Biochemie und Chemie
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A key function of reversible protein phosphorylation is to regulate protein–protein interactions, many of which involve short linear motifs (3–12 amino acids). Motif‐based interactions are difficult to capture because of their often low‐to‐moderate affinities. Here, we describe phosphomimetic proteomic peptide‐phage display, a powerful method for simultaneously finding motif‐based interaction and pinpointing phosphorylation switches. We computationally designed an oligonucleotide library encoding human C‐terminal peptides containing known or predicted Ser/Thr phosphosites and phosphomimetic variants thereof. We incorporated these oligonucleotides into a phage library and screened the PDZ (PSD‐95/Dlg/ZO‐1) domains of Scribble and DLG1 for interactions potentially enabled or disabled by ligand phosphorylation. We identified known and novel binders and characterized selected interactions through microscale thermophoresis, isothermal titration calorimetry, and NMR. We uncover site‐specific phospho‐regulation of PDZ domain interactions, provide a structural framework for how PDZ domains accomplish phosphopeptide binding, and discuss ligand phosphorylation as a switching mechanism of PDZ domain interactions. The approach is readily scalable and can be used to explore the potential phospho‐regulation of motif‐based interactions on a large scale.
Acinetobacter baumannii is an important nosocomial pathogen that requires thoughtful consideration in the antibiotic prescription strategy due to its multidrug resistant phenotype. Tetracycline antibiotics have recently been re-administered as part of the combination antimicrobial regimens to treat infections caused by A. baumannii. We show that the TetA(G) efflux pump of A. baumannii AYE confers resistance to a variety of tetracyclines including the clinically important antibiotics doxycycline and minocycline, but not to tigecycline. Expression of tetA(G) gene is regulated by the TetR repressor of A. baumannii AYE (AbTetR). Thermal shift binding experiments revealed that AbTetR preferentially binds tetracyclines which carry a O-5H moiety in ring B, whereas tetracyclines with a 7-dimethylamino moiety in ring D are less well-recognized by AbTetR. Confoundingly, tigecycline binds to AbTetR even though it is not transported by TetA(G) efflux pump. Structural analysis of the minocycline-bound AbTetR-Gln116Ala variant suggested that the non-conserved Arg135 interacts with the ring D of minocycline by cation-π interaction, while the invariant Arg104 engages in H-bonding with the O-11H of minocycline. Interestingly, the Arg135Ala variant exhibited a binding preference for tetracyclines with an unmodified ring D. In contrast, the Arg104Ala variant preferred to bind tetracyclines which carry a O-6H moiety in ring C except for tigecycline. We propose that Arg104 and Arg135, which are embedded at the entrance of the AbTetR binding pocket, play important roles in the recognition of tetracyclines, and act as a barrier to prevent the release of tetracycline from its binding pocket upon AbTetR activation. The binding data and crystal structures obtained in this study might provide further insight for the development of new tetracycline antibiotics to evade the specific efflux resistance mechanism deployed by A. baumannii.
In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
CryoEM at IUCRJ: a new era
(2016)
CO2 has been electrochemically reduced to the intermediate formate, which was subsequently used as sole substrate for the production of the polymer polyhydroxybutyrate (PHB) by the microorganism Cupriavidus necator. Faradaic efficiencies (FE) up to 54 % have been reached with Sn‐based gas‐diffusion electrodes in physiological electrolyte. The formate containing electrolyte can be used directly as drop‐in solution in the following biological polymer production by resting cells. 56 mg PHB L−1 and a ratio of 34 % PHB per cell dry weight were achieved. The calculated overall FE for the process was as high as 4 %. The direct use of the electrolyte as drop‐in media in the bioconversion enables simplified processes with a minimum of intermediate purification effort. Thus, an optimal coupling between electrochemical and biotechnological processes can be realized.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Die vorliegende Arbeit befasst sich im Wesentlichen mit zwei Zielen. Zum einen sollte durch den selektiven Einbau von modifizierten Nukleosiden der UUCG-Tetraloop untersucht werden, um seine ungewöhnlich hohe Stabilität besser zu verstehen. In einem zweiten Projekt stand die Entwicklung einer neuen Methode für das Spin-Labeling von Oligonukleotiden für die ESR-Spektroskopie im Mittelpunkt. Die einzigartige hohe Stabilität des UUCG-Tetraloops beruht auf der Ausnutzung der drei stabilisierenden Faktoren: Wasserstoffbrücken, Basenstapelung und Solvatation. Für die Untersuchung des UUCG-Tetraloops wurden 2´-Fluorpyrimidine 22a/b, 23a/b und 27a/b, 2´- Desoxyuridin 26a/b sowie ein dem Uridin isosterer Baustein 28a/b eingesetzt (Abb. 10.1). Während die Bausteine 27a/b und 28a/b vorlagen, sind die Bausteine 22a/b, 23a/b und 26a/b synthetisiert worden. 2´-Fluorpyrimidine können durch die fehlende 2´-OH-Funktion nicht als Wasserstoffbrückendonor dienen. Weiterhin verschiebt die Fluorierung in ribo- bzw. arabino- Stellung das C3´-endo/C2´-endo Gleichgewicht. Im Vergleich mit dem Einbau von 2´- Desoxyuridin lassen sich Aussagen über Vorzugskonformation und Beteiligung an Wasserstoffbrücken einzelner Nukleotide im Loop machen. Ein Schlüsselmolekül für die Synthese der 2´-Fluor modifizierten Bausteine 22a/b und 23a/b ist 2,2´-Anhydro-1-( -D-arabinofuranosyl)uracil 19 welches durch die Umsetzung von Uridin 18 mit Diphenylcarbonat und Natriumhydrogencarbonat in HMPT erhalten werden kann. Dieses ermöglicht die selektive Einführung eines Fluor-Atoms. Die 2´-Fluornukleoside wurden nach Standardbedingungen in Phosphoramidite überführt. Die Darstellung des Cytidinbausteins 23a/b gelang durch direkte Umsetzung der Verbindung 22a/b mit 1,2,4-Triazol und POCl3. Diese Reaktion erspart einen gesonderten mehrstufigen Syntheseweg für die Verbindung 23a/b ausgehend vom Cytidin. Die Bausteine wurden selektiv an verschiedenen Positionen im Loop- und Stembereich der UUCG-Haarnadelschlaufe mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten eingebaut. Die Aufreinigung der erhaltenen RNA-Stränge erfolgte durch Anionenaustausch-HPLC. Nach der Charakterisierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Stränge mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Neben den Tm-Werten wurden auch die thermodynamischen Parameter bestimmt. Aus den gemessenen Daten konnten im Wesentlichen folgende Ergebnisse erzielt werden: * Der Einbau aller Bausteine im Loopbereich führte zu einer Destabilisierung im Vergleich zum nativen Loop. Die Inkorporation von UF im Stembereich hatte eine beachtliche Stabilisierung der Struktur zur Folge, im Fall des Stranges HP19 von 8°C (siehe Tab. 7.1, Seite 79) * Der Einbau von UF an der Position U4 führte erwartungsgemäß zu einer Destabilisierung, da die durch NMR-Daten belegte Wasserstoffbrücke zu G7 nicht ausgebildet wird. * An der Position U4 liegt bevorzugt eine C2´-endo Konformation vor. * Von besonderer Bedeutung für die Stabilität des Loops ist die Position C6. Die Inkorporation von CF hat eine besonders deutliche Destabilisierung zur Folge, woraus auf eine bevorzugte C2´-endo Konformation geschlossen werden kann. Zum anderen spielen hier Solvatationseffekte eine Rolle, da die 2´-OH-Funktion des nativen Loops Kontakt zum Lösungsmittel hat. * Der Einbau des isosteren Bausteins 28a/b führte an keiner Position zu einer Stabilisierung, obwohl durch das ausgeprägte -System eine bessere Basenstapelung zu erwarten wäre. Im Gegenteil wir durch die modifizierte Base der Tetraloop nachhaltig destabilisiert (12°C). * Auffällig ist eine Abflachung der erhaltenen Schmelzkurven, die auf eine Abnahme der Kooperativität oder das Vorhandensein verschiedener Zwischenstufen schließen lässt. Auch NMR-Ergebnisse belegen, dass der Tetraloop ein hohes Maß an Flexibilität zeigt. Die erhaltenen Daten sind in Übereinstimmung mit einer auf NMR-Daten beruhenden simulierten Struktur, die Williams et al, 2001 vorgeschlagen haben. * Die Mehrfacheinbauten zeigen, dass die stabilisierenden Kräfte dieses Tetraloops synergetisch scheinbar optimal zusammenwirken und nur schwer getrennt voneinander betrachtet werden können. Im zweiten Projekt sollten Oligonukleotide durch das Anbringen von Spin-Labeln für die ESR-Spektroskopie zugänglich gemacht werden. Zunächst ist der durch seine Starrheit geeignete Label 29 in einer 8-stufigen Synthese ausgehend von 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-4-on 41 synthetisiert worden. Nach der Bromierung in und ´-Position wird durch eine Favorskii-Umlagerung der Fünfring aufgebaut. Die Oxidation des Amins wurde mit H2O2/Natriumwolframat durchgeführt. Nach der basischen Hydrolyse wird die Seitenkette über ein Weinrebamid zum Aldehyd reduziert. Eine direkte Reduktion war nicht möglich. Das terminale Alkin des Labels 29 wir durch Seitenkettenverlängerung durch eine Wittig- Reaktion mit anschließender Dehydrochlorierung erhalten. Ein alternativer Syntheseweg, der die Oxidation des Amins zum Nitroxid auf einer späteren Stufe vorsieht, war nicht erfolgreich. Da die Ankupplung des Labels an die 5-Position eines Uridin- oder Desoxyuridin- Bausteins während der Festphasensynthese am Syntheseautomaten erfolgen soll, ist der entsprechende 5-Ioduridinphosphoramidit- bzw. 2´-Desoxy-5-Ioduridinphosphoramidit- baustein synthetisiert worden. Nach der Schützung der freien Hydroxylgruppen mit der Acetylschutzgruppe ist die Iodierung der 5-Position mit Iod und Cerammoniumnitrat durchgeführt worden. Nach der Entschützung der Hydroxylgruppen wurden die Phosphoramidite nach Standardmethoden synthetisiert. Im Gegensatz zu bisherigen Arbeiten, die ein gelabletes Phosphoramidit am Synthesizer eingebaut haben, wurde die Kupplung des Labels in dieser Arbeit während der Festphasensynthese durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass im Gegensatz zu dem gelabelten Amidit pro Kupplung nur geringe Mengen des Spin-Labels verbraucht werden. An der zu markierenden Position wird ein 5-Ioduridin oder 2´-Desoxy-5-ioduridinbaustein eingebaut und danach die Säule vom Synthesizer entfernt. Nun wird mit Hilfe von Spritzen eine Mischung des Labels, des Palladium(0)-Katalysators und CuI in DMF/Triethylamin auf die Säule aufgegeben. Nach der erfolgten Kupplung wird die Säule wieder am Synthesizer installiert und die Synthese fortgesetzt. Es hat sich aus Gründen der einfacheren Handhabbarkeit als günstiger erwiesen, als Katalysator nicht Tetrakis-(triphenylophosphin)-palladium(0) 66 sondern Bis- (triphenylphospin)-palladium(II)-dichlorid 68 einzusetzen. Die Kupplungsausbeuten des Labels lagen nach HPLC-Daten bei über 90% für die Stränge SG1 bis SG4 (siehe Tab. 9.2, Seite 132). Die Ausbeuten lagen damit genauso hoch wie die Kupplung des als Vergleichsverbindung eingesetzten Hexins. Während die HPLC-Aufreinigung bei den kurzen Strängen erfolgreich war, waren bei den längeren Strängen SG7 bis SG9 die Unterschiede in den Retentionszeiten geringer, sodass es bei noch längeren Strängen nötig werden könnte, die Stränge mittels Gelelektrophorese aufzureinigen. Die Analytik erfolgte durch ESR-Spektroskopie, enzymatischen Verdau und Massenspektrometrie. Jedoch habe sich sowohl die MALDI-TOF als auch die ESI- Massenspektrometrie als problematisch erwiesen. Die Spektren waren oft nicht aussagekräftig und wenig reproduzierbar. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten ausgehend von dieser Arbeit werden folgende Untersuchungen angeregt: * Die Untersuchung, ob FPLC oder Gelelektrophorese geeignete Methoden darstellen, um längere gelabelte Stränge aufzureinigen. * Darstellung von iodierten Purinnukleosiden, um beliebige Positionen innerhalb eines Oligonukleotids mit einem Spin-Label markieren zu können. * Den Mehrfacheinbau von Spin-Labeln um Abstände in kleinen RNA-Strukturen, z.B. Ribozymen zu bestimmen. Hier können auch Wechselwirkungen mit anderen paramagnetischen Sonden wie Manganionen ausgenutzt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Knockout-Mutanten für die Cyclophiline CypA1 und CypA2 hergestellt. Für die Konstruktion wurde nicht nur das eigentlich Gen verwendet, sondern auch umliegende Bereiche. Im Endeffekt standen der homologen Rekombination an beiden Seiten des Knockout-Konstrukts ca. 1000 bp zur Verfügung. Zunächst wurden die DNA-Abschnitte der Cyclophiline aus der genomischen DNA von Streptomyces lividans mittels PCR isoliert. Aufgrund des hohen GC-Gehalts wurde die Amplifikation in Fragmenten durchgeführt. Es wurden verschiedene PCR-Bedingungen getestet und für jedes Fragment optimale Bedingungen ermittelt. Nach Aufreinigung und A-Tailing folgte eine Ligation mit pGemT-Easy. Die erhaltenen Fragmente wurden sequenziert und anschließend über mehrere Klonierungsschritte in E. coli wieder zusammengefügt. Dabei wurde eine Apramycinresistenz-Kassette so in das Gen eingebaut, dass die eigentliche Information für das Cylophilin-Gen zerstört wurde. Das daraus resultierende Knockout-Konstrukt wurde in den temperatursensitiven pGM160, einem E.coli-Streptomyces-Shuttle Vektor, kloniert und in Streptomyces lividans transformiert. Nach einem Temperaturshift integrierte der temperatursensitive Vektor über homologe Rekombination in das Genom. Die DNA der potenziellen Mutanten wurde auf den zielgerichteten Einbau des Knockout-Konstrukts im gewünschten Cypclophilin-Gen untersucht. Mittels PCR konnten entsprechende Amplifikate hergestellt werden, die den Nachweis für die erfolgreiche homologe Rekombination lieferten. Der physiologische Zustand des Zellstoffwechsels kann durch extreme Umweltbedingungen wie Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock in radikaler Weise verändert werden. Bei diesen Prozessen können Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen beteiligt sein, indem sie durch Isomerisation der Prolyl-Bindung ein Enzym modulieren oder bei der Expression von neuen Proteinen im Rahmen der Proteinfaltung mitwirken. Experimente unter veränderten Wachstumsbedingungen wie z.B. Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock können Aufschluss darüber geben, ob in diesem Fall Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen an der Modulation von Enzymen beteiligt sind.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
Im Mittelpunkt der Arbeit steht die theoretische Beschreibung von ultraschnellen nichtadiabatischen cis-trans-Photoisomerisierunen in kondensierter Phase. Zu diesem Zweck wurde auf einen etablierten Modell-Hamilton-Operator zur Darstellung des isomerisierenden Systems zurückgegriffen und die Wechselwirkung mit der Umgebung im Rahmen der Redfield-Theorie behandelt. Eine gängige Näherung im Rahmen der Redfield-Theorie ist die Säkularnäherung, welche eine deutliche Reduktion des numerischen Aufwands bewirkt. Allerdings liefert die Säkularnäherung keine korrekte Beschreibung der Dynamik für Systeme, welche Regelmäßigkeiten im Eigenwertspektrum aufweisen, was für die in dieser Arbeit benutzten Isomerisierungsmodelle mit harmonischen Schwingungsmoden zutrifft. Andererseits verbietet sich für diese Systeme aus numerischer Sicht der Redfield-Algorithmus mit vollem Relaxationstensor. Daher wurde in dieser Arbeit ein nichtsäkularer Algorithmus entwickelt, der durch die Berücksichtigung der wichtigsten nichtsäkularen Terme eine adäquate Beschreibung der Dynamik im Rahmen der Redfield-Theorie liefert und gleichzeitig zu einer durchschnittlichen Reduktion der Rechenzeit auf ein Zehntel gegenüber der vollen Redfield-Rechnung führt. Im Rahmen der Redfield-Theorie wurden dann Dekohärenz- und dissipative Effekte für ein zweidimensionales Isomerisierungsmodell untersucht, wobei die unterschiedliche nichtadiabtische Dynamik an einer konischen Durchschneidung versus einer vermiedenen Kreuzung im Mittelpunkt des Interesses stand. Fazit dieser Studie ist, dass die konische Durchschneidung ein schnelles Abklingen anfänglicher Kohärenzen und eine effiziente Energieabgabe an die Umgebung bewirkt, was zu einer um eine Größenordnung schnelleren Isomerisierung gegenüber der vermiedenen Kreuzung führt. Daraus kann gefolgert werden, dass der photochemische Trichter tatsächlich der bevorzugte Reaktionsweg bei ultraschnellen internen Konversionsprozessen ist. Ein weiteres Anliegen dieser Arbeit war die Simulation von zeit- und frequenzaufgelösten Pump-Probe-Spektren für Photoreaktionen in dissipativer Umgebung. Hierzu wurde der Doorway-Window-Formalismus herangezogen, bei dem die Wechselwirkung der Pump- und Probepulse mit dem System im Doorway- bzw. Window-Operator enthalten ist. Für diese wurden unter der Annahme gaussförmiger Laserpulse durch analytische Integration der zweizeitigen Antwortfunktionen explizite Ausdrücke erhalten, die in den Redfield-Algorithmus integriert wurden. Somit existiert nun eine Methode zur Berechnung von Pump-Probe-Spektren, deren Skalierungsverhalten durch den Redfield-Algorithmus bestimmt wird. Diese Methode wurde dann angewandt für eine umfangreiche Modellstudie zu PumpProbe-Spektren von Isomerisierungsreaktionen in dissipativer Umgebung. Dabei wurden potentielle Probleme bei der Interpretation von transienten Spektren durch die Überlagerung und teilweisen Auslöschung der spektralen Beiträge zum Gesamtsignal aufgezeigt und diskutiert. In einer weiteren Studie wurde die Methode benutzt, um am Beispiel eines Morse-Oszillators zeitaufgelöste IR-Experimente zu simulieren, wie sie zur Gewinnung von modenselektiven Informationen über eine Reaktion durchgeführt werden.
The bipolar main tetraether lipid (MPL) of Thermoplasma acidophilum has been shown to form typical liquid expanded films at the air-water interface. The limiting molecular area at the collaps pressure is approximately Ac=73 Å2 per molecule. Monopolar aiphytanyl diether lipids were found to occupy the same area at high surface pressure as MPL. Thus, it was concluded that in the monofilm only one of the two polar headgroups of the MPL molecules is hydrated, i.e. that the single MPL molecules arc oriented upright. The packing properties of MPT. in the monofilm are determined by the properties of the branched alkyl chains only; the polar head groups do not contribute to the space requirement in the film. The collaps pressure of the MPL film is approximately 39 mN m-1 at 8°C. At a surface pressure of π = 30 mN m-1 and 20 °C the film is stable for many hours.
By running a temperature series of molecular dynamics (MD) simulations starting from the known low-temperature phase, the experimentally observed phase transition in a `jumping crystal' was captured, thereby providing a prediction of the unknown crystal structure of the high-temperature phase and clarifying the phase-transition mechanism. The phase transition is accompanied by a discontinuity in two of the unit-cell parameters. The structure of the high-temperature phase is very similar to that of the low-temperature phase. The anisotropic displacement parameters calculated from the MD simulations readily identified libration as the driving force behind the phase transition. Both the predicted crystal structure and the phase-transition mechanism were verified experimentally using TLS (translation, libration, screw) refinement against X-ray powder diffraction data.
With only a 2.6 Å resolution laboratory powder diffraction pattern of the θ phase of Pigment Yellow 181 (P.Y. 181) available, crystal-structure solution and Rietveld refinement proved challenging; especially when the crystal structure was shown to be a triclinic dimethylsulfoxide N-methyl-2-pyrrolidone (1:1:1) solvate. The crystal structure, which in principle has 28 possible degrees of freedom, was determined in three stages by a combination of simulated annealing, partial Rietveld refinement with dummy atoms replacing the solvent molecules and further simulated annealing. The θ phase not being of commercial interest, additional experiments were not economically feasible and additional dispersion-corrected density functional theory (DFT-D) calculations were employed to confirm the correctness of the crystal structure. After the correctness of the structure had been ascertained, the bond lengths and valence angles from the DFT-D minimized crystal structure were fed back into the Rietveld refinement as geometrical restraints (‘polymorph-dependent restraints’) to further improve the details of the crystal structure; the positions of the H atoms were also taken from the DFT-D calculations. The final crystal structure is a layered structure with an elaborate network of hydrogen bonds.
The transcription factor p63 is expressed as at least six different isoforms, of which two have been assigned critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology on the one hand and supervision of the genetic stability of oocytes on the other hand. These two isoforms contain a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates their transcriptional activity. This inhibitory domain contains two individual components: one that uses an internal binding mechanism to interact with and mask the transactivation domain and one that is based on sumoylation. We have carried out an extensive alanine scanning study to identify critical regions within the inhibitory domain. These experiments show that a stretch of ~13 amino acids is crucial for the binding function. Further, investigation of transcriptional activity and the intracellular level of mutants that cannot be sumoylated suggests that sumoylation reduces the concentration of p63. We therefore propose that the inhibitory function of the C-terminal domain is in part due to direct inhibition of the transcriptional activity of the protein and in part due to indirect inhibition by controlling the concentration of p63. Keywords: p63, transcriptional regulation, auto-inhibition, sumoylation
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Ansätze zur Korrektur/Eliminierung von Punktmutationen in Nukleinsäuren untersucht. Im ersten Ansatz wurden chimäre RNA/DNA-Hybride zur Korrektur von einer Punktmutation im p22phox-Gen ausgetestet, während im zweiten Ansatz ein „Hammerhead“-Ribozym zur Eliminierung von mutierter N-ras-RNA untersucht wurde.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
In der vorgelegten Arbeit wurden 50 Mutationen von Aminosäuren im Bereich der Chinoloxidationsbindungsstelle (Qo-Site) des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans untersucht. Hierzu wurden die Mutanten erstellt, Kinetiken der Substratbindung bestimmt und EPR Spektren aufgenommen. Mit den gleichen Methoden wurden auch verschiedene Klasse I und Klasse II Inhibitoren der Qo-Site untersucht. Wenngleich der Reaktionsmechanismus auch mit Hilfe dieser Mutationen nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, so konnten doch neue Einsichten in die Funktionsweise des bc1-Komplexes gewonnen werden. Verschiedene Modelle wurden vorgeschlagen, um die energetisch günstige aber thermodynamisch unwahrscheinliche Verzweigung der beiden Elektronen des Ubichinols auf die beiden Redoxketten des bc1-Komplexes der Atmungskette zu beschreiben. Da die Redoxpotentiale der beiden primären Elektronenakzeptoren extrem unterschiedlich sind, scheint es zwingend zu sein, dass beide Elektronen den Hochpotentialzweig (Rieske, Cytochrom c1, Cytochrom c) durchlaufen. Energetisch bietet jedoch die Wiederverwendung eines der beiden Elektronen den immensen Vorteil der realen Verdopplung der Protonenpumpleistung. Die wichtigsten Mutationen der vorliegenden Arbeit betreffen die vermuteten direkten Bindungspartner des Ubichinols, bE295 und fH155. Das Histidin ist Teil der beweglichen Rieske Untereinheit des bc1-Komplexes, das Glutamat ist Teil eines hoch konservierten Abschnitts des Cytochrom b. Aufgrund der gemessenen Wirkungen der untersuchten Mutationen auf die kinetischen Kennzahlen und EPR Parameter der eingesetzten Substrate und Inhibitoren lassen sich folgende Schlüsse ziehen. Die Bindung des Chinol-Substrats in der Qo-Site benötigt die korrekte Ausrichtung und den unveränderten Bindungspartner fH155 der Rieske [2Fe-2S]-Gruppe. Das Fehlen des zweiten vermuteten Bindungspartners bE295, der ein Teil des hochkonservierten PEWY-Loops ist, wird hingegen toleriert. Die Aktivitäten bei Mutationen dieser Aminosäure liegen mit bis zu 56% im Vergleich zum Wildtyp (bE295A) relativ hoch. Auch unter Berücksichtigung von möglichen bypass Reaktionen ist es fraglich, ob das Glutamat des PEWY-Loops ein direkter Bindungspartner des Substrats ist. Der Inhibitor Stigmatellin bindet im bc1-Komplex von Paracoccus denitrificans irreversibel in der Qo-Site, auch wenn einer der beiden vermuteten Bindungspartner (bE295 bzw. fH155) nicht verfügbar oder verändert ist. Daraus kann man schließen, dass die Bindung des Stigmatellins im Wesentlichen von seiner Seitenkette im Bereich des Chinol-Eintrittskanals des bc1-Komplexes stabilisiert wird. Wechselwirkungen der bizyklischen Kopfgruppe mit Aminosäuren der Chinoloxidationsbindungstasche sind hierfür nicht zwingend notwendig. Weitere durchgeführte Mutationen lassen folgende weitere Rückschlüsse zu: Der korrekte Bindungsraum der Qo-Site ist für eine maximale Umsatzgeschwindigkeit des bc1-Komplexes erforderlich. Dies zeigen Mutationen von bG158 und bV161. Die Struktur des hochkonservierten PEWY-Loops ist mitentscheidend für die Aktivität des bc1-Komplexes. Störungen der Konfiguration in diesem Bereich führen zu einer deutlichen Abnahme der Aktivität. Dies lassen Mutationen von bY297, bP294 und bW296 erkennen. Der ef-Loop hat einen Einfluss auf die Bewegungsvorgänge der Rieske-Kopfgruppe. Er ist jedoch nicht sehr flexibel (bL286H). Veränderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk der Rieske-Kopfgruppe führen zu einer deutlichen Verminderung der Elektronentransferraten (bY159F, bS157A und bF151H). Die Bindungsregionen von Klasse I Inhibitoren in der Qo-Site überlappen mit denen des natürlichen Substrats. Sie sind jedoch nicht identisch, was sich im unterschiedlichen Verhalten einiger Mutationen auf die Aktivität von Substrat und die Inhibitionswirkung von Klasse I Hemmstoffen ausdrückt. Die Untersuchungen der Auswirkungen von Mutationen auf einen vermuteten Wasserkanal im Bereich des Häm bL und auf eine angenommene Zinkbindungsstelle im gleichen Bereich zeigen keine eindeutig interpretierbaren Ergebnisse. Die Mutationsstudien im Bereich des Cytochrom c1 wurden begonnen. Zusätzliche Mutanten in diesem Bereich könnten weiterführende Aufschlüsse über die Wechselwirkung der Rieske-Kopfgruppe mit Cytochrom c1 bringen. Die vorgelegte Studie lässt erkennen, dass die Vorgänge in der Qo-Site des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans höchst komplex sind. Zusätzliche Untersuchungen der erzeugten Mutanten mit Hilfe weiterer Detektionsmethoden, insbesondere CD- und FTIR-Messungen, könnten in Zukunft eine noch bessere Einsicht in die Vorgänge dieses wichtigen Komplexes der Atmungskette geben.
Cryo-EM structures of KdpFABC suggest a K+ transport mechanism via two inter-subunit half-channels
(2018)
P-type ATPases ubiquitously pump cations across biological membranes to maintain vital ion gradients. Among those, the chimeric K+ uptake system KdpFABC is unique. While ATP hydrolysis is accomplished by the P-type ATPase subunit KdpB, K+ has been assumed to be transported by the channel-like subunit KdpA. A first crystal structure uncovered its overall topology, suggesting such a spatial separation of energizing and transporting units. Here, we report two cryo-EM structures of the 157 kDa, asymmetric KdpFABC complex at 3.7 Å and 4.0 Å resolution in an E1 and an E2 state, respectively. Unexpectedly, the structures suggest a translocation pathway through two half-channels along KdpA and KdpB, uniting the alternating-access mechanism of actively pumping P-type ATPases with the high affinity and selectivity of K+ channels. This way, KdpFABC would function as a true chimeric complex, synergizing the best features of otherwise separately evolved transport mechanisms.
On the basis of the results obtained in a previous paper it is shown that in the thermodynamic limit the analogues of the Massieu-Plandc functions are linked with each other by means of the Legendre transformation. The existence of the limiting function φk(∞) implies the existence of the limiting function φl(∞) (l<k) under the same assumptions. Passage to the limit and derivation with respect to all independent variables commute. A statistical derivation of the thermodynamic stability condition in its most general form is given which leads naturally to a statistical interpretation of the concept of thermodynamic stability.
It is shown that, for all conceivable ensembles of statistical thermodynamics, at the thermodynamic limit, the frequency function of the fluctuations of macroscopic extensive parameters equals a Gaussian. The proof is based on a generalisation of Khinchin's method using the concept of "smoothed frequency functions."
Farbzentren mit Absorptionen im Bereich des sichtbaren Lichtes entstehen bei Röntgen-Bestrahlung in Calcitkristallen, wenn die Kristalle durch Verformung eine hohe Störstellenkonzentration erhalten haben. Die Absorptionsspektren solcher Farbzentren werden ausgemessen und mit röntgenographisch bestimmten Störungsgraden verglichen. Die Bildung und die thermische Ausheilung der für die Entstehung von Farbzentren erforderlichen Störstellen wird quantitativ untersucht. Dabei wird festgestellt, daß mindestens zwei verschiedene Farbzentren auftreten, deren Konzentrationsverhältnis von der Temperaturvorbehandlung der gestörten Calcitproben abhängt.
Stimulated emission from chemically formed excited iodine molecules has been observed. The emission originates from the vibrational state ν′ = 55 of I2(B 3 II). The excited molecules are produced by a three body recombination reaction.
Mit den in dieser Arbeit entwickelten und getesteten Nachweismethoden konnte in verschiedenen Marktstudien gezeigt werden, dass sowohl molekularbiologische als auch immunologische Verfahren für den Nachweis von versteckten Allergenen in Lebensmitteln geeignet und auch miteinander vergleichbar sind. Dies wurde in zwei Studien deutlich, in denen beide Methoden sowohl für den Haselnuss- bzw. Erdnussnachweis miteinander verglichen wurden. In beiden Studien wurde eine sehr gute Übereinstimmung der beiden Verfahren gefunden. Nur in Einzelfällen gab zwischen beiden Methoden Abweichungen im Resultat, was aber fast ausschließlich Proben betraf, die einen sehr geringen Anteil (ca. 10 ppm Protein) Haselnuss bzw. Erdnuss enthielten. Damit konnte erstmals im direkten Vergleich gezeigt werden, dass PCR-basierte Methoden für den Allergennachweis in prozessierten Lebensmitteln genauso gut geeignet sind, wie antikörperbasierte Methoden. Allerdings besteht bis zum heutigen Zeitpunkt das Problem solche Anteile korrekt zu quantifizieren, da es an Referenzmaterialien mangelt, die es ermöglichen würden einen Mengenstandard für ein quantitatives Verfahren herzustellen. Momentan sind quantitative Messungen nur exakt möglich, wenn die zu untersuchende Lebensmittelmatrix genau bekannt ist und ein entsprechender Standard generiert werden kann. Trotzdem bieten beide Verfahren die Möglichkeit prozessierte Lebensmittel sehr empfindlich auf allergene Bestandteile zu untersuchen, um somit sicherzustellen dass die aktuellen gesetzlichen Regelungen und Richtlinien für die Etikettierung von Lebensmitteln, wie die EU-Richtlinie 2006/146/EU bzw. die Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV), von den Lebensmittelherstellern eingehalten werden. Weiterhin bieten die etablierten Nachweismethoden den Herstellern die Möglichkeit, ihre Produktion im Hinblick auf potenzielle Kontaminationsrisiken mit allergenen Zutaten zu überprüfen bzw. die Effizienz der verwendeten Reinigungsmethoden einzuschätzen. Dies wurde erstmals im Rahmen an einer Modellstudie in Zusammenarbeit mit einem Aromenhersteller durchgeführt. In dieser Studie sollte die Effizienz von verschiedenen Reinigungsprozeduren hinsichtlich der Kontaminationsgefahr von allergenfreien Nachfolgeprodukten überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass der verwendete Reinigungsprozess sehr effektiv abläuft und nicht mit Kontaminationen gerechnet werden muss. Diese Studie hat exemplarisch gezeigt, dass es möglich ist, allergenspezifische Nachweismethoden in einem Betrieb einzusetzen, um die Belastung der Produktionsanlage und der hergestellten Produkte mit potenziellen Allergenen zu überwachen. Prinzipiell sollte es also möglich sein allergenspezifische HAACCP Konzepte innerhalb eines Betriebes zu etablieren, um so die Produktsicherheit noch weiter zu verbessern. Abschließend kann man sagen, dass die Entwicklung von allergenspezifischen Nachweismethoden einen wichtigen Beitrag zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit darstellt. Nicht nur dass diese Methoden wichtig sind, um bestehendes Recht zu überwachen, sie sind auch für die Lebensmittelproduzenten ein wichtiges Werkzeug die Qualität ihrer Produkte zu erhöhen.
Für die Optimierung sowie Entwicklung lichtsteuerbarer Systeme für biologische Anwendungen oder neue Materialien ist ein detailliertes Verständnis der zugrunde liegenden komplexen, lichtinduzierten Prozesse eine Voraussetzung. Die Verwendung von Photoschaltern in Makromolekülen ermöglicht eine zeitliche und örtliche Kontrolle über strukturelle Änderungen sowie die entsprechend folgenden (biologischen) Funktionen durch die Verwendung von Licht als externem Auslöser.
Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines auf Licht reagierenden Riboschalters, welcher die gezielte Kontrolle über Genexpression ermöglicht. Hierzu wurde eine spektroskopische Charakterisierung von verschiedenen Photoschaltern bezüglich einer Verwendung als biologischer Ligand sowie der Wechselwirkungen zwischen Azobenzolen und RNA, auch hinsichtlich ihrer Bindungsdynamiken durchgeführt. Zunächst wurde die hohe Abhängigkeit der (photo-)chemischen Eigenschaften der Azobenzole von der Wahl der Substituenten untersucht, wobei besonders die Anwendung in wässrigem Milieu betrachtet wurde. In einer detaillierten (zeitaufgelösten) Studie wurde der positionsabhängige Einfluss der Hydroxy-Substitution von Azobenzolen auf die Photoisomerisierung in wässriger Lösung untersucht. Für eine ortho-Substitution ergab sich hierbei ein alternativer Deaktivierungskanal nach Photoanregung, welcher stärker ausgeprägt ist als die Isomerisierung. Hierbei wird ein intramolekularer Protontransfer im angeregten Zustand (ESIPT) beobachtet, welcher mit einer Zeitkonstante von 0.3 ps beschrieben werden kann und in einer Keto-Spezies resultiert. Eine Keto-Enol-Tautomerie konnte für die para-Hydroxy-Substitution schon im Grundzustand beobachtet werden. Somit können beide Spezies gezielt adressiert werden. Durch Acetylierung der Hydroxygruppe verlangsamt sich die thermische Relaxation des cis-Isomer zu dem entsprechenden trans-Isomer signifikant ohne die Isomerisierung zu beeinträchtigen. Dementsprechend ermöglicht eine solche Acetylierung die Verwendung von bekannten Azobenzolderivaten als Photoschalter.
Zudem werden in dieser Arbeit zwei verschiedene Herangehensweisen in der Entwicklung eines Riboschalters beschrieben, welcher sich durch Licht regulieren lässt.
Diese sind durch kovalentes bzw. nicht-kovalentes Einbringen eines Azobenzolderivats in die RNA Struktur charakterisiert. Ein neuer Linker, welcher auf einer Desoxyribose-Struktur beruht, wird für die kovalente Anbindung des Azobenzols an den RNA Strang präsentiert, welcher eine licht-induzierte Dehybridisierung ermöglichen soll. Eine außergewöhnlich hohe Schaltamplitude mit einem cis-Gehalt von etwa 90% konnte für das Azobenzol im RNA Einzelstrang schon bei Raumtemperatur ermittelt werden. Zudem wurde der Einfluss des Photoschalters sowie der benachbarten Nukleotide in der RNA auf die Stabilität der RNA Doppelhelix untersucht. Die zweite Vorgehensweise beruht auf einer nicht-kovalenten Bindung zwischen einem Azobenzolderivat und einem RNA-Aptamer, welche lediglich für eines der Photoisomere ermöglicht wird, wodurch eine örtliche und zeitliche Kontrolle der Ligandenbindung der RNA erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit war es möglich zwei verschiedene photoschaltbare RNA Aptamere zu identifizieren und zu untersuchen, welche eine hohe Spezifität und Affinität aufweisen. Zudem wurde die Photoisomerisierung des Azobenzols innerhalb der RNA-Struktur sowie daraus resultierende lichtinduzierte Konformationsänderungen der RNA mittels zeitaufgelöster Anreg-/Abtastspektroskopie untersucht. Die daraus resultierende Dynamik der photoinduzierten Ligandenbindung sollte eine weitere gezielte Optimierung lichtschaltbarer biologischer Systeme erlauben.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der zeitaufgelösten Untersuchung eines photoschaltbaren Foldamers. Speziell wurde der strukturelle Übergang des OmPE-Foldamers 10-5 zwischen einer definierten helikalen und einer ungefalteten Konformation auf Grund der Photoisomerisierung der, in das Rückgrat integrierten, Azobenzole untersucht.
Dabei konnten die frühen (Ent-)Faltungsmechanismen des Foldamers im sub-Nanosekunden-Zeitbereich beobachtet werden, welche durch quantenmechanische Rechnungen unterstützt werden konnten. Darüberhinaus, war es möglich einen Anregungsenergietransfer vom PE-Rückgrat des Foldamers auf die Azobenzole nachzuweisen, welcher die Lebensdauer der angeregten Zustände des Systems signifikant verkürzt.
Diese Arbeit liefert wichtige Informationen zu den Reaktionspfaden, den gezielten Wechselwirkungen zwischen Photoschaltern und größeren organischen Molekülen, sowie den daraus resultierenden lichtinduzierten strukturellen Änderungen durch die Anwendung einer Vielzahl an (zeitaufgelösten) spektroskopischen Methoden. Diese Ergebnisse tragen zum weiteren Verständnis komplexer Prozesse in biologischem sowie nicht-biologischem Zusammenhang und somit zu einer weiterführenden Entwicklung neuer Systeme bei.
Als Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann man folgendes festhalten: • Die zuverlässige Bestimmung der leichten Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF ist im Konzentrationsbereich 30 mg/l bis 0,1 mg/l (600 ng bis 2 ng) grundsätzlich möglich. • Die Bestimmung von Schwefel in Proben, die dazu tendieren dicke, dichte Probenrückstände zu bilden (z.B. Alkalimetallsulfate) erfordert eine spezielle Probenpräparation. Hier können durch den Einsatz von geeigneten Glättungsmitteln gute Ergebnisse erzielt werden. • Für die Detektion von Phosphor ist die Verwendung von Saphirprobenträgern notwendig, da die Lage der Absorptionskante von Silizium, als Hauptbestandteil der üblicherweise verwendeten Quarzglasprobenträger, diese negativ beeinflußt. • Für Schwefelkonzentrationen ≤ 0,5 mg/l (≤ 10 ng) sollte mit dem dünnen Filter (Filter 1) gemessen werden. • Die berechneten Erfassungsgrenzen liegen für Schwefel, je nach Zusammensetzung der Probe, bei 0,29 bis 0,76 ng. Für Phosphor erhält man in anorganischen Proben auf Saphirträgern 0,34 ng und bei biologischen Proben 0,70 ng. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen klar, daß die zuverlässige Bestimmung der Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF möglich ist. Die Möglichkeit diese leichten Elemente zu bestimmen, eröffnet der TXRF verschiedene neue Forschungsgebiete, wie beispielsweise Biologie und Biochemie. Durch den großen Vorteil der TXRF, der geringen Probenverbrauch kombiniert mit niedrigen Nachweisgrenzen, sind Screening von Proteinen, Enzymen oder auch von anderen Makromolekülen die Phosphor und Schwefel enthalten, möglich. Hier können Strukturfragen oder Mutagenese Schritte in Proteinen, Enzymen und Nucleinsäuren geklärt werden. Eine weitere Anwendung der TXRF ist die quantitative Proteinbestimmung. Die genaue Schwefelbestimmung macht es möglich ältere Methoden wie beispielsweise die Bestimmung nach Lowry zu ersetzen. Durch Kombination der TXRF mit weiteren analytischen Methoden (z.B. AAS) und oberflächenabbildenden Methoden (z.B. REM oder AFM) kann die Probenvorbereitung verbessert werden und somit die TXRF für weitere Gebiete der Elementanalytik in Zukunft als zuverlässige Standardmethode etabliert werden.
Durch Substitution der vier Cysteine des a-Amylase-Inhibitors Tendamistat wurden Disulfidmutanten erzeugt. Zur Herstellung wurde im Rahmen dieser Arbeit die statistische Mutagenese angewandt. Die beiden Mutanten 11H27I45R73T und 11H27N45S73D wurden mit einem kombinierten Verfahren aus Olignukleotidsynthese und PCR erzeugt. Dieses hat als Grundlage die Genkassette, die in pT136 und pAX5a enthalten ist. Durch die gleichzeitige Veränderung beider Cysteine einer Disulfidbrücke sind Probleme mit der Einschränkung in der Variantenvielfalt nicht vorhanden, sowie mehrfache Mutationszyklen nicht notwendig. Die 4-fach-Mutanten wurden in Streptomyces lividans kloniert und exprimiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß stabiles Tendamistat erhalten wird. Damit wurde Disulfidbrücken-freies Tendamistat erhalten, ohne zusätzliche Mutationen einführen zu müssen.
Leukotrienes constitute a group of bioactive lipids generated by the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway. An increasing body of evidence supports an acute role for 5-LO products already during the earliest stages of pancreatic, prostate, and colorectal carcinogenesis. Several pieces of experimental data form the basis for this hypothesis and suggest a correlation between 5-LO expression and tumor cell viability. First, several independent studies documented an overexpression of 5-LO in primary tumor cells as well as in established cancer cell lines. Second, addition of 5-LO products to cultured tumor cells also led to increased cell proliferation and activation of anti-apoptotic signaling pathways. 5-LO antisense technology approaches demonstrated impaired tumor cell growth due to reduction of 5-LO expression. Lastly, pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumor cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway. However, the documented strong cytotoxic off-target effects of 5-LO inhibitors, in combination with the relatively high concentrations of 5-LO products needed to achieve mitogenic effects in cell culture assays, raise concern over the assignment of the cause, and question the relationship between 5-LO products and tumorigenesis. Keywords: leukotriene, apoptosis, cell proliferation, mitogenic effects, cytotoxicity
Lipide sind essentielle Strukturelemente von Zellen. Sie sind unter anderem Hauptbestandteil von Membranen, die einerseits verschiedene Kompartimente innerhalb der Zelle gegeneinander abgrenzen und andererseits die Zelle nach außen abschotten. Membranen regulieren den Transport von Ionen, kleinen polaren Molekülen sowie peptidartigen Botenstoffen, da sie für viele Bestandteile des Organismus nicht oder nur wenig durchlässig (permeabel) sind.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
In bacteria, the regulation of gene expression by cis-acting transcriptional riboswitches located in the 5'-untranslated regions of messenger RNA requires the temporal synchronization of RNA synthesis and ligand binding-dependent conformational refolding. Ligand binding to the aptamer domain of the riboswitch induces premature termination of the mRNA synthesis of ligand-associated genes due to the coupled formation of 3'-structural elements acting as terminators. To date, there has been no high resolution structural description of the concerted process of synthesis and ligand-induced restructuring of the regulatory RNA element. Here, we show that for the guanine-sensing xpt-pbuX riboswitch from Bacillus subtilis, the conformation of the full-length transcripts is static: it exclusively populates the functional off-state but cannot switch to the on-state, regardless of the presence or absence of ligand. We show that only the combined matching of transcription rates and ligand binding enables transcription intermediates to undergo ligand-dependent conformational refolding.
Bromotriphenylsilane
(2008)
The title compound, C18H15BrSi, crystallizes with two almost identical molecules (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.074 Å) in the asymmetric unit. It is isomorphous with chlorotriphenylsilane. Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 173 K; mean σ(C–C) = 0.010 Å; R factor = 0.095; wR factor = 0.288; data-to-parameter ratio = 17.0.
During the last years, chemopreventive activity of NSAIDs against a great variety of tumors was highly investigated. COX-2 seemingly plays a major part in tumorigensis and tumor development, underlined by several studies in animals and humans. At first, NSAIDs were thought to accomplish chemoprevention by inhibition of COX-2 as their so far known mode of action comprises unselective inhbition of COX-enzymes. However, further studies revealed COX-independent mechanisms. Sulindac is known as a well established drug used to treat inflammation and pain exerting the most prominent chemopreventive action, mainly in colorectal cancer or FAP and can be classified into the group of NSAIDs inhibting both COX-isoformes. As interference with the AA metabolism is evident, it was speculated whether Ssi has targets other than COX-enzymes providing evidence and explanation of its beneficial side effect profile and its ability to reduce tumor growth. 5-LO is another master enzyme in the AA cascade which produces inflammatory lipid mediators (LTs) upon stimulation in inflamed tissues. The present work should answer the question if Ssi targets the 5-LO pathway and should examine the molecular mechanisms behind Ssi-mediated 5-LO inhibiton. As COX-2 is upregulated during carcinogenesis and is inhibited by Ssi, further investigations should show regulatory effects of Ssi on 5-LO gene expression in MM6-cells and whether Sp1 as a common transcriptional factor is involved in such a regulation. As the use of NO-NSAIDs seem to be a promising strategy concerning their chemopreventive and gastroprotective effects compared to the parent NSAIDs, a possible interaction with the 5-LO pathway as a second, potent target should additionally be elucidated. In the first section it was demonstrated that the pharmacologically active metabolite of sulindac, Ssi, targets 5-LO. Ssi inhibited 5-LO in ionophore A23187- and LPS/fMLP-stimulated human PMNL (IC50 ≈ 8 -10 μM). Importantly, Ssi efficiently suppressed 5-LO in human whole blood at clinically relevant plasma levels (IC50 = 18.7 μM). Ssi was 5-LO-selective as no inhibition of related lipoxygenases (12-LO, 15-LO) was observed. The sulindac prodrug and the other metabolite, sulindac sulfone, failed to inhibit 5-LO. Mechanistic analysis demonstrated that Ssi directly suppresses 5-LO with an IC50 of 20 μM. Together, these findings may provide a novel molecular basis to explain the COX-independent pharmacological effects of sulindac under therapy. In the second part of the work dealing with the analysis of Ssi’s inhibitory mechanism on 5-LO it was presented that Ssi shows a lack of potency in cellular systems where membrane constituents are existent. The addition of microsomal fractions of PMNLto crude 5-LO enzyme were able to recover enzyme activity to ~ 100 %. Selectively 5-LO activity stimulating lipids like PC, participating in 5-LO membrane interactions within the regulatory C2-like domain of 5-LO, counteracted the Ssimediated inhibition on 5-LO-wt in a concentration-dependent manner. Lastly, a protein mutant lacking three trp resudies essential for linking the enzyme to nuclear membranes and deploying catalytic activity was not influenced by Ssi and shows enzyme activity in a cell-free assay. Ssi displays the first 5-LO inhibitor on the market interacting with the C2-like domain of the enzyme and therfore can stand for a novel lead structure of 5-LO inhibitors. An influence on 5-LO gene expression by Ssi could be detected in differentiated MM6-cells, described in the results chapter 3 (4.3). Ssi downregulated the 5-LO mRNA level after 72 hrs of incubation in differentiated MM6-cells to ~ 20 % of output control at concentrations of 10 μM. Concomitantly, mRNA levels of Sp1 were suppressed. Reporter gene studies revealed Sp1 most probably as a regulating agent involved in the Ssi-mediated 5-LO mRNA downregulation as co-transfection of increasing amounts of Sp1 could abrogate the effect. A ChIP assay could identify Sp1 as a critical transcriptional factor as Sp1 binding to the 5-LO promoter decreased in presence of Ssi. Lastly, three NO-NSADIs (NO-sulindac, NOnaproxen, NO-aspirin) were tested for the ability of 5-LO product inhibition. In intact PMNL, all compounds showed effective inhibition of 5-LO activity and NO-sulindac was most potent with an IC50 value of ~ 3 μM. NO-ASA inhibited 5-LO with IC50 values of ~ 30 μM and showed a non-competitive mode of action in cell-based assays. On human recombinant 5-LO all compounds again showed inhibitory potency whereas NO-sulindac again suppressed LT biosynthesis with an IC50 vaue comparable to intact cellular systems. Unfortunately, all inhibitors showed a loss of potency when tested for inhibition of 5-LO product synthesis in human whole blood as higher concentrations up to 100 μM were needed to reach at least 55 % enzyme inhibition. However, this strategy of 5-LO inhibition seems promising and needs further experimental approaches to gain more insight into the mechanism of 5-LO inhibition by NONSAIDs.
Wirkungen von Heilpflanzen, Gewürzen, Tees und Lebensmitteln werden in der Naturheilkunde seit der Antike genutzt. Pharmakologisch wirksam sind in der Regel nur die sekundären Pflanzeninhaltsstoffe. Diese in den oft aus vielen Bestandteilen zusammengesetzten Naturstoffen aufzuspüren und ihren molekularbiologischen Wirkungsmechanismus im Körper aufzuklären, ist das Ziel eines Forschungsnetzwerks am Frankfurter ZAFES (Zentrum für Arzneimittelforschung, -Entwicklung und -Sicherheit). So konnten Pharmazeuten und Kliniker gemeinsam herausfinden, wie ein Bestandteil des Rotweins, das Resveratrol, vor Darmkrebs schützt. Die Inhaltsstoffe von Salbei und Rosmarin bieten vielversprechende Ausgangspunkte für neue Medikamente gegen Altersdiabetes. Weihrauch, Myrte und Johanniskraut enthalten Wirkstoffe, die Schlüsselenzyme für Entzündungsreaktionen – etwa bei rheumatischen Beschwerden – hemmen.
Für eine zukünftige Gentherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist ein effizienter, spezifischer und sicherer Gentransfer in CD4-positive Zellen des peripheren Blutes erforderlich. Hierzu bieten sich vom murinen Leukämievirus (MLV) abgeleitete retrovirale Pseudotypvektoren an, die das Hüllprotein (Env) des HIV-1 oder des simianen Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm) tragen und daher einen selektiven Gentransfer in CD4-positive Zielzellen bewirken (Transduktion). [MLV(SIVagm)]-Vektoren haben gegenüber [MLV(HIV-1)]-Vektoren den Vorteil, daß sie von Seren HIV-1-positiver Patienten nicht neutralisiert werden und daher auch in HIV-1-infizierten Patienten angewendet werden könnten. Jedoch kann aufgrund des Tropismus von SIVagm mit [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren nur die kleine Subpopulation der CCR5-positiven Zellen innerhalb der humanen CD4-positiven Lymphozyten (3 bis 15%) transduziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Tropismus des SIVagm Env so zu modifizieren, daß auch die Mehrzahl der CD4-positiven Lymphozyten, die den CXCR4-Korezeptor exprimieren (70 bis 95%), transduziert werden kann. Hierzu wurde die putativ für die Korezeptorbindung verantwortliche V3- Loop-Region im Env des SIVagm durch die homologe Region eines CXCR4-tropen HIV-1-Stammes ersetzt. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [MLV(SIVagm-X4)]- Pseudotypvektoren herzustellen, die spezifisch CD4/CXCR4-positive Zellen transduzieren können. Neben der Bedeutung für die Generation neuer Vektoren für die Gentherapie beweist dieses Ergebnis die bisher nicht gezeigte Äquivalenz der V3- Loops der Hüllproteine von HIV-1 und SIVagm für die Korezeptornutzung. Um die neuen [MLV(SIVagm)]-Vektoren charakterisieren zu können und für eine spätere Anwendung weiterzuentwickeln, wurden stabile Zellinien etabliert, die große Vektormengen mit Titern zwischen 6x103 und 7,6x105 i.E./ml produzierten. Mittels Ultrazentifugation konnten Vektorpräparationen mit Titern bis zu 108 i.E./ml hergestellt werden. Die neu generierten [MLV(SIVagm-X4)]-Vektoren erwiesen sich wie die [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren als resistent gegenüber der Neutralisierung durch Seren HIV-1-infizierter Spender und könnten damit in vivo angewendet werden. In Experimenten zur Bestimmung der Transduktionseffizienz in primären peripheren Blutlymphozyten humaner Spender konnte der selektive Gentransfer mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren in CD4-positive Zellen gezeigt werden, während herkömmliche, amphotrope Vektoren CD4-positive und -negative Lymphozyten gleichermaßen transduzierten. Beide [MLV(SIVagm)]-Vektoren erlaubten im Vergleich zu den eingesetzten amphotropen MLV-Vektoren eine höhere Transduktionseffizienz in CD4-positiven Zellen. Neben Zielzell-Spezifität und Effizienz ist die Sicherheit neuer Vektorsysteme entscheidend für die Anwendbarkeit in der humanen Gentherapie. Eine Übertragung replikationskompetenter Retroviren (RCR) gilt hierbei als das Hauptrisiko bei der Nutzung retroviraler Vektoren. Auch bei der Herstellung von [MLV(HIV-1)]- oder [MLV(SIVagm)]-Pseudotypvektoren könnten durch Rekombinationsereignisse in den Verpackungszellen replikationsfähige Hybridviren entstehen. Bei der Untersuchung dieser Vektorsysteme wurde allerdings bisher keine spontane Bildung von RCR nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, durch molekulare Klonierung gezielt derartige Hybridviren zu generieren, um zu klären, ob solche Onko/Lenti-Hybridviren replikationsfähig sein können, zudem sollte gegebenenfalls das pathogene Potential dieser Viren untersucht werden. Dazu wurden die vollständigen Leserahmen des rev- und des env-Gens des HIV-1 bzw. SIVagm anstelle des MLV env-Gens in das Genom eines infektiösen molekularen Klon des MLV inseriert. Die Klonierungsstrategie wurde dabei so gewählt, daß alle notwendigen mRNAs gebildet werden konnten. Die Hybridvirusklone waren nach Transfektion in 293T-Zellen tatsächlich in der Lage, neben den MLV-Genen auch HIV-1 bzw. SIVagm env und rev funktionell zu exprimieren. Es konnten infektiöse Partikel nachgewiesen werden, die das Hybridvirusgenom auf Zielzellen übertragen konnten. In den infizierten Zielzellen wurde jedoch nur die Expression von MLV/SIVagm nachgewiesen werden. Keines der beiden Hybridviren erwies sich als replikationskompetent. Dies deutet darauf hin, daß die Bildung replikationskompetenter Onko/Lenti-Hybridviren unwahrscheinlich ist. Mit den [MLV(SIVagm)]-Vektoren steht somit ein Vektorsystem zur Verfügung, das sich für In-vivo-Anwendungen im HIV-infizierten Patienten eignet. Es konnte gezeigt werden, daß humane CD4-positive Lymphozyten mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren spezifisch, aber auch effizienter und sicherer transduziert werden als unter Verwendung bisher beschriebener amphotroper MLV-Vektoren.
Protein-tyrosine phosphatases (PTPs) and protein-tyrosine kinases co-regulate cellular processes. In pathogenic bacteria, they are frequently exploited to act as key virulence factors for human diseases. Mycobacterium tuberculosis, the causative organism of tuberculosis, secretes a low molecular weight PTP (LMW-PTP), MptpA, which is required for its survival upon infection of host macrophages. Although there is otherwise no sequence similarity of LMW-PTPs to other classes of PTPs, the phosphate binding loop (P-loop) CX5R and the loop containing a critical aspartic acid residue (D-loop), required for the catalytic activity, are well conserved. In most high molecular weight PTPs, ligand binding to the P-loop triggers a large conformational reorientation of the D-loop, in which it moves ∼10 Å, from an “open” to a “closed” conformation. Until now, there have been no ligand-free structures of LMW-PTPs described, and hence the dynamics of the D-loop have remained largely unknown for these PTPs. Here, we present a high resolution solution NMR structure of the free form of the MptpA LMW-PTP. In the absence of ligand and phosphate ions, the D-loop adopts an open conformation. Furthermore, we characterized the binding site of phosphate, a competitive inhibitor of LMW-PTPs, on MptpA and elucidated the involvement of both the P- and D-loop in phosphate binding. Notably, in LMW-PTPs, the phosphorylation status of two well conserved tyrosine residues, typically located in the D-loop, regulates the enzyme activity. PtkA, the kinase complementary to MptpA, phosphorylates these two tyrosine residues in MptpA. We characterized the MptpA-PtkA interaction by NMR spectroscopy to show that both the P- and D-loop form part of the binding interface.
Diluted aqueous solutions of some proteins (bovine serum albumin, β-Lactoglobubin, Peroxidase) show weak phosphorescence lasting over several minutes after they have been irradiated with light in the range 3500-4200 A. Addition of Eosin after the irradiation amplifies in some cases the intensity of luminescence to a value of about hundred. If Eosin is present at the irradiation process the excitation to phosphorescence is possible with light of the wavelength 5460 A.
After denaturation processes which destroy the configuration of proteins (Urea, Guanidine-HCI. detergents, heat at higher pH) the ability of phosphorescence disappears altogether; likewise after blocking the SH-groups by benzochinone or a total oxidation or reduction of the SS-groups which causes an complete unfolding of the peptide chain.
In solutions of bovine serum-albumin irradiated with 3650 Å at room temperature and afterwards frozen to -178°C no radicals could be observed by measurements of electron-spin-resonance but they were detectable if the irradiation took place in the presence of H2O2.
The reactions Xanthinoxidase-Xanthine-O2, Peroxidase-H2O2 and bovine serum-albumin-H2O2-Fe (II) EDTA are accompanied by chemiluminescence. By comparison with the behaviour of oxidised serum-albumin it could be shown that the chemical reaction produces an excited state of the native protein.
The observations lead to the conclusion that the weak phosphorescence of long duration originates from a triplet-state which is sufficiently populated only as the consequence of cooperative phenomena attending the undisturbed α-Helix-structure of the protein.
During photooxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) products can be formed which develop chemiluminescence on treatment with bases. Flash photolysis experiments show that this is the case only after previous formation of cation radicals, e.g. in the presence of CCl4 as solvent or of e-acceptors in aprotic solvents. These radicals react with oxygen to peroxy-radicals which can combine to several kinds of peroxides. Primary and secondary peroxides are the sources of chemiluminescent activity.
Chemiluminescent peroxides can also be obtained by irradiation of PA H carbonyl com pounds in protic solvents under nitrogen. It is assumed that two excited CO groups combine exceptionally with their O-atom s thus creating a peroxide bond. 24 aromatic aldehydes, ketones, dicarboxylic acid anhydrides and coumarines develop chemiluminescence after illumination with wavelengths ≥ 320 nm with intensities varying 4 magnitudes of order.
The sensitivity of the photochemiluminescent method is sufficient to detect amounts of PA H and their CO derivatives in the ppb to ppm range.
Exposite produce chemiluminescence when heated to 50 - 70 °C or treated with nucleophilic substances at room temperature. Initiation by Piperidine in Dimethylsulfoxide allows to determine 5 nmol of Phenyloxirane in 5 ml samples.
Durch fluoreszenz-spektrographische Intensitätsmessungen mit einem aus Laboratoriumsmitteln gebauten, einfachen Fluoreszenzspektrometer wurde die Löslichkeit des carcinogenen Kohlenwasserstoffs 3.4-Benzpyren in verdünnten, wäßrigen Lösungen von β-Lactoglobulin und Milchsäure-Dehydro-genase bestimmt. Die molare Lösungsvermittlung der Proteine für 3.4-Benzpyren ist erheblich größer als die des Koffeins. Die Fluoreszenz des 3.4-Benzpyrens wird in den Proteinlösungen nicht durch molekularen Sauerstoff gelöscht. Das beobachtete Spektrum gleicht demjenigen alkoholischer Lösungen von 3.4-Benzpyren ohne Konzentrationslöschung.
Mitochondrien aus Rattenleber (RL) und Rinderherzmuskel (BH) erzeugen bei Behandlung mit O2 eine schwache Chemilumineszenz in dem Spektralbereich zwischen 400 und 650 mµ, deren Intensität bei RL-Mitochondrien durch vorheriges Einfrieren und Auftauen wie durch Ultraschallbehandlung größer wird. Bei beiden Arten verursacht Zusatz von Acridinorange eine wesentliche Verstärkung der Lumineszenz, gleichzeitig wird die O2-Aufnahme gehemmt. RL-Mitochondrien erzeugen unter diesen Bedingungen eine kurzzeitige, BH-Mitochondrien eine langsam ansteigende langandauernde Strahlung; das gleiche Verhalten zeigen aus BH-Mitochondrien gewonnene „electrontransfer-particles“ (ETP). Der zeitliche Ablauf und die Beeinflußbarkeit durch Effektoren der Atmungskette ist andersartig als bei der von VLADIMIROV gefundenen Chemilumineszenz von RL-Mitochondrien. Als Träger der Lumineszenz wird angeregter O2 diskutiert.
Um den Mechanismus der Reaktion des Cysteins mit molekularem Sauerstoff in Gegenwart von Komplexen des zweiwertigen Kupfers als Katalysatoren zu ermitteln, wurden Messungen der Chemilumineszenz, der Sauerstoff- und der Cysteinkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit vorgenommen. Variation der Konzentration der Reaktionsteilnehmer führte zu Meßergebnissen, die die Aufstellung eines Reaktionsschemas gestattete. Das hieraus abzuleitende System nichtlinearer Differentialgleichungen für die Reaktionsgeschwindigkeiten wurde in einem Analogrechner gelöst, wobei Übereinstimmung zwischen Rechnung und Meßergebnissen sowohl für die Zeitabhängigkeit als auch für die Konzentrationsabhängigkeit gefunden wurde.
The autoxidation of NaSH and Cysteine in the presence of heavy metal ions is accompanied by chemiluminescence due to the formation of O2⊖ or adequate compounds as intermediates. The observation of the luminescence intensity and its time dependence has been used as analytical indication of the occurrence of electron transfer reactions from - SH to O2.
This enabled the study of the influence of different catalytic promoters. The efficiency of different metal ions could easily be demonstrated by their enhancement of light production during the reaction of NaSH with molecular oxygen. Cu (II) as one of the most efficient catalysts was also applied in the form of different complexes. Because it would catalyse the oxidation of cysteine, glutathione and other electron donors of biological interest, the influence of the nature of the ligands of the complexes was investigated. In the case of cysteine only complexes with stability constants of medium strength and planar configuration acted as effective catalysts. Therefore it has to be assumed that for an effective electron transport to the loosely bound oxygen the cysteine molecule has to enter the inner sphere of the complex. The much longer time of luminescence of this reaction (4 -10 min) compared to the short time luminescence caused by free O2H. OH and H2O2 indicates that these intermediates are stabilized by binding to the Cu (II) -complex as in compounds (I), (II) and (III) of oxidizing enzymes.