Biochemie und Chemie
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The reactions of diluted aqueous solutions of SO2 resp. HSO3-ions with MnO4-or Ce4+ ions in the pH range 1-4 produce chemiluminescence in the spectral region of 450-600 nm. Measurements of the time course of the light emission and their simulation on an analog computer led to a reaction scheme in which a recombination product of primarily formed HSO3 radicals -of a lifetime of about 1 second -appears as precursor of electronically excited SO2 molecules. The participation of singlet oxygen can be excluded because at least the reaction with Ce4+ ions proceeds also in the absence of oxygen.
In order to determine the influence of OH and O2H-radicals on proteins, bovine serum albumin (BSA) in aqueous solution was treated with Fenton’s reagent [Fe(II)SO4+EDTA+H2O2] and with ultraviolet light (λ > 2800 Å) in the presence of H2O2. The action of free radicals produced in this way did not change the properties of the native protein with respect to the sedimentation in the ultracentrifuge or optical rotatory dispersion and electrophoresis under normal conditions. Ampèrometric titration indicated partial oxidation of SH-groups and of 3—5 SS-groups which are not reducible by NaBH4.
Heat aggregation investigated by means of light-scattering was suppressed at pH 7.5 and strongly accelerated at pH 4.6 (range of coagulation), the latter being a result of increased entropy of activation of coagulation velocity.
The difference spectrum against native BSA had positive values of Δε and two maxima at 2480 and 2950 Å.
Ultracentrifugation at room temperature in phosphate buffer (pH 7.3, μ=0.18) furnishes a molecular weight of 63 300. In a solution of 8 M urea and borate buffer (pH 9, μ=0.05) fragments with molecular weights between 25 000 and 37 000 were observed while in phosphate buffer (pH 7.3, without urea) at temperatures higher than 46 °C an anomalous behaviour of the concentration gradient indicated an effect which possibly depends on a dissociation equilibrium.
As a consequence oxygen radicals seem to attack not only SH- and SS-groups but at least one covalent bond of the peptide chain. Some experiments of heat aggregation with BSA treated with γ-rays (60Co) gave the same results as BSA treated with Fenton’s reagent or UV-light+H2O2.
In systems containing singlet-oxygen and aromatic fluorescers energy transfer from singletoxygen dimers to the dye should be observable by emission of the fluorescer. In order to prove this hypothesis, externally generated singlet-oxygen (1Δg) was bubbled through the solutions of dyes (chlorophyll a, eosin y, rhodamine b, luminol, rubrene and acridine orange) in organic solvents.
Luminescence could be observed and its spectral distribution analyzed by sharp cut-off filters and interference filters (rubrene) . Spectra, rates of oxidation, addition of quenchers and the long lasting time dependence of the reported reactions lead to the conclusion that the observed afterglow is due to chemical oxidation mechanisms producing a chemiluminescence. Therefore an excitation of the substances investigated in these experiments by simple physical energy transfer seems not to be predominant.
Dodecins, a group of flavin-binding proteins with a dodecameric quaternary structure, are able to incorporate two flavins within each of their six identical binding pockets building an aromatic tetrade with two tryptophan residues. Dodecin from the archaeal Halobacterium salinarum is a riboflavin storage device. We demonstrate that unwanted side reactions induced by reactive riboflavin species and degradation of riboflavin are avoided by ultrafast depopulation of the reactive excited state of riboflavin. Intriguingly, in this process, the staggered riboflavin dimers do not interact in ground and photoexcited states. Rather, within the tetrade assembly, each riboflavin is kept under the control of the respective adjacent tryptophan, which suggests that the stacked arrangement is a matter of optimizing the flavin load. We further identify an electron transfer in combination with a proton transfer as a central element of the effective excited state depopulation mechanism. Structural and functional comparisons of the archaeal dodecin with bacterial homologs reveal diverging evolution. Bacterial dodecins bind the flavin FMN instead of riboflavin and exhibit a clearly different binding pocket design with inverse incorporations of flavin dimers. The different adoption of flavin changes photochemical properties, making bacterial dodecin a comparably less efficient quencher of flavins. This supports a functional role different for bacterial and archaeal dodecins.
Ziel dieser Arbeit war es zum einen Informationen über den Mechanismus in Dodecinproteinen zu gewinnen, der zu der effizienten Fluoreszenzlöschung von gebundenem Riboflavin und einer deutlichen Verlängerung der Lebendsdauer des Chromophors unter Lichteinwirkung führt. Zum anderen sollte mit Hilfe eines kurzen Modellpeptids, das eine Azobenzoleinheit als Photoschalter in seinem Peptidrückgrat enthielt, erste Schritte der Peptidfaltung untersucht werden.
Die Untersuchungen an Dodecinproteinen konzentrierten sich hauptsächlich auf archaeales Dodecin aus Halobacterium salinarum (HsDod). Eine Besonderheit der Dodecinproteine ist, dass sie im Gegensatz zu anderen Flavinbindeproteinen zwei Flavinmoleküle in jeder ihrer sechs identischen Bindetaschen einbauen können. Kurzzeitspektroskopische Untersuchungen im UV/vis-Spektralbereich zeigen, dass nach Photoanregung eines gebundenen Riboflavinmoleküls nach etwa 10 ps der Ausgangszustand wieder erreicht wird. Weiterhin zeigt das Fehlen der stimulierten Emission in den transienten Daten, dass bereits innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, in weniger als 150 fs, der erste angeregte Zustand des Riboflavins entvölkert wird. Dies verhindert unerwünschte Reaktionen des Riboflavins und stellt eine Versorgung der Zelle mit diesem wichtigen Baustein für die Biosynthese von FMN und FAD sicher. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass zwei Spezies mit unterschiedlichen spektralen Signaturen und Lebensdauern an dem Löschungsmechanismus und der Wiedererlangung des Ausgangszustands beteiligt sind. Der Vergleich von HsDod-Proteinen in nicht-deuteriertem und deuteriertem Lösungsmittel sowie die spektrale Signatur der Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 800 fs zerfällt deuten an, dass ein Elektronen- sowie ein Protonentransfer Teil des Mechanismus sind. Mit Hilfe von HsDod-Proteinen, bei denen der Asparaginsäurerest unterhalb der Bindetasche, der für das Binden eines wasserkoordinierten Magnesiumions verantwortlich ist, gegen Serin (D41S) oder Glutaminsäure (D41E) ausgetauscht war, konnte gezeigt werden, dass das wasserkoordinierte Magnesiumion nicht relevant für den Löschungsmechanismus ist. Dennoch konnte eine Beteiligung von Wassermolekülen nicht ausgeschlossen werden. Die Beteiligung eines Elektronentransfers von einem Tryptophanrest in der Bindetasche auf das photoangeregte Flavin konnte durch Messungen an Dodecinproteinen mit Tryptophan-Derivaten mit unterschiedlichen Ionisationsenergien bestätigt werden.
Die Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 5 ps zerfällt, die ebenfalls zu einer Wiederbesetzung des Ausgangszustands führt, konnte nicht eindeutig identifiziert werden. Die spektrale Signatur des zerfallassoziierten Spektrums könnte neben einer neutralen Tryptophanspezies und einem kationischen Riboflavinradikal auch durch schwingungsangeregte Riboflavinmoleküle verursacht werden.
Eine Beteiligung der Ribitylkette am Mechanismus kann aufgrund der Ergebnisse von HsDod-gebundenem Lumiflavin ausgeschlossen werden. Weiterhin konnte anhand der Ergebnisse für HsDod-gebundenes FAD, das in seiner geschlossenen Konformation gebunden wird, wobei der Adeninrest die zweite Position in der Bindetasche besetzt, eine Beteiligung des zweiten Flavins in der Bindetasche am Löschungsmechanismus sowie ein Beitrag zu den Differenzspektren ausgeschlossen werden. Somit dient die Besetzung einer Bindetasche mit zwei Flavinmolekülen vermutlich lediglich der Maximierung der Flavinbeladung. Nicht eindeutig geklärt werden konnte die Frage, ob es sich um einen sequentiellen oder parallelen Mechanismus handelt.
Neben archaealem wurde auch bakterielles Dodecin mittels transienter UV/vis-Spektroskopie untersucht. Für Dodecin aus Halorhodospira halophila (HhDod) konnte ebenfalls eine sehr schnelle Wiedererlangung des Ausgangszustands nach Photoanregung des gebundenen Riboflavins beobachtet werden. Allerdings spiegeln einige Unterschiede in den transienten Daten die Unterschiede in den Bindetaschen von archaealem und bakteriellem Dodecin wider und geben Hinweise darauf, dass die Funktionen in der Zelle für die Dodecine unterschiedlich sind. Diese Hypothese wird durch verschiedene Cofaktoren, Riboflavin und Lumichrom für HsDod und FMN für HhDod, in vivo unterstützt. Die ermittelten Zeitkonstanten sind für das bakterielle Dodecin etwas länger als für das archaeale und die transienten Daten weisen in den spektralen Signaturen der Differenzsignale sowohl Unterschiede als auch Gemeinsamkeiten auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden erste Schritte der Peptidfaltung mit Hilfe eines wasserlöslichen bizyklischen Modellpeptids, das den Photoschalter 4(4’-Aminomethylphenylazo)benzoesäure (AMPB) enthält, untersucht. Hierfür wurden Kurzzeitspektroskopische Messungen im mittleren infraroten Spektralbereich für den Schaltvorgang von der cis-Form des Azopeptids in die trans-Form durchgeführt. Diese Methode erlaubt es, transiente Konformationsänderungen des Peptidrückgrats zu verfolgen. In der cis-Form kann das Peptid mehrere unterschiedliche Konformationen einnehmen, während der Konformationsraum für die trans-Form deutlich eingeschränkt ist. Nach der Photoanregung im Bereich der n-pi*-Bande der Azobenzoleinheit finden die grundlegenden konformationellen Änderungen innerhalb der ersten 10-20 ps statt. Dies wurde durch polarisationsabhängige Messungen bestätigt.
Auf dieser Zeitskala finden die größten Änderungen in den transienten Differenzspektren statt, die auf Konformationsänderungen sowie Kühlprozesse zurückzuführen sind. Diese Prozesse konnten mit einer Zeitkonstanten von 5 ps zusammengefasst werden. Auf längeren Zeitskalen finden weitere Reorganisationsprozesse statt, die mit einer Zeitkonstante von 300 ps zusammengefasst werden können. Bei maximaler Verzögerungszeit des Experiments (1,8 ns) ist der Gleichgewichtszustand noch nicht erreicht und es finden weitere Prozesse auf längeren Zeitskalen statt. Im Vergleich zu einem ähnlichen bereits untersuchten DMSOlöslichen bizyklischen AMPB-Peptid konnte keine schnellere Dynamik durch den Einsatz von Wasser als Lösemittel festgestellt werden, wie es vorangegangene transiente Experimente im UV/vis-Spektralbereich an wasser- und DMSO-löslichen bizyklischen Azopeptiden angedeutet hatten. Die Ergebnisse der transienten Messungen zeigen gute Übereinstimmungen mit molekulardynamischen Rechnungen. Das so gewonnene Modell von den Prozessen nach der Isomerisierung des Photoschalters erlaubt Einblicke in erste Schritte bei der Faltung von Peptiden in ihrem natürlichen Lösungsmittel Wasser und die Zeitskalen der entsprechenden Prozesse.
Die Entwicklung neuer und Verbesserung bestehender Methoden zur theoretischen Beschreibung molekularer Systeme ist eine der wichtigsten Aufgaben der theoretischen Chemie, vor allem zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände zur Simulation von Spektren. Das Ziel dieser Arbeit ist in diesem Zusammenhang die Weiterentwicklung des algebraisch-diagrammatischen Konstuktionsverfahrens (ADC), einer Methode zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände, und die Bereitstellung effizienter Computerprogramme zum theoretischen Studium optischer Eigenschaften von "open-shell" Molekülen. Im Vordergrund stehen hierbei die physikalisch richtige Beschreibung von ladungsgetrennten Zuständen und solchen mit hohem Doppeltanregungscharakter. Verbesserte theoretische Methoden sind notwendig, da die zu berechnenden Systeme häufig für eine Beschreibung mit vorhandenen hochgenauen ab initio Methoden zu groß sind. Einfachere, durchführbare Methoden wie z.B. semi-empirische oder DFT-basierte Methoden, die es erlauben, sehr große Molekülsysteme mit mehr als 100 Atomen zu beschreiben, weisen häufig große, nicht vorhersagbare Fehler auf. Experimente im Forschungsgebiet angeregter Zustände von Molekülen finden spektroskopisch statt und erfordern auf der anderen Seite eine Unterstützung durch zuverlässige theoretische Voraussagen. Die Weiterentwicklung der Theorie ist also auch im allgemeinen Interesse der Chemie, Biologie und der anderen Naturwissenschaften. Teil 1 dieser Arbeit umfasst die Theorie, während in Teil 2 deren Anwendung auf ausgewählte Systeme zu finden ist. Nach einer allgemeinen Einführung in die Problematik und grundlegenden Methoden der Quantenchemie in Kapitel 1, wurde im ersten Teil von Kapitel 2 die Methode zur Berechnung angeregter Zustände und ihrer Eigenschaften vorgestellt, auf der diese Arbeit basiert, nämlich das algebraisch-diagrammatische Konstruktionsverfahren (ADC). Dabei sind Eigenschaften von ADC zu betonen, die es von den anderen Methoden unterscheidet. Zum einen werden in ADC alle angeregten Zustände energetisch zuverlässig beschrieben, das heißt Rydberg-, Ladungstransfer- und doppelt angeregte Zustände findet man im Anregungsspektrum an der richtigen Position. Andererseits ist die Methode eine der schnellsten zur Beschreibung doppelt angeregter Zustände (z.B. bei Polyenen) und eignet sich, deren Relevanz im Spektrum zu ermitteln. Denn die beiden Schemata ADC(2)-s und ADC(2)-x unterscheiden sich in der störungstheoretischen Behandlung doppelt angeregter Zustände um eine Ordnung, ADC(2)-s beschreibt sie in nullter Ordnung, ADC(2)-x in erster. Im folgenden Abschnitt stehen die ausführlichen Gleichungen des ADC-Verfahrens für unseren Computercode. Kapitel 2 wurde abgeschlossen durch die Gleichungen der Erweiterung von ADC zur Behandlung von "open-shell" Molekülen auf UADC. Kapitel 3 umfasst die Beschreibung der "intermediate state representation" (ISR), die zur Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände dient und die theoretische Herleitung des UADC-Verfahrens erlaubt. Am Anfang von Teil 2 in Kapitel 4 steht die Untersuchung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit des neu entwickelten UADC-Verfahrens. Dabei wurden elf verschiedene, mittelgroße, aromatische Moleküle ausgewählt, zu denen in der Literatur auch experimentelle Daten zu Vergleichszwecken zu finden waren. Das Ergebnis ist sehr überzeugend und nur minimal aufwändiger als ADC. Kapitel 5 zeigt eine erste Anwendung von UADC auf größere Moleküle und stellt die Eigenschaft der Bestimmung von doppelt angeregten Zuständen von ADC und UADC noch einmal heraus. Der Vergleich der Polyene mit ihren "open-shell" Partnern, den Polyen-Radikalkationen und den neutralen Polyenylradikalen, zeigte, dass der Einfluss der Doppeltanregungen in den Radikalen kleiner ist, für eine exakte Beschreibung der angeregten Zustände ist er jedoch nicht zu vernachlässigen. Danach wurde eine Extraplation der angeregten Zustände von langkettigen Polyenen, Polyenradikalkationen und Polyenylradikalen vorgenommen, die den konjugierten pi-Systemen von Karotinoiden als Modellsysteme dienen. Die Beschreibung der Polyene bestätigte die experimentellen Vorhersagen zu Karotinoiden. Eine erste Anwendung der ISR bezüglich der Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände ist mit der Berechnung von Dipolmomenten angeregter Zustände in Kapitel 6 durchgeführt worden. Die Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung mit anderen Methoden und Messergebnissen. Eine weitere Anwendung der ISR ist die Berechnung von resonanten Zwei-Photonen-Absorptionsspektren, mit deren Hilfe spektroskopisch "dunkle" Zustände detektiert werden können. Die zur Berechnung notwendigen Übergangsdipolmomente zwischen angeregten Zuständen aus der ISR wurden dazu in einer sogenannten "sum-over-states" Näherung verwendet. Eine mögliche andere Berechnung über einen geschlossenen Ausdruck mit Hilfe der ADC-Näherung ist noch nicht implementiert.
The major light-harvesting complex (LHC-II) of higher plants plays a crucial role in capturing light energy for photosynthesis and in regulating the flow of energy within the photosynthetic apparatus. Native LHC-II isolated from plant tissue consists of three isoforms, Lhcb1, Lhcb2, and Lhcb3, which form homo- and heterotrimers. All three isoforms are highly conserved among different species, suggesting distinct functional roles. We produced the three LHC-II isoforms by heterologous expression of the polypeptide in Escherichia coli and in vitro refolding with purified pigments. Although Lhcb1 and Lhcb2 are very similar in polypeptide sequence and pigment content, Lhcb3 is clearly different because it lacks an N-terminal phosphorylation site and has a higher chlorophyll a/b ratio, suggesting the absence of one chlorophyll b. Low temperature absorption and fluorescence emission spectra of the pure isoforms revealed small but significant differences in pigment organization. The oligomeric state of the pure isoforms and of their permutations was investigated by native gel electrophoresis, sucrose density gradient centrifugation, and SDS-PAGE. Lhcb1 and Lhcb2 formed trimeric complexes by themselves and with one another, but Lhcb3 was able to do so only in combination with one or both of the other isoforms. We conclude that the main role of Lhcb1 and Lhcb2 is in the adaptation of photosynthesis to different light regimes. The most likely role of Lhcb3 is as an intermediary in light energy transfer from the main Lhcb1/Lhcb2 antenna to the photosystem II core.
Die bei der Photosynthese verwendete Lichtenergie wird zu einem großen Anteil von Lichtsammlersystemen bereitgestellt. In der pflanzlichen Photosynthese wird unterschieden zwischen Lichtsammlersytem I (light harvesting complex I, LHC-I), assoziiert mit Photosystem I (PS-I) und Lichtsammlersystem II (light harvesting complex II, LHC-II), assoziiert mit Photosystem II (PS-II). LHC-II ist der häufigste Protein-Pigment Komplex der Chloroplasten und bindet bis zu 50% aller Chlorophylle in der Thylakoidmembran. Der Protein-Pigment Komplex LHC-II hat vier, teils miteinander verwandte Funktionen in der Photosynthese. I) Die Sammlung und Weiterleitung von Lichtenergie, II) Stabilisierung der Granastapel, III) Ausgleich der Anregungsenergie von PS-I und PS-II, IV) Schutz der Photosynthese vor Überanregung mittels nichtphotochemischer Eliminierung von Anregungsenergie (NPQ). In der Pflanze bildet LHC-II Trimere in verschiedenen Kombinationen dreier Isoformen (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3), wobei Lhcb1 mit 70-90% den Hauptteil des LHC-II stellt. Jedes Monomer bindet 8 verschiedene Co-Faktoren in unterschiedlichen Mengen, die ca. 30% seiner Masse ausmachen. Die drei Isoformen des LHC-II sind in allen Pflanzen stark konserviert. Die funktionelle Bedeutung der Isoformen ist jedoch weitestgehend unklar. Dies liegt vor allem an der schwierigen Isolierung reiner Isoformen aus Pflanzenmaterial. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden deshalb alle drei Isoformen rekombinant hergestellt und mit getrennt isolierten Lipiden und photosynthetischen Pigmenten in ihre native Form gefaltet. Die anschließende biochemische und spektroskopische Charakterisierung zeigte einen hohen Grad an Homologie zwischen den drei Isoformen, wobei Lhcb3 die größten Unterschiede aufwies (Standfuss und Kühlbrandt 2004). Die wahrscheinlichsten Funktionen für Lhcb1 und Lhcb2 ist die Anpassung der Photosynthese an variierende Lichtbedingungen. LHC-II Heterotrimere mit Lhcb3 Anteil könnten an der Weiterleitung von Lichtenergie von der Haupt Lhcb1/Lhcb2 Antenne zum PS-II Reaktionszentrum beteiligt sein. Für die Erforschung des LHC-II war das mittels Cryo-Elektronenmikroskopie an 2D Kristallen erstellte atomare Modell des Komplexes von enormer Bedeutung. Ein tiefes Verständnis der Funktionen des LHC-II benötigt jedoch eine Struktur von höherer Auflösung, welche mit 2D Kristallen nur schwer zu erreichen ist. Im Verlauf der Arbeit wurden deshalb mehr als 100000 3D Kristallisationsexperimente durchgeführt, wodurch die Kristallisation von aus Erbsenblättern isoliertem und in vitro gefaltetem LHC-II gelang. Die 3D Kristalle aus nativem Material zeigten einen für die röntgenkristallographische Strukturaufklärung ausreichenden Ordnungsgrad und führten zu einer Struktur des LHC-II bei 2.5 Å Auflösung (Standfuss et al., eingereicht). Die Struktur zeigt 223 der 232 Aminosäuren und die Position und Orientierung von 4 Carotinoiden (2 Luteine, 1 Neoxanthin und 1 Violaxanthin), 14 Chlorophyllen (8 Chl a und 6 Chl b) und zwei Lipiden (PG und DGDG) pro Monomer. Diese Informationen sind essentiell für das Verständnis des Energietransfers innerhalb des LHC-II und zu den Photoreaktionszentren und sollten zusammen mit der großen Anzahl von spektroskopischen Untersuchungen eine zukünftige detaillierte Modellierung dieser ultraschnellen und extrem effizienten Energietransfer Prozesse ermöglichen. Auf Basis der Ladungsverteilung der stromalen Seite des Komplexes konnte ein Modell für die Beteiligung des LHC-II an der Stapelung von Grana in Chloroplasten erstellt werden. Dieses liefert außerdem eine plausible Erklärung für den mittels Phosphorylierung des N-Terminus gesteuerten Ausgleich von Anregungsenergie zwischen PS-I und PS-II. Die 2.5 Å Struktur des LHC-II zeigt schließlich einen einfachen aber effektiven Mechanismus zur Optimierung und Schutz des Photosyntheseapparates mittels NPQ. Dieser benötigt keine Strukturänderungen des LHC-II oder der restlichen Lichtsammelantenne und beruht auf der reversiblen Bindung der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin an LHC-II. Diese Arbeit liefert damit Beiträge zu allen Funktionen des LHC-II Komplexes und hilft damit grundlegende Regulationsmechanismen und die Bereitstellung von solarer Energie für die pflanzliche Photosynthese zu verstehen.
Membrane proteins are biological macromolecules that are located in a cell’s membrane and are responsible for essential functions within an organism, which makes them to prominent drug targets. The extraction of membrane proteins from the hydrophobic membrane bilayer to determine high-resolution crystal structures is a difficult task and only 2% of all solved proteins structures are membrane proteins. Computational methods may help to gain deeper insights into membrane protein structures and their functions. This study will give an overview of such computational methods on a representative set of membrane proteins and will provide ideas for future computational and experimental research on membrane proteins.
In a first step (chapter 2), I updated an earlier, manually-curated data set of homologous membrane proteins (HOMEP) to more recent versions in 2010 (HOMEP2) and 2013 (HOMEP3) using an automated clustering approach. High-resolution structures of membrane proteins listed in the PDB_TM database were structurally aligned and subsequently clustered using structural similarity scores. Both data sets were used as a standard gold reference set for subsequent work.
Subsequently, I have updated and applied the sequence alignment program AlignMe to determine protein descriptors that are suitable for detecting evolutionary relationship between homologous a-helical membrane proteins. Single input descriptors were tested alone and in combination with each other in different modes of AlignMe by optimizing gap penalties on the HOMEP2 data set. Most accurate alignments and homology models on the HOMEP2 data set were observed when using position-specific substitution information (P), secondary structure propensities (S) and transmembrane propensities (T) in the AlignMe PST mode. An evaluation on an independent reference set of membrane protein sequence alignments from the BAliBASE collection showed that different modes of AlignMe are suitable for different sequence similarity levels. The AlignMe PST mode improved the alignment accuracy significantly for distantly related proteins, whereas for closely-related proteins from the BAliBASE set the AlignMe PS mode was more suitable. This work was published in March 2013 in PLOS ONE. In order to allow also an easier usage of the AlignMe program, I have implemented a web server of AlignMe (chapter 4) that provides the optimized settings and gap penalties for the AlignMe P, PS and PST modes. A comparison to other recent alignment web server shows that the alignments of AlignMe are similar or even more accurate than those of other methods, especially for very distantly related proteins for which the inclusion of membrane protein information has been shown to be suitable. This work was published in the NAR web server issue in July 2014.
Although membrane-specific information has been shown to be suitable for aligning distantly related membrane proteins on a sequence level, such information was not incorporated into structural alignment programs making it unclear which method is the most suitable for aligning membrane proteins. Thus, I compared 13 widely-used pairwise structural alignment methods on an updated reference set of homologous membrane protein structures (HOMEP3) and evaluated their accuracy by building models based on the underlying sequence alignments and used scoring functions (e.g., AL4 or CAD-score) to rate the model accuracy (chapter 5). The analysis showed that fragment-based approaches such as FR-TM-align are the most useful for aligning structures of membrane proteins that have undergone large conformational changes whereas rigid approaches were more suitable for proteins that were solved in the same or a similar state. However, no method showed a significant higher accuracy than any other. Additionally, all methods lack a measure to rate the reliability of the accuracy for a specific position within a structure alignment. In order to solve these problems, I propose a consensus-type approach that combines alignments from four different methods, namely FR-TM-align, DaliLite, MATT and FATCAT and assigns a confidence value to each position of the alignment that describes the agreement between the methods. This work has been published 2015 in the journal “PROTEINS: structure, function and bioinformatics”.
Consensus alignments were then generated for each pair of proteins of the HOMEP3 data set and subsequently analyzed for single evolutionary events within membrane spanning segments and for irregular structures (e.g., 310- and p-helices) (chapter 6). Interestingly, single insertions and deletions could be observed with the help of consensus alignments in the conserved membrane-spanning segments of membrane proteins in four protein families. The detection of such single InDels might help to identify crucial residues for a proteins function.
The photoelectron (PE) spectra of dicyano methane and of its dimethyl derivative are tentatively assigned on the basis of a simple MO model. The interactions defined therein between the two cyano groups as well as with the R2C-framework can be parametrized using the PE data. Thus the hyperconjugation πCN/πCR₂ is estimated to amount to 1.7 eV in both compounds. Hyperconjugative effects in methane derivatives H3CX and H2CX2 with X = Br, Cl and CN are compared.
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
Tectonin β-propeller containing protein 2 (TECPR2) was first identified in a mass- spectrometric approach as an interactor of GABARAP, an ATG8-family protein playing a role in autophagy. The mammalian ATG8 protein family consists of seven members, namely MAP1LC3A (LC3A), MAP1LC3B (LC3B), MAP1LC3C (LC3C), GABARAP, GABARAPL1 and GABARAPL2. All share an ubiquitin-like core and possess two additional N-terminal α-helices, which are important for the distinct functions of the proteins. First determined in various organelles the ATG8 proteins are shown to be involved in autophagy, supporting the formation and cargo recruitment of autophagosomes, the vesicles transporting cargo for autophagic degradation.
Autophagy is the process of recycling cytoplasmic contents by degradation of misfolded proteins or damaged organelles in order to supply nutrients. Also clearance of pathogens can be achieved via autophagy. Importantly, LC3B is incorporated into the autophagosomal membrane and is therefore used as the main marker for autophagosomes. Previous studies exhibited that depletion of TECPR2 leads to a loss of LC3B-positive structures in cells, which suggests TECPR2 to positively regulate autophagic processes.
A frame shift deletion in the gene encoding for TECPR2 causes the generation of a premature stop codon and subsequent an unstable version of the protein, which is then degraded. Mutation in the TECPR2 gene triggers a neurodegenerative disorder termed hereditary spastic paraparesis (HSP). HSPs are a diverse group of neurodegenerative diseases that are characterized by spasticity in prevalent lower extremities and were mediated by a loss of axonal integrity of the corticospinal motor neurons. In the context of HSP more than 50 gene loci were identified by now. While TECPR2 is a human ATG8 binding protein and positive regulator of autophagy causing a form of HSP, the exact function of TECPR2 is unknown.
This study primarily focused on the determination of TECPR2’s binding mode to ATG8 proteins in vitro and in cells. The association of TECPR2 to all ATG8-family proteins was confirmed in in vitro pulldown experiments. Following fragment-based binding and peptide array experiments, the LC3-interacting region (LIR) of TECPR2 could be verified with mutants of TECPR2 lacking the LIR motif. Nuclear magnetic resonance (NMR) and isothermal titration calorimetry (ITC) were conducted to gain deeper insights into the binding preference to the different ATG8-family members. Moreover, the crystal structure of TECPR2-LIR was solved. In cells colocalization studies with overexpressed ATG8 proteins unraveled a preferential binding to the LC3-subfamily.
Further, mass spectrometric analysis revealed novel association partners of TECPR2: SEC24D, HOPS and BLOC-1, all of those participating in different endomembrane trafficking pathways. Interaction and colocalization of TECPR2 with these components was validated with several immunoprecipitation experiments and the N-terminal part of the protein comprising the WD40-domain could be defined as the binding site for all three of the association partners. In further approaches, the requirement of the LIR-motif and the necessity of the availability of LC3 protein for the particular interactions were determined. Interestingly, in the absence of LC3C the binding of TECPR2 to SEC24D was completely disrupted whereas a loss of LC3B only resulted in a decreased association. Notably, the binding proteins were not subjected to autophagosomal degradation, indicating that TECPR2 may operate as a multifunctional scaffold protein. While depletion of TECPR2 destabilized HOPS and BLOC-1, the autophagy defect observed in TECRP2-deficient cells could not be attributed to functional impairment of these two complexes.
Moreover, loss of TECPR2 led to a decline in protein levels of SEC24D and of its heterodimer partner SEC23A. Thus, TECPR2 is required to regulate the protein levels of SEC23A and SEC24D and subsequently the formation of the heterodimers. Together, SEC24D and SEC23A form the inner coat of COPII vesicles. These vesicles are responsible for the anterograde transport of cargo from the ER toward the Golgi compartment. COPII-coated vesicles are secreted form ER at distinct sites, termed ER exit sites (ERES). The small GTPase SAR1A maintains the vesicle budding, coating and secretion at the ERES. Together with SEC13, SEC31 forms the outer coat of the COPII vesicles and therefore serves as a general ERES marker.
Consistent with a defect in COPII coat assembly, the number of ERES diminished in the absence of TECPR2. These phenotypes could be rescued by the wildtype TECPR2 protein but not by the LIR-mutant. Intriguingly, these results were mimicked by depletion of LC3C, which localized to ERES. By monitoring the release of various cargos from ER in dependency of TECPR2 or LC3C, a role of both proteins in ER export was determined. These facts indicated that TECPR2 cooperates with LC3C to facilitate COPII assembly, ERES maintenance and ER export. Notably, fibroblast derived from a HSP patient carrying mutated TECPR2 showed diminished SEC24D protein levels and delayed ER export.
Concurrent with emerging evidence for a role of ERES in autophagosome formation, depletion of TECPR2 or LC3C or overexpression of a constitutive inactive SAR1 mutant reduced puncta formation of the early autophagosomal protein WIPI2.
In summary, this study uncovered a role for TECPR2 in ER export at ERES through interaction and stabilization of SEC24D, a COPII coat protein. This process also depended on ATG8-family protein LC3C, which is localized at ERES. Both proteins are required for correct COPII-mediated secretion. Moreover, the presence of TECPR2 and LC3C on ER allows development of omegasomes, membranous structures budding ER to form autophagosomes, by stabilization of WIPI2 and therefore contribute to autophagosome formation.
G-protein coupled receptors (GPCRs) comprise the largest superfamily of cell surface receptors and possess a signature motif of seven transmembrane helices. The endothelin B (ETB) receptor is a member of rhodopsin like GPCR family. It plays an important role in vasodilation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. Knowledge of the three-dimensional structure of G-protein coupled receptors in general would significantly add to our understanding of their molecular mechanisms and would be useful in the search for new specific drugs. However, three-dimensional structural analysis will require milligram quantities of pure and homogeneous protein. This dissertation is a study of the production, biochemical characterization and preliminary structural studies of the human ETB G-protein coupled receptor. The present work aimed at elucidating the structure and mechanistic details of function of the receptor by using a combination of X-ray crystallographic and NMR methods for collecting structural data. To obtain homogenous and monodisperse receptor protein preparation for structural and functional studies, we implemented the baculovirus expression system for the production of ETB receptor for the present work. The two step affinity purification ensured capture of full-length receptor. Silver stained SDS-PAGE of the purified receptor-ligand complex indicated greater than 90% protein purity. Based on previous reports, we used the high affinity ligand (endothelin -1) binding to the receptor for co-crystallization of receptor-ligand complex by locking the receptor in the activated conformation. As a prerequisite for 3D crystallization trials, the stability of the detergent solubilized receptor-ligand complex was assessed with respect to pH, temperature and time. Receptor-ligand complex did not show any degradation and aggregation over 6 days at 4°C and 18°C. Interestingly, change of pH suggested that receptor-ligand complex is unstable at lower pH due to possible charge induced conformational changes. In our work, we introduced the idea of using fluorophore labeled ligand for simple visual recognition of the receptor-ligand complex during purification and crystallization. On the other hand, we alternatively used biotinylated endothelin-1 to produce an adequate amount of ligand bound receptor complex, thus ensuring homogeneity of the purified complex for use in structural studies. Thus far, preliminary crystals have been obtained for both the unlabelled ET-1 and fluorophore labeled ET-1 complexed with ETB receptor. Moreover, we performed the systematic investigation of the protein/peptide binding partner for the receptor-ligand complex with the chief aims of stabilizing structure and increasing the possibilities of 3D-crystal contacts. Thus subsequent to formation of receptor-ligand complex, the additional in vitro formation of a ternary arrestin-receptor-ligand complex was also attempted for use in structural studies. We successfully demonstrated that arrestin mutant (R169E) forms a tight complex with ETB receptor regardless of its phosphorylation state. A second approach to get insight into the ETB receptor ligand binding site relied on the use of spin isotope labeled ET-1 ligand peptide by employing solid state MAS NMR method. Preliminary data provided compelling evidence that the C-terminal region of the peptide is immobilized in an ordered environment and presumably bound to the receptor. This indicates that the approach is feasible, although there are difficulties in sample preparation for further spectral measurements and data collection which are currently being discussed in ongoing investigations. At this point of our research work, we initiated a collaborative effort to obtain high yields of pure, active receptor without post translational modifications, from an E. coli cell lysate based in vitro expression system. We successfully optimized the production of homogenous and monodisperse endothelin B receptor in mg amounts. Thus this could potentially provide an alternative source of high quality receptor production in large quantities for immediate crystallization trials. Thus we hope that the results from these investigations can be applied in a more general sense to the production and crystallization of other G protein-coupled receptors.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Polo-Like Kinase 1 (PLK 1), eine Kinase aus der Familie der hochkonservierten Serin/Threonin-Kinasen in ihrer Funktion zu hemmen. Alle Zellen des Säugetier-Organismus benötigen für ihre Zellteilung PLK1. PLK1 wird vor allem in der G2/M-Phase des Zellzyklus exprimiert und wird in malignen Geweben, verglichen mit normalem, primärem Gewebe überexprimiert. Hier liegt ein differentieller Unterschied zwischen normalem, primärem Gewebe und malignem Tumorgewebe vor, denn in normalem Gewebe sind nur sehr niedrige PLKI -Spiegel vorhanden, so dass eine Krebstherapie, die über die Hemmung von PLKI wirkt, keine bzw. geringe Auswirkungen auf das normale gesunde Gewebe haben sollte. Insgesamt bietet sich PLKI daher als interessantes Ziel für eine molekularbiologisch basierte Krebstherapie an. Die im Rahmen dieser Arbeit angewandten Techniken waren die Antisense-Technologie und die RNA-Interferenz (mittels synthetischer small interfering RNAs [siRNAs]) und rekombinanter Plasmide zur Expression von hairpin-RNAs [shRNAs]). Antisense-Oligonukleotide (ASOs) sind schon seit ca. einem Jahrzehnt im Einsatz, um verschiedene Zellzykluselemente zu hemmen, auch bereits in verschiedenen Phasen der klinischen Prüfung, doch mit PLKI ist erstmals die Hemmung eines späten Elements der Signaltransduktionskaskade, das essentiell für die Mitose ist, gelungen. Hierbei sind die Auswirkungen auf die Zellen wesentlich stärker als bei weiter am Anfang der Signaltransduktionskaskade gelegenen Elementen, bei denen die Zelle noch die Möglichkeit hat, die Hemmung durch alternative parallele Signalwege zu umgehen. siRNAs bzw. shRNA-exprimierende Plasmide sind erstmals zum Einsatz gekommen, um in Mammalia-Zellen die Krebszellproliferation bzw. das Tumorwachstum im humanen Krebs-Xenograft-Modell durch Hemmung eines endogenen Gens zu hemmen. Bei Anwendung der RNA-lnterferenz konnte darüber hinaus ein für die Anwendung am Menschen wichtiger differentieller Unterschied zwischen primären Zellen und Krebszelllinien in vitro beobachtet werden, denn für die Hemmung der Proliferation und für die Reduktion der PLK1-mRNA und des PLK1-Proteins in primären humanen Mammaepithelzellen war eine 350-fach höhere siRNA-Konzentration nötig als in den Krebszelllinien. Die Konzentrationen, mit denen die Krebszellproliferation signifikant gehemmt werden konnte, hatten auf die primären Zellen überhaupt keine Auswirkungen, womit ein Meilenstein auf dem Weg zu einer spezifischen Krebstherapie erreicht werden konnte. Dabei konnten mit allen drei eingesetzten Techniken die PLK1-mRNA- und -Protein-Expression in vitro und die Zellproliferation in vitro gehemmt werden. Das Tumorwachstum konnte mit ASOs und mit den rekombinanten Plasmiden in vivo in Krebs-Xenograft-Modellen an Nacktmäusen erfolgreich gehemmt werden. Mit U6-Promoter-basiert exprimierten shRNAs konnten im humanen Xenograft-Modell auch die Expression der PLK1-mRNA und das PLK 1-Protein reduziert werden. Auf diese Weise kam es zu einem starken Antitumor-Effekt in vivo, der nach Behandlung mit den Expressionsplasmiden vier Wochen über das Ende der Therapie hinaus anhielt. Ausgehend von diesen Daten sollte für beide Techniken - sowohl für die Antisense-Strategie als auch für die RNA-Interferenz mit dem Target PLK1 - über Toxizitätsuntersuchungen und Ausweitung auf weitere Tumormodelle der Weg in die präklinische Phase eingeschlagen werden, um möglichst schnell die Grundlagen für einen Heilversuch oder eine klinische Studie zu schaffen.
This study describes a simple technique that improves a recently developed 3D sub-diffraction imaging method based on three-photon absorption of commercially available quantum dots. The method combines imaging of biological samples via tri-exciton generation in quantum dots with deconvolution and spectral multiplexing, resulting in a novel approach for multi-color imaging of even thick biological samples at a 1.4 to 1.9-fold better spatial resolution. This approach is realized on a conventional confocal microscope equipped with standard continuous-wave lasers. We demonstrate the potential of multi-color tri-exciton imaging of quantum dots combined with deconvolution on viral vesicles in lentivirally transduced cells as well as intermediate filaments in three-dimensional clusters of mouse-derived neural stem cells (neurospheres) and dense microtubuli arrays in myotubes formed by stacks of differentiated C2C12 myoblasts.
Die vorliegende Arbeit fasst folgende experimentellen Arbeiten zusammen: • Synthese von amorphem, schwarzem, basischem Silicium Si am,schw,ox und amorphem, schwarzem, nicht basischem Silicium Siam,schw durch Reduktionsreaktion von Siliciumtetrachlorid mit Natrium. • Reaktivität des amorphen Siliciums Si am gegenüber verschiedenen Gasen: Cl2, HCl, CH3Cl • Reaktivität von Si am gegenüber Alkoholen bei Raumtemperatur. • Reaktivität von Si am gegenüber Alkoholen und Essigsäure in einem geschlossenen System, nicht katalysiert/katalysiert durch Cu(I)Cl und Cu(I)O. • Reaktivität von Si am,schw,ox und Si am,schw gegenüber Alkoholen und Essigsäure in einem offenen System (Ofen, „slurry phase“-Reaktor), nicht katalysiert/katalysiert durch Cu(I)Cl und Cu(I)O. • Thermische und katalytische Disproportionierungsreaktionen von Methylmethoxysilanen, katalysiert durch Alkalimetalle (Na), salzartige Verbindungen (Ca(OH)2, MgSO4/C, Na2SO4/C und (NH4)2SO4/C) und Lewis-Säuren (AlCl3). • Komproportionierung zwischen Trimethylmethoxysilan und Methyltrimethoxysilan Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in Untersuchung der chemischen Reaktivität von amorphem Silicium Si am, synthetisiert durch Na-Reduktion von Siliciumtetrachlorid, gegenüber verschiedenen Gasen, wie z. B. Chlorgas, Chlorwasserstoff und Methylchlorid, gegenüber Alkoholen, wie z. B. Methanol, Ethanol und Phenol und gegenüber Essigsaure unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen. Die Reaktion zwischen amorphem Silicium Si am und Cl2-Gas führt bei 240-250°C zu Tetrachlorsilan SiCl4 als einziges Produkt. Die Reaktion mit HCl-Gas liefert im Temperaturbereich zwischen 360-370°C zwei Produkte: 15% Dichlorsilan, H2SiCl2 und 85% Trichlorsilan, HSiCl3. Im Temperaturbereich zwischen 370-420°C entstehen drei Produkte: 36,4% Dichlorsilan H2SiCl2, 58,5% Trichlorsilan HSiCl3 und 5,1% Tetrachlorsilan SiCl4. Über eine Temperaturführung kann die Produktbildung wesentlich beeinflusst und damit auch gesteuert werden. Durch eine Reaktion mit Methylchlorid bei 560°C entstehen zwei Produkte: 79% Methyltrichlorsilan CH3SiCl3 und 21% Dimetyldichlorsilan (CH3)2SiCl2. Basisches Silicium Siam,schw,ox liefert in den Reaktionen mit Alkoholen und Essigsäure unter Rückfluss-Bedingungen (Temperaturen zwischen 20 und 420°C; offene Reaktionssysteme) jeweils ein einziges Produkt und führt mit den korrespondierenden Partnern selektiv zu Tetramethoxy-, Tetraethoxy-, Tetraphenoxy- und Tetraacetoxysilan. Diese Reaktionen werden durch die im eingesetzten Siam/NaCl-Gemisch vorhandene Base (NaOH, Na2Ox; x = 1, 2) katalysiert. Gemischte Alkylalkoxysilane oder Siloxane entstehen unter den vorgegebenen Bedingungen nicht. Silicium setzt sich dabei in den Reaktionen mit Methanol und Ethanol vollständig um. Werden die Bedingungen modifiziert und die Reaktionen in geschlossenen Systemen (Reaktionsampullen) bei 150°C, katalysiert durch 5 Gew. % Cu(I)Cl im Mol-Verhältnis Si am,schw,ox/CH3OH 1:3 und 1:4 durchgeführt, wird Trimethoxysilan in 91% und 84% Ausbeute gewonnen. Der Produktbildungsweg führt offensichtlich über die Katalyse eines Komplexes Na+[Cu(OH)Cl]-, der in situ aus Cu(I)Cl und NaOH gebildet wird. Nicht basisches Silicium, Siam,schw, reagiert mit Methanol bei Raumtemperatur zu Trimethoxysilan HSi(OCH3)3 (16-18%) und zu Tetramethoxysilan Si(OCH3)4 (84-82%). Die Produktbildung kann durch Änderungen Reaktionsbedingungen in Richtung von Trimethoxysilan verschoben werden. So entsteht Trimethoxysilan in einer geschlossenen Ampulle zu 95% als Hauptprodukt der Reaktion zwischen amorphem Silicium und Methanol im Mol-Verhältnis 1:3 in Anwesenheit von NH4HF2 als Aktivator. 84,5% Trimethoxysilan entstehen in einer Ampulle bei 200°C nach 5 Stunden Reaktionszeit, dann wenn Methanol im stöchiometrischen Verhältnis 8:1 eingesetzt wird. Der Umsatz an Silicium ist praktisch vollständig (100%). Wird die Reaktion zwischen Siam,schw und Methanol in einem „slurry phase“-Reaktor durchgeführt, resultiert eine Abhängigkeit der Produktausbeute vor allem vom Lösungsmittel, dann aber auch von den weiteren Bedingungen. In Dodecylbenzol entsteht das Trimethoxysilan bei 230°C und mit Cu(I)O als Katalysator zu 72% in einer 8-stündigen Reaktion. Unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Isoparaffinöl bildet sich Trimethoxysilan zu 61%. In einem modifizierten „slurry phase“-Reaktor, in dem die Produkte mit überschüssigem Methanol sofort aus der Reaktion abgeführt werden, entsteht das Trimethoxysilan nicht. Allerdings bilden sich in diesem Fall methylierte Methoxysilane. Der Umsatz an Silicium hängt auch von der Temperatur des Methanol-Dampfes ab. Wird die Temperatur zwischen 150-200°C gehalten, werden 49% des Siliciums umgesetzt. Ansonsten beträgt die Umsatzrate des Siliciums 20-25%. Amorphes, schwarzes, basenfreies Silicium, Si am,schw, reagiert bei 150°C mit Ethanol im Mol-Verhältnis 1:3 zu 91% und bei 200°C (Mol-Verhältnis Si : EtOH 1:8) zu 86% Triethoxysilan, HSi(OEt)3. Die Reaktion zwischen nicht basischem Silicium Si am,schw und Essigsäure liefert in der Siedehitze kein Tetraacethoxasilan, sondern nur Polyacethoxysilane mit einem Polymerisationsgrad von n = 2, 3, in einer Ampulle bildet sich jedoch ein Gemisch aus Tetraacetoxysilan und verschiedenen Acethoxypolysilanen. Die Polysilanbildung verstärkt sich mit zunehmender Reaktionstemperatur und –dauer. Die Reaktion zwischen Si am,schw und Essigsäure in einem offenen System (Ofen) liefert bei 300°C außer Tetraacetoxysilan ein Gemisch von Acethoxypolysilanen mit n=2-6. Versuche zur Bildung von Phenoxsilanen aus Si am,schw. und Phenol schlugen bei Temperaturen zwischen 150-300°C fehl. Das MALDI-TOF-MS-Spektrum einer bei 225-230°C im Vakuum siedenden Fraktion, die aus Reaktion von Si am,schw mit Phenol bei 420°C im Ofen entstanden ist, zeigt Spuren von Tetraphenoxysilan und organische Polymere mit dem Molekulargewichht bis zu 960 Dalton. Während Umsetzungen von amorphem Silicium mit Methanol in geschlossenen Reaktionsampullen Trimethoxysilan und Tetramethoxysilan als Hauptprodukte liefern, bilden sich in einem offenen System methylierte Methoxysilane MenSi(OMe)4-n (n=1, 2) in unterschiedlichen Ausbeuten. Dimethyldimethoxysilan entsteht aus basischem Silicium Siam,schw,ox nicht; selbst durch Katalysatorzusatz entsteht das gewünschte Produkt nur in Spuren. Die Monomethylierung verläuft dagegen erfolgreicher. Die höchste Ausbeute an Methyltrimethoxysilan (33,7%) wird bei 320°C mit 20 Gew. % Cu(I)Cl als Katalysator erzielt. Völlig anders verhält sich nicht basisches Silicium Si am,schw , denn es reagiert mit Methanol in einem offenen System bei 350°C zu 13% Dimethyldimethoxysilan (CH3)2Si(OCH3)2, und 37% Methyltrimethoxysilan CH3Si(OCH3)3. In Reaktionen mit größeren Silicium-Mengen (Si-Gehalt: 39-60 mmol) entstehen in einem nicht gerührten Reaktionsreaktor nach 20’ Minuten Reaktionszeit bei 300°C 26% Dimethyldimethoxysilan (CH3)2Si(OCH3)2 und nach 45’ Minuten Reaktionszeit 49,5% Methyltrimethoxysilan CH3Si(OCH3)3. In einem nicht gerührten Reaktionsrohr entstehen nach 3 Stunden Reaktionszeit 25-30% Dimethyldimethoxysilan bei 300°C und mit 20 Gew. % Kupfer(I)Chlorid als Katalysator. In einem gerührten Reaktionsrohr bilden sich bei 350°C und mit 20 Gew. % Cu(I)Cl nach 3-stündiger Reaktion 23,5% (CH3)2Si(OCH3)2 und 53,3% CH3Si(OCH3)3. Das Vorhandensein des Katalysators erhöht die Ausbeute an methylierten Methoxysilanen in den Reaktionen zwischen nicht basischem Silicium und Methanol. Aus dem Verlauf der Reaktion im Ofen lässt sich schließen, dass die größte Menge des Dimethyldimethoxysilans, (CH3)2Si(OCH3)2, während der ersten 20-40 Minuten entsteht. Danach sinkt der Anteil mit zunehmender Reaktionszeit, es bilden sich verstärkt die festen Dimethyloligosiloxane. Die Ausbeute an Tetramethoxysilan, Si(OCH3)4, wächst mit der Reaktionszeit kontinuierlich. Dagegen bleibt die Ausbeute an Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, während 3-stündiger Reaktion relativ konstant. Die Bildung aller drei Produkte wurde zwischen 300° und 350°C detailliert verfolgt. Nur ca. 20% des Siliciums setzen sich zu den flüchtigen Produkten um, rund 80% Silicium bleiben in fester Form als nicht abreagiertes Silicium und als feste Oligodimethylsiloxane erhalten. Eine nicht katalysierte Reaktion zwischen Si am,schw und Ethanol liefert nach 3h Reaktionszeit in einem nicht rührenden Reaktor etwa 23% HSi(OCH3)3 und etwa 72% Si(OEt)4. Etylenethoxysilane oder -siloxsane bilden sich nicht. Zum Weiteren ist es gelungen, Dimethyldimethoxysilan durch Disproportionierungsreaktion aus Methyltrimethoxysilan und Tetramethoxysilan über metallischem Natrium im Mol-Verhältnis 1:1 in einer Ampulle bei 250°C herzustellen. Aus Disproportionierung von Methyltrimethoxysilan sind 12% Dimethyldimethoxysilan zu erhalten. Die Disproportionierung von Tetramethoxysilan führt zu 27% Dimethyldimethoxysilan, (CH3)2Si(OCH3)2, 34% Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, und 11% Trimethylmethoxysilan, (CH3)3SiOCH3. Die Menge des eingesetzten Natriums muss in weiteren Arbeiten noch optimiert werden. Eine Komproportionierungsreaktion zwischen Trimethylmethoxysilan, (CH3)3SiOCH3, und Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, zu Dimethyldimethoxysilan, (CH3)2Si(OCH3)2, fand unter den in dieser Arbeit beschriebenen Bedingungen nicht statt. Diese Ergebnisse sind ein im Labormaßstab chlorfreies Verfahren zur Herstellung von methylierten Methoxysilanen. Unter der Voranstellung der Aufskalierbarkeit wird damit eine neue Route eines möglicherweise technisches Prozesses (das Q-Verfahren) zu Darstellung von Siliconen zugänglich; diese führt wie folgt aus: Siliciumtetrachlorid → amorphes Silicium → Tetramethoxysilan/Tetraethoxysilan/Tetraacetoxysilan → Methylmethoxysilane → Silicone. Es gilt nun, die Synthesebedingungen nach erfolgreicher Optimierung in den Pilotmaßstab zu überführen. Die Synthese von Trimethoxysilan, HSi(OCH3)3, erscheint bereits jetzt schon den Bedingungen des technisch durchführenden Cromptonprozesses überlegt zu sein. Diese bietet jedoch den Vorteil, von technisch verfügbarem Silicium anzugehen. Eine exakte und vergleichende Prozess-Analyse wird darüber Aufschluss geben, ob die in dieser Arbeit erworbenen Ergebnisse zu einer technischen Umsetzung führen.
Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
Pulsed Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is the most powerful tool to investigate structural properties and dynamics of paramagnetic substances. Up to date the electron spin is almost exclusively manipulated by rectangular shaped microwave pulses generated with switches. These pulses are unselective which means they excite outside their nominal bandwidth which is in most cases shallow compared to the overall spectral width of the spin system. Shaped pulses which are widely applied in NMR promise higher bandwidth and selectivity. The use of amplitude and phase modulated pulses was not possible for EPR due to the three orders of magnitude faster timescale compared to NMR. In this work, for the first time, an AWG (arbitrary waveform generator) operating with a 1 ns time resolution and 14 bit amplitude resolution was implemented into a commercial Bruker pulsed EPR spectrometer.
First results were obtained with broadband excitation pulses derived by optimum control theory (OCT). The OCT-pulse used excites transverse magnetization with 98% efficiency over a more than four times larger bandwidth than common rectangular pulse generating the same 1 B field. The benefit of such a pulse was demonstrated for magnitude FT-EPR spectroscopy on organic radicals in liquid phase.
Due to Spectrometer deadtime an FID cannot be observed for most inhomogeneous spin systems. For that reason prefocused pulses have been evaluated for their applicability to EPR spectroscopy. OCT-derived prefocused pulses can be understood as a compact Hahn Echo sequence in one monolithic pulse. Here, two problems have been encountered. 1) The limited bandwidth of the active and passive microwave components in the excitation path as well as microwave resonator cause linear distortions of the pulse shape which results in inferior pulse performance. This could be circumvented by measuring the impulse response function of the whole spin excitation path and including this information in the pulse optimization procedure. 2) Anisotropic hyperfine interaction which was not taken into account during the pulse optimization also caused efficiency losses.
PELDOR spectroscopy is a valuable tool to measure distance distributions between two or more paramagnetic centers in the range from 2-8 nm. It is demonstrated that the S/N ratio of PELDOR experiments can be substantially increased by substituting the rectangular shaped pump pulse by an adiabatic inversion pulse. The damping of the dipolar oscillations introduced by the prolonged pump pulse towards shorter distances could be circumvented by introducing a second time reversed pump pulse.
By substituting the refocused echo of the well-known 4-pulse PELDOR with a CPMG sequence the dipolar evolution time and thus the validity of PELDOR experiments would be increased. To achieve the maximum dipolar evolution time in a CPMG PELDOR for each refocusing pulse one pump pulse has to be applied. This could only be achieved with the new adiabatic inversion pulses since multiple inversions with efficiency close to one are not possible with rectangular pulses. Even with adiabatic pump pulses a reduced efficiency was observed due to hardware limitations thus limiting the sequence to three refocusing pulses. An iterative method was developed to remove the residual dipolar signals attributed to the reduced inversion efficiency.
The new 7-pulse CPMG PELDOR sequence enabled measuring reliable distance distributions between the protomers of the trimeric betaine transporter BetP. With these it could be shown that the asymmetries found for the 2 and 3-dimensional crystal structures are even larger in frozen detergent.
Observation and tracking of fluorescently labeled molecules and particles in living cells reveals detailed information about intracellular processes on the molecular level. Whereas light microscopic particle observation is usually limited to two-dimensional projections of short trajectory segments, we report here image-based real-time three-dimensional single particle tracking in an active feedback loop with single molecule sensitivity. We tracked particles carrying only 1-3 fluorophores deep inside living tissue with high spatio-temporal resolution. Using this approach, we succeeded to acquire trajectories containing several hundred localizations. We present statistical methods to find significant deviations from random Brownian motion in such trajectories. The analysis allowed us to directly observe transitions in the mobility of ribosomal (r)RNA and Balbiani ring (BR) messenger (m)RNA particles in living Chironomus tentans salivary gland cell nuclei. We found that BR mRNA particles displayed phases of reduced mobility, while rRNA particles showed distinct binding events in and near nucleoli.