Biochemie und Chemie
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Employing NMR spectroscopy, it is not only possible to calculate the three dimensional structures of single proteins, but also to study dynamics and conformational changes of protein-complexes. In fact that is an important aspect, since the protein function depends on dynamics and interactions with other molecules. Therefore the study of protein-protein interactions is of highest importance for a better understanding of biological processes. Based on NMR methods, in this thesis we were able to determine protein-protein interactions within the enterobacterial Rcs signalling complex which is regulated via a phosphorelay. Originally identified as regulator of capsule synthesis, the Rcs phosphorelay is now considered to be implicated in stress response caused by disturbances in the peptidoglycan layer. Beyond that the Rcs system is involved in multiplex transcriptional networks including cell division, motility, biofilm formation and virulence. Because of such global nature and its extraordinary structural organisation involving membrane integrated sensor proteins (RcsC, RcsD), coactivators (RcsF, RcsA) and a transcription factor (RcsB), the Rcs system is one of the most remarkable phosphorelays in the family of enterobacteriacaea. During the complex phosphotransfer the histidine phosphotransferase (HPt) domain of the intermediary RcsD protein mediates the phosphotransfer between RcsC and RcsB, and probably modulates the phosphorylation state of the response regulator RcsB. Therefore the present work has been focused on the interface between RcsD and RcsB in more detail. In the first part of the thesis a new domain within the RcsD protein has been identified and structurally analysed by liquid NMR spectroscopy. RcsD is an inner membrane bound hybrid sensor like-kinase composed of a periplasmic sensor domain and a cytoplasmic portion. The cytoplasmic part contains the histidine like-kinase (HK) domain and the histidine phosphotransferase (HPt) domain. By analysis of the secondary structure in more detail, it was shown here that the two domains are intermitted by an additional 13.3 kDa domain. Corresponding to the position of the ABL (α−β−loop) domain of RcsC, located C-terminal to the RcsC-HK domain, the new identified domain was named RcsD-ABL. The central structural element of RcsD-ABL is a β-sheet composed of six strands with a β1−β2−β3−β4−β6−β5 topology and surrounded by two α-helices α1 and α2. In the second part of the thesis, RcsD-ABL is identified as a binding domain for the response regulator RcsB by NMR titration experiments. Such a binding domain for a response regulator has so far only been described for the histidine kinase CheA. In reportergene assays with β-galactosidase and ONPG as substrate it was shown that overexpression of RcsD-ABL in high amounts inhibited binding of RcsB to its target promoter. The β-galactosidase activity was reduced by 80 % with respect to cells carrying no plasmid encoding RcsD-ABL. The mapping of the binding interface was successfully achieved by chemical shift perturbations, a fast mapping protocol and selective labelling. It was shown that the interaction between RcsD-ABL and RcsB takes place via a binding interface comprising mainly the two α-helices of RcsD-ABL and the α-helices α7, α8 and α10 in the effector domain of RcsB. In the third part of the thesis, the interaction of RcsB with RcsD-ABL was related to that with RcsD-HPt. Using NMR titration experiments and ITC measurements, a comparison of the binding constants (Kd) of RcsB interacting either with the isolated RcsD-ABL (2 PM) or the isolated RcsDHPt domain (40 PM) revealed a higher affinity of RcsD-ABL to RcsB. A conjugate of RcsD-ABL-HPt interacting with RcsB decreased the Kd in the one-site fitting mode to 10 PM. However, the two-site fitting mode applied for RcsD-ABL-HPt/RcsB interaction resulted in a Kd (RcsD-ABL) of 2 PM and a Kd (RcsD-HPt) of 8 PM, indicating that RcsD-ABL enhances the binding of RcsD-HPt to RcsB. In the last part of the thesis, it was partly possible together with the data obtained from NMR titration experiments, PRE measurements and a HADDOCK protocol to develop a geometrical model for the interaction of RcsD with RcsB. In this model the receiver domain of RcsB interacts with the RcsD-HPt domain and the RcsB effector domain interacts with the RcsD-ABL domain. These results lead to surprising insights on the regulation of phosphorelays, since normally the effector domain binds to DNA. Here the effector domain is recognized by the newly identified RcsD-ABL domain. Prospectively, further investigations of phosphorylation affects and mutational studies will be of great interest.
Background Olfactory receptors work at the interface between the chemical world of volatile molecules and the perception of scent in the brain. Their main purpose is to translate chemical space into information that can be processed by neural circuits. Assuming that these receptors have evolved to cope with this task, the analysis of their coding strategy promises to yield valuable insight in how to encode chemical information in an efficient way. Results We mimicked olfactory coding by modeling responses of primary olfactory neurons to small molecules using a large set of physicochemical molecular descriptors and artificial neural networks. We then tested these models by recording in vivo receptor neuron responses to a new set of odorants and successfully predicted the responses of five out of seven receptor neurons. Correlation coefficients ranged from 0.66 to 0.85, demonstrating the applicability of our approach for the analysis of olfactory receptor activation data. The molecular descriptors that are best-suited for response prediction vary for different receptor neurons, implying that each receptor neuron detects a different aspect of chemical space. Finally, we demonstrate that receptor responses themselves can be used as descriptors in a predictive model of neuron activation. Conclusions The chemical meaning of molecular descriptors helps understand structure-response relationships for olfactory receptors and their 'receptive fields'. Moreover, it is possible to predict receptor neuron activation from chemical structure using machine-learning techniques, although this is still complicated by a lack of training data.
Analysis of coding principles in the olfactory system and their application in cheminformatics
(2007)
Unser Geruchssinn vermittelt uns die Wahrnehmung der chemischen Welt. Im Laufe der Evolution haben sich in unserem olfaktorischen System Mechanismen entwickelt, die wahrscheinlich optimal auf die Erfüllung dieser Aufgabe angepasst sind. Die Analyse dieser Verarbeitungsstrategien verspricht Einblicke in effiziente Algorithmen für die Kodierung und Verarbeitung chemischer Information, deren Entwicklung und Anwendung dem Kern der Chemieinformatik entspricht. In dieser Arbeit nähern wir uns der Entschlüsselung dieser Mechanismen durch die rechnerische Modellierung von funktionellen Einheiten des olfaktorischen Systems. Hierbei verfolgten wir einen interdisziplinären Ansatz, der die Gebiete der Chemie, der Neurobiologie und des maschinellen Lernens mit einbezieht.
Für verschiedene gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der HIV-Infektion oder anderer erworbener oder angeborener Krankheiten wie z. B. der angeborenen Immunschwäche SCID ist ein hocheffizienter Gentransfer in CD4-positive T- Lymphozyten erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurden daher geeignete retrovirale Pseudotypvektoren weiterentwickelt. Unter Einsatz von Markergenen wurden Methoden der Transduktion primärer humaner Lymphozyten optimiert. Schließlich wurden verschiedene potentielle therapeutische anti-HIV-Gene durch retroviralen Gentransfer in humane T-Zelllinien übertragen und hinsichtlich der Hemmung der in-vitro Replikation verschiedener HIV-Stämme verglichen. Zunächst wurden stabile Verpackungszelllinien zur Herstellung von [MLV(HIV-1)]- und [MLV(GaLV)]-Pseudotypvektoren entwickelt, die ein für die Analyse der Transduktionseffizienz geeignetes Markergen übertragen. [MLV(HIV-1)]-Vektoren konnten mit Titern bis zu 2 x 10 hoch 5 i.E. / ml hergestellt werden. Die Optimierung der Kultivierung primärer humaner T-Lymphozyten vor dem ex- vivo Gentransfer ergab, dass eine 24-stündige PHA/IL-2 Stimulation mit anschließender 48-stündiger Kultivierung in IL-2 Medium optimal für die Transduktion primärer CD4-positiver T-Lymphozyten unter weitgehender Erhaltung des Expressionsmusters der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 ist. Bei längerer Stimulation mit PHA und IL-2 verändert sich sowohl das CD4/CD8-Verhältnis als auch die CCR5-Expression gegenüber nativem Blut signifikant. Die Analyse der Expression des übertragenen Markergens und anderen Oberflächenmarkern der Zellen nach der Transduktion zeigte eine strikte Abhängigkeit der Transduktion der [MLV(HIV-1)]-Vektoren vom HIV-Rezeptor CD4, während herkömmliche [MLV(GaLV)]-Vektoren sowohl CD4-positive als auch CD4-negative Zellen transduzierten. Die Effizienz von [MLV(HIV-1CXCR4)]- Vektoren für CD4-positive Zellen war signifikant höher als die der [MLV(GaLV)]-Vektoren, während die Transduktionseffizienz der [MLV(HIV-1CCR5)]-Vektoren aufgrund der geringen Anzahl CCR5-positiver CD4-T-Zellen am niedrigsten war. Zwei Tage nach der Transduktion wurde eine reduzierte Korezeptorexpression in den Zellen nachgewiesen. Gründe hierfür könnten die Internalisierung der Korezeptoren nach der Transduktion oder eine durch die Kultivierung der Zellen bedingte Änderung der Expression sein. Nach weiterer Optimierung des retroviralen Gentransferprotokolls, u.a. durch Verwendung autologen Plasmas, konnten schließlich bei einmaliger Transduktion mit einer m.o.i. von 5 mit den [MLV(HIV-1CXCR4)]-Vektoren Transduktionsraten von bis zu 80 % erreicht werden. Zum Vergleich der Wirkung potentieller anti-HIV-Gene, die mit den neuen Vektoren in der Gentherapie des Immunschwächesyndroms AIDS eingesetzt werden könnten, wurden fünf verschiedene HIV-Inhibitoren (zwei intrazellulär exprimierte Antikörperfragmente (scFv) gegen HIV-1 Integrase und Reverse Transkriptase, zwei Ribozyme, die die HIV-1 RNA in der 5´-LTR oder im Pol- Leserahmen spezifisch spalten, sowie Interleukin-16) in den gleichen Transfervektor kloniert und durch retroviralen Gentransfer in die T-Zelllinie SupT1 übertragen. In Infektionsversuchen mit zwei unterschiedlichen HIV-1 Stämmen vermittelte jedoch keiner der potentiellen Inhibitoren eine signifikante Resistenz gegenüber HIV-1. Erst nach Sortierung der Kulturen auf starke Expression der übertragenen Gene konnte in den sortierten Zellen eine geringe Hemmwirkung des 5´-LTR-spezifischen Ribozyms auf die in-vitro Replikation des Stammes HIV-1IIIB, nicht jedoch auf die des Stammes HIV-1NL4-3 gezeigt werden. Die Signifikanz dieser Beobachtung muß über den Vergleich der Hemmwirkung weiterer Inhibitorgene geklärt werden.
Optogenetic approaches using light-activated proteins like Channelrhodopsin-2 (ChR2) enable investigating the function of populations of neurons in live Caenorhabditis elegans (and other) animals, as ChR2 expression can be targeted to these cells using specific promoters. Sub-populations of these neurons, or even single cells, can be further addressed by restricting the illumination to the cell of interest. However, this is technically demanding, particularly in free moving animals. Thus, it would be helpful if expression of ChR2 could be restricted to single neurons or neuron pairs, as even wide-field illumination would photostimulate only this particular cell. To this end we adopted the use of Cre or FLP recombinases and conditional ChR2 expression at the intersection of two promoter expression domains, i.e. in the cell of interest only. Success of this method depends on precise knowledge of the individual promoters' expression patterns and on relative expression levels of recombinase and ChR2. A bicistronic expression cassette with GFP helps to identify the correct expression pattern. Here we show specific expression in the AVA reverse command neurons and the aversive polymodal sensory ASH neurons. This approach shall enable to generate strains for optogenetic manipulation of each of the 302 C. elegans neurons. This may eventually allow to model the C. elegans nervous system in its entirety, based on functional data for each neuron.
Habituation ist eine der einfachsten Formen des Gedächtnisses. Hierbei handelt es sich um die erlerne Gewöhnung an einen harmlosen Reiz. Dies bedeutet, dass nach mehrfacher wiederholter Repräsentation eines harmlosen Reizes die Reaktion darauf stetig abnimmt, bis sie völlig zum erliegen kommt. Je nach Trainingsprotokoll kann diese Gewöhnung bis zu mehren Tagen andauern. Habituation ist hoch konserviert und ein Verhaltensmuster, dass auch bei sehr einfachen vielzelligen Organismen zu finden ist und untersucht werden kann. Zur Untersuchung des Zusammenspiels innerhalb eines neuronalen Netzwerkes, welches für die Habituation des Rückzugsreflexes (Ausweichreaktion nach Berührung) verantwortlich ist wurde hier der Fadenwurm Caenohabditis elegans (C. elegans) als Modell Organismus verwendet. Aufgrund seines einfachen, nur 302 Zellen umfassenden, Nervensystems eignet sich C. elegans sehr gut für Grundlagenforschung in diesem Bereich. Das neuronale Netzwerk, das verantwortlich ist für den Rückzugsreflex ist in drei Ebenen organisiert. Wahrgenommen wird der Reiz von sensorischen Neuronen (ASH, ALM, AVM, PLM, PVM). Die Weiterleitung erfolgt über verschiedene Interneuronen (AVA, AVB, AD, AVE, PVC) hin zu den Motorneuronen, welche die Muskeln enervieren und somit die Reaktion auf den in erster Ebenen wahrgenommen Reiz auslösen.
Mit Hilfe von optogenetischen Werkzeugen wurde hier Untersucht welche Rolle einzelne Zellen innerhalb dieses Netzwerkes innehaben und an welcher Stelle innerhalb des Netzwerkes die kurzzeitige Habituation des Reizes, nach einem Einfachen Lernprotokoll stattfindet. Zuerst musste eine Möglichkeit gefunden werden die zur Verfügung stehenden optogenetischen Werkzeuge zellspezifisch zu exprimieren. In dieser Arbeit wurden hierfür Rekombinasesysteme verwendet, die es ermöglichten zur Expression eine Kombination aus 2 verschiedenen Promotoren zu verwenden. Beide Promotoren dürfen hierbei nur in einer Zelle, der Zielzelle, überlappen. Es konnte zellspezifische Expression des Kationenkanals Chanelrhodopsin 2 (ChR2) in den beiden Zellparen AVAL/R und ASHL/R (nimmt aversive Reize wahr) erreicht werden.
Zur Untersuchung der Habituation wurde zusätzlich noch ein Wurmstamm verwendet, welcher ChR2 unter dem mec-4 Promotor exprimiert. ChR2 ist hier in den Mechanorezeptorneuronen (MRN) ALM, AVM, PLM und PVM exprimiert. Die hier durchgeführten Experimente deuten darauf hin das den MRNs die Größte Rolle bei der Ausbildung einer Habituation zukommt. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass AVA zusätzlich eine Rolle spielt.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Rolle von AVA genauer untersucht. AVA gilt als der Hauptsignalgeber für eine Rückwärtsbewegung (spontan und nach Reizempfang). Es konnte gezeigt werden dass eine Unterbrechung der ’Gap Junktionen’ zwischen AVA und PVC eine stärkere Reaktion zur Folge haben. AVA scheint also durch PVC inhibiert zu werden. Ebenfalls mit AVA direkt interagierende Neuronen sind AVD und AVE. Mit den hier zur Verfügung stehenden Mitteln konnte die genaue Modulation von AVA durch diese Zellen jedoch nicht gezeigt werden.
In dieser Arbeit konnte der Grundstein für eine funktionale Aufklärung des Nervensystems von C. elegans gelegt werden. Vor allem durch die Möglichkeit der zellspezifischen Expression kann es zukünftig gelingen das Zusammenspiel der einzelnen Nervenzellen und ihren Anteil an einem bestimmtem Verhalten zu Untersuchen.
Misregulated receptor tyrosine kinases (RTKs), i.e. the epidermal growth factor receptor EGFR or the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R), can be involved in the development of cancer. Monoclonal antibodies specifically inhibit the RTKs in cancer therapy. The scope of this thesis is to investigate the molecular basis of the inhibition through the therapeutic antibodies matuzumab (EMD72000) against EGFR and EMD1159476 against IGF-1R. The 3D crystal structure of matuzumab in complex with the EGFR domain III shows an eptiope connected with a novel inhibition mechanism: a non-competitive, sterical inhibition of receptor acitivation. The anti-IGF-1R targeted monoclonal antibody EMD1159476 shows a reduced binding capacity to the receptor in the presence of ligand indicating a competitive inhibition mechanism. The epitope of EMD1159476 is within domain II of the receptor. The results of these molecular interaction studies are important for the clinical therapies with these monoclonal antibodies. The matuzumab-EGFR complex crystal structure shows that a simultaneous binding of matuzumab and cetuximab (Erbitux) is possible. The latter antibody is already in clinical use. A combination of several therapeutic antibodies in cancer treatment might show synergistic effects and benefits for the patients.
Expectation values of kinetic and potential energy are calculated for some lower antibonding orbital states of simple diatomic molecules using H2+ and HeH2+ as test cases. Common LCAO-MO theory and a scaling procedure are applied which allow an analysis of atomic orbital interactions in terms of RUEDENBERG'S1 promotion and interference effect at various internuclear distances. Contributions to the total energy at different regions of interatomic separations are discussed in detail. A characteristic increase of the kinetic energy is observed for antibonding linear combinations at distances where chemical bonding occurs.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
The photochemical cleavage of the endoperoxides of anthradichromene and benzodixanthene into the parent hydrocarbon and oxygen is shown to be an adiabatic photoreaction originating from an upper excited singlet state. This photochemical behaviour is described by a theory for the photochemistry of endoperoxides developed by Kearns and Khan.
The association of Schlen k’s hydrocarbon was studied by means of osmometric and magnetic measurements. The mixed chain-ring-association can be explained satisfactorily assuming that two different dimers and four monomer species participate in the equilibria, including a monomeric diamagnetic ring. The equilibria existing between the different species are discussed. For the equilibria between the monomer and dimer species, which can be detected in solutions of normal viscosity by means of ESR-measurements, the unexpected values of ΔH=0 for the enthalpie of association and ΔS= +19.7 e. u. for the entropie of association were found.
The thermal and the photochemical reactions of the endoperoxide of Tetrabenzo(bc,fg.lm,pq)- pentacene have been investigated with respect to its photochromic properties. The thermal yield of irreversible rearrangement reactions was determined to be Adec = 0.045. From the activation parameters of the thermal cycloreversion. forming the parent hydrocarbon and oxygen, a half life time of 114 years at 20 °C has been extrapolated. For the quantum yield of the irreversible photochemical rearrangement a value of Qdec = 0.03 was obtained. As can be seen from the wavelength dependence of the photocycloreversion quantum yield Q1, cycloreversion occurs not only from the thermalized S2(πccπ*cc) but from higher excited states too. The maximum quantum yield was found at 302 nm to be (Q1 = 0.15. From our results it follows that this endoperoxide is of high quality in respect to the colour change colourless/blue and to thermal stability, whereas the reversibility is only moderate.
Introduction: Immune paralysis with massive T-cell apoptosis is a central pathogenic event during sepsis and correlates with septic patient mortality. Previous observations implied a crucial role of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) during T-cell apoptosis.
Methods: To elucidate mechanisms of PPARγ-induced T-cell depletion, we used an endotoxin model as well as the caecal ligation and puncture sepsis model to imitate septic conditions in wild-type versus conditional PPARγ knockout (KO) mice.
Results: PPARγ KO mice showed a marked survival advantage compared with control mice. Their T cells were substantially protected against sepsis-induced death and showed a significantly higher expression of the pro-survival factor IL-2. Since PPARγ is described to repress nuclear factor of activated T cells (NFAT) transactivation and concomitant IL-2 expression, we propose inhibition of NFAT as the underlying mechanism allowing T-cell apoptosis. Corroborating our hypothesis, we observed up-regulation of the pro-apoptotic protein BIM and downregulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 in control mice, which are downstream effector proteins of IL-2 receptor signaling. Application of a neutralizing anti-IL-2 antibody reversed the pro-survival effect of PPARγ-deficient T cells and confirmed IL-2-dependent apoptosis during sepsis.
Conclusion: Apparently antagonizing PPARγ in T cells might improve their survival during sepsis, which concomitantly enhances defence mechanisms and possibly provokes an increased survival of septic patients.
Modelling protein structure seems a challenging enterprise because the number of structure parameters required ordinarily exceeds the amount of independent data points available from experimental observations. Expressing the predominant conformation of a protein in terms of a geometry model, a polypeptide chain consisting of N atoms would command 3N – 6 Cartesian coordinates be fixed. Even for small proteins, this becomes a daunting number. Fortunately, so-called holonomic constraints limit the number of variables, leaving substantially fewer, truly relevant parameters for folding the polypeptide chain into its native tertiary structure. For example, adjusting bond lengths and the many angles between the covalent bonds connecting the atoms is of little concern and appropriate standard values can be inserted from tableworks (Pople & Gordon, 1967; Engh & Huber, 1991, 2006). Table 1 exemplifies for the 147-residue protein Desulfovibrio vulgaris flavodoxin how the number of truly independent internal rotational degrees of freedom amounts to less than one-tenth of the Cartesian coordinate set size...
The triplet state of acridine orange dissolved in methanol/water matrix was investigated by ESR. In absence of oxygen a strong temperature dependence of the spectra was observed. At low temperature (100 °K) the zero-field splitting parameters calculated from the triplet spectrum are: X/hc = 0.0050 cm-1, Y/hc= 0.0342 cm-1, Z/hc=0.0387 cm-1 , at higher temperature (140 °K) : X*(hc=0.0056 cm-1, Y*/hc=0.0206 cm-1, Z*/hc = 0.0262 cm-1 . It was assumed that the low temperature spectrum is caused by isolated molecules in the triplet state while the high temperature spectrum must be attributed to the triplet exciton state of the acridine orange dimer. From the theory of the ESR triplet exciton spectra it can be shown that in the dimer state of acridine orange the molecular planes form an angle of 50° or 130°. However, it cannot be excluded that the dimer configuration differs in the ground or excited singlet state from the triplet state.
Der Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels ESIMS erfordert Analysebedingungen, die sich deutlich von den Bedingungen der etablierten Standard-ESIMS kovalent gebundener Biopolymere unterscheiden. Für die ESIMS-Analyse nichtkovalenter Komplexe ist insbesondere die Einschränkungen auf das Lösungsmittel Wasser mit Zusatz von Salzen oder Puffern problematisch, was den Nachweis vollständig desolvatisierter Analytionen unter Erhalt der häufig relativ schwachen nichtkovalenten Wechselwirkungen erschwert. Die Problematik für die massenspektrometrische Analyse nichtkovalenter Komplexe steht dabei in engem Zusammenhang mit dem Mechanismus der ElektrosprayIonisierung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, grundlegende Phänomene des ESIProzesses zu untersuchen und so ein besseres Verständnis der einzustellenden Randbedingungen beim ESImassenspektrometrischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe zu erlangen. Die Untersuchungen erfolgten dabei unter Verwendung geeigneter Modellsysteme, wie Salze, Kohlenhydrate, Peptide und ausgewählte nichtkovalente Komplexe. Eine wesentliche Bedeutung kam der Charakterisierung der physikalischen Randbedingungen der im Rahmen der vorliegenden Arbeit eingesetzten ESIMS-Systeme zu. Auf experimenteller und theoretischer Basis wurden die verschiedenen Aufbautypen im Eingangsbereich des oTOFMS-Systems MICKEY verglichen, wobei ein besonderes Augenmerk auf deren desolvatisierende Wirkung gelegt wurde. Es ließ sich zeigen, daß an diesem oTOFMS-System der Aufbau mit geheizter Transferkapillare dem Aufbau mit Stickstoffgegenstrom vorzuziehen ist, um eine effiziente Desolvatisierung von Analytionen in der ESI zu erzielen. Am oTOFMS-System MARINER wurde die Bedeutung des Drucks in der ersten Druckstufe für die Desolvatisierung von Analytionen am Beispiel ausgewählter nichtkovalenter Proteinkomplexe demonstriert. Dabei konnte gezeigt werden, daß eine Erhöhung des Drucks den Nachweis vollständig desolvatisierter, aber dennoch intakter nichtkovalenter Komplexe dramatisch begünstigt. Dies kann auf die mit der Druckerhöhung einhergehenden Veränderungen der Stoßbedingungen der Analytionen mit dem Restgas beim Passieren der ersten Druckstufe sowie auf die größere Verweilzeit der Ionen in diesem Bereich zurückgeführt werden. Als weitere Randbedingung für Untersuchungen an ESIoTOFMS-Systemen wurde zudem der Einfluß der Axialgeschwindigkeit der Ionen auf das Erreichen des Detektors auf der Grundlage theoretischer und experimenteller Befunde charakterisiert. Die Bedeutung der Axialgeschwindigkeit insbesondere für den Nachweis von Analytionen mit hohen m/zVerhältnissen konnte dabei am Beispiel des nichtkovalenten Komplexes Hämoglobin gezeigt werden. Ebenfalls wurden ausgewählte Phasen des ESIProzesses bei der Überführung gelöster Analyte in massenspektrometrisch detektierbare Gasphasenionen untersucht. So wurde der Einfluß der Zerstäubungsbedingungen auf das resultierende Ionensignal am Beispiel der diskontinuierlichen Zerstäubung von Analytlösung getestet. Künstlich induzierte Zerstäubungsimpulse an der Spraykapillare wurden mit den Extraktionsimpulsen des verwendeten oTOFMSSystems synchronisiert, was die gezielte Analyse einzelner Phasen der diskontinuierlichen Emission von Flüssigkeit ermöglicht. Mit Hilfe des Modellanalyts Bariumbromid ließ sich anhand charakteristischer Indikatorsignale in den Massenspektren auf qualitativer Basis zeigen, daß zu Beginn einzelner Sprayimpulse zunächst kleine Tröpfchen an der Spraykapillare emittiert werden und die Tröpfchengröße im zeitlichen Verlauf des Emissionsimpulses zunimmt. Dieser Befund steht im Einklang mit der von Juraschek [Jur97] vorgestellten Verteilung der Tröpfchengrößen während der diskontinuierlichen Zerstäubung unter den Bedingungen der ESIMS. Ferner konnte durch synchronisierte ESIoTOFAnalyse am Modellsystem einer ZuckerPeptidMischung gezeigt werden, daß Analyte mit höherer Aufenthaltswahrscheinlichkeit an der Flüssigkeitsoberfläche bevorzugt (d.h. zu früheren Zeitpunkten der diskontinuierlichen Zerstäubung) in die geladenen Initialtröpfchen gelangen. Analyte, welche eine höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit im Flüssigkeitsinneren aufweisen, gelangen mit geringerer Wahrscheinlichkeit und somit zu einem späteren Zeitpunkt eines Zerstäubungsimpulses in die Tröpfchen. Die vorgestellten Resultate stehen im Einklang mit den Modellvorstellungen zur Verteilung der Analyte beim für die Desolvatisierung relevanten unsymmetrischen Tropfenzerfall, die unter anderem die geringere Nachweiseffizienz hydrophiler Analyte zu erklären vermag. Der Einfluß des Lösungsmittels auf das resultierende Ionensignal wurde im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf seine Wirkung als chemische Umgebung des Analyten, auf seine Eigenschaften als Trägerkomponente des Analyten und auf seine Wirkung als Reaktionspartner der Analytionen in der Gasphase untersucht. Als Modellsystem diente der Analyt Bariumbromid in verschiedenen Alkoholen und AlkoholMischungen. Die Untersuchungen ergaben, daß insbesondere die Polarität des eingesetzten Lösungsmittels einen relevanten Aspekt für dessen Wirkung als chemische Umgebung des Modellanalyten darstellt. Eine hohe Polarität des eingesetzten Lösungsmittels begünstigt die Dissoziation des Analyten in Lösung und wirkt somit dem Nachweis von AnalytGegenionAddukten entgegen. Als maßgebliche Eigenschaft in der Rolle der Trägerkomponente ließ sich am Modellanalyt Bariumbromid die Verdampfbarkeit des Lösungsmittels identifizieren. Untersuchungen an einer Analytmischung aus Turanose und Octylglucosid ergaben ferner, daß ebenfalls ausgeprägte Wechselwirkungen zwischen Analyt und Lösungsmittelmolekülen der Verdampfung des Lösungsmittels entgegenwirken. Eine geringe Verdampfbarkeit des Lösungsmittels und eine starke Solvatisierung des Analyten erschweren somit die Desolvatisierung der Analytionen und haben geringe Analytsignalintensitäten in den Massenspektren zur Folge. Ebenfalls ist dem Einfluß der Leitfähigkeit der Analytlösung und somit der Polarität des Lösungsmittels auf die Intensität des resultierenden Ionensignals Rechnung zu tragen. Reaktionen in der Gasphase sind in den ausgewählten Modellsystemen im wesentlichen stoßinduzierte Elektronentransferreaktionen zwischen Lösungsmittel molekülen und zweiwertigen Metallkationen. Eine niedrige Ionisierungsenergie sowie ein hoher Energieeintrag während der Stoßaktivierung - und somit eine hohe Molekülmasse des Lösungsmittels - konnten dabei als begünstigende Faktoren für diese Reaktionen ermittelt werden. Die Resultate zum grundsätzlichen Einfluß des Lösungsmittels dienten als Basis zur Untersuchung des Lösungsmitteleinflusses auf die Bildung von Gramicidin DDimeren mit Hilfe der ESIMS. Am Beispiel dieser nichtkovalenten Peptidkomplexe konnte gezeigt werden, daß die resultierenden Massenspektren unter schonenden Desolvatisierungsbedingungen die Veränderungen des Dimerisierungsgleichgewichts bei Variation des Lösungsmittels widerspiegeln. Die verschiedenen Komponenten der Peptidmischung Gramicidin D bilden zudem in Lösung gemischte Dimere, deren Signale in den Massenspektren eine eindeutige Identifizierung auch geringer Mengen Dimere zulassen. Es ließ sich ferner zeigen, daß die Veränderung der Zusammensetzung von Lösungsmittelgemischen während der Desolvatisierung aus kinetischen Gründen keinen Einfluß auf den detektierbaren Anteil GramicidinDimere aufweist. Untersuchungen zur unspezifischen Adduktbildung in der ESIMS zwischen einem Analyten und weiteren Komponenten der Lösung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel verschiedener PeptidAnionenAddukte durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß insbesondere im negativen Ionenmodus eine ausgeprägte unspezifische Adduktbildung eintritt, während im positiven Ionenmodus nur in geringem Maße PeptidAnionenAddukte zu beobachten sind. MS 2 Untersuchungen der Addukte im negativen Ionenmodus ergaben, daß deren Dissoziation unter Abspaltung der zum Anion korrespondierenden Säure erfolgt, wobei in der Reihe der untersuchten Anionen die Stabilität des Addukts mit abnehmender Gasphasenbasizität des Anions zunimmt. Es konnte aber ferner gezeigt werden, daß neben der Gasphasenbasizität noch weitere Faktoren für die Adduktstabilität von Bedeutung sind; insbesondere sind in diesem Zusammenhang dem Einfluß von CoulombWechselwirkungen und räumlichen Faktoren im Addukt Rechnung zu tragen. Soll die Adduktbildung eines Analyten mit in der Lösung vorhandenen Anionen generell vermindert werden, so ist eine Analyse im positiven Ionenmodus vorzuziehen. Untersuchungen zur Stabilität spezifischer nichtkovalenter Komplexe in der ESIMS wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel der HämGlobinKomplexe von Hämoglobin und Myoglobin durchgeführt. Unter schonenden Desolvatisierungsbedingungen sind die in Lösung vorhandenen nichtkovalenten Komplexe ebenfalls in den ESIMassenspektren detektierbar. Durch vergleichende Untersuchungen im positiven und negativen Ionenmodus sowie durch Variation des Ladungszustands der HämGruppe ließ sich allerdings zeigen, daß die Stabilisierung dieser Komplexe in der ESIMS im wesentlichen auf CoulombWechselwirkungen zwischen Protein und prosthetischer Gruppe in der Gasphase beruht. Die Resultate demonstrieren deutlich, daß die in der ESIMS beobachtete Stabilität nichtkovalenter Komplexe in der Gasphase unter Umständen erheblich von der biologisch relevanten Stabilität dieser Spezies in Lösung abweicht. Zwar kann mit Hilfe der ESIMS die Stöchiometrie nichtkovalenter Komplexe zuverlässig ermittelt werden; zur Ermittlung ihrer Stabilität sind jedoch analytische Untersuchungen in kondensierter Phase prinzipiell vorzuziehen. Zum Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels ESIMS ist für jedes Instrument und jede neue analytische Fragestellung stets eine Optimierung der Analysebedingungen erforderlich. Die vorgestellten Resultate bestätigen anhand ausgewählter Beispiele, daß in Lösung vorhandene spezifische Komplexe intakt in Gasphasenionen überführt und massenspektrometrisch detektiert werden können, sofern die Analyseparameter sorgfältig angepaßt wurden. Dabei stellt der Energieeintrag in die Analytionen während der Desolvatisierung ebenso einen bedeutenden Parameter dar wie die Stabilität des nichtkovalenten Komplexes in der Gasphase, welche in einigen Fällen durch die Wahl des ''richtigen" Ionenmodus zur Analyse beeinflußt werden kann. Ein grundsätzliches ''Patentrezept" zum erfolgreichen massenspektrometrischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe kann jedoch nicht gegeben werden. Die Desolvatisierung von Analyten aus einem relativ schwer verdampfbaren Lösungsmittel, wie z.B. Wasser, ist problematisch, und die Freisetzung hydrophiler Analytionen wird durch die ausgeprägte Solvatisierung dieser Spezies erschwert. Um neben diesen unabänderlichen Schwierigkeiten weitere Probleme, wie die Bildung von Addukten, zu vermeiden, sollten für die ESIMSAnalyse möglichst saubere Proben Verwendung finden. Ist zur Stabilisierung des Komplexes in Lösung allerdings der Zusatz von Salzen erforderlich, so sollten unter anderem solche Anionen gewählt werden, die nur in geringem Maße Addukte bilden. Ferner ist im Hinblick auf eine Minimierung der Adduktbildung mit Anionen eine Untersuchung im positiven Ionenmodus vorzuziehen. Für die Weiterentwicklung der ESIMS zur Analyse nichtkovalenter Komplexe ist eine weitere Optimierung der grundsätzlichen Desolvatisierungsmöglichkeiten wünschenswert, welche eine schonende Desolvatisierung des Analyten unter Erhalt der spezifischen nicht kovalenten Wechselwirkungen ermöglichen. Ferner sind Methoden zu entwickeln, um Proben effizient und schnell zu reinigen, ohne die Proteinkomplexe irreversibel zu dissoziieren. Durch Entwicklungen dieser Art sollten erhebliche Fortschritte in der ESIMSAnalytik nichtkovalenter Komplexe möglich sein, die dem Ziel eines zuverlässige en Einsatzes dieser Methode in der Routineanalytik biologisch bedeutender Proben näherkommen.
Bioactive lipid mediators play a major role in regulating inflammatory processes. Herein, early pro-inflammatory phases are characterized and regulated by prostanoids and leukotrienes, whereas specialized pro-resolving mediators (SPM), including lipoxins, resolvins, protectins, and maresins, dominate during the resolution phase. While pro-inflammatory properties of prostanoids have been studied extensively, their impact on later phases of the inflammatory process has been attributed mainly to their ability to initiate the lipid-mediator class switch towards SPM. Yet, there is accumulating evidence that prostanoids directly contribute to the resolution of inflammation and return to homeostasis. In this mini review, we summarize the current knowledge of the resolution-regulatory properties of prostanoids and discuss potential implications for anti-inflammatory, prostanoid-targeted therapeutic interventions.
The formation and maintenance of a defined three-dimensional structure is a prerequisite for most proteins in order to fulfill their function in the native context. However, there are proteins, which are intrinsically unstructured and thus natively unfolded. In addition, the misfolding and aggregation of many proteins can lead to severe diseases. The investigation of non-native states of proteins significantly contributes to the understanding of protein folding and misfolding. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the only known technique that can provide information on structure and dynamics of non-native states of proteins at atomic resolution. Unfolded and non-native states of proteins have to be treated as ensembles of rapidly interconverting conformers and their observed properties are ensemble and time averaged. In this thesis, hen egg white lysozyme (HEWL) and mutants thereof have been investigated by NMR spectroscopy. The reduction of its four disulfide bridges and the successive methylation of the cysteine residues renders HEWL permanently non-native (‘HEWL-SMe’). Alternatively, the exchange of the eight cysteines for alanines results in very similar states (‘all-Ala-HEWL’). Under these conditions, HEWL-SMe and all-Ala-HEWL do not resemble random coil conformations, but exhibit residual secondary and tertiary structure. The presence of hydrophobic clusters and long-range interactions around the proteins six tryptophan residues and the modulation of these properties by single-point mutants has been observed. For the NMR spectroscopic investigation, HEWL has been isotopically labelled in E. coli by expression into inclusion bodies. After purification, the 1HN, 15NH, 13Calpha, 13Cbeta, 13C’, 1Halpha and 1Hbeta resonances of HEWL-SMe and all-Ala-HEWL have been assigned almost completely using three-dimensional NMR experiments. The analysis of secondary chemical shifts revealed regions in the proteins sequence — particularly around the six tryptophan residues—with significantly populated alpha-helix like conformations. In order to further elucidate the influence of the tryptophan side chains, a set of two new pulse sequences has been developed that allowed for the successful assignment of the 13Cg, 15Ne and 1HNe resonances in these side chains. This knowledge was eventually exploited in the interpretation of two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP spectra, which revealed a differential solvent accessibility of the tryptophan residues in all-Ala-HEWL but not in the single point mutant W62G-all-Ala-HEWL. In addition, heteronuclear R2 relaxation rates have been determined for the indole 15Ne nuclei of all-Ala-HEWL and W62G. While in the wild-type like all-Ala-HEWL, the rates are different among the six tryptophan residues, in W62G they are more uniform. Together with relaxation data from the amide backbone, these results indicate the significant destabilization of the hydrophobic clusters in the absence of W62. In contrast, in the W108G mutant the profile of the R2 relaxation rates was not found to be significantly altered. No evidence was found by R1rho relaxation rates and relaxation dispersion measurements for conformational exchange on slower (micro- to millisecond) timescales. Residual dipolar couplings have been determined for non-native HEWL in order to retrieve structural information of these states. The differences of the W62G and the wild-type like non-native HEWL is also picked up in NH-RDCs of these proteins aligned in polyacrylamide gels. Significant positive RDCs are observed in the regions of the hydrophobic clusters in all-Ala-HEWL, but to a much lesser degree in W62G. So far, all attempts to simulate RDCs from generated non-native ensembles failed even when including long-range contacts or specific phi/psi backbone angle propensities. However, the measured RDCs can be used to cross-validate structural ensembles of non-native HEWL generated by molecular dynamics simulations that are based on restraints from the other experimental data, such as the differential solvent accessibilities from the photo-CIDNP experiments and the data on the hydrophobic clustering gained from the combined mutational and relaxation studies. Finally, non-native HEWL has been investigated for the first time using two-dimensional NMR in organic solvents, which are able to induce secondary structures and ultimately lead to amyloid formation. Under these conditions severe line broadening was observed, which was attributed to exchange between different — mostly a-helical— conformations. In summary, in this thesis methods have been developed, optimized and successfully applied for the structural and dynamical characterization of non-native states of proteins and the effect of single-point mutants on the properties of such ensembles has been investigated. Data has been gained that can considerably contribute to the further elucidation of the nature of non-native states of HEWL by molecular dynamics simulations.
Die Kombination aus proteolytischer Spaltung, massenspektrometrischer Analyse und Datenbanksuche ist eine etablierte Methode zur Identifizierung von Proteinen. Ist die Identität eines Proteins geklärt, dann stellt sich im Anschluß daran häufig die Frage nach den posttranslationalen Modifikationen des Proteins. Auch hierfür ist die Massenspektrometrie eine prädestinierte und häufig angewandte Methode. Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen eukaryotischer Proteine ist die Phosphorylierung an Ser-, Thr- und Tyr-Resten. In der vorliegenden Arbeit ist die Weiterentwicklung und Anwendung zweier massenspektrornetrischer Methoden zur Analyse der Proteinphosphorylierung beschrieben: i) der Neutralverlust-Scan zur selektiven Detektion von Ser/Thr-phosphorylierten Peptiden, und ii) die Metallaffinitätschromatographie zur selektiven Anreicherung von Phosphopeptiden. Bei der Optimierung der Analytik der Proteinphosphorylierung mittels Neutralverlust-Scan hatte sich am Beispiel der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A gezeigt, dass die Verwendung einer Protease mit geringer Spaltungsspezifität (Elastase) wesentliche Vorteile gegenüber einer Protease mit hoher Spaltungsspezifität (Trypsin) besitzt. Die kleineren Elastase-generierten Phosphopeptide zeigen im Vergleich zu den Trypsin-generierten Phosphopeptiden eine effektivere Phosphorsäure-Abspaltung und lassen sich im Neutralverlust-Scan mit deutlich besserer Empfindlichkeit detektieren. in weiterer Vorteil der Elastase ist in ihrer Eigenschaft partiell überlappende Peptide zu generieren begründet. Die Metallaffinitätschrornatographie wurde eingesetzt, um die Elastase-generierten Phosphopeptide selektiv anzureichern. Es konnte gezeigt werden, dass die Metallaffinitätschromatographie eine geeignete Methode ist, um die Komplexität des Elastase-generierten Peptidgemischs drastisch zu reduzieren, so dass eine automatische Fragmentionen-Analyse aller angereicherten Peptide mittels nanoESl möglich ist. Die Leistungsfähigkeit der Kombination aus Elastase-Verdau, Metallaffinitätschromatographie und Q-TOF- Tandem-MS wurde am Beispiel des Transkriptionsinitiationsfaktors IA unter Beweis gestellt, wo mit Hilfe dieser Analysen-Strategie drei bislang unbekannte in-vivo-Phosphorylierungsstellen nachgewiesen werden konnten. Neben der Proteinphosphorylierung wurden in dieser Arbeit auch eine Reihe anderer kovalenter Modifikationen untersucht. Bei der Analyse der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A konnten neben einer bislang unbekannten fünften Phosphorylierungsstelle an Ser259 auch die Modifikation von Cys343 durch Glutathion und die N-terminale Modifikation durch Gluconsäure nachgewiesen werden. Mittels Q-TOF-Tandem-MS wurde die in-vivo-Myristoylierung des humanen Proteins GAPR 1 nachgewiesen. Mittels der sog Top-Down-Analyse wurde am Beispiel des Proteins Dynamin A gezeigt, wie mittels dieser Strategie eine vollständige Charakterisierung aller kovalenten Modifikationen eines Proteins erreicht werden kann. Im Falle von Dynamin A konnte die Acetylierung des N-terminalen Methionins nachgewiesen werden. Andere kovalente Modifikationen konnten ausgeschlossen werden. Im letzten Kapitel der vorliegenden Arbeit wird am Beispiel von Dynamin A gezeigt, wie sich die Kombination aus partieller proteolytischer Spaltung, Tandem-MS und Datenbanksuche effektiv zur Charakterisierung der Domänenstruktur von Proteinen einsetzen lässt.
The focus of this thesis has been to further advance and develop existing NMR techniques for the study of protein folding. In order to do so, experimental as well as theoretical approaches have been pursued. From the theoretical side, a successful attempt to the development of a general theory for the treatment of residual dipolar couplings in the case of unfolded proteins has been undertaken. Information contained in residual dipolar couplings is especially valuable due to its long-range nature. The dynamic character of unfolded states of proteins, which may be composed of distinct subsets of conformations, renders reliable interpretation of data a non-trivial task. Statistical-coil-based approaches have been shown to be powerful in data interpretation. A consistent theory based on fundamental polymer physics, however, had not been presented so far. The herein presented model addresses this problem building on the original work by Annila and co-workers. In this work, several shortcomings have been identified. These shortcomings have been corrected here leading to a general approach for the treatment of residual dipolar couplings of unfolded proteins. More specifically, it is shown that, in the case of fully unfolded proteins aligned by a steric mechanism, basic dependencies of dipolar couplings such as on chain length and location with in the chain can be analysed in simple analytical terms. The main predictions of the model are compared to experimental data showing reasonable agreement. The presented mathematical framework is principally suited for various improvements which could include the treatment of long-range interactions and of the actual geometry of the given aligment medium. From the experimental side, bovine alpha-lactalbumin has been chosen as a model system for the development of improved time-resolved 1D NMR methods aiming at the observation of conformational transitions by kinetic means. The presented results show that high-quality data can now be obtained at protein concentrations as low as 100uM. Rate constants characterising distinct conformational transitions of up to 8/s have been measured. These are the fastest rate constants which have been reported so far for protein folding events. The NMR data supplemented by complementary biophysical data furthermore demonstrate that the folding of bovine alpha-lactalbumin is more complex than has been anticipated. All data are consistent with a triangular folding mechanism involving parallel pathways of folding for formation of the native state of the protein. Interestingly, such a folding mechanism has also been found for the highly structurally homologous protein lysoyzme from hen egg white. Evidence is presented that the guiding role of long-range interactions in the unfolded state of lysoyzme for mediating intersubdomain interactions during folding is replaced in the case of bovine alpha-lactalbumin by the Ca2+ binding site.
Aging and age-related diseases are becoming more and more important for our society and our health care system. Alzheimer's disease (AD) is a disorder that destroys some parts of the brain and is characterized by global cognitive decline including a progressive irreversible loss of memory, orientation, and reasoning. “Healthy aging”, therefore, is one of the major aims for modern medicine. Apoptosis, or programmed cell death, plays an important role for example in fetal development, as well as for learning processes. T-lymphocytes usually undergo apoptosis in order to terminate an acute inflammation. The aim of this thesis was to explore the changes in the apoptotic mechanism of peripheral lymphocytes from Alzheimer’s disease (AD) patients in contrast to physiological aging. The experiments were conducted with lymphocytes of healthy volunteers of different ages, AD patients and young and aged mice. Moreover, transgenic mice carrying familiar AD-related mutations were examined. The aging study of peripheral cells of ‘healthy’-aged volunteers revealed an age-related increase of basal apoptosis. In addition, spontaneous apoptosis as well as apoptosis induced by oxidative stress (ROS) or by Fas engagement were enhanced in aging. A closer look at the subcellular basis of the lymphocytes (e.g. B-, NK-, CD4+-, and CD8+-T cells) determined that all lymphocyte subsets were affected by aging. Therefore, it could be concluded that the regulation of apoptosis is generally impaired in lymphocytes of aged persons. The increased susceptibility to oxidative stress supports the ‘Free radical theory of aging’ that claims the radicals to be the cause for the aging-process. In mice an increase of basal, spontaneous and ROS-induced apoptosis was detected in T cells from the spleen, as well. An oral treatment over two weeks with the Ginkgo biloba extract EGb761 showed a clear reduction of ROS-induced apoptosis in the treated group. Interestingly, basal and spontaneous apoptosis, e.g. physiological apoptosis, were not effected by the plant extract. This is an important benefit for therapy since physiological apoptosis has a great relevance in the elimination of cancer-cells for example. In conclusion, the antidementive drug EGb761 reduces specifically ROS-induced apoptosis that a plays an important role in aging as shown in this thesis. Based on the data found in healthy aging, lymphocytes from AD patients were assessed for apoptosis. The cells show enhanced levels of basal, spontaneous, and Fas-induced apoptosis. In subsequent experiments it was demonstrated that mainly the T cells were responsible for the findings. However, the NK-cells provided an important impact as well. In concordance with AD-affected neurons, peripheral lymphocytes of AD patients show clear signs of apoptotic cell death. In addition, basal apoptosis of T cells and the CD4/CD8-ratio showed a correlation with the severity of the dementia. Therefore, it could be speculated that apoptosis is due to activation-induced cell death (AICD) that occurs in acute and chronic activation of adaptive immunity. In AD there is a chronic neuroinflammation in the CNS triggering degeneration of neural tissue. In order to explore this, the experimental model of lymphocyte’s activation was established in healthy aging first. The study included the detection of various events of lymphocyte’s activation on the basis of the T cell subsets (CD4+ and CD8+). The inducibility to mitogenic stimulation clearly decreased in both subsets in aging. In contrast, T lymphocytes from AD patients showed an enhanced activation subsequent to mitogenic stimulation compared with age-matched nondemented persons. Only proliferation of CD8+ T cells was clearly reduced in AD. This data could be clues that an increased generation of memory T cells due to chronic neuroinflammation might be evident in AD. Memory T lymphocytes show increased inducibility upon mitogenic activation. Interestingly, CD8+ memory T cells display decreased prolifertive capacity. Due to activation, cells die by apoptosis later on. It could be concluded that AD patients display an increased amount of memory T cells compared to controls. The data implicate that there could be a cross talk between inflammatory within the brain and inflammatory cells of the periphery. This is an interesting point since the brain used to be assumed as immune-privileged zone. According to the experiment, the information of the diseased brain is transferred to white blood cells. The connection of those two compartments might raise the opportunity to observe and probably to influence easily not-accessible regions like the brain. Transgenic mice carrying mutations in familiar AD-relevant genes (Amyloid-Precursor-Protein, Presenilin-1, respectively) displayed enhanced levels of apoptotic T cells from the spleen, as well. It seems that those mutated proteins influence the regulation of apoptosis. Probably, they are involved in the increased cell death of T- and NK-cells, as well. Animals overexpressing Presenilin-1 showed reduced levels of apoptotic cell death. It was demonstrated with molecuar biology tools that Presenilin-1, processed during apoptosis, has an anti-apoptotic effect.
Biogenesis of mitochondrial cytochrome c oxidase (COX) is a complex process involving the coordinate expression and assembly of numerous subunits (SU) of dual genetic origin. Moreover, several auxiliary factors are required to recruit and insert the redox-active metal compounds, which in most cases are buried in their protein scaffold deep inside the membrane. Here we used a combination of gel electrophoresis and pull-down assay techniques in conjunction with immunostaining as well as complexome profiling to identify and analyze the composition of assembly intermediates in solubilized membranes of the bacterium Paracoccus denitrificans. Our results show that the central SUI passes through at least three intermediate complexes with distinct subunit and cofactor composition before formation of the holoenzyme and its subsequent integration into supercomplexes. We propose a model for COX biogenesis in which maturation of newly translated COX SUI is initially assisted by CtaG, a chaperone implicated in CuB site metallation, followed by the interaction with the heme chaperone Surf1c to populate the redox-active metal-heme centers in SUI. Only then the remaining smaller subunits are recruited to form the mature enzyme which ultimately associates with respiratory complexes I and III into supercomplexes.
The nuclear farnesoid X receptor (FXR) and the enzyme soluble epoxide hydrolase (sEH) are validated molecular targets to treat metabolic disorders such as non‐alcoholic steatohepatitis (NASH). Their simultaneous modulation in vivo has demonstrated a triad of anti‐NASH effects and thus may generate synergistic efficacy. Here we report dual FXR activators/sEH inhibitors derived from the anti‐asthma drug Zafirlukast. Systematic structural optimization of the scaffold has produced favorable dual potency on FXR and sEH while depleting the original cysteinyl leukotriene receptor antagonism of the lead drug. The resulting polypharmacological activity profile holds promise in the treatment of liver‐related metabolic diseases.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Elektronentransferprozesse in Pd-Komplexen 1,4-Chinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(2009)
PdII-katalysierte Oxidationsreaktionen organischer Verbindungen stellen wichtige synthetische Werkzeuge dar. Um das Übergangsmetall in katalytischen Mengen einsetzen zu können ist es nötig, das im Zuge der Substratumwandlung entstehende Pd0 seinerseits wieder zu reoxidieren. Im großtechnischen Wacker-Prozess setzt man zu diesem Zweck das Redoxsystem CuII/CuI ein, welches Elektronen von Pd0 aufnimmt und sie auf molekularen Sauerstoff überträgt, so dass als einziges Abfallprodukt Wasser entsteht. Da beim Einsatz von Kupfersalzen allerdings Probleme durch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können, stieß man auf der Suche nach alternativen Redox-Cokatalysatoren auf 1,4-Benzochinon. Man nimmt an, dass der Reoxidation von Pd0 eine Koordination des 1,4-Benzochinons an das Übergangsmetallatom vorausgeht. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit ein 1,4-Naphthochinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Ligand entwickelt, dessen Pd-Komplex das katalytisch aktive Übergangsmetallatom und den Redox-Cokatalysator in einem einzigen Molekül vereint. Eine direkte intra- und intermolekulare 1,4-Chinon/Pd-Koordination wird durch das Ligandendesign jedoch verhindert. Anhand dieses Modellsystems sollte dann untersucht werden, ob alternativ zu den etablierten mechanistischen Vorstellungen zum Ablauf des Elektronentransfers, eine durch den Raum verlaufende elektronische Kommunikation der beiden redoxaktiven Zentren möglich ist. Sollte das der Fall sein, wäre man künftig bei der Entwicklung und Optimierung solcher Hybridkatalysatoren nicht auf die Miteinbeziehung des 1,4-Chinons in die Koordinationssphäre des Übergangsmetallions angewiesen, sondern könnte diese ausschließlich an die koordinationschemischen Erfordernisse des Pd-Zentrums anpassen. Nachdem das Modellsystem zur Verfügung stand, galt es im ersten Schritt, die elektrochemischen Eigenschaften von freiem Ligand und PdII-Komplex mittels Cyclovoltammetrie zu bestimmen. Mit Kenntnis der Redoxpotentiale wurden daraufhin elektrochemisch selektiv reduzierte Spezies des Liganden bzw. seines PdII-Komplexes erzeugt und deren UV-vis-Spektren in situ aufgenommen. Letztere lieferten nötige Referenzwerte für die folgenden Experimente. Auf Grundlage dieser Vorarbeiten konnte nun die elektronische Kommunikation der redoxaktiven Zentren in dem Komplex untersucht werden. Da im Modellsystem zunächst beide redoxaktive Zentren in der oxidierten Form vorliegen, war es erforderlich, das PdII-Ion selektiv zu reduzieren, um dem System an der richtigen Stelle Elektronen zuzuführen. Als Reduktionsmittel wurde Triethylamin gewählt; entsprechende Vergleichsexperimente stellten zuvor sicher, dass dieses keine Nebenreaktionen mit dem Liganden selbst eingeht. Im Zuge der Reduktion des PdII-Zentrums ist eine Änderung der UV-vis-spektroskopischen Eigenschaften des Liganden zu beobachten. Ein Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzspektren der elektrochemisch erzeugten reduzierten Spezies legt den Schluss nahe, dass nach Überführung des PdII-Zentrums in die nullwertige Stufe der durch den Raum verlaufende Übergang eines Elektrons auf den 1,4-Naphthochinon-basierten Liganden erfolgt. Das hierbei entstehende 1,4-Naphthosemichinonradikal wurde zusätzlich ESR-spektroskopisch nachgewiesen.
The spectral properties of binary complexes of NAD-analogues and fragments therefrom with I.DH from pig heart or ADH from liver and yeast have been investigated. The NADH-analogues were modified by replacing adenine through benzimidazole, benzene or dihydronicotinamide. Additionally adenosine diphosphate ribose, dihydronicotinamide and dihydronicotinamide- ribose pyrophosphate-5"-ribose have been studied.
It has been shown by means of difference spectra that complexes between ADH from horse liver and analogues cause spectral changes in the region of aromatic absorption at 280 nm even when adenine is absent in the analogues. Spectral changes in the other enzymes mentioned are probably due to changes of the n-π* absorption of the adenine ring. The spectral changes upon complexing indicate hydrophobic interaction of the adenine with the enzyme protein. Fluorescence spectra vary in the intensity of the energy transfer band as well as in coenzyme emission depending on variation of the coenzym analogue. Changing of complex formation between protein and analogues at different pH-values are investigated. ADH from yeast, especially, shows a pK around 6 which suggests interaction with histidine imidazole.
Necroptosis is a programmed cell death pathway that is implicated in a variety of human diseases. In recent years, increasing knowledge has been gained on the necroptotic signaling cascade. Nevertheless, the role of reactive oxygen species (ROS) in necroptosis is still ambiguous. In this study, we reveal that ROS critically regulate BV6/TNFα-induced necroptotic signaling in FADD-deficient Jurkat cells and in zVAD-treated MV4-11 cells. We show that several ROS scavengers such as butylated hydroxyanisole (BHA), N-acetylcysteine (NAC), α-tocopherol (αToc) and ethyl pyruvate (EP) significantly reduce ROS production and BV6/TNFα–induced cell death. Importantly, ROS are produced prior to cell death induction and promote the assembly of the Receptor-interacting protein kinase (RIP)1/RIP3 necrosome complex via a potential positive feedback loop since on the one hand radical scavengers diminish RIP1/RIP3 necrosome formation and since on the other hand RIP1 or RIP3 silencing attenuates ROS production. Furthermore, the deubiquitinase CYLD contributes to BV6/TNFα-induced ROS generation, necrosome assembly and cell death since CYLD knockdown attenuates all these events. Of note, knockdown of the downstream effector protein mixed lineage kinase domain like (MLKL) only partly reduces BV6/TNFα-triggered ROS production and cell death and does not affect necrosome formation. Contrary to expectations, the MLKL inhibitor Necrosulfonamide (NSA) not only decreases BV6/TNFα-stimulated ROS production and cell death but also attenuates RIP1/RIP3 necrosome assembly pointing to additional and MLKL-independent anti-necroptotic effects of NSA. Interestingly, silencing of the potential necroptotic excecutors mitochondrial proteins phosphoglycerate mutase family member 5 (PGAM5) or Dynamin-related protein 1 (Drp1) does not affect BV6/TNFα-induced cell death. Consistently, mitochondrial perturbations are not implicated in BV6/TNFα-induced cell death since mitochondrial membrane potential and respiration remain stable along with to BV6/TNFα-triggered necroptosis induction. Interference with the mitochondrial potential by depolarizing agents such as FCCP reduces BV6/TNFα-induced necroptosis indicating that proper mitochondrial function or a well-defined redox status is required for necroptotic cell death execution. This study demonstrates that ROS are critically involved in BV6/TNFα-induced necroptosis and thus provides novel insights into the redox regulation of necroptotic signaling.
Der Einbau von Übergangsmetallionen in Polymerketten kann zu Materialien mit vielversprechenden optischen, elektronischen oder magnetischen Eigenschaften führen, wie sie auf der Basis konventioneller organischer Polymere nicht zu erzielen sind. Die für metallorganische Makromoleküle charakteristischen Eigenschaften resultieren vor allem aus der Vielfalt der Strukturtypen, die für Metallkomplexe auftreten, und in vielen Fällen aus kooperativen Effekten zwischen den Übergangsmetallzentren eines Polymerstranges. Gezieltes Materialdesign setzt daher neben einem grundlegenden Verständnis der Interaktion zwischen den Metallkomplexfragmenten die Fähigkeit voraus, diese durch geeignete Verknüpfungseinheiten so miteinander zu verbinden, dass Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Kooperative Phänomene lassen sich häufig bereits an kurzkettigen Oligomeren beobachten, die daher als Modellsysteme für die entsprechenden Polymere dienen. Vor diesem Hintergrund lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Synthese und Charakterisierung di- und trinuclearer Metallkomplexe. Darüber hinaus wurden aber auch entscheidende Fortschritte in Bezug auf die Synthese metallhaltiger Polymere auf der Basis ausgewählter Ferrocenderivate erzielt. Zur Darstellung der Zielverbindungen wurden sowohl etablierte Verknüpfungs-Konzepte genutzt als auch neue Syntheserouten entwickelt. Als wichtige Startverbindungen wurden die Ferrocenylborane FcBR2 und 1,1‘-fc(BR2)2 [Fc = (C5H5)Fe(C5H4), fc = Fe(C5H4)2, R = Br, H, CR‘3] eingesetzt, da sich deren Borylsubstituenten in vielfältiger Weise zur Verknüpfung der metallorganischen Bausteine nutzen lassen. Aufgrund der Lewis-sauren Eigenschaften der Borylsubstituenten können Ferrocenylborane mit difunktionellen organischen Lewis-Basen wie 4,4‘-Bipyridin oder Pyrazin zu Polymeren verknüpft werden. Um die Anzahl der Metallatome innerhalb derartiger Makromoleküle zu erhöhen, wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals metallorganische Lewis-Basen als Verknüpfungseinheiten eingesetzt. In dieser Hinsicht bieten sich 3,4-Dimethyl-1-phosphaferrocen und 3,3‘,4,4‘-Tetramethyl-1,1‘-diphosphaferrocen sowie Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen an, da in diesen Verbindungen das Lewis-basische Zentrum Bestandteil des Cyclopentadienylrings ist. Im Gegensatz zu Phosphaferrocenen bilden die starken Lewis-Basen Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen mit dem Ferrocenylboran FcBMe2 selbst in Lösung stabile Addukte (z. B. Fc2BMe2Li). Polymerisationsversuche mit den Edukten 1,1‘-(fcBMe2)2 und 1,1‘-Dilithioferrocen führen entgegen den Erwartungen jedoch nicht zu polymerem Material, sondern ergeben das borverbrückte [1.1]Ferrocenophan [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2. Die Struktur von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2 im festen Zustand weist als hervorstechendstes Merkmal ein nacktes Lithium-Ion auf, das sich im Zentrum des Käfigs befindet. Dieses supramolekulare Aggregat ist auch in Lösung beständig. Werden jedoch beide Ferroceneinheiten oxidiert, verlässt das Li+-Ion den Makrozyklus, um nach vollständiger Reduktion von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2] wieder an seinen ursprünglichen Platz zurückzukehren. Komplementär zum Verknüpfungskonzept über dative Bor-Stickstoff-, Bor-Phosphor- und Bor-Kohlenstoff-Bindungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kondensationsreaktion erarbeitet, die auf einfachem Wege zu kovalent verknüpften di- und oligonuclearen Ferrocenkomplexen führt. Bei der Umsetzung von FcBBr2 mit HSiEt3 beobachtet man eine Dimerisierungsreaktion, die unter Bildung von Fc2BBr verläuft. Einer entsprechenden Reaktion lässt sich auch 1,1‘-fc(BBr2)2 unterziehen, womit sich ein Weg zu Poly(ferrocenylenen) eröffnet, in denen die Ferroceneinheiten über dreifach koordiniertes Bar verknüpft sind ([-fcB(R)-]n, R = Br). Weitere Wege zu ferrocenhaltigen Polymeren mit Bar im Polymerrückgrat wurden durch die erfolgreiche Synthese der Ferrocenylborane FcBH2 und 1,1‘-fc(BH2)2 eröffnet, die in Form ihrer Lewis-Säure-Base-Addukte mit Dimethylethylamin [FcBH2 . NMe2Et; 1,1‘-fc(BH2 . NMe2Et)2] oder Dimethylsulfid [FcBH2 . SMe2; 1,1‘-fc(BH2.SMe2)2] isoliert werden konnten. FcBH2 . NMe2Et und FcBH2 . SMe2 erwiesen sich als aktive und selektive Hydroborierungsreagenzien. Durch Umsetzung mit aromatischen Dialkinen werden dadurch konjugierte Polymere zugänglich, welche mit Polyolefinen verwandt sind, in denen einige der Kohlenstoffatome durch Boratome ersetzt wurden. Diese Materialien zeichnen sich durch ausgeprägt pi-Delokalisation aus, die sich über das Bor hinweg erstreckt, und weckten unser Interesse, da Oxidation der Ferrocenyl-Seitenketten eine elektrochemische Modifizierung der Ladungsdichte an den Borzentren erlauben sollte. Gleichzeitig ließen sich auf diese Weise paramagnetische Fe(III)-Ionen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem elektrisch leitfähigen Polymer generieren. Überdies erhält man Polymere des Typs [-fcB(R)-]n nicht nur über die Reaktion von 1,1‘-fc(BBr2)2 mit HSiEt3 (R = Br) sondern auch über die Kondensationsreaktion von 1,1‘-fc(BH2)2, die unter Abspaltung von BH3 verläuft (R = H).
Endogene Retroviren des Schweines (PERV), die vertikal auf die Nachkommen vererbt werden, stellen ein potentielles Infektionsrisiko bei der Transplantation porziner Zellen, Gewebe oder solider Organe auf den Menschen (Xenotransplantation) dar. Bislang sind zwei PERV- Klassen des C-Typs bekannt, die in-vitro humane Zellen produktiv infizieren können. Voraussetzung einer produktiven Infektion ist neben dem Rezeptor-vermittelten Eindringen des Virus in die Wirtszellen die transkriptionelle Aktivität des retroviralen Promotors (LTR), welcher die zweite Determinante des Wirtstropismus darstellt. Mittels eines Luciferase Reportergen Assays wurde die Aktivität verschiedener PERV LTRs in humanen und anderen Säugerzellen im Vergleich zu bekanntermaßen starken Promotoren untersucht. Dabei zeigten LTRs, welche in der die Transkription regulierenden Region U3 eine aus 39-bp Repeats bestehende Repeatbox trugen, in nahezu allen getesteten Zellinien eine außerordentlich starke Promotoraktiviät. Diese wurde insbesondere durch die Repeatbox vermittelt und korrelierte direkt mit der Anzahl der 39-bp Repeats. Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnte die Aktivität heterologer und Repeat-loser homologer Promotoren durch eine 4-fach 39-bp Repeatbox unabhängig von deren Lage und Orientierung über weite Distanzen hinweg signifikant erhöht werden. Die Repeatbox stellt damit einen klassischen Enhancer dar. Als die Transkription regulierende zelluläre Komponente konnte der ubiquitäre, in der Evolution konservierte Transkriptionsfaktors NF-Y identifiziert werden, dessen Bindung an Sequenzabschnitte des 39-bp Repeats nachgewiesen wurde. Weitere cis-aktive Elemente konnten in der U3 Region stromaufwärts der Repeatbox sowie in der R Region lokalisiert werden. Im Verlauf einer seriellen Passagierung in infizierten humanen Zellen erfolgte eine rasche Adaptation der Repeatzahl und damit der transkriptionellen Aktivität an den neuen Wirt. Wie die Ergebnisse einer neu etablierten quantitativen Real- Time PCR zeigten, korrelierte die Anzahl der von einer infizierten Zelle freigesetzten Viruspartikel direkt mit der Aktivität der LTR. Durch Adaptation der LTR Aktivität kann somit eine maximale, für die Wirtszelle verträgliche Virusproduktion erfolgen. Ausgehend von den beschriebenen Eigenschaften der PERV LTR ergeben sich für die Xenotransplantation spezifische Risiken, die Infektion des möglichen Transplantatempfängers vorausgesetzt. Diese betreffen durch mögliche Aktivierung von Protoonkogen oder Disruption zellulärer Gene den Empfänger selbst, durch die mögliche Rekombination von PERV mit humanen endogenen Sequenzen oder anderen exogenen Erregern und der Ausbildung potentiell hochpathogener Formen aber auch sein soziales Umfeld. Wie in-vitro Studien mit zwei routinemäßig in der Transplantationsmedizin eingesetzten Immunsuppressiva belegen, werden diese Risiken durch deren unvermeidlichen Einsatz im Falle einer Xenotransplantation nicht potenziert. Ausgehend von der starken transkriptionellen Aktivität Repeat-tragenden LTRs könnten diese geeignete Werkzeuge für molekularbiologische Anwendungen darstellen, bei denen, wie im Falle des Gentransfers oder der Gentherapie, starke Promotoren benötigt werden. In einem zweiten Projekt der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Expression des humanen endogenen Retrovirus HERV-K in einem transgenen Mausmodell Auswirkungen auf den Phänotyp der Tiere hat. HERV-K kodiert im Gegensatz zu den meisten anderen HERV-Familien für komplette virale Proteine, deren Bedeutung für den menschlichen Organismus jedoch weitgehend unbekannt sind. Zur Etablierung transgener Tiere waren zwei verschiedene Transgen-Konstrukte verwendet worden, von denen eines die komplette provirale Sequenz exklusive der LTRs beinhaltete, das andere lediglich das env-Gen. Für beide Konstrukte war die Etablierung homozygot transgener Tiere gelungen, der Nachweis der RNA Expression konnte jedoch nur bei jenen Linien erfolgen, die das komplette virale Genom trugen. Immuno Blot-Analysen und indirekte Immunfluoreszenz belegten die Expression viraler Proteine in verschiedenen Organen juveniler und adulter Tiere dieser Linien. Die transgenen Mäuse zeigten einen normalen Phänotyp und einen normalen Lebenszyklus mit einer unveränderten Reproduktionsrate. Eine auftretende Tumorgenese konnte stets auf das hohe Alter der betroffenen Tiere zurückgeführt werden, histologische oder anatomische Auffälligkeiten traten nicht auf. Ausgehend von diesen Beobachtungen in einem Tiermodell kann der Schluß gezogen werden, daß die HERV-K Expression im humanen Organismus keine große Bedeutung hat.
In previous investigations an impact of cellular copper homeostasis on ageing of the ascomycete Podospora anserina has been demonstrated. Here we provide new data indicating that mitochondria play a major role in this process. Determination of copper in the cytosolic fraction using total reflection X-ray fluorescence spectroscopy analysis and eGfp reporter gene studies indicate an age-related increase of cytosolic copper levels. We show that components of the mitochondrial matrix (i.e. eGFP targeted to mitochondria) become released from the organelle during ageing. Decreasing the accessibility of mitochondrial copper in P. anserina via targeting a copper metallothionein to the mitochondrial matrix was found to result in a switch from a copper-dependent cytochrome-c oxidase to a copper-independent alternative oxidase type of respiration and results in lifespan extension. In addition, we demonstrate that increased copper concentrations in the culture medium lead to the appearance of senescence biomarkers in human diploid fibroblasts (HDFs). Significantly, expression of copper-regulated genes is induced during in vitro ageing in medium devoid of excess copper suggesting that cytosolic copper levels also increase during senescence of HDFs. These data suggest that the identified molecular pathway of age-dependent copper dynamics may not be restricted to P. anserina but may be conserved from lower eukaryotes to humans.
Durch RNAinterferenz (RNAi) läßt sich die Expression eines beliebigen Gens spezifisch unterdrücken. Dafür müssen in das Zytoplasma kurze, doppelsträngige RNA Moleküle (siRNA bzw. shRNA) eingebracht werden, die teilweise komplementäre Sequenzen zu dem Zielgen aufweisen. Um siRNAs mit einer hohen Effizienz und Kopienzahl in die Zielzelle einzubringen, wurden Transfersysteme unterschiedlicher Art entwickelt. Nicht-virale Transfersysteme können nur einen transienten Effekt auslösen - ein Umstand, der für Langzeitstudien eine mehrfache Transfektion bedingt. Zur Lösung dieses Problems wurden retrovirale Vektorsysteme entwickelt, die durch Integration der shRNA-Expressionskassette in das zelluläre Genom eine stabile Unterdrückung eines Zielgens erreichen können. Insbesondere für präklinische Studien in vivo ist jedoch ein System mit erhöhter Transferrate wünschenswert, um in möglichst vielen Zielzellen einen RNAi-Effekt zu bewirken. Sliva et al. konnten zeigen, dass das Murine Leukämie Virus (MLV) theoretisch diese Anforderung erfüllt. Dafür wurde eine shRNA-Expressionskassette in das Virusgenom eingefügt und in vitro ein RNAi-Effekt nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System nun durch die Verwendung von microRNA-adaptierten shRNAs (shRNAmir) verbessert. In mehreren Publikationen wurde bestätigt, dass shRNAs, die endogenen microRNAs nachempfunden sind, eine höhere Effizienz und niedrigere Toxizität aufweisen. Zunächst wurde die für die genetische Stabilität optimale Orientierung der shRNAmir-Expressionskassette bestimmt. Das Konstrukt in reverser Orientierung wies eine Deletion in der shRNAmir Promotersequenz auf, die wahrscheinlich durch Interferenz mit dem 5’LTR Promoter entstanden ist. Mit dem genetisch stabilen Viruskonstrukt wurden Experimente zur Reduktion der Expression von Markergenen durchgeführt, um die Effizienz der RNAi-Aktivität leicht zu quantifizieren. Dafür wurden humane Fibrosarkom (HT1080) Zellen infiziert, die eGFP oder Luziferase stabil exprimieren.
Mit eGFP- und Luziferase-spezifischen shRNAmir-Expressionskassetten konnte nach Infektion eine Herunterregulation von eGFP auf etwa 20 % und für Luziferase auf unter 10% beobachtet werden. Das Kontrollvirus, das eine unspezifische shRNAmir kodiert, hatte keinen Einfluss auf die Expression beider Markerproteine. Die Kinetik mit der die Markerproteine herrunterreguliert wurden, war abhängig von der Virusdosis. Die Virusdosis hatte aber keinen Einfluß auf die Stärke des RNAi-Effekts, der nach Infektion aller Zellen festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung an ein replikatives Transfersystems, das je nach applizierter Virusdosis unterschiedlich schnell RNAi in der Zellkultur ausbreitet und induziert. Die Anwendbarkeit dieses RNAi-Transfersystems auch für endogene Gene wurde mit MMP14-spezifischen shRNAmirs gezeigt. Nach Infektion von HT1080 Zellen mit den entsprechenden Viren in HT1080 Zellen konnte eine verringerte Menge an MMP14 mRNA und Protein nachgewiesen werden. Dies konnte funktionell durch eine verringerte Menge an intermediärem MMP2 und durch eine reduzierte Invasivität bestätigt werden. Zudem war die Fähigkeit dieser Zellen subkutane Tumore zu bilden stark eingeschränkt.
Um die Anwendbarkeit dieses Systems für in vivo Applikationen zu zeigen, wurde in Mäuse, die Luziferase-exprimierenden Tumoren trugen, MLV-shLuc oder das Kontrollvirus systemisch appliziert. 21 Tage nach Virusgabe konnte in den Tumoren von MLV-shLuc infizierten Mäusen eine Abnahme der Luziferaseaktivität auf 15 % nachgewiesen werden. Auch in Mäusen, die systemisch applizierte Tumorzellen erhielten, konnte eine Tendenz von RNAi-vermittelter Luziferase-Reduktion beobachtet werden.
Damit wurde in dieser Arbeit ein neuartiges RNAi-Transfersystem geschaffen, das in der Lage ist, auch in vivo einen starken und lang andauernden RNAi-Effekt auszulösen. Die Einzigartigkeit besteht in der Kombination von shRNAmir und Replikations-kompetenten Retroviren. Dadurch konnte eine erweiterte Transferrate von shRNAmir in Tumorzellen erreicht werden, so dass nun Genfunktionsstudien mit sehr hoher Aussagekraft möglich sind.
Vanille ein tropisches Orchideengewächs liefert eines der bedeutendsten Aromen weltweit. Die stetig wachsende Nachfrage und das hohe Preisniveau sind allerdings häufig die Ursache für Verfälschung von Vanilleextrakten und -aromen. Ziel der Arbeit war es daher, die Methoden zur Echtheitsbewertung von Vanille weiter zu entwickeln. Daneben sollten Untersuchungen im Hinblick auf aromaaktive Minorkomponenten durchgeführt werden. Als Basisdaten für die Authentizität von Vanille dienen häufig Verhältniszahlen, die aus den Gehalten der Hauptinhaltsstoffe Vanillin, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillinsäure und 4-Hydroxybenzoesäure gebildet werden. Um diese Verhältniszahlen zuverlässig bestimmen zu können, wurden eine hochdruckflüssigkeits-chromatographische (HPLC) und zum ersten Mal eine gas-chromatographische (GC) Methode entwickelt. Unter Verwendung von internen Standards konnte mit beiden Methoden eine zuverlässige Quantifizierung erzielt werden. Die ermittelten Werte erwiesen sich als unabhängig von der Analysenmethode, von Erntejahrgang und Herkunft der Schoten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die bisher zur Bewertung herangezogenen Richtwerte im Vergleich mit den im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Werte durchweg zu enge Spannbreiten aufweisen. Die neu bestimmten Daten zur quantitativen Zusammensetzung von Vanilleschoten stellen daher wertvolle Basiskriterien für eine Echtheitsbewertung von Vanille dar. Für eine weitergehende, noch zuverlässigere Authentizitätsbewertung wurden die 13C/12C-Verhältnisse von Vanillin und der zweiten Hauptkomponente 4- Hydroxybenzaldehyd ermittelt. Als grundlegende Voraussetzung für die Bestimmung korrekter Isotopenwerte wurde zum einen die Gerätekonfiguration optimiert, um eine vollständige Verbrennung zu gewährleisten, zum anderen wurde der Einfluss der Schotenaufarbeitung untersucht. Durch Korrelation der Delta13CV-PDB-Werte der beiden Komponenten konnten klare Authentizitätbereiche festgelegt werden. Insbesondere durch die integrale Betrachtungsweise beider Kriterien Verhältniszahlen und Isotopenwerte konnte die Authentizitätsbewertung von Vanille erheblich verbessert werden. Neben den Hauptkomponenten kommen in der Vanille aber auch eine große Zahl von aromaaktiven Minorkomponenten vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher auch Untersuchungen zu einigen dieser Minorkomponenten durchgeführt werden. Dabei ermöglichte es der Einsatz der neuen, hochempfindlichen Methode der Stir Bar Sorptive Extraction, eine enantioselektive Analyse von - Nonalacton und verschiedenen Monoterpenen durchzuführen. -Nonalacton konnte dabei in allen untersuchten Proben mit einem nahezu racemischen Enantiomerenverhältnis nachgewiesen werden. Die Enantiomerenreinheit und die Schwankungen der Enantiomerenverhältnisse für die untersuchten Monoterpene waren stark variierend. Es konnte dabei aber weder eine Herkunfts- noch eine Jahrgangsabhängigkeit festgestellt werden. Die sehr geruchsaktive Substanz Guajacol wurde in Schoten der Gattungen V. planifolia und V. tahitensis semiquantitativ untersucht. Es konnte aber auch hier keine Abhängigkeit von der Herkunft der Schoten festgestellt werden. Um weitere geruchsaktive Minorkomponenten zu identifizieren, wurde ein Headspace- Extrakt von Vanilleschoten mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie untersucht. Es konnten dabei die beiden Substanzen Kreosol und 4- Hydroxybenzylamin identifiziert werden. Letztgenanntes war bisher als natürlicher Aromastoff nicht bekannt. Obwohl beide Komponenten nur im ppb- Bereich vorkommen, leisten sie dennoch eine Beitrag zum Gesamtaroma von Vanille. Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Wege im Hinblick auf die Analytik und Authentizitätsbewertung von Vanille aufgezeigt werden.
In dieser Arbeit erfolgt eine Untersuchung der intrazellulären Transporteigenschaften des Na /Glucose Cotransporters SGLT1 aus dem Kaninchen. Der Transporter wird dazu heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die hohe Expressionsdichte erlaubt die Anwendung der "giant excised patch clamp"-Technik in der inside-out Konfiguration. Die Patches mit Durchmessern von 20-30 µm enthalten ca. 2,5 - 5·10 hoch 6 Transportern bei einem durchschnittlichen Strom von 20-40 pA. Der Transport des Substrats Glucose bzw. des hier verwendeten alpha MDG wird angetrieben durch den elektrochemischen Gradienten für das Cosubstrat Na . Bei 0 mV Haltepotential wird zuerst die reine Konzentrationsabhängigkeit des Auswärtstransports durch die Bestimmung der apparenten intrazellulären Affinität für alpha MDG bei verschiedenen festen Na -Konzentrationen untersucht. Es kann eine deutliche Abhängigkeit des KM alpha MDG von der Na -Konzentration festgestellt werden. Eine Erhöhung der intrazellulären Na -Konzentration von 10 mM auf 400 mM führt zu einer ca. 12fachen Abnahme des KM alpha MDG. Experimente mit symmetrischer Na -Verteilung zeigen, dass auch ohne Na -Konzentrations-Gradient Transport stattfinden kann, allerdings mit einer deutlich geringeren Affinität für alpha MDG. Verglichen mit Literaturwerten für die extrazelluläre alpha MDG-Affinität ist die intrazelluläre Affinität 10-15mal geringer ist als die extrazelluläre. Die Untersuchung der Abhängigkeit von der Na -Konzentration bei verschiedenen festen MDG-Konzentrationen zeigt, dass KM Na eine geringe Abhängigkeit von der alpha MDG- Konzentration besitzt. Die 10fache Erhöhung der alpha MDG-Konzentration von 25 mM auf 250 mM führt nur zu einer leichten Erniedrigung des KM Na. Die intrazelluläre Na - Affinität liegt in der gleichen Größenordnung wie die extrazelluläre. Zur Untersuchung der intrazellulären Bindungsreihenfolge werden die gemessenen Abhängigkeiten des KM alpha MDG und des I Max von der Na -Konzentration mit Simulationen für die 3 möglichen Bindungsreihenfolgen (2Na :G), (Na :G:Na ) und (G:2Na ) verglichen. Mit den hier gemachten Annahmen für die intrazellulären Bindungskonstanten für MDG und Na wird die beste Übereinstimmung für die intrazelluläre Bindungsreihenfolge (2Na :G) gefunden. Zur Untersuchung des spannungsabhängigen Verhaltens der Affintitäten für alpha MDG und Na werden Spannungssprünge unter denselben Konzentrationsbedingungen wie vorher durchgeführt. Die Strom-Spannungs-Kennlinien zeigen eine Zunahme der zuckerinduzierten Stromamplituden zu positiven Potentialen hin. Dabei wird weder bei hyperpolarisierenden noch bei depolarisierenden Potentialen eine Sättigung erreicht. Dies läßt den Rückschluss, dass im betrachteten Spannungsbereich ein spannungsabhängiger Schritt im Transportzyklus geschwindigkeitsbestimmend ist. Die apparenten Affinitäten für alpha MDG und Na besitzen eine geringe Spannungsabhängigkeit. Der KM alpha MDG bei annähernd sättigender Na -Konzentration fällt zwischen 40 mV und 40 mV um einen Faktor 4,4. Bei verringerter Na -Konzentration beeinflusst das Membranpotential die MDG-Affinität stärker. Der KM Na fällt unter sättigenden Zuckerbedingungen im gleichen Spannungsbereich auf die Hälfte ab, wobei der Hill-Koeffizient konstant bleibt. Die Erniedrigung der alpha MDG-Konzentration verursacht keine Veränderung des spannungsabhängigen Verlaufs. Die Ergebnisse zeigen, dass SGLT1 ein reversibler Transporter ist, der sowohl Einwärts-, aber auch Auswärtstransport von Glucose generieren kann. Er zeigt dabei eine starke Abhängigkeit von der Na -Konzentration und eine geringe Abhängigkeit vom Membranpotential. Die hier bestimmten Eigenschaften zeigen aber auch, dass unter physiologischen Bedingungen ein Auswärtstransport von Glucose sehr unwahrscheinlich ist. Das Zusammenwirken der Faktoren Richtung des Na -Gradient, geringe Zuckeraffinität, negatives Membranpotential und geringe intrazelluläre Na - Konzentration verhindern den Auswärtstransport. Der physiologische Na -Gradient ist dem Auswärtstransport entgegengerichtet. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration und das negative Membranpotential verursachen eine sehr geringe intrazelluläre Zuckeraffinität von ca. 75 mM alpha MDG, so dass ein merklicher Auswärtstransport nur bei einer hohen Zuckerkonzentration innerhalb der Epithelzellen stattfinden kann. Dies wird jedoch durch basolaterale Glucose-Transporter verhindert. Das negative Membran- potential führt zu einer geringen Aktivität des Auswärtstransports. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration liegt weit unterhalb es KM Na , so dass auch hier die Transporteraktivität gering ist. Die asymmetrische Funktionsweise des SGLT1 gewährleistet, dass der Glucose- Transport nur in eine physiologisch sinnvolle Richtung, nämlich der Aufnahme von Glucose in die Epitheltzellen, stattfindet.
The cis-trans-isomerism of the WITTIG hydrocarbon was investigated in solid state and solution by means of fluorescence spectroscopy. The fluorescence behavior of both isomers in 2-methyltetrahydrofurane was determined as a function of concentration, temperature, and wavelength of exciting radiation. Furthermore, irradiation experiments were undertaken with light of various wavelengths.
The results obtained are in agreement with the assumption that the WITTIG hydrocarbon behaves with regard to the cis-trans-isomerism like a 1,3-butadien derivative, i.e. a thermal but no photochemical cis-trans-isomerisation can be detected. The enthalpy difference between the two isomers was estimated to ΔΗ = 250 ± 50 cal/mole. It could be shown that the fluorescence of the cis-isomer is quenched by the trans-isomer. This quenching occurs probably according to the resonance energy transfer mechanism.
The industry‐scale production of methylchloromonosilanes in the Müller–Rochow Direct Process is accompanied by the formation of a residue, the direct process residue (DPR), comprised of disilanes MenSi2Cl6‐n (n=1–6). Great research efforts have been devoted to the recycling of these disilanes into monosilanes to allow reintroduction into the siloxane production chain. In this work, disilane cleavage by using alkali and alkaline earth metal salts is reported. The reaction with metal hydrides, in particular lithium hydride (LiH), leads to efficient reduction of chlorine containing disilanes but also induces disproportionation into mono‐ and oligosilanes. Alkali and alkaline earth chlorides, formed in the course of the reduction, specifically induce disproportionation of highly chlorinated disilanes, whereas highly methylated disilanes (n>3) remain unreacted. Nearly quantitative DPR conversion into monosilanes was achieved by using concentrated HCl/ether solutions in the presence of lithium chloride.
UV-mikrospektrophotometrische Messungen der Nucleinsäuren- und Eiweißkörper-Konzentration sowie der Kern- und Nukleolengröße nach Virusinfektion und unspezifischer Reizung der Chorion-Allantoismembran zeigen, daß es in beiden Fällen zu einer gleich starken Stimulierung des nucleinsäuren- und eiweißkörperbildenden Systems der Zelle kommt. Bei der Infektion mit Vaccinevirus auf das Ektoderm setzt die Reaktion der Membranzellen in der Eklipse ein, nach Infektion mit Newcastle-Disease-Virus fällt der Titeranstieg mit der Zellreaktion zeitlich zusammen.
A non-radioactive cell-free assay was developed to quantitatively determine inhibition of plant-type phytoene desaturase by bleaching herbicides. An active desaturase was prepared from an appropriately cloned E. coli transformant. Another E. coli transformant was used to produce the required phytoene. Phytofluene and t-carotene, the products of the desaturase reaction, were either determined by HPLC or optical absorption spectra. Enzyme kinetics and inhibition data for the bleaching tetrazole herbicide WL110547 are presented as an example.
Methods are described for an enzymatic preparation of 14C-labeled terpenoids. With a cell-free system of a white mutant of Phycomyces blakesleeanus (Mucoraceae) [14C]squalene and [14C- cis]phytoene can be synthesized from [2-14C]mevalonate. The application of norflurazon, a phenyl- pyridazinone herbicide, helps to increase the yield of squalene. Furthermore, the liquid endosperm of Echinocystis lobata (Cucurbitaceae) was used for the formation of either [14C(-)]kaurene from [14C]mevalonic acid or [14C-/ra/w]geranylgeranyl pyrophosphate in the presence of Amo 1618.
The hydrocarbons formed were purified by alumina-column chromatography and preparative thin-layer chromatography (TLC). Geranylgeranyl pyrophosphate was separated by DE-column chromatography followed by TLC.