weist aber im Gegensatz zu diesem keinerlei Magnesiumabhängigkeit auf. Auf Grundlage dieser Daten wird ein Modell vorgeschlagen, in dem alternativ zu dem hydrolytischen Öffnungszyklus, in dem zunächst eine ATP-Hydrolyse an der NBD1 erfolgt, auch die nichthydrolytische Öffnung über die NBD2 möglich ist.
Ziel dieser Arbeit ist es, Wege darzustellen, wie die Thematik Ökobilanzen im Chemieunterricht allgemeinbildender Schulen behandelt werden kann. Ökobilanzen sind definiert als ein Verfahren zur Ermittlung der potentiellen Umweltbelastungen eines Produktes über dessen gesamten Lebensweg. Ein solcher Lebensweg besteht aus mehreren Abschnitten. Am Anfang steht die Rohstoffgewinnung, dann folgt die Herstellung des Produktes, darauf der Gebrauch/Verbrauch und schließlich die Entsorgung oder das Recycling. Die grundlegende Vorgehensweise, wie eine (klassische) Ökobilanz aufzustellen ist, ist ausführlich in den DIN EN ISO-Normen 14040 bis 14043 beschrieben. Für den Chemieunterricht ist aber ein solche, den gesamten Lebensweg umfassende und DIN-gerechte Betrachtung zu zeitaufwendig und schwierig. Daher wurde nach Lösungsmöglichkeiten gesucht, dieses aufgrund seines Umweltbezuges interessante Thema dennoch für den Unterricht erschließen zu können. Es wurde ein kombinierter experimenteller und computerunterstützter Zugang entwickelt. Schwerpunkt ist der Chemieunterricht der Sekundarstufe II, jedoch kann die Thematik Ökobilanzen aufgrund umfassender didaktischer Reduktion bereits in der Sekundarstufe I oder ganz vereinfacht sogar im Sachunterricht der Grundschule behandelt werden. Methodische Möglichkeiten werden auch für diese Schulstufen vorgestellt. Für die Sekundarstufe II wurden Experimente erarbeitet, deren Daten zu den Stoff- und Energieströmen dazu dienen, eine vereinfachte Ökobilanz im Unterricht aufstellen zu können. Gegenstand der Experimente ist zum einen die Herstellung von entionisiertem Wasser über Destillation und Ionenaustausch, zum anderen die Herstellung und das Recycling von Kunststoffen. Die Experimente sind so konzipiert, daß sie von Schülern selbst durchgeführt werden können. Um die Auswertung und die Aufstellung der Ökobilanz zu vereinfachen und somit zu beschleunigen, wurde das Programm ÖKO-BILLY unter Microsoft Excel 97 entwickelt, welches hier ebenfalls vorgestellt werden soll. Es dient nicht nur Datenerfassung, sondern ist darüber hinaus auch ein Lernprogramm, welches den Aufbau und die Durchführung einer Ökobilanz demonstriert. Durch die Kombination von Experiment und Computerprogramm kann die Thematik Ökobilanzen erfolgreich im Chemieunterricht der gymnasialen Oberstufe vermittelt werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich im Wesentlichen mit zwei Zielen. Zum einen sollte durch den selektiven Einbau von modifizierten Nukleosiden der UUCG-Tetraloop untersucht werden, um seine ungewöhnlich hohe Stabilität besser zu verstehen. In einem zweiten Projekt stand die Entwicklung einer neuen Methode für das Spin-Labeling von Oligonukleotiden für die ESR-Spektroskopie im Mittelpunkt. Die einzigartige hohe Stabilität des UUCG-Tetraloops beruht auf der Ausnutzung der drei stabilisierenden Faktoren: Wasserstoffbrücken, Basenstapelung und Solvatation. Für die Untersuchung des UUCG-Tetraloops wurden 2´-Fluorpyrimidine 22a/b, 23a/b und 27a/b, 2´- Desoxyuridin 26a/b sowie ein dem Uridin isosterer Baustein 28a/b eingesetzt (Abb. 10.1). Während die Bausteine 27a/b und 28a/b vorlagen, sind die Bausteine 22a/b, 23a/b und 26a/b synthetisiert worden. 2´-Fluorpyrimidine können durch die fehlende 2´-OH-Funktion nicht als Wasserstoffbrückendonor dienen. Weiterhin verschiebt die Fluorierung in ribo- bzw. arabino- Stellung das C3´-endo/C2´-endo Gleichgewicht. Im Vergleich mit dem Einbau von 2´- Desoxyuridin lassen sich Aussagen über Vorzugskonformation und Beteiligung an Wasserstoffbrücken einzelner Nukleotide im Loop machen. Ein Schlüsselmolekül für die Synthese der 2´-Fluor modifizierten Bausteine 22a/b und 23a/b ist 2,2´-Anhydro-1-( -D-arabinofuranosyl)uracil 19 welches durch die Umsetzung von Uridin 18 mit Diphenylcarbonat und Natriumhydrogencarbonat in HMPT erhalten werden kann. Dieses ermöglicht die selektive Einführung eines Fluor-Atoms. Die 2´-Fluornukleoside wurden nach Standardbedingungen in Phosphoramidite überführt. Die Darstellung des Cytidinbausteins 23a/b gelang durch direkte Umsetzung der Verbindung 22a/b mit 1,2,4-Triazol und POCl3. Diese Reaktion erspart einen gesonderten mehrstufigen Syntheseweg für die Verbindung 23a/b ausgehend vom Cytidin. Die Bausteine wurden selektiv an verschiedenen Positionen im Loop- und Stembereich der UUCG-Haarnadelschlaufe mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten eingebaut. Die Aufreinigung der erhaltenen RNA-Stränge erfolgte durch Anionenaustausch-HPLC. Nach der Charakterisierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Stränge mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Neben den Tm-Werten wurden auch die thermodynamischen Parameter bestimmt. Aus den gemessenen Daten konnten im Wesentlichen folgende Ergebnisse erzielt werden: * Der Einbau aller Bausteine im Loopbereich führte zu einer Destabilisierung im Vergleich zum nativen Loop. Die Inkorporation von UF im Stembereich hatte eine beachtliche Stabilisierung der Struktur zur Folge, im Fall des Stranges HP19 von 8°C (siehe Tab. 7.1, Seite 79) * Der Einbau von UF an der Position U4 führte erwartungsgemäß zu einer Destabilisierung, da die durch NMR-Daten belegte Wasserstoffbrücke zu G7 nicht ausgebildet wird. * An der Position U4 liegt bevorzugt eine C2´-endo Konformation vor. * Von besonderer Bedeutung für die Stabilität des Loops ist die Position C6. Die Inkorporation von CF hat eine besonders deutliche Destabilisierung zur Folge, woraus auf eine bevorzugte C2´-endo Konformation geschlossen werden kann. Zum anderen spielen hier Solvatationseffekte eine Rolle, da die 2´-OH-Funktion des nativen Loops Kontakt zum Lösungsmittel hat. * Der Einbau des isosteren Bausteins 28a/b führte an keiner Position zu einer Stabilisierung, obwohl durch das ausgeprägte -System eine bessere Basenstapelung zu erwarten wäre. Im Gegenteil wir durch die modifizierte Base der Tetraloop nachhaltig destabilisiert (12°C). * Auffällig ist eine Abflachung der erhaltenen Schmelzkurven, die auf eine Abnahme der Kooperativität oder das Vorhandensein verschiedener Zwischenstufen schließen lässt. Auch NMR-Ergebnisse belegen, dass der Tetraloop ein hohes Maß an Flexibilität zeigt. Die erhaltenen Daten sind in Übereinstimmung mit einer auf NMR-Daten beruhenden simulierten Struktur, die Williams et al, 2001 vorgeschlagen haben. * Die Mehrfacheinbauten zeigen, dass die stabilisierenden Kräfte dieses Tetraloops synergetisch scheinbar optimal zusammenwirken und nur schwer getrennt voneinander betrachtet werden können. Im zweiten Projekt sollten Oligonukleotide durch das Anbringen von Spin-Labeln für die ESR-Spektroskopie zugänglich gemacht werden. Zunächst ist der durch seine Starrheit geeignete Label 29 in einer 8-stufigen Synthese ausgehend von 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-4-on 41 synthetisiert worden. Nach der Bromierung in und ´-Position wird durch eine Favorskii-Umlagerung der Fünfring aufgebaut. Die Oxidation des Amins wurde mit H2O2/Natriumwolframat durchgeführt. Nach der basischen Hydrolyse wird die Seitenkette über ein Weinrebamid zum Aldehyd reduziert. Eine direkte Reduktion war nicht möglich. Das terminale Alkin des Labels 29 wir durch Seitenkettenverlängerung durch eine Wittig- Reaktion mit anschließender Dehydrochlorierung erhalten. Ein alternativer Syntheseweg, der die Oxidation des Amins zum Nitroxid auf einer späteren Stufe vorsieht, war nicht erfolgreich. Da die Ankupplung des Labels an die 5-Position eines Uridin- oder Desoxyuridin- Bausteins während der Festphasensynthese am Syntheseautomaten erfolgen soll, ist der entsprechende 5-Ioduridinphosphoramidit- bzw. 2´-Desoxy-5-Ioduridinphosphoramidit- baustein synthetisiert worden. Nach der Schützung der freien Hydroxylgruppen mit der Acetylschutzgruppe ist die Iodierung der 5-Position mit Iod und Cerammoniumnitrat durchgeführt worden. Nach der Entschützung der Hydroxylgruppen wurden die Phosphoramidite nach Standardmethoden synthetisiert. Im Gegensatz zu bisherigen Arbeiten, die ein gelabletes Phosphoramidit am Synthesizer eingebaut haben, wurde die Kupplung des Labels in dieser Arbeit während der Festphasensynthese durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass im Gegensatz zu dem gelabelten Amidit pro Kupplung nur geringe Mengen des Spin-Labels verbraucht werden. An der zu markierenden Position wird ein 5-Ioduridin oder 2´-Desoxy-5-ioduridinbaustein eingebaut und danach die Säule vom Synthesizer entfernt. Nun wird mit Hilfe von Spritzen eine Mischung des Labels, des Palladium(0)-Katalysators und CuI in DMF/Triethylamin auf die Säule aufgegeben. Nach der erfolgten Kupplung wird die Säule wieder am Synthesizer installiert und die Synthese fortgesetzt. Es hat sich aus Gründen der einfacheren Handhabbarkeit als günstiger erwiesen, als Katalysator nicht Tetrakis-(triphenylophosphin)-palladium(0) 66 sondern Bis- (triphenylphospin)-palladium(II)-dichlorid 68 einzusetzen. Die Kupplungsausbeuten des Labels lagen nach HPLC-Daten bei über 90% für die Stränge SG1 bis SG4 (siehe Tab. 9.2, Seite 132). Die Ausbeuten lagen damit genauso hoch wie die Kupplung des als Vergleichsverbindung eingesetzten Hexins. Während die HPLC-Aufreinigung bei den kurzen Strängen erfolgreich war, waren bei den längeren Strängen SG7 bis SG9 die Unterschiede in den Retentionszeiten geringer, sodass es bei noch längeren Strängen nötig werden könnte, die Stränge mittels Gelelektrophorese aufzureinigen. Die Analytik erfolgte durch ESR-Spektroskopie, enzymatischen Verdau und Massenspektrometrie. Jedoch habe sich sowohl die MALDI-TOF als auch die ESI- Massenspektrometrie als problematisch erwiesen. Die Spektren waren oft nicht aussagekräftig und wenig reproduzierbar. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten ausgehend von dieser Arbeit werden folgende Untersuchungen angeregt: * Die Untersuchung, ob FPLC oder Gelelektrophorese geeignete Methoden darstellen, um längere gelabelte Stränge aufzureinigen. * Darstellung von iodierten Purinnukleosiden, um beliebige Positionen innerhalb eines Oligonukleotids mit einem Spin-Label markieren zu können. * Den Mehrfacheinbau von Spin-Labeln um Abstände in kleinen RNA-Strukturen, z.B. Ribozymen zu bestimmen. Hier können auch Wechselwirkungen mit anderen paramagnetischen Sonden wie Manganionen ausgenutzt werden.
Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Human epidermal-type fatty acid binding protein (E-FABP) belongs to a family of intracellular non-enzymatic 14-15 kDa lipid binding proteins (LBP) that specifically bind and facilitate the transport of fatty acids, bile acids or retinoids. Their functions have also been associated with fatty acid signalling, cell growth, regulation and differentiation. As a contribution to better understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by NMR spectroscopy are reported here. Both unlabeled and 15N-enriched samples of recombinant human E-FABP were used for multidimensional high-resolution NMR. The sequential backbone as well as side-chain resonance assignments have been completed. They are reported here and are also available at the BioMagResBank under the accession number BMRB-5083. The presence of six cysteines in the amino acid sequence of human E-FABP is highly unusual for LBPs. Four of the six cysteines are unique to the E-FABPs: C43, C47, C67 and C87. In the three-dimensional structure of E-FABP, two cysteine pairs (C67/C87 and C120/C127) were identified by X-ray analysis to be close enough to allow disulfide bridge formation, but a S-S bond was actually found only between C120 and C127 [Hohoff et al., 1999]. Since the exclusion of a disulfide bridge between C67 and C87 improved the Rfree factor of the crystallographic model, the existence of a covalent bond between these two side- chains was considered unlikely. This agrees with the NMR data, where SCH resonances have been observed for the cysteine residues C43, C67 (tentative assignment) and C87, thus excluding the possibility of a second disulfide bridge in solution. Based on the NOE and hydrogen exchange data, an ensemble of 20 energy-minimized conformers representing the solution structure of human E-FABP complexed with stearic acid has been obtained. The analysis of homonuclear 2D NOESY and 15N-edited 3D NOESY spectra led to a total of 2926 NOE-derived distance constraints. Furthermore, 37 slow- exchanging backbone amide protons were identified to be part of the hydrogen-bonding network in the >-sheet and subsequently converted into 74 additional distance constraints. Finally, the disulfide bridge between C120 and C127 was defined by 3 upper and 3 lower distance bounds. The structure calculation program DYANA regarded 998 of these constraints as irrelevant, i.e., they did not restrict the distance between two protons. Out of the remaining 2008 non-trivial distance constraints, 371 were intraresidual (i = j), 508 sequential (|i - j| = 1), 233 medium-range (1 < |i - j| £ 4), and 896 long-range (|i - j| > 4) NOEs. The protein mainly consists of 10 antiparallel -strands forming a >-barrel structure with a large internal cavity. The three-dimensional solution structure of human E-FABP has been determined with a root-mean-square deviation of 0.92 ± 0.11 Å and 1.46 ± 0.10 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the portal region (i.e., for residues 4-26, 40-56, 63-75 and 83-134; the portal region apparently represents the only opening in the protein surface through which the fatty acid ligand can enter and exit the internal binding cavity), an average backbone RMSD of 0.85 ± 0.10 Å was obtained, thus reflecting the higher conformational dispersion in the portal region. Superposition with the X-ray structure of human E-FABP (excluding the terminal residues) yielded average backbone RMSD values of 1.00 ± 0.07 Å for the entire residue range and 0.98 ± 0.06 Å without the portal region. This indicates a close similarity of the crystallographic and the solution structures. The structure coordinates have been deposited at the RCSB data bank under PDB ID code 1JJJ. The measurement of 15N relaxation experiments (T1, T2 and heteronuclear NOE) at three different fields (500, 600 and 800 MHz) provided information on the internal dynamics of the protein backbone. Nearly all non-terminal backbone amide groups showed order parameters S2 > 0.8, with an average value of 0.88 ± 0.04, suggesting a uniformly low backbone mobility in the nanosecond-to-picosecond time range throughout the entire protein sequence. Moreover, hydrogen/deuterium exchange experiments indicated a direct correlation between the stability of the hydrogen-bonding network in the >-sheet structure and the conformational exchange (Rex) in the millisecond-to-microsecond time range. The features of E-FABP backbone dynamics elaborated here differ from those of the phylogenetically closely related heart-type FABP and the more distantly related ileal lipid binding protein. The results on protein dynamics obtained in this work allow to conclude that the different LBP family members E-FABP, H-FABP and ILBP are characterized by varying stabilities in the protein backbone structures. Hydrogen/deuterium exchange experiments displayed significant differences in the chemical exchange with the solvent for the backbone amide protons belonging to the hydrogen-bonding network in the >-sheets. The >-barrel structure of H- FABP appears to be the most rigid, with exchange processes presumably slower than the millisecond-to-microsecond time range. ILBP, on the other hand, shows the fastest hydrogen exchange as well as a significant number of exchange parameters (Rex), implying a decreased stability in the >-sheet structure. E-FABP, finally, appears to rank between these two proteins based on the hydrogen/deuterium exchange, with Rex terms in the >-strands indicating millisecond-to-microsecond exchange processes like in ILBP.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Die enorme genetische Variabilität von HIV-1[14],[50] und die mangelnde Korrelation zwischen genetisch definierten Subtypen einerseits und antigener Variation[51]-[56] andererseits verhindern bisher die Entwicklung eines effizienten, breit neutralisierenden Impfstoffes. Neueren Ansätzen liegt daher das Konzept einer serologischen Klassifikation zu Grunde[61],[62], die verschiedene HIV-Subtypen nach ihrer serologischen Reaktivität und nicht nach ihrem genetischen Ursprung klassifiziert. Diese Ansätzen beruhten allerdings auf der Verwendung ausgewählter Consensus-Modellpeptide der immunodominanten V3-Region des viralen Hüllproteins gp120 und monoklonaler Antikörper weniger HIV-1-Subtypen[61]. Somit ist nicht auszuschließen, dass aus dem Einsatz weiterer Peptide und anderer Antikörper bislang unidentifizierte Serotypen resultieren. Es lag nahe, den ursprünglichen Ansatz auf eine wesentlich breitere Basis von Antikörpern und Peptiden zu stellen. Als Antikörperquelle kamen hierbei die polyklonalen Seren HIV-1-positiver Patienten in Betracht; man machte sich dabei das native HIV-spezifische Antikörperreservoir zu Nutze. Seitens der Peptide als Zielmoleküle einer Ermittlung serologischer Reaktivität bot sich ein kombinatorischer Zugang an. Ziel der vorliegenden Arbeit war demnach die Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das Screening humaner HIV-positiver Seren gegen kombinatorisch erzeugte Peptide mit dem Hintergrund, einen minimalen Satz reaktiver Peptide zu identifizieren, die eine serologisch basierte Charakterisierung der Reaktivität verschiedener HIV-1-Subtypen erlaubt. Um Reaktivitätsmuster zwischen Seren verschiedener Subtypen ermitteln und ausschließlich signifikante, hochreaktive Sequenzen finden zu können, sollte dieses Assay zudem die Möglichkeit der mehrfachen Wiederholbarkeit mit derselben Peptidbibliothek bieten. Diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit umgesetzten Ziele lassen sich somit wie folgt zusammenfassen: Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen und eindeutigen massenspektrometrischen Sequenzierung von Peptiden aus kombinatorischen Bibliotheken, Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das iterative Screening HIV-positiver Seren gegen festphasengebundene Peptide, Screening von Serenpools verschiedener genetisch bestimmter Subtypen von HIV-1 gegen eine kombinatorische Peptidbibliothek, die die genetische Variation der V3-Region von gp120 reflektiert, und Multivariate Analyse der gefundenen Peptidsequenzen mit dem Ziel einer serologischen Interpretation derselben. Das Verfahren zur schnellen und im Vergleich zum herkömmlichen Kettenabbauverfahren nach Edman weniger aufwändigen massenspektrometrischen Sequenzierung als reaktiv bestimmter Peptide basiert auf der adaptiven Einführung Kettenabbruch erzeugender Sequenzen während der Synthese der kombinatorischen Peptidbibliothek nach einer modifizierten One Bead One Peptide"-Synthese[118],[119]. Diese Codierung wird sequenztreu durch den Einsatz von Mischungen aus der Fmoc-geschützten Aminosäure, die für diese Sequenzposition vorgesehen ist, und ihres N-terminal permanent blockierten Derivats eingeführt. Das Programm Biblio optimiert das Codierungsmuster hinsichtlich minimaler Einführung von Terminationssequenzen und minimalem Einsatz Kettenabbruch erzeugender Reagenzien, um den Anteil des Hauptpeptids pro Bead nur so gering wie möglich zu vermindern. Eine MALDI-massenspektrometrische Analyse der Peptide eines betreffenden Beads liefert somit neben dem Signal des Hauptpeptids auch die Sequenz des Peptide codierenden Signale. Diese werden von Biblio zur gesuchten Peptidsequenz decodiert. Des weiteren konnte ein immunologisches Testsystem für das iterative Screening festphasengebundener Peptide entwickelt werden. Dieses beruht auf der Detektion der Bindung des Serumantikörpers an das Peptid durch einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem fluoreszenten Farbstoff markiert ist. Eine Bindung ließ sich somit fluoreszenzmikroskopisch nachweisen. Um eine Wiederholbarkeit des Screenings zu gewährleisten, wurde die Peptidbibliothek mittels eines Epoxidharzklebstoffs auf der Probenunterlage fixiert. Eine Entfernung des Immunkomplexes gelingt durch mehrfache Behandlung mit pH 1. Eine 80640 Spezies umfassende Decapeptidbibliothek, die die genetische Variabilität der immunodominanten V3-Schleife der viralen Hüllproteins gp120 von HIV-1 wiedergibt, wurde gegen Serenpools verschiedener HIV-1-Subtypen gemäß diesem Verfahren iterativ gescreent. Insgesamt 36 Peptide konnten aufgrund ihrer intensiven Fluoreszenz als hochreaktiv erkannt werden; sie wurden mit MALDI-Massenspektroskopie und anschließender Decodierung durch Biblio sequenziert. Eine Auswahl von vier der 36 ermittelten Sequenzen erwies sich als ausreichend für eine Differenzierung der zugrunde liegenden HIV-1-Subtypen. Eine anschließende multivariate Analyse der gefundenen Sequenzen in bezug auf ihr Seroreaktivitätsmuster ermöglichte die Bestimmung neuer, konservierter Epitope der Bindung polyklonaler Serenantikörper von HIV-1 und die Identifikation der für diese Bindung kritischen Aminosäurepositionen der betrachteten Decapeptide. Diese Epitope könnten in nachfolgenden Studien auf ihre Bedeutung hinsichtlich ihres Neutralisationspotentials bezüglich primärer HIV-Isolate getestet werden. Das hier entwickelte Verfahren zum iterativen Screening codierter Peptidbibliotheken jedoch ist nicht auf das HIV-System beschränkt, es bietet vielmehr einen universellen Zugang zur reaktivitätsbasierten Evaluation festphasengebundener Substanzbibliotheken, die die volle genetische Variabilität ihrer biologischen Zielregion abbilden. Eine dieser Regionen könnte beispielsweise der Antigenrezeptor von B-Lymphocyten darstellen, der die B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Diese regen die B-Zelle zur Proliferation und deren Nachkommen zur Differenzierung zu antikörpersezernierenden Zellen gegen diese Antigene an. Sie bilden damit ein interessantes Ziel, auf diesem Wege eine effektive Immunantwort hervorzurufen[146],[150].
Ziel dieser Arbeit war es, mit der Methode der NMR-Spektroskopie strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Fettsäurebindungsproteinen zu untersuchen. NMR-Spektren von Proteinen mit hohem -Faltblattanteil, wie H-FABP, zeigen häufig eine große Dispersion mit einer typischen Verteilung tief- und hochfeldverschobener Signale. Es wurden 1D/2D 1H-NMR Spektren für den Wildtyp und mehrere Mutanten (F4E, F4S, F4S/W8E, W8E, F16E, F16S, K21I, F64S, L66G und E72S) des humanen H-FABP aufgenommen und so weit wie möglich zugeordnet. Auf diese Weise ließ sich bestimmen, ob die typische -Faßstruktur des Wildtyp bei den Mutanten noch intakt ist. Fast alle Mutanten wiesen eine Signalaufspaltung von 10,2 bis 0,4 ppm wie der Wildtyp auf, nur die W8- Mutanten W8E und F4S/W8E zeigen keine Struktur mehr. H-FABP zeigt in NMR-Spektren sogenannte Spinsystem-Heterogenitäten, die auf mehrere parallel existierende konformationelle Zustände zurückzuführen sind und im NMR- Zeitfenster ( < 200 ms) nicht untereinander austauschen. Diese Spinsystem-Heterogenitäten werden nicht direkt durch Liganden verursacht, da sie auch in delipidierten H-FABP-Spektren vorhanden sind. Noch sind sie abhängig von der Position der in räumlicher Nachbarschaft befindlichen Seitenkette des F57, da sie auch in den Spektren einer F57S-Mutante anwesend sind. Eine Relipidierung der H-FABP Proben mit unterschiedlichen Fettsäuren führte zu einer selektiven Bevorzugung einzelner Spinsysteme. So konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung beim H-FABP nach einem ,,selected-fit" Mechanismus abläuft, bei dem je nach gebundenem Liganden (Palmitin-, Palmitolein-, Stearin- oder Ölsäure) unterschiedliche, schon vorher vorliegende Konformationen des Proteinrückgrates bevorzugt werden. Ein weiterer Teil der hier vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP. Es wurde zur Strukturaufklärung die holo-Form des Proteins verwendetet, die ein Fettsäuregemisch endogener Fettsäuren enthielt. Durch den Einsatz mehrdimensionaler homonuklearer und 15N-editierter NMR-Experimente gelang es, nahezu alle 1H und 15N Resonanzen der Aminosäuren zuzuordnen. Lediglich für K37 konnten in den Spektren keine Signale gefunden werden. Nach einer automatisierten Zuordnung der aus den NOESY-Spektren gewonnenen Abstandsbeschränkungen wurde zur Verfeinerung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP ein strukturgefilterter Iterationsprozeß durchlaufen. Mit 2490 Abstandsrandbedingungen zwischen Protonenpaaren sowie 106 stereospezifischen Zuordnungen wurden Torsionswinkeldynamikrechnungen mit abschließender Energieminimierung durchgeführt. Ein mittlerer globaler RMSD-Wert der Proteinrückgratatome von 0,85 ± 0,12 Å erfüllt die Ansprüche einer hochaufgelösten Struktur. Die Tertiärstruktur entspricht einem -Faß bzw. einer -Muschel. Sie besteht aus zehn antiparallelen -Faltblattsträngen und einer kurzen Helix-Turn-Helix Domäne. Die - Faltblattstränge bilden zwei nahezu orthogonale -Faltblätter von jeweils fünf Strängen. Die Lösungsstruktur ähnelt trotz teilweise niedriger Sequenzhomologie den bereits bekannten Strukturen der FABPs aus unterschiedlichsten Organismen. Eine sehr gute Übereinstimmung wurde im Vergleich mit der Lösungsstruktur des H-FABP beobachtet. Die enge Verwandtschaft beider zur Unterfamilie IV gehörenden Proteine äußert sich durch die hohe Sequenzhomologie (67%), die Ähnlichkeit der Konformation und Bindungsaffinität der Liganden, die helikale Konformation am N-Terminus (V1-F4) und ein vergleichbares Wasserstoffbrückennetzwerk innerhalb der Bindungstasche.
In der vorliegenden Arbeit wurden die pharmakologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften des Kaliumkanals KCNQ1 und des KCNQ1/MinK (IKs) untersucht. Hierzu wurden die Kanäle in Xenopus-laevis-Oozyten und der KCNQ1/MinK (IKs) in CHO-Zellen exprimiert und in Voltage-Clamp-Experimenten untersucht. Die Blockwirkung des Chromanol-293B-Razemates und die der beiden Enantiomere wurden am KCNQ1- und KCNQ1/MinK-Kanal untersucht. Eine Enantiomerenselektivität der Chromanol 293B-Enantiomere wurde nachgewiesen. Beide Enantiomere wirken abhängig vom Zustand der KCNQ1- und IKs-Kanäle. Das 3S,4R-293B blockierte nur geschlossene Kanäle, während das andere Enantiomer 3R,4S-293B auf geschlossene und auf geöffnete Kanäle wirkte. Als Grundlage dieser Aussagen wurden kinetische Analysen der Kanalkinetiken ohne Blocker und bei partieller Blockade der Kanäle durchgeführt. Die Inhibiton des IKs
In den vergangenen Jahren wurden in der AntisenseTechnologie grundlegende Hürden genommen, die eine Arzneimittelentwicklung auf Nukleinsäurebasis ermöglichen. Hierzu zählt vor allem die Gewährleistung einer ausreichenden metabolischen Stabilität und die Synthese im technischen Maßstab. In zahlreichen klinischen Studien wurde der Wirksamkeitsnachweis am Menschen erbracht. Als sequenzspezifische Therapeutika zeichnen sich Antisense Oligonukleotide im Vergleich zu vielen anderen Wirkstoffen dadurch aus, daß sie spezifisch mit einer RNAZielsequenz hybridisieren, ohne dabei wichtige zelluläre Funktionen zu beeinträchtigen. Neben krankheitsauslösenden Genen können Antisense Oligonukleotide auch virale Gene blockieren und nach Aktivierung der Ribonuklease H hydrolysieren. Das erste Präparat auf Oligonukleotidbasis wurde 1998 zugelassen und hemmt erfolgreich die Vermehrung des Cytomegalievirus. Hepatitis C ist eine Virusinfektion, die momentan nur unzureichend therapiert werden kann. Seit Mitte der neunziger Jahre wird nach geeigneten Antisense Oligonukleotiden und Ribozymen gesucht, um die Heilungschancen bei einer chronischen HCVInfektion zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch experimentelles Screening eine potente Zielsequenz (tS13) im Bereich der internen ribosomalen Angriffsstelle (IRES) und des Startcodons für die Proteinbiosynthese des HCV gefunden (Nukleotide 326342 des HCV Genoms). Hierzu wurde die Sequenz eines bereits bekannten 23mer Antisense Oligonukleotids durch systematisches Verkürzen auf 17 Nukleotide reduziert, ohne in vitro an Inhibitionspotential einzubüßen. Erst weitere Verkürzungen führten zu einer deutlichen Abnahme der Antisense Wirkung. Eine Schwierigkeit bei der therapeutischen Anwendung von polyanionischen Antisense Oligonukleotiden ist deren begrenzte zelluläre Aufnahme. Wie in Kapitel 3 dargelegt, wurden bislang zahlreiche Methoden zur Verbesserung der Membrangängigkeit dieser Wirkstoffklasse entwickelt. Zur Evaluierung eines leberselektiven Transports (engl.: drug targeting) und zur Steigerung der hepatozellulären Aufnahme (engl.: cell uptake) wurde das antiviral wirkende 17mer Antisense Oligonukleotid tS13 mit Biomolekülen wie den Gallensäuren, die im enterohepatischen Kreislauf das Zielorgan Leber passieren, kovalent verknüpft. Die Kupplung erfolgte dabei über die für die zelluläre Aufnahme nicht essentielle 3aHydroxylgruppe der Cholsäure und Taurocholsäure. Die Gallensäuren wurden entsprechend geschützt, in die Phosphoramidite 22a/b und 27a/b überführt und im letzten Kupplungsschritt der Festphasensynthese an das 5
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
Der Cytochrom b6f Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I und nimmt damit eine zentrale Rolle in der Photosynthese ein. Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Protokoll für die Präparation des Cytochrom b6f Komplexes aus Spinat ermöglichte eine reproduzierbare Reinigung von hochaktivem Enzym. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den publizierten Daten für den Komplex überein. SDS-PAGE zeigte alle vier großen Untereinheiten sowie eine Bande der kleinen 4 kDa Untereinheiten. Die Präparation ist mit 450 ± 60 Elektronen pro Sekunde 10 - 15 mal aktiver als in bisherigen Veröffentlichungen für Präparationen aus Pflanzenblättern beschrieben und fast doppelt so aktiv wie die besten Präparationen aus Chlamydomonas reinhardtii. Die Zuverlässigkeit des Aktivitätstests konnte durch den Wechsel des Lösungsmittels für den Elektronendonor von Ethanol zu Dimethylsulfoxid erheblich verbessert werden. Die hohe Effizienz der Proteinreinigung und die hohe Aktivität des Komplexes stellen ideale Voraussetzungen für biophysikalische und strukturelle Studien dar. Versuche zur zweidimensionalen Kristallisation des Cytochrom b6f Komplexes erbrachten Kristalle mit verschiedenen Morphologien, die unterschiedlich gut geordnet waren. Eine Projektionsdichtekarte bis zu einer Auflösung von 20 Å von mehrschichtigen Kristallen zeigte strukturelle Übereinstimmungen, aber auch Unterschiede zu dem verwandten Komplex aus der einzelligen Alge C.reinhardtii. H -ATPase Plasmamembran H -ATPasen wandeln chemische Energie (in Form von ATP) in einen elektrochemischen Gradienten um, der als Energielieferant von sekundären Transportproteinen dient. Es ist gelungen, zweidimensionale Kristalle der heterolog exprimierten und mit einem His-tag ausgestatteten Plasmamembran H -ATPase AHA2 aus Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zwei verschiedene Methoden wurden dabei angewandt. Zum einen wurde das Protein wurde in Proteoliposomen rekonstituiert, und die so gewonnenen Vesikelkristalle resultierten in einer Projektionsdichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å. In einer zweiten Methode wurde eine Technik, basierend auf dem Einsatz neu entwickelter, partiell fluorierter und funktionalisierter Lipide, angewandt. Einzelschichten dieser fluorierten Lipide auf der Oberfläche eines Tropfens erwiesen sich auch in Anwesenheit von Detergenz als stabil. Die funktionalisierte Ni2 -NTA-Kopfgruppe der fluorierten Lipide ermöglichte eine Bindung des Proteins über den His-tag. Nach Detergenzentzug bildeten sich in einer Lipiddoppelmembran eingebettete 2D-Kristalle mit einem Durchmesser von bis zu 10 (m, die für die Erstellung einer Projektionsdichtekarte bis 9 Å genutzt wurden. Die beiden elektronenkristallographisch erstellten Projektionskarten waren sehr ähnlich. Sie zeigten drei voneinander abgegrenzte Domänen, die in Zusammenhang mit einer vorliegenden Struktur der verwandten Ca2 -ATPase interpretiert werden konnten. Die Technik der Oberflächenkristallisation eröffnet neue Möglichkeiten für die Kristallisation von Membranproteinen. Kristallisationsexperimente können bei Proteinkonzentrationen von nur 50-150 (g/ml durchgeführt werden und sind für alle Membranproteine, die mit einem His-tag exprimiert werden können, anwendbar. Es wurde ein Homologiemodell der Plasmamembran H -ATPase aus Neurospora crassa in Anlehnung an die atomare Struktur der verwandten Ca2 -ATPase SERCA1 erstellt. Beide Enzyme liegen in unterschiedlichen Konformationen vor, die sie während des Reaktionszyklus durchlaufen. Es konnte gezeigt werden, dass es sich dabei offenbar um die Bewegung ganzer Domänen handelt. Dabei wurde klar, dass in einem solchen Fall schon 3D-Strukturen bei einer mittleren Auflösung von ca. 8 Å, wie sie mit Hilfe der Elektronenkristallographie verhältnismäßig einfach erreicht werden können, viel zum Verstehen von Reaktionszyklen beitragen können, die große Konformationsänderungen beinhalten.
Die Hämatopoese stellt den blutbildenden Prozeß dar, der den Menschen ein Leben lang mit Blutzellen versorgt und deren Ausgangspunkt eine kleine Zahl hämatopoetischer Stammzellen ist. Diese Stammzellen besitzen einerseits die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind andererseits in der Lage, durch Proliferation und terminale Differenzierung Zellen verschiedener Linien hervorzubringen. Das biologische Hauptmerkmal der Stammzelle ist die Fähigkeit die Hämatopoese zu rekonstituieren, was klinisch bei der Stammzelltransplantation genutzt wird. Überwiegend werden dabei Knochenmark und peripheres Blut als Quelle für Stammzellen genutzt, die abhängig von der Zahl der transplantierten Zellen zur völligen Rekonstitution der Blutbildung führen. Für Patienten ohne passende Spender wurde das Nabelschnurblut als Alternative in Betracht gezogen. Trotz verschiedener Vorteile der Stammzellen aus Nabelschnurblut besteht der Hauptnachteil in der sehr limitierten Zahl der Zellen mit dem erhöhten Risiko eines Transplantatversagens. Aus diesem Grund wird die ex vivo Vermehrung dieser Stammzellen derzeit zunehmend untersucht. Erforderlich sind Bedingungen zur ausreichenden Vermehrung der Zellen unter Erhalt der Stammzelleigen schaften, die die klinische Anwendung möglich machen. Diese Bedingungen waren bisher nicht erfüllt. Hauptziel dieser Arbeit war es demnach Kulturbedingungen für die Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren, die den klinischen Anforderungen einer Transplantation genügen. Dafür wurden sowohl die determinierten Vorläuferzellen untersucht, als auch die Fähigkeit der Stammzelle in vitro Langzeithämatopoese aufrecht zu erhalten und zur Repopulierung der NOD/SCIDMaus. Die Repopulierung ist ein spezifischer Prozeß (Homing), bei dem die Migration der Zellen aus der Blutbahn durch die Endothelzellschicht der Gefäße in die spezialisierten Nischen des Knochenmarks erfolgt. Da für die Amplifikation äußere Stimuli erforderlich sind, welche die biologischen Eigenschaften der Zellen modulieren, wurden die Eigenschaften der expandierten Zellen in verschiedenen in vitro Assays wie CFU und LTCIC untersucht, die derzeit als die besten Verfahren gelten, die hämatopoetische Stammzelle zu detektieren. Zur Untersuchung der Repopulierungsfähigkeit wurde das NOD/SCIDMausmodell etabliert, in dem der Aufbau einer humanen Hämatopoese im murinen Knochenmark gemessen wird, sowie ein neues in vitro Modell entwickelt, das Stromazellsphäroid, mit dessen Hilfe die Migrationsfähigkeit untersucht wurde. Mit der Kombination der auf primitive Stammzellen wirkenden Zytokine SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine gute und ausreichende Vermehrung der ontogenetisch unreifen und der determinierten Progenitorzellen nach Kultivierung der Zellen über 7 Tage. Das beim Einsatz in der ex vivo Expansion umstrittene Zytokin IL3 führte hierbei nicht zum befürchteten Verlust der Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen. Es sorgte vielmehr durch eine starke Vermehrung der Zellen für ein Engraftment der NOD/SCIDMaus, das dem durch frische unmanipulierte Nabelschnurblutzellen vergleichbar war. Von den getesteten Kultursystemen erwies sich die statische Kultivierung im Teflonbeutel als geeignet zur Vermehrung der primitiven Progenitoren, ohne die Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen zu vermindern. Durch die Wahl eines serumfreien, klinisch anwendbaren Mediums gelang somit die Etablierung eines Kultursystems zur optimierten ex vivo Expansion früher Progenitor und Stammzellen aus Nabelschnurblut ohne Verlust der Repopulierungsfähigkeit für die klinische Anwendung. Das Homing in das Knochenmark ist ein selektiver aus mehreren Einzelschritten bestehender Prozeß unter Interaktion der Zellen mit Endothelzellen und dem Knochenmarkstroma, der durch eine Vielzahl verschiedener zusammenwirkender Adhäsionsmoleküle reguliert wird. Weitere Faktoren, die das Homing beeinflussen sind Zytokine oder Chemokine. Diese Stimuli wirken über verschiedene intrazelluläre Signalwege, von denen die RhoProteinfamilie der kleinen GTPasen eine bestimmende Rolle in der Migration zugedacht wird, sowie andere Bestandteile der intrazellulären Signaltransduktion, wie Kinasen und GProteine. Die Migration in das Sphäroidmodell ist ebenso ein selektiver und gerichteter Prozeß, bei dem neben den primären CD34 Zellen aus Nabelschnurblut auch andere humane hämatopoetische Zelllinien eine gerichtete Einwanderung zeigen. Durch Zugabe eines Inhibitors von G Proteinen, Pertussis Toxin (PT), und Hemmung der kleinen GTPasen durch spezifische Toxine aus Clostridien konnte eine reproduzierbare und deutliche Verringerung der Migration in das Sphäroid erreicht werden. Die Migration hämatopoetischer Zellen in das Sphäroid erfolgt also unter Beteiligung der kleinen GTPasen, sowie PT sensitiver GProteine. Blockierungsversuche zeigten unerwarteterweise keine funktionelle Beteiligung des ChemokinRezeptorpaares SDF1/CXCR4 und des Adhäsionsmoleküls VLA4 bei der Migra- tion in das Sphäroid. Welche weiteren Mechanismen für diese Migration bedingend sind erfordert weitergehende Untersuchungen. Durch die Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut mit den Zytokinen SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine ausreichende Vermehrung von frühen und determinierten Progenitorzellen unter Erhalt ihrer Stammzellfähigkeiten, so daß ein klinischer Einsatz möglich wird. Dabei ergab sich durch Untersuchung der Migrationsfähigkeit im Sphäroidmodell, daß beim Homing der Zellen die Aktivierung der kleinen GTPasen und eines Pertussis Toxinsensitiven GProteins beteiligt sind.