Biochemie und Chemie
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Die Modulation molekularer Systeme mit Licht ist ein in den letzten Jahren immer stärker untersuchtes Forschungsgebiet. Es existiert bereits eine große Anzahl an Publikationen, die mittels statischer Spektroskopie und anderer statischer Methoden Einblicke in die ablaufenden Prozesse gewähren konnten. Untersuchungen im Ultrakurzzeitbereich sind jedoch eher selten, liefern aber detaillierte Informationen zu den ablaufenden Prozessen. Den Wissensstand diesbezüglich zu erweitern, war Ziel dieser Dissertation.
Untersucht wurden neun photoschaltbare, molekulare Dyaden hinsichtlich ihrer Dynamik nach Photoanregung. Die Dyaden setzten sich aus einem Fluorophor (Bordipyrromethen, BODIPY), einem Photoschalter (Dithienylethen, DTE; offen oder geschlossen) und gegebenenfalls einer COOH-Ankergruppe zusammen.
Die Unterschiede in den Molekülstrukturen bestanden in der Verknüpfung der einzelnen Bauteile (kurze oder lange, beziehungsweise gerade oder gewinkelte Brücke) und der Art des Fluorophors und des Photoschalters (jeweils zwei verschiedene Strukturen).
Durch Belichtung mit UV- oder sichtbarem Licht konnten photostationäre Zustände generiert werden, die 40 – 98 % geschlossenes Isomer (je nach Molekül) beziehungsweise 100 % offenes Isomer enthielten.
Unter Verwendung von Licht verschiedener Wellenlängen konnten beide Teile der Dyade (BODIPY beziehungsweise DTE) separat angeregt und hinsichtlich der ablaufenden Photodynamik untersucht werden, wobei der Fokus der Arbeit auf transienten Absorptionsmessungen mit Anregung des BODIPY lag. Bei einem Großteil der untersuchten Moleküle kam es in diesem Fall, je nach Zustand des Photoschalters, zu einem intramolekularen Energietransfer nach der Theorie von Theodor Förster. Durch diese Energietransferprozesse kommt es zu einer drastischen Verkürzung der Lebenszeit des angeregten Zustands des BODIPY. Ausgehend von Lebenszeiten im Bereich von Nanosekunden im Falle der offenen Dyaden (entspricht der Fluoreszenzlebensdauer) reduziert sich die Lebenszeit auf wenige Pikosekunden, beziehungsweise je nach Aufbau des Moleküls sogar noch weiter. Die unterschiedlich schnellen Transferprozesse sind im Sinne der Förster-Theorie durch die unterschiedlichen Entfernungen und relativen Orientierungen der beiden beteiligten Übergangsdipolmomente (von DTE und BODIPY) erklärbar.
Neben Experimenten mit Anregung des BODIPY-Teils der Dyaden wurden weitere Experimente durchgeführt, in denen der geschlossene Photoschalter direkt angeregt wurde. Aus diesen Messungen konnten Erkenntnisse über die Relaxation des DTE erlangt werden. Auf diese Weise war es möglich, bei einigen der Moleküle die Ringöffnungsreaktion zu beobachten und zu charakterisieren. Im Fall von Dyade 4 konnten zusätzlich kohärente Schwingungen des Moleküls nach Photoanregung detektiert werden, die sich anhand einer Frequenzmodulation der Absorptionsbande des BODIPY-Teils über einen Zeitbereich von 2 ps beobachten ließen.
Die Blut-Hirn-Schranke macht das Gehirn zum streng kontrollierten extraterritorialen Raum. Die sensiblen Hirnfunktionen laufen unabhängig und ungestört von den vielfältigen Prozessen der anderen Organe ab. Neben den wichtigen Funktionen dieser Barriere hält sie jedoch auch nötige Medikamente von ihrem Wirkort, dem Gehirn, fern. Die in-vitro-BHS soll Mechanismen aufklären und Tierversuche ersetzen. In den letzten Jahren konnte so das Bild von einem statischen Computer, Gehirn, durch das Bild eines hoch plastischen Arbeitsspeicher-Netzwerkes mit verschiedensten Verbindungen ersetzt werden. Die vorliegende Arbeit ist ein zwei Bereiche gegliedert: 1. Transportstudien von Nanopartikeln und Substanzen im Transwell-System 2. Aufklärung von Transportmechanismen für Nanopartikel an der BHS Die Transportuntersuchungen erfolgten in einem Zwei-Kammer- Transwell-System. Dieses besteht aus zwei Kompartimenten, die zum einen das Blut-Kreislauf-System und zum anderen das Gehirn darstellen sollen. Diese Kompartimente sind durch eine Membran getrennt, auf welche Gehirn-Kapillar-Endothelzellen ausgebracht werden. Membran und ausgebrachte Zellen stellen die BHS dar. Der Transport von Nanopartikeln oder Substanzen wurde durch den Nachweis von Fluoreszenz im Medium der zwei Kompartimente nachgewiesen. Die fluoreszierenden Nanopartikel oder die fluoreszierende Substanz wurden in das obere Donor-Kompartiment gegeben und zu den Zeitpunkten 2, 4, 6 und 24 Stunden wird die Fluoreszenz in Donor- und Akzeptor-Kompartiment gemessen und beurteilt. Bei diesen Transportstudien konnte gezeigt werden, dass dieses System für den Nachweis von Nanopartikel-Transport ungeeignet ist. So benötigen die Nanopartikel zur Überwindung der Membran ohne Zelllayer schon über 24 Stunden. Die Menge der ankommenden Nanopartikel im Akzeptor-Kompartiment war sehr gering. Substanz-Transport und BHS-charakteristische Eigenschaften lassen sich in diesem Modell jedoch gut nachweisen. So konnte die Aktivität der Efflux-Pumpe PgP anhand des Transportes von Rhodamin, einem PgP-Substrat, belegt werden. Während der Transport von Rhodamin nach Zugabe des PgP-Substrates nur eingeschränkt beobachtbar war, konnte der Transport des Rhodamins vom Donor-Kompartiment in das Akzeptor-Kompartiment nach Zugabe des PgP-Hemmers Verapamil innerhalb 4 Stunden nachgewiesen werden. Auch die TEER-erhöhende Wirkung von Hydrokortisol und somit verbesserter Barriereeigenschaften der Zellschicht konnte an diesem Modell nachgewiesen werden. Zur Aufklärung des Mechanismus eines erfolgreichen Nanopartikel-Transports über die Blut-Hirn-Schranke wurde zunächst der rezeptor-vermittelte Transport über den LDL-Rezeptor untersucht. Der LDL-R ist ein Mitglied der LDL-R-Familie welche neben anderen Organen vermehrt in Gehirn und BHS lokalisiert sind. Als Ligand fungiert bei dieser Rezeptorfamilie und insbesondere bei dem LDL-R das ApoE. Mittels ApoE-modifizierter HSA-Nanopartikel sollte eine spezifische Bindung der Transportsysteme über den gebundenen Liganden ApoE an zielspezifische Transport-Mechanismen wie den LDL-R nachgewiesen werden. Über diesen könnten die Nanopartikel endocytiert und der Arzneistoff an seinen Wirkort gebracht werden. Untersuchungen zu diesem Transport-Mechanismus erfolgten in verschiedenen Arbeitsschritten. So wird erst eine Optimierung des LDL-R-Nachweises auf den Zellen durchgeführt. Eine Leberzelllinie wurde auf LDL-R hin untersucht und die Rezeptorkonzentration durch Mehrfachkultivierung der Zellen optimiert. Nach 2-tägiger Kultivierung in lipidfreiem Serum und dem zweimaligen Sorten der Zellen mit einem Antikörper gegen den LDL-Rezeptor konnte ein Nachweis des Rezeptors von 70-90% erreicht werden. Nächster Schritt war die Untersuchung der Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln an verschiedenen Zelllinien mit unterschiedlichem LDL-R-Nachweis, gefolgt von Untersuchungen zur Bindungsspezifität. In diesen Untersuchungen sollte die Spezifität dieser Bindung durch Präinkubationen mit einen Antikörper gegen die Liganden-Bindungsstelle und freiem ApoE nachgewiesen werden. Eine Bindung der ApoE-modifierten HSA-Nanopartikel konnte an Endothelzellen des Gehirns nachgewiesen werden. Sowohl die primär isolierten porcinen brain capillary endothelial cells (pBCEC), als auch die Maus-Gehirn-Endothelzelllinie bEnd3 wiesen eine prozentuale Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln von über 70% auf. Eine Bindung dieser Partikel an andere getestete Zelllinien mit BHS-Eigenschaften oder einem hohen Nachweis an LDL-R konnte nicht gezeigt werden. Eine Hemmung der Bindung von ApoEmodifizierten Nanopartikeln an Gehirn-Endothelzellen war nicht oder nur geringfügig möglich. So konnte durch eine Präinkubation mit dem Antikörper keine Reduktion der Bindung erreicht werden. Die Präinkubation mit freiem ApoE führte hingegen zu einer sehr geringen Erniedrigung der Bindungsaffinität der ApoE-modifizierten Nanopartikel. Zu beachten war hierbei noch die geringe nachweisbare Bindung von freiem ApoE an die Zellen. In Versuchen zur Bindung von freiem ApoE war eine prozentuale Bindung von freiem ApoE an die Zellen von nur etwa 20% nachweisbar. Bei einer solch geringen Bindung des freien Liganden kann also auch nicht von einer hohen Hemm-Wirkung ausgegangen werden. Es muß nach diesen Untersuchungen davon ausgegangen werden, dass ein ApoE- und Gehirn-Endothelzell-spezifischer Mechansimus am Transport von ApoEmodifizierten Nanopartikeln beteiligt ist. Der untersuchte LDL-R spielt hierbei keine oder nur eine sehr untergeordnete Rolle. Abschließend wurden noch Nanopartikel mit gebundenen ApoE-Mutanten auf ihre Bindung an Zellen getestet. Die modifizierten ApoE-Liganden unterschieden sich in dem Austausch von Aminosäuren in der Ligand-Bindunsdomäne. In Bindungsuntersuchungen konnte bei diesen ApoE-Varianten kein Unterschied in deren Affinität zu Zellen aufgezeigt werden. Dieser Austausch von Aminosäuren in der Liganden-Bindungsstelle hatte keinerlei Auswirkung auf deren Bindung an die Zellen, was wiederum für einen LDL-R unabhängigen Transport-Mechanismus spricht. Am Ende der vorliegenden Arbeit wurde noch ein alternativer Transport-Mechanismus untersucht. Das Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) als alternativer Mechansimus weist Heparin-Bindungsdomänen auf, die der LDL-R Bindungsdomäne sehr ähnlich sind und bekannterweise in der Lage sind, LDL-Partikel zu internalisiseren. Heparinase I kann die anionischen Heparansulfat-Seitenketten entfernen und somit den Internalisierungsmechanismus über das HSPG beeinträchtigen. Untersuchungen zum HSPG und eine Vorinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Heparinase I deuteten auf eine wichtige Rolle des HSPG im Bindungs- und Internalisierungsmechanismus für ApoE-PEG-HSA-NP hin. Die Affinität der ApoE- modifizierten Nanopartikel konnte durch einen Heparinase-Enzymverdau deutlich erniedrigt werden. Auch führte der Einsatz unterschiedlicher Heparinase I-Konzentrationen zu der Annahme, dass es sich um eine konzentrationsabhängige Beeinträchtigung des Mechanimus handelte. So erreichten 10 Units/ml eine weitaus größere Hemmung der ApoE-PEG-HSA-NP-Bindung als Konzentrationen von 2-5 Units/ml. Strukturelle Ähnlichkeiten des ApoEs mit zellpenetrierenden Peptiden sprechen dafür, dass neben dem HSPG noch andere Translokationsmechanismen von Bedeutung sein könnten.
Die vorgelegte Arbeit beschäftigte sich zunächst mit der Synthese von neuen 3'- und basenmodifizierten Nukleotiden und deren Markierung mit Fluoresceinisithiocyanat. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der synthetisierten Verbindungen auf ihre Eignung als Terminatoren für die enzymatische DNA-Sequenzierung. Die Synthese des neuen Thioamidtriphosphats 3'- [[6-Amino- 1 -thioxohexyl) amino] -3'-konnte in 10 Schritten ausgehend vom Thymidin erfolgreich durchgeführt werden. Zunächst erfolgte die Umsetzung zum 3'-Amino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-desoxythymidin, an dessen 3'-Aminofunktion ein Aminocapronsäurelinker angekuppelt wurde. Der Schlüsselschritt der Synthese war die Beschwefelung der so generierten 3'-Amidfunktion mittels Lawesson's Reagenz. Dabei konnte durch Optimierung der Synthesebedingungen die Ausbeute der Beschwefelungsreaktion um 30 % gesteigert werden. Das Thioamid 3' -Desoxy-5 '-0- (4,4'-dimethoxytrityl) -3'- {{6-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)-carbonyl] -amino}-1-thioxohexyl}amino}thymidin wurde zum Triphosphat umgesetzt und anschliessend FITC markiert. Für die Synthese des N2-modifizierten 2-Pentylamin-2',3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphats 43 wurden Synthesewege beschritten. Schliesslich führte der Trick des Ausnutzens von Desmethylwyosin als Schutzgruppe zum Erfolg. Ausgehend vom 2'-Desoxyguanosin konnte die Synthese der unmarkierte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 41 in 8 Schritten und die des Triphosphats 2-Pentylamin-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 43 und dessen FITCMarkierung in 12 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Die 5'-entschützte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde erfolgreich zum Triphosphat umgesetzt. Die Verbindung 5'-0- (tert-Butyldimethylsilyl)-2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde Azid überführt. Das anschliessend synthetisierte Triphosphat 2-Pentylazid-2',3-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 42 wurde reduziert und über die entstandene freie Aminofunktion mit FITC markiert. Alle neuen Triphosphate konnten durch optimierte Aufreinigungsbedingungen in hochreinem, salzreien Zustand isoliert werden. Vor dem Einsatz als Terminatoren für die DNA-Sequenzierung wurden alle Triphosphate als Na-Salze gefällt. Die synthetisierten Thioamidtriphosphate sind im Laufe dieser Arbeit als neue Verbindungen synthetisiert und veröffentlicht worden. Die hergestellten N2 - modifizierten Didesoxyguanosintriphosphate sind bisher nicht beschrieben und neue Vertreter ihrer Verbindungsklasse. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die neuen, modifizierten Triphosphate 39, 40, 41, 43 und 44 auf ihre Eignung als Terminatoren für die Sanger-DANN-Sequenzierung getestet. Dabei wurden fünf verschiedene Polymerasen eingesetzt: Die thermostabilen Polymerasen AmpliTaq, Taq(exo-), Vent(exo-), Bst und die nicht thermostabile T7 Polymerase. Die besten Ergebnisse konnten mit der T7 Polymerase erreicht werden. Alle getesteten Terminatoren wurden als Terminatoren von der T7 Polymerase akzeptiert. Die entsprechenden Sanger-Abbruchfragmente konnten mittels des Cy5-markierten Primers detektiert werden. Die Verbindung 39 wurde auch von der AmpliTaq und der Taq(exo-) Polymerase akzeptiert. Die Terminatoren 41 und 43 wurden von der Taq(exo-) Polymerase eingebaut. Entsprechende Abbruchfragmente konnten in schwacher Konzentration detektiert werden. Mit der Bst- und der Vent(exo-)-Polymerase konnten keine positiven Ergebnisse erzielt werden. Mit Sicherheit können alle getesteten Triphosphate als Substrate zumindest für die positiv getesteten Polymerasen T7, AmpliTaq und Taq(exo-) bezeichnet werden. In Zukunft sollten mit beiden FITC-markierten Nukleotiden Sequenzierversuche mit einem geeigneten Laser durchgeführt werden, um Klarheit darüber zu bekommen, ob der Farbstoff nach dem enzymatischen Einbau am Terminator verbleibt und zur Dye-TerminatorSequenzierung eingesetzt werden kann. Ausserdem ist mit der Synthese des N2 -modifizierten ddG's die Grundlage für ein Sequenziersystem mit den bereits existierenden modifizierten ddA- und ddC-Terminatoren geschaffen.
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Bis(N,N-diethyl-N′-benzoylselenoureato)lead(II) has been prepared and characterized by single-crystal structure analysis. Pb(C12H15N2OSe)2 crystallizes in the non-centrosymmetric orthorhombic space group Iba2. The cell parameters are a = 13.206(3), b = 20.542(4), c = 10.089(2) A and Z = 4. R = 0.025. The direction of the polar axis was determined unambig uously. Pb(II) is bidentally coordinated to two N,N-diethyl-N′-benzoylselenourea molecules. The coordination polyhedron is a distorted pseudo-trigonal bi-pyramid with one equatorial position occupied by an electron lone-pair. The Pb-Se and Pb-O bond lengths are 2.876(1) and 2.444(4) Å, respectively. In the crystal lattice, each Pb atom also shows interactions with two Se atoms of a neighboring molecule. The Pb-Se distance of that interaction is 3.643 Å.
1. Die Membran des SR besitzt mehrere unterscheidbare Transportsysteme für organische und anorganische Anionen. Diese Transportsysteme lassen sich durch Anionenfluxmessungen mit der FilterassayMethode und durch Einzelkanalmessungen mit der Planarmembrantechnik charakterisieren. Der Vergleich der mit beiden Methoden ermittelten Daten ergibt, dass der 35 SO 4 2 Flux unter Standardbedingungen durch den als BCl (Big Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanal bewerkstelligt wird und eine Steigerung der Effluxrate im Vesikelfluxexperiment auf die zusätzliche Aktivierung des als SCl (Small Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanals zurückzuführen ist. 2. Neben Chlorid und Sulfat werden auch andere organische und anorganische Anionen wie Jodid, Pyrophosphat, Oxalat und Nukleotide transportiert. 3. Der stärkste Hemmstoff von 35 SO 4 2 und NukleotidTransport ist der PurinozeptorAntagonist Suramin mit einer I 50 von 0.91.16 µM. 4. Eine Stimulation des 35 SO 4 2 Transports kann durch die Kationen Calcium, Magnesium und Cholin erreicht werden. Ebenso wirken Hemmstoffe des RyR wie Ryanodin und Atractylosid stimulierend bzw. aktivierend. 5. 35 SO 4 2 Influx und Efflux werden durch Nukleotide unterschiedlich beeinflusst. Der Efflux wird in Abhängigkeit von Nukleotidbase, Anzahl der Phosphatreste und der Ladung gehemmt. Unter Magnesiumeinwirkung ist der Hemmeffekt verstärkt und auch das als nicht hydrolysierbar geltende ATP Analogon AMPPNP wirkt inhibierend. Der maximale 35 SO 4 2 Influx hingegen ist in Anwesenheit von ATP erhöht. Die ATPAnaloga AMPPNP und AMP PCP zeigen diesen stimulierenden Effekt nicht. 6. ATP und GTP werden in Anwesenheit von SRProtein schnell ab und umgebaut. Dieser Umbau lässt sich durch Magnesium und verschiedene Hemmstoffe des Anionenfluxes beeinflussen. 7. Der Eintransport von Nukleotiden in das Lumen des SR lässt sich durch Hemmstoffe des Anionenfluxes inhibieren. Die zusätzliche Hemmbarkeit durch Atractylosid, einen Inhibitor des mitochondrialen ATP/ADP Translokators (AAT), impliziert die Möglichkeit einer Beteiligung dieses Transportproteins am Nukleotidtransport. 8. Inhibitoren der Ca 2 ATPase hemmen auch den Anionenflux. Die Vermittlung des Anionentransports durch die Ca 2 ATPase selbst sowie die Hemmung des Ca 2 Eintransports aufgrund der Inhibition der Anionenkanäle sind ausgeschlossen. Vesikel mit rekonstituierter Ca 2 ATPase weisen keinen Anionen transport auf, obwohl der Ca 2 Eintransport durch Anionenkanalhemmstoffe wie Suramin, DIDS und PPANS inhibiert werden kann. 9. Beim Anionenflux eingesetzt zeigen Aktivatoren und Inhibitoren des Ca 2 ReleaseKanals gegenläufige Effekte. Der Ca 2 ReleaseKanal ist nicht der Vermittler des Anionentransports. Anionentransporter sind im RyRfreien longitudinalen SR ebenso häufig wie in den RyRreichen terminalen SR Zisternen.
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
Die gezielte Modifikation von Proteinen für die Erforschung des Proteoms stellt eine entscheidende Herausforderung dar. Sie wird meistens dann zwingend notwendig, wenn das intrinsische Signal zum Auslesen ungeeignet ist. So ist es z.B. für die größte Anzahl von fluoreszenzbasierenden Methoden unerlässlich, das zu untersuchende Protein spezifisch und einheitlich mit einem Fluorophor zu markieren. Eine weitere Schwierigkeit ist die gerichtete Immobilisierung von Proteinen für deren Charakterisierung an Oberflächen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die spezifische Markierung, Manipulation und strukturierte Immobilisierung von rekombinanten Proteinen analysiert. Dafür wurde mit dem hauptsächlich aus der Proteinreinigung bekannten NTA/Oligohistidin-System gearbeitet. Verwendet wurden multivalte NTA-Chelatorköpfen mit zwei (bisNTA), drei (trisNTA) oder vier (tetrakisNTA) NTA-Gruppen pro Molekül. Durch die Multivalenz können hervoragende Bindungsaffinitäten im nanomolaren Bereich erzielt werden, die die stabile, stöchiometrische, nicht kovalente und damit reversible Modifikation His-getaggter Proteine in Lösung und an Grenzflächen erlaubt. Fluoreszente trisNTAs wurden vielfach erfolgreich für die Markierung His-getaggter Proteine eingesetzt. Dabei wurde die Beobachtung gemacht, dass die Ni2+-Ionen im trisNTA die Emission des benachbarten Fluorophors stark quenchen und dadurch die Einsatzmöglichkeiten der Verbindung reduzieren. Durch die räumliche Trennung der beiden Gruppen mit starren, biokompatiblen Polyprolin-Helices konnte erstmals systematisch demonstriert werden, dass das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung abstandsabhängig ist. Bei der Verwendung von 12 Prolinen (3.6 nm lange Helix) wurde mit einem ATTO565-Derivat eine Intensitätserhöhung um etwa 70%, und bei einem OregonGreen488-Derivat um etwa 40% erreicht. Bei den Verbindungen können der Abstand der beiden Gruppen voneinander und der Fluorophor nahezu frei gewählt werden, so dass eine Optimierung in Hinblick auf die jeweilige Fragestellung ohne Probleme möglich ist. In Kooperationen untersucht wurden z.B. die ATP-Hydrolyse von MDL1 und die ATP-Bindung von TAP. Die deutlich verbesserte Quantenausbeute, die stabile Bindung an einen His-Tag und die geringe Größe machen die Verbindungen zu idealen Reportersonden für die Einzelmolekül-Fluoreszenz-Analyse. Die gezielte Manipulation eines makromolekularen Proteinkomplexes mit einem kleinen Molekül wurde in einem weiteren Projekt untersucht. Das tetrakisNTA wurde verwendet, um die His-getaggten Eingänge des alphaN-His6 Proteasoms von Thermoplasma acidophilum gezielt zu blockieren. Durch den Abbau von Fluoreszein-markiertem Casein konnte die Aktivität der Proteasomkomplexe in Echtzeit verfolgt werden. Unter Zugabe von tetrakisNTA fand kein Abbau statt, während dieser ohne oder nach Entfernen der tetrakisNTAs von den Eingängen im gleichen Maße detektierbar war. Die Aktivität der Peptidase-Schnittstellen im blockierten Zustand konnte durch die Überschichtung eines nativen Gels mit einem Peptidsubstrat demonstriert werden. Die Ergebnisse belegen, dass die His-Tags an den Eingängen des Proteasomkomplexes so umstrukturiert werden, dass der Eintritt von Proteinen reversibel blockiert wird. Neben der gezielten Manipulation des Proteasoms wurde außerdem erstmals die spezifische Fluoreszenzmarkierung His-getaggter Proteine in kompletten E. coli Zelllysaten mittels nativer PAGE nachgewiesen. Um neue Anwendungsgebiete für das trisNTA zu erschließen, sollte dieses mit einem 1.4 nm großen Goldcluster modifiziert werden. Damit könnte die Position von His-Tags in Proteinkomplexen mittels Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mittels Gelfiltration mit MBP-H6 wurde nachgewiesen, dass die entwickelten Goldcluster teilweise mehr als eine trisNTA-Gruppe auf der Oberfläche hatten, wobei eine Trennung der Partikel nach der Anzahl der NTA-Gruppen nicht möglich war. Die Partikel wurden erfolgreich für die spezifische Markierung des alphaN-His6 Proteasoms verwendet. In der Einzelpartikelanalyse deutlich erkennbar waren der markierte Proteasomkomplex und die Lage des trisNTA-Goldclusters. Die Verwendung solcher Goldpartikel in der EM bringt entscheidende Vorteile im Hinblick auf die Strukturaufklärung von Proteinen mit sich. Orthogonale NTA/His-Tag Bindungspaare, bei denen ein bestimmtes, multivalentes NTA-Molekül einen definierten His-Tag bindet, würden einen großen Nutzen für die spezifische Markierung oder Immobilisierung verschiedener His-getaggter Proteine bringen. Durch die Verwendung teilweise rigider His-Tags und möglichst starrer bisNTAs sollten solche Bindungspaare realisiert werden. Die Synthese rigider bisNTAs mit unterschiedlichen Abständen zwischen den NTA-Gruppen konnte erfolgreich etabliert werden. Allerdings zeigten Fluoreszenztitrationen mit verschieden Fluoreszeinmarkierten His-Peptiden nicht die erhofften Unterschiede in den Affinitäten. Im letzten Teil der Arbeit wurden durch intramolekulare His-Tags inaktive trisNTAs synthetisiert. Diese können durch Licht gespalten und damit aktiviert werden (photoaktivierbare trisNTAs, PAtrisNTAs). Die Verbindungen mit unterschiedlicher Anzahl an Histidinen im intramolekularen Tag wurden systematisch in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Dazu wurden HPLC-Studien, Gelfiltrationen und SPR-Experimente durchgeführt. Die strukturierte Organisation von Proteinen auf solchen lichtaktivierbaren Oberflächen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie demonstriert. Außerdem konnten durch die Laserlithographie gezielt verschiedene His-getaggte Proteine in situ in definierten Bereichen immobilisiert werden. Die Biokompatibilität der Oberflächen wurde erfolgreich durch die strukturierte Organisation aktiver, Virusbindender Rezeptor-Partikel gezeigt. Im Prinzip sollte das Konzept die lichtinduzierte Aufkonzentrierung von His-getaggten Rezeptoren in lebenden Zellen ermöglichen. Durch das Clustern ausgelöste Vorgänge könnten so gezielt herbeigeführt und analysiert werden.
[MesnacnacZn(μ-H)]2 (1) was synthesized by reaction of MesnacnacZnI with either an equimolar amount of KNH(iPr)BH3 or an excess of NaH and characterized by multinuclear NMR and IR spectroscopy as well as X-ray diffraction. Two polymorphs of 1 were found and their structures determined on single crystals.
Rotary adenosine triphosphate (ATP)ases are ubiquitous, membrane-bound enzyme complexes involved in biological energy conversion. The first subtype, the so-called F1Fo ATP synthase, predominantly functions as an ATP synthesizing machinery in most bacteria, mitochondria and chloroplasts. The vacuolar subtype of enzyme, the V1Vo ATPase, operates as an ATP driven ion pump in eukaryotic membranes. The subtype found in archaea and some bacteria is called A1Ao ATP (synth)ase and is capable of working in both directions either to synthesize ATP or to generate an ion motive force by consuming the same.
All the three above-mentioned subtypes of rotary ATPases work as nanomolecular machines sharing a conserved mechanism to perform the energy conservation process. The simplest form of these enzymes is the bacterial F1Fo ATP synthase. Here, ions are channelled via the membrane stator subunit a to the rotor ring of the enzyme. After almost a complete rotation of the ring the ions are released again on the other side of the membrane. This rotation is further transmitted via the central stalk to the soluble part of the enzyme, the F1-complex, where conformational changes within the nucleotide binding sites result in the synthesis of ATP from ADP and Pi.
The rotor or c-ring of the enzyme is the key protein complex in mediating transmembrane ion translocation. Several structural and biochemical methods have been applied in the past years to study the rotor rings from many different organisms. The results revealed that the stoichiometry of a c-ring of a given species is constant while it can vary between different species within a range of 8 to 15 c subunits. The c-ring stoichiometry determines directly the number of ions transported through Fo per rotation whereby three molecules of ATP are concurrently synthesized in the water-soluble F1 headgroup. Hence the number of c subunits has an important influence on the bioenergetics of the corresponding enzyme and thus the entire organism.
The c-ring of a rotary ATPase is able to specifically bind either protons (H+) or sodium ions (Na+) as the coupling ion for the enzyme. Several structures are already available revealing the coordination network of both types of rotor rings. In each case ion binding includes a highly-conserved carboxylic acid residue (glutamate or aspartate), in addition to a more varying combination of amino acid residues, whereby Na+ coordination is structurally more demanding than H+ binding.
In the first part of my PhD thesis, I aimed to characterize the F1Fo ATP synthase rotor ring of the opportunistic pathogenic bacterium Fusobacterium nucleatum on a functional and structural level. F. nucleatum is an anaerobic bacterium which uses peptides and amino acids as a primary energy source. It is one of the most frequently occuring bacteria in human body infections and involved in human periodontal diseases.
The protein complex was heterologously expressed within a hybrid ATP synthase in Escherichia coli and purified without an affinity tag for further analysis. Two high resolution X-ray structures of the c-ring were solved at low (5.3) and high (8.7) pH to 2.2 and 2.64 Å, respectively. In both structures, the conserved glutamate is in an ion-locked conformation, revealing that the conformational state of the ion binding carboxylate is not depending on the pH of the crystallization condition, which is in good agreement with previous structural and biochemical studies of other c-rings.
A Na+ ion is present within the c-ring binding site and directly coordinated by four amino acid residues and a structural water molecule. Remarkably, the Na+ is bound by two glutamate residues instead of one as is the case in the I. tartaricus Na+ binding c-ring, of which the first high resolution X-ray structure of a c-ring has been solved in 2005. Thus, a new type of Na+ coordination in an ATP synthase rotor ring with a two-carboxylate ion binding motif is described here, which also occurs in other bacteria, including several pathogens. Na+ specificity of the investigated c-ring was further confirmed by a competitive biochemical labeling reaction performed with a fluorescent ATP synthase inhibitor molecule (N-cyclohexyl-N`-[4(dimethylamino)-α-naphtyl] carbodiimide, NCD-4).
We furthermore complemented our functional and structural data of the F. nucleatum c-ring by computational studies to explore the ion translocation mechanism of this enzyme in more details. We therefore analyzed the protonation state of the second, additional glutamate in the ion binding site. Molecular dynamics (MD) simulations and free-energy calculations indicated that this glutamate is constitutively protonated, in the ion-locked as well as in a simulated, more hydrated open-conformation of the ion binding glutamate as when it is travelling through the a/c-ring interface upon c-ring rotation.
Background: ClC-7 is a ubiquitous transporter which is broadly expressed in mammalian tissues. It is implied in the pathogenesis of lysosomal storage disease and osteopetrosis. Because of its endosomal/lysosomal localization it is still poorly characterized. Methodology/Principal Findings: An electrophysiological characterization of rat ClC-7 using solid-supported membrane-based electrophysiology is presented. The measured currents show the characteristics of ClC-7 and confirm its function as a Cl−/H+-antiporter. We have used rat ClC-7 in CHO cells as a model system to investigate the functionality and cellular localization of the wt transporter and its variant G213R ClC-7 which is the analogue of human G215R ClC-7 responsible for autosomal dominant osteopetrosis type II. Our study shows that rat G213R ClC-7 is functional but has a localization defect in CHO cells which prevents it from being correctly targeted to the lysosomal membrane. The electrophysiological assay is tested as a tool for drug discovery. The assay is validated with a number of drug candidates. It is shown that ClC-7 is inhibited by DIDS, NPPB and NS5818 at micromolar concentrations. Conclusions/Significance: It is suggested that the scenario found in the CHO model system also applies to the human transporter and that mislocalization rather than impaired functionality of G215R ClC-7 is the primary cause of the related autosomal dominant osteopetrosis type II. Furthermore, the robust solid-supported membrane-based electrophysiological assay is proposed for rapid screening for potential ClC-7 inhibitors which are discussed for treatment of osteoporosis.
Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.
In the absence of apparent mutations, alteration of gene expression patterns represents the key mechanism by which normal cells evolve to cancer cells.
Gene expression is tightly regulated by posttranscriptional processes. Within this context, RNA-binding proteins (RBPs) represent fundamental factors, since they control mechanisms, such as mRNA-stabilization, -translation and -degradation. Human antigen R (HuR) was among the first RBPs that have been directly associated to carcinogenesis. HuR modulates the stability and translation of mRNAs which encode proteins facilitating various ‘hallmarks of cancer’, namely proliferation, evasion of growth suppression, angiogenesis, cell death resistance, invasion and metastasis. Furthermore, it is well established that tumor-promoting inflammation contributes to tumorigenesis. In this process, monocytes are attracted to the site of the tumor and educated towards a tumor-promoting macrophage phenotype. While HuR has been extensively studied in various tumor cell types, little is known about HuR in hepatocellular carcinoma (HCC). Thus, the aim of my work was to characterize the contribution of HuR to the development of cancer characteristics in HCC. I was particularly interested to investigate if HuR facilitates tumor-promoting inflammation, since a role for HuR has not been described in this context. To this end, I depleted HuR in HepG2 cells (HuR k/d) and used a co-culture model of HepG2 tumor spheroids and infiltrating monocytes to study the impact of HuR on the tumor microenvironment. I could show that depletion of HuR resulted in the reduction of cell numbers. Additionally, the expression of proliferation marker KI-67 and proto-oncogene c-Myc was reduced, supporting a proliferative role of HuR. Furthermore, exposure to cytotoxic staurosporine elevated apoptosis in HuR k/d cells compared to control cells. Concomitantly, the expression of the anti-apoptotic mediator B-cell lymphoma protein-2 (Bcl-2) was markedly reduced in the HuR k/d cells, pointing to an involvement of HuR in cell survival processes.
Accordingly, a pro-survival function of HuR was also observed in tumor spheroids, since HuR k/d spheroids exhibited a larger necrotic core region at earlier time points and showed elevated numbers of dead cells compared to control (Ctr.) spheroids. Interestingly, HuR k/d spheroids isplayed reduced numbers of infiltrated macrophages, suggesting that HuR contributes to a tumor-promoting, inflammatory microenvironment by recruiting monocytes/macrophages to the tumor site. Aiming at identifying HuR-regulated factors responsible for the recruitment of monocytes, I found reduced levels of the chemokine interleukin 8 (IL-8) in supernatants of HuR k/d spheroids, supporting a critical involvement of HuR in the chemoattraction of monocytes. Analyzing supernatants of co-cultures of macrophages and HuR k/d or Ctr. spheroids revealed additional differences in chemokine secretion patterns. Interestingly, protein levels of many chemokines were elevated in co-cultures of HuR k/d spheroids compared to control co-cultures. Albeit enhanced chemokine secretion was observed, less monocytes are recruited into HuR k/d spheroids, further underlining the necessity of HuR in cancer related monocyte/macrophage attraction and infiltration. Differences between chemokine profiles of mono- and co-cultured spheroids could be attributable to changes in spheroid-derived chemokines as a result of the crosstalk with the immune cells. Provided the chemokines originate from monocytes/macrophages, the different secretion patterns suggest that HuR contributes to the modulation of the functional phenotype of infiltrated macrophages, since the tumorenvironment is critically involved in the shaping of macrophage phenotypes. Regions of low-oxygen (hypoxia) represent another critical feature of tumors. Therefore, I next analyzed the impact of HuR on the hypoxic response. Loss of HuR attenuated hypoxia-inducible factor (HIF) 2α expression after exposure to hypoxia, while HIF-1α protein levels remained unaltered. Considering previous results of our group, showing that HIF-2α depletion (HIF-2α k/d) resulted in the enhanced expression of HIF-1α protein, I aimed to determine the involvement of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α protein in HIF-2α k/d cells. I could demonstrate that not only total HuR protein levels, but specifically cytoplasmic HuR was elevated in HIF-2α depleted cells pointing to enhanced HuR activity. Silencing HuR in HIF-2α deficient cells attenuated enhanced HIF-1α protein expression, thus confirming a direct role of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α. This as also reflected on HIF-1α target gene expression. I further investigated the mechanism underlying the compensatory HIF-1α expression in HIF-2α deficient cells. Analyzing HIF-1α mRNA expression, I excluded enhanced HIF1-α transcription and stability to account for elevated HIF-1α expression in HIF-2α k/d cells. HIF-1α promoter activity assays confirmed the mRNA data. Furthermore, HIF-1α protein half-life was not elevated in HIF-2α k/d cells compared to control cells, indicating that HIF-1α protein stability is not altered in HIF-2α k/d cells. Analysis of the association of HIF-1α with the translational machinery using polysomal fractionation finally revealed an increased istribution of HIF-1α mRNA in the heavier polysomal fractions in HIF-2α k/d cells compared to control cells. Since augmented ribosome occupancy is an indicator for more efficient translation, I propose enhanced HIF-1α translation as underlying principle of the compensatory increase in HIF-1α protein levels in HIF-2α k/d cells. In summary, my results demonstrate that HuR is critical for the development of cancer characteristics in HCC. Future work analyzing the impact of HuR on tumor-promoting inflammation, specifically macrophage attraction and activation could provide new trategies to inhibit macrophage-driven tumor progression. Furthermore, I provide evidence that HuR contributes to the hypoxic response by regulating the expression of HIF-1α and HIF-2α. Targeting single HIF-isoforms for tumor therapy should be carefully considered, because of their compensatory regulation when one α-subunit is depleted. Thus, therapeutic strategies targeting factors such as HuR that control both α-subunits and at the same time prevent compensation might be more promising.
Channelrhodopsin-2 (ChR2) is widely used for rapid photodepolarization of neurons, yet, as it requires high-intensity blue light for activation, it is not suited for long-term in vivo applications, e.g. for manipulations of behavior, or photoactivation of neurons during development. We used “slow” ChR2 variants with mutations in the C128 residue, that exhibit delayed off-kinetics and increased light sensitivity in Caenorhabditis elegans. Following a 1 s light pulse, we could photodepolarize neurons and muscles for minutes (and with repeated brief stimulation, up to days) with low-intensity light. Photoactivation of ChR2(C128S) in command interneurons elicited long-lasting alterations in locomotion. Finally, we could optically induce profound changes in animal development: Long-term photoactivation of ASJ neurons, which regulate larval growth, bypassed the constitutive entry into the “dauer” larval state in daf-11 mutants. These lack a guanylyl cyclase, which possibly renders ASJ neurons hyperpolarized. Furthermore, photostimulated ASJ neurons could acutely trigger dauer-exit. Thus, slow ChR2s can be employed to long-term photoactivate behavior and to trigger alternative animal development.
In Nervensystemen werden zahlreiche Informationen wahrgenommen und verarbeitet um ein adäquates Verhalten hervorzurufen. Für die Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge hierbei wurden verschiedene Methoden entwickelt, die eine gezielte Manipulation neuronaler Prozesse ermöglichen. Durch Analyse der resultierenden Effekte können dabei synaptische Proteine, einzelne Neuronen oder neuronale Netzwerke funktionell charakterisiert werden. Bisherige Ansätze verfügen jedoch nur über eine geringe zeitliche und räumliche Auflösung oder erlauben lediglich eine eingeschränkte Anwendung im frei beweglichen Tier.
Diese Nachteile können durch die heterologe Expression von lichtgesteuerten, mikrobiellen Rhodopsinen zur gezielten Manipulation des Membranpotentials umgangen werden. So induziert die Photoaktivierung des Kationenkanals Channelrhodopsin 2 (ChR2; (Nagel et al., Curr Biol 2005)) eine Depolarisation, während die Chloridpumpe Halorhodopsin (NpHR; (Zhang et al., Nature 2007)) für die Hyperpolarisation verwendet werden kann. Dabei ermöglichen die schnellen Kinetiken der Rhodopsine eine zeitlich präzise Steuerung des Membranpotentials. Durch Auswahl geeigneter Promotoren ist zudem oftmals eine zell spezifische Expression möglich. Dieser Ansatz wird daher allgemein als Optogenetik bezeichnet.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst konventionelle Techniken genutzt, um die Funktion von zwei assoziierten Proteinen eines Acetylcholin Rezeptors in C. elegans zu untersuchen. Des Weiteren wurden verschiedene Methoden für den Fadenwurm entwickelt und angewendet, die die Vorteile optogenetischer Techniken für die funktionelle Charakterisierung synaptischer Proteine und neuronaler Netzwerke nutzbar machen. Hierbei erlaubt die Transparenz von C. elegans die optogenetische Stimulation im lebenden Organismus unter nicht invasiven Bedingungen. Weitere Vorteile von C. elegans als neurobiologischem Modellorganismus liegen in seiner einfachen Handhabung (Hope, 1999) und der stereotypen Entwicklung seines Nervensystems mit bekannten anatomischen Ausprägungen (Sulston and Horvitz, Dev Biol 1977; Varshney et al., PLoS Comput Biol 2011; White et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1986). Durch ihre Häufigkeit und die experimentelle Zugänglichkeit wird hierbei die neuromuskuläre Synapse oftmals zur Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung genutzt (Von Stetina et al., Int Rev Neurobiol 2006). Durch pharmakologische (Lewis et al., Neuroscience 1980; McIntire et al., Nature 1993; Miller et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1996; Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) und elektrische Stimulation (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) können dabei Defekte der Transmission hervorgehoben werden, während Verhaltensexperimente oder elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme in Muskelzellen eine quantitative Analyse ermöglichen (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999).
Diese Methoden wurden für die funktionelle Charakterisierung von NRA 2 und NRA 4 verwendet, die beide als akzessorische Proteine zusammen mit dem Levamisol sensitiven Acetylcholin Rezeptor der Körperwandmuskelzellen aufgereinigt wurden (Gottschalk et al., EMBO J 2005). Dabei konnte gezeigt werden, dass NRA 2 und NRA 4 im Endoplasmatischen Retikulum (ER) der Muskelzellen einen Komplex bilden, der die Sensitivität von beiden nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren gegenüber verschiedenen cholinergen Agonisten verändert. In diesem Zusammenhang wurde auch nachgewiesen, dass die Oberflächenexpression einzelner Untereinheiten der beiden Rezeptoren durch NRA 2/4 beeinflusst wird. Diese Resultate legen die Vermutung nahe, dass beide Proteine die Zusammensetzung der Rezeptoren und somit ihre pharmakologischen Eigenschaften modulieren. Denkbar ist dabei eine regulatorische Funktion bei der Assemblierung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Rezeptor oder bei der Kontrolle des ER Austritts von Rezeptoren mit bestimmter Zusammensetzung. In dieser Hinsicht konnte jedoch keine Interaktion von NRA 2/4 mit der Notch Signalkaskade nachgewiesen werden, wie sie für die homologen Proteine nicalin und NOMO in Vertebraten gezeigt wurde (Haffner et al., J Biol Chem 2007; Haffner et al., EMBO J 2004).
Für die Untersuchung synaptischer Proteine durch optogenetische Techniken wurde ChR2(H134R) selektiv in cholinergen oder GABAergen Motorneuronen exprimiert, um die akute und lichtgesteuerte Freisetzung des jeweiligen Neurotransmitters zu ermöglichen. Die resultierende Stimulation bzw. Inhibition von Muskelzellen wurde hierbei durch elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme und durch Analyse von Kontraktionen respektive Relaxationen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Störungen der synaptischen Reizweiterleitung die Ausprägung und Dynamik dieser lichtinduzierten Effekte beeinflussen und dadurch charakterisiert werden können. So zeigten beispielsweise Mutanten von Synaptojanin und Endophilin nachlassende Effekte bei anhaltender oder wiederholter Stimulation, was durch die gestörte Regeneration synaptischer Vesikel erklärt werden kann (Harris et al., J Cell Biol 2000; Schuske et al., Neuron 2003; Verstreken et al., Neuron 2003).
Die hohe Sensitivität dieser Methode wurde im Nachfolgenden dazu verwendet, die Inhibition cholinerger Motorneuronen durch den metabotropen GABAB Rezeptor zu untersuchen, der in C. elegans aus den beiden Untereinheiten GBB 1 und GBB 2 gebildet wird (Dittman and Kaplan, J Neurosci 2008; Vashlishan et al., Neuron 2008). Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass diese heterosynaptische Inhibition verschiedene lokomotorische Verhaltensweisen der Tiere beeinflusst. Für die mechanistische Untersuchung wurden anschließend cholinerge Motorneuronen durch ChR2(H134R) photoaktiviert, während resultierende Kontraktionseffekte in Abhängigkeit von GBB 1/2 analysiert wurden. Um hierbei die Funktion von GBB 1/2 durch erhöhte GABA Konzentrationen hervorzuheben, wurden zusätzlich GABAerge Motorneuronen optogenetisch stimuliert oder die Wiederaufnahme von GABA aus dem synaptischen Spalt durch Mutation des Membran ständigen GABA Transporters blockiert. So konnte gezeigt werden, dass GBB 1/2 eine akute Inhibition der cholinergen Motorneuronen bewirken, was vermutlich für die Regulation von Bewegungsabläufen eine wichtige Rolle spielt. Die geringe Dynamik der GBB 1/2 induzierten Effekte deutet allerdings darauf hin, dass die synaptische Aktivität durch den metabotropen Rezeptor kaum nachhaltig moduliert wird.
In nachfolgenden Versuchen wurde die optogenetische Stimulation von Motorneuronen außerdem mit der elektronenmikroskopischen Analyse der präsynaptischen Feinstruktur kombiniert. Dadurch konnte die Dynamik der Exozytose und Endozytose synaptischer Vesikel (SV) in Abhängigkeit von neuronaler Aktivität untersucht werden. So wurde gezeigt, dass synaptische Vesikel nahe der aktiven Zone während einer 30 sekündigen Hyperstimulation nahezu komplett aufgebraucht waren. Die vollständige Regeneration der SV Pools benötigte anschließend etwa 12 Sekunden und erfolgte zunächst in der Peripherie der aktiven Zone, was auf eine laterale Heranführung der Vesikel schließen lässt. Nach etwa 20 Sekunden erholte sich ebenfalls die Wirksamkeit der Stimulation von Muskelzellen durch die Motorneuronen, was durch elektrophysiologische Messungen der photo induzierten post synaptischen Ströme gezeigt wurde. Während der Hyperstimulation bildeten sich außerdem große vesikuläre Strukturen, die sich anschließend nach etwa acht Sekunden wieder aufgelöst hatten. In Analogie zu vergleichbaren Experimenten in anderen Organismen liegt die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Zwischenprodukte der so genannten Bulk Phase Endozytose handelt, die das Clathrin abhängige Recycling von synaptischen Vesikeln bei starker neuronaler Aktivität ergänzt (Heuser and Reese, J Cell Biol 1973; Miller and Heuser, J Cell Biol 1984; Richards et al., Neuron 2000). Bemerkenswerterweise war der Abbau der vesikulären Strukturen in Synaptojanin und Endophilin defizienten Tieren stark verzögert. Denkbar ist, dass beide Proteine für die Synthese von synaptischen Vesikeln aus den vesikulären Zwischenprodukten der Bulk Phase Endozytose wichtig sind, analog zur ihrer Funktion bei der Clathrin abhängigen Endozytose an der Plasmamembran.
Durch die zielgerichtete Manipulation der Zellaktivität ermöglichen optogenetische Techniken außerdem die funktionelle Charakterisierung von Neuronen und neuronalen Netzwerken. Um die zelluläre Spezifität dieses Ansatzes zu erhöhen, wurde ein Tracking System entwickelt das die Position frei beweglicher Tiere in Echtzeit bestimmt und nachverfolgt. Dadurch konnte die Photoaktivierung optogenetischer Proteine auf definierte Bereiche der Fadenwürmer und somit auf ausgewählte Neuronen innerhalb der Expressionsmuster von verwendeten Promotoren eingeschränkt werden. Des Weiteren ermöglichte hierbei die Auswertung translatorischer Parameter die Analyse verschiedener lokomotorischer Merkmale wie Geschwindigkeit, Bewegungsbahn oder Ausprägung der Körperbiegungen. Dieses System wurde beispielhaft für die konzertierte Photoaktivierung durch ChR2(H134R) bzw. Photoinhibition durch MAC von zwei verschiedenen Gruppen von Neuronen angewendet, um die Integration mechanosensorischer Informationen durch Command Interneuronen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde zudem eine Rekombinase basierte Methode für optogenetische Proteine adaptiert, die die Transkription auf die zelluläre Schnittmenge von zwei verschiedenen Promotoren einschränkt und somit die Spezifität der Expression erhöht. Idealerweise kann dieser Ansatz außerdem mit der gezielten Photoaktivierung kombiniert werden, um die zelluläre Selektivität optogenetischer Anwendungen weiter zu verbessern.
Weiterhin ist die Anwendung optogenetischer Techniken bisher durch intrinsische Eigenschaften der verwendeten Rhodopsine auf die relativ kurzzeitige Manipulation des Membranpotentials von Zellen beschränkt. So benötigt ChR2 durch die schnelle Schließung seines offenen Kanals eine kontinuierliche Photoaktivierung, um eine andauernde Depolarisation hervorzurufen. Dies ist jedoch potentiell mit phototoxischen und – besonders bei C. elegans – phototaktischen Nebeneffekten verbunden. Deswegen wurden diverse Mutanten von ChR2 mit stark verlangsamter Inaktivierung (Berndt et al., Nat Neurosci 2009) für ihren Nutzen zur Langzeit Stimulation von erregbaren Zellen im Nematode getestet. Dabei wurde gezeigt, dass ChR2(C128S) durch einen kurzen Photostimulus mit vergleichsweise niedriger Intensität eine anhaltende Depolarisation über mehrere Minuten auslösen kann. Die wiederholte Stimulation in ASJ Neuronen ermöglichte zudem eine langzeitige Depolarisation über mehrere Tage, wodurch die genetisch veranlagte Entwicklung von Tieren manipuliert werden konnte. Durch gezielte Punktmutation konnten außerdem relevante Eigenschaften von ChR2(C128S) für die Langzeit Stimulation weiter verbessert werden.
Als weiteres optogenetisches Werkzeug wurde zudem die Photoaktivierbare Adenylatzyklase alpha (PACa) aus Euglena gracilis (Iseki et al., Nature 2002; Ntefidou et al., Plant Physiol 2003; Schroder-Lang et al., Nat Methods 2007) für die akute und lichtgetriebene Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP in C. elegans etabliert. Die Photoaktivierung von PACa in cholinergen Motorneuronen verstärkte dabei die Neurotransmitterfreisetzung und induzierte hyperlokomotorische Phänotypen, vergleichbar zu Mutanten mit erhöhten cAMP Konzentrationen.
Zusammengefasst wurden diverse optogenetische Techniken für C. elegans entwickelt und optimiert, die die zellspezifische und nicht invasive Manipulation des Membranpotentials beziehungsweise die Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP durch Licht im frei beweglichen Tier ermöglichen. Diese Methoden können zur gezielten Störung neuronaler Aktivität angewendet werden, um dadurch neurobiologische Fragestellungen im Fadenwurm zu untersuchen. Dies wurde beispielhaft für die Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung und die funktionelle Analyse neuronaler Netzwerke demonstriert. Denkbar ist außerdem, diese für C. elegans etablierten Methoden vergleichbar in anderen Modellorganismen anzuwenden. So sind die Fruchtfliege ebenso wie der Zebrafisch Embryo bereits für optogenetische Techniken erprobt (Arrenberg et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2009; Schroll et al., Curr Biol 2006). Für Säugetiere wie die Maus, die Ratte und den Makaken wurden zudem bereits Ansätze entwickelt, die die gezielte Photostimulation in lebenden und frei beweglichen Tieren ermöglichen (Han et al., Neuron 2009; Wentz et al., J Neural Eng 2011; Yizhar et al., Nature 2011; Zhang et al., Nat Rev Neurosci 2007).
Understanding the conformational sampling of translation-arrested ribosome nascent chain complexes is key to understand co-translational folding. Up to now, coupling of cysteine oxidation, disulfide bond formation and structure formation in nascent chains has remained elusive. Here, we investigate the eye-lens protein γB-crystallin in the ribosomal exit tunnel. Using mass spectrometry, theoretical simulations, dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state nuclear magnetic resonance and cryo-electron microscopy, we show that thiol groups of cysteine residues undergo S-glutathionylation and S-nitrosylation and form non-native disulfide bonds. Thus, covalent modification chemistry occurs already prior to nascent chain release as the ribosome exit tunnel provides sufficient space even for disulfide bond formation which can guide protein folding.