Biochemie und Chemie
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Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine entscheidende Rolle in der Generierung von Leukotrienen. Diese fungieren als wichtige proinflammatorische Mediatoren. Darüber hinaus ist die 5-LO anhand ihrer N-terminalen Domäne in der Lage mit verschiedenen Proteinen zu interagieren. Unter den Interaktionspartnern befindet sich Dicer, ein Enzym welches für den finalen Schritt der microRNA (miRNA)-Biosynthese verantwortlich ist. MiRNA sind kurze, nicht kodierende RNA Stränge mit einer typischen Länge von etwa 23 Nukleotiden, die an der posttranskriptionalen Regulierung der Proteinbiosynthese beteiligt sind.
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der 5-LO auf die miRNA-Prozessierung im zellulären Kontext zu untersuchen. Als Modellsystem wurde die MonoMac6 (MM6) Zelllinie ausgewählt. MM6-Zellen exprimieren im undifferenzierten Grundzustand nur geringe Mengen an 5-LO. Erst nach Differenzierung mittels transformierenden Wachstumsfaktors ß (TGFß) und Calcitriol kommt es zur Induktion der 5-LO Proteinbiosynthese. Darüber hinaus war es Basavarajappa et al. möglich die 5-LO-Expression in diesen Zellen mittels RNA-Interferenz stark herunter zu regulieren (Δ5-LO).
Um die Frage der Auswirkungen des 5-LO knockdowns auf die miRNA-Expression analysieren zu können, wurde ein Microarray in differenzierten Kontroll-und Δ5-LO-Zellen durchgeführt.Es wurden 37 miRNAs identifiziert deren Expression 5-LO abhängig ist. Dabei war das Niveau von 30 Vertretern in Abwesenheit der 5-LO erhöht, wohingegen die Expression von sieben miRNAs reduziert war. Unter diesen sieben herunter regulierten miRNAs befanden sich miR-99b-5p und miR-125a-5p, die einem gemeinsamen Cluster entstammen. Als Cluster wird eine Gruppe von miRNAs bezeichnet, die aus einem gemeinsamen primären Transkript (pri-miRNA) hervorgeht. Diese Eigenschaft führte zur Vermutung, dass bereits die Expression dieser pri-miRNA durch die 5-LO reguliert wird. Allerdings zeigte sichim Verlauf dieser Arbeit, dass die Expression der pri-miRNA 5-LO unabhängig verläuft. Im Gegensatz dazu wies die Zwischenstufe zwischen pri-miRNA und reifer miRNA eine reduzierte Expression in Δ5-LO Zellen auf. Für die Prozessierung dieser sogenannten precursor miRNAs (pre-miRNA) ist die Ribonuklease III Drosha verantwortlich, welche die pre-miRNA aus der jeweiligen pri-miRNAs chneidet. Das verringerte pre-miR-99b-und pre-miR-125a-Niveau ist daher ein Hinweis darauf, dass überDicerhinausmöglicherweise ebenfalls die Drosha Aktivität mittels 5-LO reguliert wird.
Des Weiteren wurde untersucht iniefern Leukotriene beziehungsweise 5-LO-Inhibitoren die Expression von miR-99b-5p und miR-125a-5p beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass das miRNA-Niveau unabhängig von der vorhandenen Leukotrien-Menge ist. Das 5-LO aktivierende Protein (FLAP) besitzt dahingegen einen mit der 5-LO vergleichbaren Einfluss auf die reife miRNA. FLAP ist ein weiterer Interaktionspartner der 5-LO und essentiell für die Leukotrien-Biosynthese in vivo. Anhand von Protein-Lokalisationsstudien mittels Immunofluoreszenz konnte gezeigt werden, dass FLAP außerdem in der Lage zu sein scheint die Relokalisation der 5-LO aus dem Zytoplasma in den Nukleus einzuschränken. Im Zytoplasma ist die 5-LO in der Lage mit Dicer zu interagieren. Daten bezüglich einer Interaktion zwischen Drosha und 5-LO im Zellkern liegen bisher nicht vor. Eine etwaige Interaktion könnte allerdings helfen die reduzierten pre-miRNA Spiegel in Abwesenheit der 5-LO zu erklären.
Im Laufe dieser Arbeit wurden weiterhin die Auswirkungen von proinflammatorischen Lipopolysacchariden (LPS) auf die Prozessierung von miR-99b-5p und miR-125a-5p analysiert. Ausschließlich in Anwesenheit von 5-LO zeigte sich eine differenzierungsunabhängig gesteigerte Biosynthese der pri-und der reifen miRNA. Allerdings konnte kein Einfluss von LPS auf die 5-LO-Lokalisation beziehungsweise Expression festgestellt werden. Aufgrund dessen sind weiterführende Studien, die den Zusammenhang zwischen LPS induzierter miR-99b-5p- beziehungsweise miR-125a-5p-Biosynthese und 5-LO herstellen, nötig.
Abschließend hat sich diese Arbeit mit den Zielgenen der durch 5-LO regulierten miRNAs auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von miR-99b-5p und miR-125a-5p die Freisetzung der beiden durch LPS stimulierten Zytokine Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) gesteigert ist. Interessanterweise besitzt TNFα einen stimulierenden Effekt auf die Leukotrien-Biosynthese. Allerdings konnte kein direkter Zusammenhang zwischen miR-99b-5p/miR-125a-5p Expression, TNFα und der 5-LO Aktivität hergestellt werden. Der Einsatz von miR-99b-5p-und miR-125a-5p-Inhibitoren zeigte keine Auswirkungen auf die Leukotrien-Biosynthese nach LPS Stimulation. Im Gegensatz dazu konnte in unstimulierten Zellen eine signifikante Aktivitätssteigerung in Abwesenheit von miR-125a-5p festgestellt werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass miR-125a-5p einen TNFα unabhängigen Einfluss auf die 5-LO Aktivität besitzt. In LPS stimulierten Zellen kommt es möglicherweise zu Überlagerungen dieses Effektes.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass 5-LO eine regulierende Funktion auf die Reifung der beiden miRNAs miR-99b-5p und miR-125a-5p aufweist. Dieser Effekt könnte einer direkten Interaktion zwischen 5-LO und Dicer zuzuschreiben sein. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulierung der Expression bestimmter miRNAs mittels 5-LO nicht auf deren kanonischer enzymatischer Aktivität beruht. Diese Ergebnisse schlagen eine neue Richtung der 5-LO-Forschung ein und können in Zukunft dazu beitragen 5-LO vermittelte Effekte besser charakterisieren zu können.
Lewis-azide Organoborverbindungen finden Verwendung als Anionensensoren und als (Co)katalysatoren in der Metallocen-vermittelten Olefinpolymerisation bzw. in elektrocyclischen Reaktionen. Mit Lewis-Basen, die sterisch anspruchsvolle Reste tragen, können sie keine stabilen Addukte ausbilden. Solche Systeme werden als „frustrierte Lewispaare“ (FLPs) bezeichnet. Diese zeigen eine besondere kooperative Reaktivität gegenüber kleinen Molekülen und haben sich insbesondere in der metallfreien Aktivierung molekularen Wasserstoffs bewährt. Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer kostengünstigen, ungefährlichen und einfachen Synthese von (C6F5)2BH („Piers' Boran“). Dieses stark elektrophile Reagenz wird in der FLP-Chemie eingesetzt und monohydroboriert selektiv terminale C≡C-Funktionen. Die literaturbekannten Darstellungsmethoden dieses Borans sind präparativ aufwendig oder erfordern kostspielige Startmaterialien. Die Hydrid-Abstraktion aus dem [(C6F5)2BH2]−-Anion, welches aus einer Eintopfreaktion zwischen BH3·SMe2, C6F5MgBr und ClSiMe3 erhalten wurde und je nach Aufarbeitung in der Zusammensetzung [Mg2(Et2O)3Br2Cl][(C6F5)2BH2] bzw. [Mg(Et2O)2][(C6F5)2BH2]2 kristallisiert, bietet eine Methode zur insitu-Präparation von Piers' Boran. Es kann mit terminalen Alkinen als Monohydroborierungsprodukt oder mit Dimethylsulfid als Lewis-Säure-Base-Addukt abgefangen werden (Abbildung 1). Zusätzlich sind sowohl das Salz [Mg2(Et2O)3Br2Cl][(C6F5)2BH2] als auch das Addukt (C6F5)2BH·SMe2 geeignete Präkursoren für die literaturbekannten FLPs I und II...Mit dem Ziel der Synthese eines Methylen-verbrückten Boran-Phosphans zur H2-Aktivierung wurde der Borinsäureester (C6F5)2BOEt mit dem Lithiumorganyl LiCH2PtBu2 umgesetzt. Dies lieferte nicht die Zielverbindung (C6F5)2BCH2PtBu2, sondern in sehr selektiver Reaktion das bicyclische Phosphoniumborat (EtO)(C6F5)B(CH2)(C6F4)PtBu2 ((III)OEt), welches mit HCl quantitativ zum Chlorid-Addukt (III)Cl reagiert (Abbildung 2). Dadurch wird am (chiralen) Borzentrum eine bessere Abgangsgruppe eingeführt und die luftund wasserstabile Spezies (III)OEt aktiviert. Der Fluorierungsgrad in (III)Cl kann durch Austausch des exocyclischen C6F5-Restes gegen eine Phenylgruppe oder durch eine F/H- bzw. F/tBu-Substitution am verbrückenden C6F4-Ring variiert werden. Nach Ersatz einer tBu-Funktion am Phosphoratom gegen eine Methylgruppe wurde ein zweites Chiralitätszentrum in das Molekülgerüst des Phosphoniumborats eingeführt. Mit Silbersalzen schwach koordinierender Anionen (AgA) reagiert (III)Cl quantitativ zu den entsprechenden Addukten (III)A (A = Acetat, Trifluoracetat, Nitrat, Tosylat, Triflat). Ungeladene Donoren (Do) verdrängen den Triflat-Rest in (III)OTf und führen zu den Salzen [(III)Do]+[OTf]− (Do = OPEt3, Pyridin, H2O)...Das freie Boran [III]+ existiert nur in Gegenwart des sehr schwach koordinierenden Anions [Al[OC(CF3)3]4]–. Mit einer Gutmann-Akzeptornummer (AN) von AN = 87.3 ist es eine stärkere Lewis-Säure als die ungeladene Verbindung (C6F5)3B (AN = 80.0). Auch die – im Vergleich zu (C6F5)3B·Do – kürzeren B–O/N-Bindungslängen in [(III)Do][OTf] (Do = OPEt3, Pyridin, H2O) bestätigen diese Beobachtung. Sowohl die freie Lewis-Säure [III]+ als auch ihr Triflat-Addukt (III)OTf katalysieren die Diels-Alder-Reaktion zwischen Cyclopentadien und 2,5-Dimethyl-,4-benzochinon. Die Reaktion läuft in Gegenwart von [III]+ schneller ab als in Anwesenheit von (III)OTf. Dennoch hat das Triflat-Addukt gegenüber [III]+ den Vorteil, dass im Laufe der Cycloaddition keine konkurrierende Polymerisation des Cyclopentadiens auftritt.
NMR spectroscopy is a potent method for the structural and biophysical characterization of RNAs. The application of NMR spectroscopy is restricted in RNA size and most often requires isotope‐labeled or even selectively labeled RNAs. Additionally, new NMR pulse sequences, such as the heteronuclear‐detected NMR experiments, are introduced. We herein provide detailed protocols for the preparation of isotope‐labeled RNA for NMR spectroscopy via in vitro transcription. This protocol covers all steps, from the preparation of DNA template to the transcription of milligram RNA quantities. Moreover, we present a protocol for a chemo‐enzymatic approach to introduce a single modified nucleotide at any position of any RNA. Regarding NMR methodology, we share protocols for the implementation of a suite of heteronuclear‐detected NMR experiments including 13C‐detected experiments for ribose assignment and amino groups, the CN‐spin filter heteronuclear single quantum coherence (HSQC) for imino groups and the 15N‐detected band‐selective excitation short transient transverse‐relaxation‐optimized spectroscopy (BEST‐TROSY) experiment.
Basic Protocol 1: Preparation of isotope‐labeled RNA samples with in vitro transcription using T7 RNAP, DEAE chromatography, and RP‐HPLC purification
Alternate Protocol 1: Purification of isotope‐labeled RNA from in vitro transcription with preparative PAGE
Alternate Protocol 2: Purification of isotope‐labeled RNA samples from in vitro transcription via centrifugal concentration
Support Protocol 1: Preparation of DNA template from plasmid
Support Protocol 2: Preparation of PCR DNA as template
Support Protocol 3: Preparation of T7 RNA Polymerase (T7 RNAP)
Support Protocol 4: Preparation of yeast inorganic pyrophosphatase (YIPP)
Basic Protocol 2: Preparation of site‐specific labeled RNAs using a chemo‐enzymatic synthesis
Support Protocol 5: Synthesis of modified nucleoside 3′,5′‐bisphosphates
Support Protocol 6: Preparation of T4 RNA Ligase 2
Support Protocol 7: Setup of NMR spectrometer for heteronuclear‐detected NMR experiments
Support Protocol 8: IPAP and DIPAP for homonuclear decoupling
Basic Protocol 3: 13C‐detected 3D (H)CC‐TOCSY, (H)CPC, and (H)CPC‐CCH‐TOCSY experiments for ribose assignment
Basic Protocol 4: 13C‐detected 2D CN‐spin filter HSQC experiment
Basic Protocol 5: 13C‐detected C(N)H‐HDQC experiment for the detection of amino groups
Support Protocol 9: 13C‐detected CN‐HSQC experiment for amino groups
Basic Protocol 6: 13C‐detected “amino”‐NOESY experiment
Basic Protocol 7: 15N‐detected BEST‐TROSY experiment
Highlights
• Cryo-EM structures of the yeast low-affinity phosphate importer ScPho90
• Complementary structures reveal insights into the substrate translocation mechanism
• Comparisons with homologous transporters highlight the conserved transport mechanism
• Regulation by the SPX domain is discussed
Summary
Phosphate homeostasis is essential for all living organisms. Low-affinity phosphate transporters are involved in phosphate import and regulation in a range of eukaryotic organisms. We have determined the structures of the Saccharomyces cerevisiae phosphate importer Pho90 by electron cryomicroscopy in two complementary states at 2.3 and 3.1 Å resolution. The symmetrical, outward-open structure in the presence of phosphate indicates bound substrate ions in the binding pocket. In the absence of phosphate, Pho90 assumes an asymmetric structure with one monomer facing inward and one monomer facing outward, providing insights into the transport mechanism. The Pho90 transport domain binds phosphate ions on one side of the membrane, then flips to the other side where the substrate is released. Together with functional experiments, these complementary structures illustrate the transport mechanism of eukaryotic low-affinity phosphate transporters.
Inorganic phosphate is one of the most abundant and essential nutrients in living organisms. It plays an indispensable role in energy metabolism and serves as a building block for major cellular components such as the backbones of DNA and RNA, headgroups of phospholipids and in posttranslational modifcations of many proteins. Disturbances in cellular phosphate homeostasis have a detrimental effect on the viability of cells. There- fore, both the import and export of phosphate is strictly regulated in eukaryotic cells. In the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae, the uptake of phosphate is carried out either by transporters with high affinity or by transporters with low affinity, depending on the cytosolic phosphate concentration. While structures are available for homologues of the high-affinity transporters, no structures of low-affinity transporters have been solved so far. Interestingly, only the low-affinity transporters have a regulatory SPX domain, which is found in various proteins involved in phosphate homeostasis.
In this work, structures of Pho90 from Saccharomyces cerevisiae, a low-affinity phosphate transporter, were solved by cryo-EM, providing insights into its transport mechanism. The dimeric structure resembles the structures of proteins of the divalent anion symporter superfamily (DASS) and of mammalian transporters of the solute carrier 13 (SLC13) family. The transmembrane domain of each protomer consists of 13 helical elements and can be subdivided into scaffold and transport domains. The structure of ScPho90 in the presence of phosphate shows the phosphate binding site within the transporter domain in an outward-open conformation with a bound phosphate ion and two sodium ions. In the absence of phosphate, an asymmetric dimer structure was determined, with one protomer adopting an inward-open conformation. While the dimer contact and the scaffold domain are identical in both conformations, the transport domain is rotated by about 30° and shifted by 11 Å towards the cytoplasmic side, leading to the accessibility of the binding pocket from the cytoplasm. Based on these findings and by comparison with known structures, a phosphate transport mechanism is proposed in the present work that involves substrate binding on the extracellular side, conformational change by a rigid-body motion of the transport domain, in an "elevator-like" motion, and substrate release into the cytoplasm. The regulatory SPX domain is not well resolved in the ScPho90 structures, so that no direct conclusions were drawn about its regulatory mechanism. The findings provide new insights into the function and mechanism of eukaryotic low-affinity phosphate transporters.
While eukaryotic cells express various phosphate import proteins, most eukaryotes have only a single highly conserved and essential phosphate exporter. These exporters show no sequence homology to other transporters of known structure, but also possess a regulatory SPX domain. In this work, the structural basis for eukaryotic phosphate export is investigated by elucidating the structures of the homologous phosphate exporters Syg1 from Saccharomyces cerevisiae and Xpr1 from Homo sapiens, using cryo-EM. The structures of ScSyg1 and HsXpr1 show a conserved homodimeric structure and the transmembrane part of each protomer consists of 10 TM helices. Helix TM1 establishes the dimer contact by means of a glycine zipper motif, which is a known oligomerization motif. Helices TM2-5 form a hydrophobic pocket that has density for a lipid molecule. Whether the lipid binding into the hydrophobic pocket has an allosteric effect on the phosphate export activity or only serves protein stabilization is not known. Helices TM5-10 form a six-helix bundle, which constitutes a putative phosphate translocation pathway in its center. This bundle is formed by the protein sequence annotated as EXS domain.
The respective phosphate translocation pathways of ScSyg1 and HsXpr1 show structural differences. While the translocation pathway in HsXpr1 is accessible from the cytoplasm, in ScSyg1 it is closed by a large loop of the SPX domain. Interestingly, this loop is not conserved in higher eukaryotes and is therefore not present in HsXpr1. Another difference are distinct conformations of helix TM9. In ScSyg1, TM9 adopts a kinked conformation, which results in the translocation pathway being open to the extracellular side. In contrast, TM9 adopts a straight conformation in HsXpr1, resulting in the placement of a highly conserved tryptophane residue in the middle of the translocation pathway. As a result, the translocation pathway in HsXpr1 is closed to the extracellular side.
Wie findet man einen neuen Wirkstoff? Die pharmazeutisch-chemische Forschung steht mit diesem Vorhaben vor einer scheinbar unlösbaren Aufgabe, denn der "chemische Raum" aller wirkstoffartigen Moleküle ist unvorstellbar groß. So wurde geschätzt, dass man prinzipiell aus 1060 bis 10100 verschiedenen Verbindungen die geeigneten Kandidaten auswählen kann. Zum Vergleich: Seit dem Urknall sollen "nur" etwa 10 hoch 18 Sekunden, etwa 14 Milliarden Jahre, vergangen sein. Dies bedeutet, dass der chemische Raum praktisch unendlich ist. Aus dieser Überlegung lassen sich zumindest zwei Schlussfolgerungen ziehen: Zum einen gibt es die begründete Hoffnung, dass ein Molekül mit der gewünschten Aktivität existiert, zum anderen stellt sich die Frage, wie diese unvorstellbar große Zahl chemischer Verbindungen systematisch durchmustert werden kann? Doch die Situation ist nicht so hoffnungslos, wie sie auf den ersten Blick erscheint. Dies zeigt die erfolgreiche Entwicklung immer neuer Medikamente. Das Forschungsgebiet der Chemieinformatik befasst sich mit der Entwicklung von intelligenten Lösungsansätzen, die Chemikern bei dieser Suche nach den "Nadeln im riesigen Heuhaufen" helfen können.
Eine Stiftungsprofessur ermöglicht die konzentrierte Forschung auf einem speziellen Fachgebiet und schafft den notwendigen Freiraum, Neues zu erproben. Insbesondere kann sie dazu dienen, Brücken zwischen Disziplinen zu errichten. Mit diesem Ziel wurde vor fünf Jahren die Beilstein-Stiftungsprofessur für Chemieinformatik an der Johann Wolfgang Goethe-Universität eingerichtet. Gefördert von dem in Frankfurt am Main ansässigen Beilstein-Institut zur Förderung der Chemischen Wissenschaften, wurde sie in enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Organische Chemie und Chemische Biologie unter der Federführung von Prof. Dr. Michael Göbel konzipiert. Nachdem die Förderperiode von fünf Jahren im März 2007 ausgelaufen war, ist die Stiftungsprofessur nahtlos in den ordentlichen Universitätsbetrieb übernommen worden. Dies gibt Anlass, ein Fazit zu ziehen.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
Zusammenfassung Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist mit 60% die am häufigsten auftretende Art der Demenz. Weltweit sind ca. 24 Mio. Menschen von der neurodegenerativen Krankheit betroffen, welche sich durch den Verlust der kognitiven Fähigkeiten auszeichnet. Es gibt zwei Ausprägungen der Demenz, zum einen die sporadische Verlaufsform, die bei Menschen in einem Alter ab 65 Jahren auftritt und zum anderen die familiäre Alzheimersche Krankheit (FAD), die schon weitaus jüngere Menschen betrifft und auf genetische Mutationen zurück zu führen ist. Beide Formen der Demenz zeigen den gleichen neuropathologische Phänotyp, der zur Ausbildung von extrazellulären Plaques und intrazellulären Neurofibrillen führt. Durch die Entstehung der Plaques und der Neurofibrillen werden die Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verringert und die Neuronen sterben ab. Für das Auftreten der FAD sind Mutationen in den Genen des Amyloid Vorläufer Proteins (APP, Substrat) sowie der Aspartatprotease Einheit des γ-Sekretase Komplexes, Presenilin 1 (PS1) oder Presenilin 2 (PS2), verantwortlich. Die γ-Sekretase ist ein membranständiger Komplex bestehend aus den vier Untereinheiten PS1 oder PS2, Nicastrin (Nct), Aph-1 und Pen-2. Um ausreichende Informationen über den γ-Sekretase Komplex bezüglich seiner Interaktionsflächen, seines Katalysemechanismus und seiner Substraterkennung zu erhalten, wäre es hilfreich seine 3 Dimensionale Struktur aufzuklären, wozu große Mengen der sauberen und homogenen Proteine benötigt werden. Die Herstellung von ausreichenden Proteinmengen stellt derzeit aber einen Engpass für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des γ-Sekretase Komplexes in-vitro dar. Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, which affects 24 million people worldwide. It is a neurodegenerative disorder, which occurs either in its most common form in people over 65 years or in the rare early-onset familial AD (FAD). Responsible for the autosomal dominant FAD are mutations in the genes encoding for the β-amyloid precursor protein (APP) and the two homologues integral membrane proteins Presenilin 1 (PS1) and Presenilin 2 (PS2). The two PSs are major but alternative components of the intramembrane aspartyl protease γ-secretase. Further components are the membrane proteins Nicastrin (Nct), Aph-1 and Pen-2. Production of sufficient amounts of protein samples is still the major bottleneck for the detailed functional and structural in-vitro characterization of the γ-secretase complex. Due to toxicity, stability and targeting problems, the overproduction of MPs in conventional in-vivo systems often has only limited success. Therefore, efficient expression protocols using the cell-free (CF) system were established in this work. After optimization, I was able to produce up to milligram amounts of the single proteins PS1 and PS2, the cleavage products PS1-NTF and PS1-CTF, and Pen-2. The in-vitro produced γ-secretase subunits were further characterized, concerning their purity, secondary fold, thermal stability and homogeneity. Highest purities with over 90% after affinity chromatography could be achieved for PS1-CTF and Pen-2. Reconstitution of PS1, PS1-NTF, PS1-CTF and Pen-2 into E. coli liposomes results in a homogeneously distribution, which gives evidence for a structural folding. This was confirmed by CD spectroscopy of PS1-CTF and Pen-2. The thermal stability of Pen-2 shows a transition at 68°C, whereas PS1-CTF is stable up to 95°C. Both proteins show in addition homogeneous elution profiles investigated by analytical SEC and exhibit a monomeric (Pen-2) or dimeric (PS1-CTF) character analyzed by blue native PAGE. Different methods were performed to get evidence about the assembly of the complex, like pull-down experiments, immunoprecipitation, co-expression of radioactive labeled subunits and titration assays by liquid-state NMR. First hints for an interaction of the CF synthesized proteins could be observed by co-expression. Supplemental, Pen-2 and CTF could be purified in sufficient amounts and to apparent homogeneity that allow structural approaches by X-ray crystallography and liquid-state NMR spectroscopy. First conditions for protein crystals were achieved for Pen-2 and structural investigations of PS1-CTF by liquid-state NMR could be performed after optimization of the expression-, purification- and detergent conditions.
LANGEVIN equations of the type dn× (t)/dtn+...+c × (t)=K (t) constitute the starting point of a phenomenological fluctuation theory of irreversible processes. These equations are not constructed from transport equations (as in the older theory), but via a generalized MASTER equation from phase space mechanics. The MARKOFF processes of first and higher order defined by the various LANGEVIN equations are studied by the prediction theory of stationary stochastic processes. Instead of the variation principle of the ONSAGEB–MACHLUP theory one has the minimization of the prediction error. The mean relaxation path and the entropy of the considered processes are calculated. It is shown that the entropy consists of one part which is given by the relaxation path and another which is determined by the prediction error.
Employing NMR spectroscopy, it is not only possible to calculate the three dimensional structures of single proteins, but also to study dynamics and conformational changes of protein-complexes. In fact that is an important aspect, since the protein function depends on dynamics and interactions with other molecules. Therefore the study of protein-protein interactions is of highest importance for a better understanding of biological processes. Based on NMR methods, in this thesis we were able to determine protein-protein interactions within the enterobacterial Rcs signalling complex which is regulated via a phosphorelay. Originally identified as regulator of capsule synthesis, the Rcs phosphorelay is now considered to be implicated in stress response caused by disturbances in the peptidoglycan layer. Beyond that the Rcs system is involved in multiplex transcriptional networks including cell division, motility, biofilm formation and virulence. Because of such global nature and its extraordinary structural organisation involving membrane integrated sensor proteins (RcsC, RcsD), coactivators (RcsF, RcsA) and a transcription factor (RcsB), the Rcs system is one of the most remarkable phosphorelays in the family of enterobacteriacaea. During the complex phosphotransfer the histidine phosphotransferase (HPt) domain of the intermediary RcsD protein mediates the phosphotransfer between RcsC and RcsB, and probably modulates the phosphorylation state of the response regulator RcsB. Therefore the present work has been focused on the interface between RcsD and RcsB in more detail. In the first part of the thesis a new domain within the RcsD protein has been identified and structurally analysed by liquid NMR spectroscopy. RcsD is an inner membrane bound hybrid sensor like-kinase composed of a periplasmic sensor domain and a cytoplasmic portion. The cytoplasmic part contains the histidine like-kinase (HK) domain and the histidine phosphotransferase (HPt) domain. By analysis of the secondary structure in more detail, it was shown here that the two domains are intermitted by an additional 13.3 kDa domain. Corresponding to the position of the ABL (α−β−loop) domain of RcsC, located C-terminal to the RcsC-HK domain, the new identified domain was named RcsD-ABL. The central structural element of RcsD-ABL is a β-sheet composed of six strands with a β1−β2−β3−β4−β6−β5 topology and surrounded by two α-helices α1 and α2. In the second part of the thesis, RcsD-ABL is identified as a binding domain for the response regulator RcsB by NMR titration experiments. Such a binding domain for a response regulator has so far only been described for the histidine kinase CheA. In reportergene assays with β-galactosidase and ONPG as substrate it was shown that overexpression of RcsD-ABL in high amounts inhibited binding of RcsB to its target promoter. The β-galactosidase activity was reduced by 80 % with respect to cells carrying no plasmid encoding RcsD-ABL. The mapping of the binding interface was successfully achieved by chemical shift perturbations, a fast mapping protocol and selective labelling. It was shown that the interaction between RcsD-ABL and RcsB takes place via a binding interface comprising mainly the two α-helices of RcsD-ABL and the α-helices α7, α8 and α10 in the effector domain of RcsB. In the third part of the thesis, the interaction of RcsB with RcsD-ABL was related to that with RcsD-HPt. Using NMR titration experiments and ITC measurements, a comparison of the binding constants (Kd) of RcsB interacting either with the isolated RcsD-ABL (2 PM) or the isolated RcsDHPt domain (40 PM) revealed a higher affinity of RcsD-ABL to RcsB. A conjugate of RcsD-ABL-HPt interacting with RcsB decreased the Kd in the one-site fitting mode to 10 PM. However, the two-site fitting mode applied for RcsD-ABL-HPt/RcsB interaction resulted in a Kd (RcsD-ABL) of 2 PM and a Kd (RcsD-HPt) of 8 PM, indicating that RcsD-ABL enhances the binding of RcsD-HPt to RcsB. In the last part of the thesis, it was partly possible together with the data obtained from NMR titration experiments, PRE measurements and a HADDOCK protocol to develop a geometrical model for the interaction of RcsD with RcsB. In this model the receiver domain of RcsB interacts with the RcsD-HPt domain and the RcsB effector domain interacts with the RcsD-ABL domain. These results lead to surprising insights on the regulation of phosphorelays, since normally the effector domain binds to DNA. Here the effector domain is recognized by the newly identified RcsD-ABL domain. Prospectively, further investigations of phosphorylation affects and mutational studies will be of great interest.
Background Olfactory receptors work at the interface between the chemical world of volatile molecules and the perception of scent in the brain. Their main purpose is to translate chemical space into information that can be processed by neural circuits. Assuming that these receptors have evolved to cope with this task, the analysis of their coding strategy promises to yield valuable insight in how to encode chemical information in an efficient way. Results We mimicked olfactory coding by modeling responses of primary olfactory neurons to small molecules using a large set of physicochemical molecular descriptors and artificial neural networks. We then tested these models by recording in vivo receptor neuron responses to a new set of odorants and successfully predicted the responses of five out of seven receptor neurons. Correlation coefficients ranged from 0.66 to 0.85, demonstrating the applicability of our approach for the analysis of olfactory receptor activation data. The molecular descriptors that are best-suited for response prediction vary for different receptor neurons, implying that each receptor neuron detects a different aspect of chemical space. Finally, we demonstrate that receptor responses themselves can be used as descriptors in a predictive model of neuron activation. Conclusions The chemical meaning of molecular descriptors helps understand structure-response relationships for olfactory receptors and their 'receptive fields'. Moreover, it is possible to predict receptor neuron activation from chemical structure using machine-learning techniques, although this is still complicated by a lack of training data.
Analysis of coding principles in the olfactory system and their application in cheminformatics
(2007)
Unser Geruchssinn vermittelt uns die Wahrnehmung der chemischen Welt. Im Laufe der Evolution haben sich in unserem olfaktorischen System Mechanismen entwickelt, die wahrscheinlich optimal auf die Erfüllung dieser Aufgabe angepasst sind. Die Analyse dieser Verarbeitungsstrategien verspricht Einblicke in effiziente Algorithmen für die Kodierung und Verarbeitung chemischer Information, deren Entwicklung und Anwendung dem Kern der Chemieinformatik entspricht. In dieser Arbeit nähern wir uns der Entschlüsselung dieser Mechanismen durch die rechnerische Modellierung von funktionellen Einheiten des olfaktorischen Systems. Hierbei verfolgten wir einen interdisziplinären Ansatz, der die Gebiete der Chemie, der Neurobiologie und des maschinellen Lernens mit einbezieht.
Für verschiedene gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der HIV-Infektion oder anderer erworbener oder angeborener Krankheiten wie z. B. der angeborenen Immunschwäche SCID ist ein hocheffizienter Gentransfer in CD4-positive T- Lymphozyten erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurden daher geeignete retrovirale Pseudotypvektoren weiterentwickelt. Unter Einsatz von Markergenen wurden Methoden der Transduktion primärer humaner Lymphozyten optimiert. Schließlich wurden verschiedene potentielle therapeutische anti-HIV-Gene durch retroviralen Gentransfer in humane T-Zelllinien übertragen und hinsichtlich der Hemmung der in-vitro Replikation verschiedener HIV-Stämme verglichen. Zunächst wurden stabile Verpackungszelllinien zur Herstellung von [MLV(HIV-1)]- und [MLV(GaLV)]-Pseudotypvektoren entwickelt, die ein für die Analyse der Transduktionseffizienz geeignetes Markergen übertragen. [MLV(HIV-1)]-Vektoren konnten mit Titern bis zu 2 x 10 hoch 5 i.E. / ml hergestellt werden. Die Optimierung der Kultivierung primärer humaner T-Lymphozyten vor dem ex- vivo Gentransfer ergab, dass eine 24-stündige PHA/IL-2 Stimulation mit anschließender 48-stündiger Kultivierung in IL-2 Medium optimal für die Transduktion primärer CD4-positiver T-Lymphozyten unter weitgehender Erhaltung des Expressionsmusters der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 ist. Bei längerer Stimulation mit PHA und IL-2 verändert sich sowohl das CD4/CD8-Verhältnis als auch die CCR5-Expression gegenüber nativem Blut signifikant. Die Analyse der Expression des übertragenen Markergens und anderen Oberflächenmarkern der Zellen nach der Transduktion zeigte eine strikte Abhängigkeit der Transduktion der [MLV(HIV-1)]-Vektoren vom HIV-Rezeptor CD4, während herkömmliche [MLV(GaLV)]-Vektoren sowohl CD4-positive als auch CD4-negative Zellen transduzierten. Die Effizienz von [MLV(HIV-1CXCR4)]- Vektoren für CD4-positive Zellen war signifikant höher als die der [MLV(GaLV)]-Vektoren, während die Transduktionseffizienz der [MLV(HIV-1CCR5)]-Vektoren aufgrund der geringen Anzahl CCR5-positiver CD4-T-Zellen am niedrigsten war. Zwei Tage nach der Transduktion wurde eine reduzierte Korezeptorexpression in den Zellen nachgewiesen. Gründe hierfür könnten die Internalisierung der Korezeptoren nach der Transduktion oder eine durch die Kultivierung der Zellen bedingte Änderung der Expression sein. Nach weiterer Optimierung des retroviralen Gentransferprotokolls, u.a. durch Verwendung autologen Plasmas, konnten schließlich bei einmaliger Transduktion mit einer m.o.i. von 5 mit den [MLV(HIV-1CXCR4)]-Vektoren Transduktionsraten von bis zu 80 % erreicht werden. Zum Vergleich der Wirkung potentieller anti-HIV-Gene, die mit den neuen Vektoren in der Gentherapie des Immunschwächesyndroms AIDS eingesetzt werden könnten, wurden fünf verschiedene HIV-Inhibitoren (zwei intrazellulär exprimierte Antikörperfragmente (scFv) gegen HIV-1 Integrase und Reverse Transkriptase, zwei Ribozyme, die die HIV-1 RNA in der 5´-LTR oder im Pol- Leserahmen spezifisch spalten, sowie Interleukin-16) in den gleichen Transfervektor kloniert und durch retroviralen Gentransfer in die T-Zelllinie SupT1 übertragen. In Infektionsversuchen mit zwei unterschiedlichen HIV-1 Stämmen vermittelte jedoch keiner der potentiellen Inhibitoren eine signifikante Resistenz gegenüber HIV-1. Erst nach Sortierung der Kulturen auf starke Expression der übertragenen Gene konnte in den sortierten Zellen eine geringe Hemmwirkung des 5´-LTR-spezifischen Ribozyms auf die in-vitro Replikation des Stammes HIV-1IIIB, nicht jedoch auf die des Stammes HIV-1NL4-3 gezeigt werden. Die Signifikanz dieser Beobachtung muß über den Vergleich der Hemmwirkung weiterer Inhibitorgene geklärt werden.
Optogenetic approaches using light-activated proteins like Channelrhodopsin-2 (ChR2) enable investigating the function of populations of neurons in live Caenorhabditis elegans (and other) animals, as ChR2 expression can be targeted to these cells using specific promoters. Sub-populations of these neurons, or even single cells, can be further addressed by restricting the illumination to the cell of interest. However, this is technically demanding, particularly in free moving animals. Thus, it would be helpful if expression of ChR2 could be restricted to single neurons or neuron pairs, as even wide-field illumination would photostimulate only this particular cell. To this end we adopted the use of Cre or FLP recombinases and conditional ChR2 expression at the intersection of two promoter expression domains, i.e. in the cell of interest only. Success of this method depends on precise knowledge of the individual promoters' expression patterns and on relative expression levels of recombinase and ChR2. A bicistronic expression cassette with GFP helps to identify the correct expression pattern. Here we show specific expression in the AVA reverse command neurons and the aversive polymodal sensory ASH neurons. This approach shall enable to generate strains for optogenetic manipulation of each of the 302 C. elegans neurons. This may eventually allow to model the C. elegans nervous system in its entirety, based on functional data for each neuron.