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Die Mehrheit (60%) aller AML-Erkrankungen beruhen auf chromosomalen Aberrationen, genauer genommen Translokationen, bei der zwei chromosomale Bruchstücke zu einem Chimärgen refusionieren. Die daraus resultierenden Fusionsproteine sind charakteristisch für die verschiedenen Formen der AML-Erkrankungen. In 97% aller Fälle der APL-Erkrankungen, einer Unterform der AML, tritt die t(15;17) und in weniger als 2% die t(11;17) auf. Die t(15;17) führt zu dem rekombinanten Fusionsprotein PML/RARK und die t(11;17) zu PLZF/RARK (X-RARK). Der APL-assoziierte leukämische Phänotyp X-RARKpositiver Zellen zeichnet sich durch die Blockierung terminaler Differenzierung früher hämatopoetischer Vorläuferzellen und dem gesteigerten Selbsterneuerungspotenzial leukämischer Stammzellen (LSCs) aus. Demzufolge können PML/RARK und PLZF/RARK auf der Ebene des frühen Vorläufers sowie der HSCs die leukämische Pathogenese initiieren. Bei der Erforschung der molekularen Grundlagen für die X-RARK-vermittelte Steigerung der aberranten Selbsterneuerung LSCs hat sich ergeben, dass die aberrante Aktivierung des Wnt-Signalweges eine zentrale Rolle einnimmt. Die Schlüsselmoleküle der aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges und damit der gesteigerten Selbsterneuerung sind 2-Catenin und Plakoglobin, die wiederum durch AML-assoziierte Fusionsproteine wie PML/RARK, PLZF/RARK und AML1/ETO transkriptionell hochreguliert werden. Das ansteigende Proteinniveau von 2-Catenin und Plakoglobin, welches entscheidend zur Initiation der Leukämieerkrankung beiträgt, führt zur nukleären Akkumulation von 2-Catenin und zur Aktivierung der CF/LEF-Familienmitglieder kontrollierten Genexpression. Aus diesem Grund stellen 2-Catenin und Plakoglobin einen wichtigen Ansatzpunkt für neue Therapieansätze in der Behandlung der AML dar. Die aberrante Aktivierung und pharmakologische Inhibition des Wnt-Signalweges, insbesondere von 2-Catenin, hat in zahlreichen humanen Krebserkrankungen, wie Brust-, Prostata-, Adenom- und Kolonkarzinomen, zu therapeutischen Erfolgen geführt. Grundlage der erfolgreichen pharmakologischen Inhibition des aberranten Wnt-Signalweges ist die Verwendung von Inhibitoren aus der Gruppe der nichtsteroidalen Entzündungshemmer (NSAIDs). Sulindac und seine Metabolite, Sulfon, das keine COX-inhibitorische Wirkung aufweist, und Sulfid, einem spezifischen COX-1/-2- Inhibitor, sind Vertreter der Gruppe der NSAIDs und haben in klinischen Studien erfolgreich die Größe und Anzahl der Kolorektaltumore von FAP-Patienten reduziert. Es deutet alles daraufhin, dass die vermittelten Effekte von Sulindac und seinen Metaboliten in den bisher untersuchten Zellsystemen in einem zur COX-Inhibition unabhängigen Kontext stehen. Zusammenfassung: 135 Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Ziel verfolgt herauszufinden, ob die Verwendung von NSAIDs einen neuen Therapieansatz in der gezielten pharmakologischen Bekämpfung der leukämischen Stammzelle („ stem cell targeting“) zur Behandlung der AML darstellen können. Sulindac (S), Sulindac Sulfid (SSi) und Sulindac Sulfon (SSo) sind in der Lage unabhängig von der PML/RARK-Expression die Viabilität leukämischer monozytärer U937-Zellen zu reduzieren und dosisabhängig in X-RARKpositiven U937-Zellen die Apoptose zu induzieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in einem Konzentrationsbereich von 75-100 μM PML/RARK-positive U937-Zellen geringfügig stärker auf die Apoptoseinduktion reagieren als die Kontrollzellen. Des Weitern senkt SSi in PML/RARK-positiven NB4-Zellen am effektivsten das Proteinniveau von PML/RARK, 2-Catenin und Plakoglobin. Dem gegenüber weist sich SSo in KG-1-Zellen als potenteres Agenz aus, das Proteinniveau von PML/RARK, 2-Catenin und Plakoglobin effektiv zu senken. Zusätzlich deuten die Ergebnisse der Westernblotanalyse aus den KG-1- Experimenten daraufhin, dass der induzierte Proteinabbau nicht auf einen PML/RARKvermittelten Effekt zurückzuführen ist. Hinzu kommt, dass gezeigt werden konnte, dass SSi im Vergleich zu SSo in klinisch relevanten Konzentrationsbereichen weit aus effektiver die Viabilität PML/RARK-positiver NB4-Zellen reduziert und Apoptose induziert. Im Rahmen der seriellen Replattierungsexperimente konnte gezeigt werden, dass SSi in der Lage ist, mit dem leukämogenen Potenzial PML/RARK- und PLZF/RARK-exprimierender Stamm- und Progenitorzellen zu interferieren bzw. dieses zu revertieren. Darüber hinaus beherrscht und hebt SSi die 2-Catenin- und Plakoglobin-vermittelten Effekte auf das Stammzellpotenzial HSCs auf. Im Zuge der experimentellen Analyse des Einflusses von SSi auf die Wnt-Signalwegaktivierung hat sich gezeigt, dass SSi in der Lage ist, die PML/RARK- und S33A-vermittelte aberrante Wnt-Signalwegaktivierung zu reduzieren. Hinzu kommt, dass SSi die Siah1-Promotoraktivität stimuliert, die wiederum zur Expression von Siah-1 führt und einen phosphorylierungsunabhängigen 2-Catenin- und PML/RARK-Abbau induziert. Ferner hebt SSi den X-RARK-vermittelten Differenzierungsblock auf und inhibiert spezifisch die Proliferation PML/RARK- und PLZF/RARK-positiver HSCs. In humanen APL-Zellsystemen ist SSi alleine nicht imstande in vergleichbarem ATRA-Ausmass granulozytäre Differenzierung zu induzieren, aber den ATRA-vermittelten Effekt in der humanen APL-Patienten abgeleiteten NB4-Zelllinie zu verstärken. Infolge der Zellzyklusanalyse konnte gezeigt werden, dass SSi zu einer PML/RARK-spezifischen Apoptoseinduktion, ermittelt durch den Anstieg der subG0/G1-Phase, führt, welche in der PML/RARK-negativen Zelllinie ausbleibt. Darüber hinaus verhindert die Präsenz von PML/RARK ein SSi induziertes Ausscheren der Zellen in die G0/G1-Phase. Zusätzlich haben in vivo Experimente (CFU-S12) ergeben, dass SSi die Kurzzeitstammzellkapazität X-RARK-positiver HSCs senkt. SSi induziert außerdem im humanen Stammzellmodel der KG-1-Zellen die RARK-spezifische Reduktion der stammzellähnlichen CD34+/CD38-/ALDH+-KG1-Subpopulation, wobei die Reduktion dieser Subpopulation nicht auf zytotoxischen Effekten beruht. Des Weiteren ist SSi in der Lage die ALDH+-NB4-Subpopulation zu senken, wohingegen die Abwesenheit von PML/RARK in U937-Zellen eine Stimulation der ALDH+-Population zulässt. Zusammenfassend bleibt zusagen, dass SSi ein vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der „Stammzelltargeting-Therapie“ zur Behandlung akuter Leukämien darstellt. Nicht nur die effiziente Inhibition des aberranten Wnt-Signalweges, der maßgeblich am X-RARK-vermittelten leukämischen Phänotyp beteiligt ist, sondern auch die gezielte Reduktion der X-RARK-assoziierten Stammzellpopulation könnte SSi möglicherweise favorisieren, unterstützend zu anderen Chemotherapeutika, in der Erhaltungstherapie eingesetzt zu werden. SSi-assoziierte renale und gastrointestinale Nebeneffekte sowie der beobachtete Wachstumskompensationsmechanismus sollten zum gegenwärtigen Zeitpunkt pharmakologisch beherrschbar sein.
Charakterisierung der Amyloidplaque-assoziierten Entzündungsreaktion in APP23 transgenen Mäusen
(2009)
Ein charakteristisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Ablagerung von Amyloid-beta (A beta) Protein im Gehirn. Die Proteinaggregate bilden Plaques, in deren Umgebung eine chronische Entzündungsreaktion nachgewiesen werden kann. Welche Rolle diese plaqueassoziierte Inflammation für die Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit spielt, ist unklar. Es wird diskutiert, dass es sich um einen Versuch des Immunsystems handelt, A beta durch Prozessierung und Phagozytose aus dem Gehirn zu entfernen. Durch die dadurch entstehende chronische Entzündung könnten Nervenzellen in der Umgebung von Plaques geschädigt werden ("bystander attack"). Ein Schritt zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsprozesse und ihrer pathogenetischen Bedeutung ist die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit drei zentralen Fragen: (1) Welche Moleküle sind an der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion beteiligt? (2) Sind ausgewählte Kandidatenmoleküle (Toll-like Rezeptoren, SOCS) in der Umgebung von Plaques reguliert? (3) Welche Rolle spielen Entzündungsmediatoren aus Endothelzellen in der Nähe von Plaques? Die plaqueassoziierten Entzündungsprozesse wurden im Gehirn von alten APP23 transgenen Mäusen, einem Modell der Alzheimer-Erkrankung, untersucht. Plaques, plaquenahes Gewebe und plaquefreies Gewebe wurden mittels Laser Mikrodissektion ausgeschnitten und anschließend mit Hilfe von Mikroarrays und quantitativer RT-PCR analysiert. Dazu wurden zwei methodische Ansätze gewählt: Im ersten Teil der Arbeit wurden in einem hypothesenfreien Ansatz neue regulatorische Kandidatenmoleküle identifiziert, unter ihnen der Rezeptor Trem2. Dabei konnten sowohl eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA als auch eine erhöhte Protein Expression von Trem2 sowie dessen Lokalisation auf Mikrogliazellen nachgewiesen werden. Trem2 spielt anscheinend eine Rolle bei der Herbeiführung eines mikroglialen Aktivierungsstatus, der die Phagozytose unterstützt, während die Entstehung von proinflammatorischen Zytokinen unterdrückt wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit einem hypothesenbasierten Ansatz die plaqueassoziierte mRNA Expression von Molekülen untersucht, die bereits in anderen Untersuchungen mit der Alzheimer-Erkrankung in Zusammenhang gebracht wurden. Dabei konnte eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA Expression der Toll-like Rezeptoren Tlr2, 4 und 9 sowie einzelner SOCS in APP23 transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Tlr2 und 4 sind in der Lage, Mikrogliazellen und andere phagozytierende Zellen zu aktivieren und werden mit der Aufnahme und Beseitigung von Amyloid-beta in Verbindung gebracht. Im dritten Teil der Arbeit wurde ebenfalls mit einem hypothesenbasierten Ansatz die mRNA Expression von plaqueassoziiertem Endothelgewebe überprüft. Dabei konnte eine erhöhte mRNA Expression von MIP-1 alpha und CXCL10, zwei Entzündungsmediatoren aus der Familie der Chemokine, in plaqueassoziiertem Endothelgewebe gezeigt werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass auch das Endothelgewebe an der Entzündungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung bei. Die Aufklärung der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung ist entscheidend, um in den nächsten Jahren und Jahrzehnten neue und effektive Medikamente zur Behandlung dieser schweren Demenzerkrankung zu entwickeln.
Ein weit verbreitetes Merkmal von Leukämien sind genetische Veränderungen, wobei die Entstehung der Leukämie häufig mit reziproken chromosomalen Translokationen assoziiert ist, welche zur Bildung chimärer Genprodukte führen. Eine Vielzahl dieser reziproken Translokationen basieren auf Translokationen des MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia), die mit dem Krankheitstyp einer AML oder einer ALL verbunden sind. Die häufigste chromosomale Translokation ist die t(4;11) Translokation. Sie tritt vor allem bei Kleinkindern bzw. auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie auf und resultiert in einer akuten lymphatischen Leukämie. Es handelt sich um eine Hochrisikoleukämie, welche aufgrund ihrer nahezu Therapie-resistenten Blasten mit einer besonders schlechten Prognose assoziiert ist. Der Mechanismus der Leukämieentstehung durch die MLL-Translokationen und der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Für einige MLL-Translokationen, die mit einer myeloischen Leukämie verknüpft sind, konnte zunächst das onkogene Potenzial der Fusionsproteine im Mausmodell belegt werden. Im Bezug auf die t(4;11) Translokation blieben Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells jedoch lang erfolglos. Erst 2006 konnten mittels einer knock-in-Strategie bzw. einem „inverter“-System Mausmodelle für MLL•AF4 entwickelt werden, in denen die Mäuse nach sehr langer Latenzzeit ein disseminiertes B-Zell-Lymphom aufwiesen. Ein neueres konditionales MLL•AF4 knock-in-Modell, in dem MLL•AF4 unter der Kontrolle des endogenen Zellzyklus-abhängigen MLL-Promotors steht, resultierte hingegen in einer ALL oder AML. Im Allgemeinen steht somit bislang das MLL•AF4-Fusionsprotein im Vordergrund der Erforschung des pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation. Aufgrund der Tatsache, dass in der Regel jedoch neben dem MLL•AF4- ebenso ein AF4•MLL-Fusionstranskript nachgewiesen werden kann, befassten sich Studien unserer Arbeitsgruppe mit der Funktion des AF4•MLLFusionsproteins. Diese Untersuchungen zeigten, dass das AF4•MLL-Fusionsprotein in der Zelle akkumuliert und in der Entwicklung onkogener Effekte sowie der Wachstumstransformation der Zelle resultiert. Ergänzend belegten retrovirale Transduktions-/Transplantations-Experimente die Entwicklung einer akuten Leukämie im Mausmodell, wenn zuvor mit AF4•MLL bzw. mit AF4•MLL und MLL•AF4 transduzierte Stammzellen transplantiert wurden. Um nun die Funktion des AF4•MLL-Proteins sowie die molekularen Ursachen der beobachteten Eigenschaften besser verstehen zu können, wurde der AF4•MLL-Proteinkomplex mittels einer Strep-Tag-Affinitätschromatographie erfolgreich gereinigt und ein Molekulargewicht von ca. 2 MDa über Größenausschlusschromatographie bestimmt. Damit nicht nur ein Vergleich mit dem MLL- sondern auch mit dem AF4-Wildtyp- Proteinkomplex möglich war, wurden ebenfalls eine Größenbestimmung und eine Reinigung des AF4-Proteinkomplexes durchgeführt. Die folgenden Analysen der Komplexkomposition über Immunopräzipitationen, Western Blot-Analysen sowie massenspektrometrische Analysen zeigten, dass sich der AF4•MLL-Proteinkomplex aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt; es wurden P-TEFb, HEXIM1, NFKB1, NPM1, DDX6 und das AF4-Wildtypprotein aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, CREBBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex nachgewiesen. Auf diese Weise werden im AF4•MLL-Proteinkomplex Eigenschaften bzw. Funktionen beider Wildtyp-Proteinkomplexe kombiniert. Um einen weiteren Hinweis auf die Funktion zu erhalten, wurde ergänzend ein in vitro Histon-Methyltransferase-Assay etabliert, der für beide gereinigten Proteinkomplexe eine Histonmethyltransferase-Aktivität zeigte. Basierend auf den vorliegenden Daten kann eine Konkurrenzsituation zwischen dem AF4•MLL-Proteinkomplex und den beiden Wildtyp-Proteinkomplexen um die entsprechenden Faktoren angenommen werden, welche die Assemblierung vollständiger und funktioneller Wildtyp-Proteinkomplexe verhindern könnte. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf Funktionen des AF4•MLL-Proteins in transkriptionellen Prozessen, Histonacetylierungen sowie der H3K4-Trimethylierung hin. Die Fehlregulation epigenetischer und transkriptioneller Prozesse durch die Anwesenheit des AF4•MLL-Proteinkomplexes spielt somit vermutlich eine entscheidende Rolle im pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation.
Chromosomale Aberrationen des humanen MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia) sind mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert. 5-10% aller akuten myeloischen und lymphatischen Leukämien beruhen auf einer Translokation des MLL Gens mit einem von mehr als 50 bekannten Partnergenen. Die reziproke Translokation t(4;11), die zur Entstehung der zwei Fusionsgene MLL/AF4 und AF4/MLL führt, stellt die häufigste genetische Veränderung des MLL Gens dar und prägt sich in Form einer akuten lymphatischen Leukämie aus. Besonders häufig sind von dieser Erkrankung Kleinkinder und Patienten mit einer Sekundärleukämie betroffen. Aufgrund einer ungewöhnlich hohen Resistenz der leukämischen Blasten gegenüber gängigen Therapie-Protokollen ist diese Erkrankung mit einer schlechten Prognose verbunden. Die beiden erzeugten Fusionsgene der t(4;11) werden als Fusionsproteine MLL/AF4 (der11) und AF4/MLL (der4) exprimiert. Transduktionsexperimente verschiedener MLL Translokationen zeigten, dass in vielen Fällen das jeweilige der11 Fusionsprotein (MLL_N/Translokationspartner) starkes onkogenes Potential besitzt und daher vermutlich ursächlich für die Transformation der betroffenen Zellen ist. Im Fall der Translokation t(4;11) hingegen, konnte für das der11 Fusionsprotein MLL/AF4 nur sehr schwaches onkogenes Potential nachgewiesen werden, während das der4 AF4/MLL Fusionsprotein sich als potentes Onkoprotein herausstellte. Untersuchungen zur Aufklärung des pathologischen Mechanismus des AF4/MLL Fusionsproteins zeigten, dass es, analog zum MLL Wildtyp Protein, einer Prozessierung durch die Taspase 1 unterliegt. Desweiteren ist bekannt, dass die gebildeten Proteinfragmente, der4_N und der4_C (MLL_C), über intramolekulare Interaktionsdomänen des MLL Proteins, in der Lage sind miteinander zu komplexieren. In der unprozessierten Form wird das Fusionsprotein über einen Bereich des AF4 Proteins unter Einsatz der E3-Ligasen SIAH 1/2 dem proteasomalen Abbau zugeführt. Nach der Proteolyse und Komplexbildung findet weiterhin eine Erkennung durch die SIAH Proteine statt, jedoch erfolgt keine Degradation mehr. Auf diese Weise kommt es zur Akkumulation des Komplexes, was letztendlich zur Transformation der betroffenen Zellen führt. Eine Möglichkeit dem onkogenen Charakter des AF4/MLL Fusionsproteins entgegen zu wirken, besteht in der Inhibition der Interaktion der zwei Proteinfragmente der4_N und der4_C (=MLL_C). Für eine mögliche Inhibition stellt die Kenntnis der minimalen Kontaktdomäne des MLL Proteins (und damit gleichermaßen des AF4/MLL Proteins) eine Grundvoraussetzung dar. Die grundlegende Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Bestimmung des minimalen intramolekularen Interaktionsinterface. Zu diesem Zweck wurden Interaktionsanalysen verschiedener C-terminaler und N-terminaler MLL Proteinfragmente unter Verwendung des bakteriellen Zwei-Hybrid-Systems sowie eines zellbasierten Protein-Translokation-Biosensor-Systems durchgeführt. Dabei ist es gelungen, die Größe der minimalen Interaktionsdomänen von den bis heute publizierten >150 Aminosäuren auf 58 Aminosäuren im N-terminalen Proteinfragment (FYRN_A3) bzw. 56 Aminosäuren im C-terminalen MLL Fragment (FYRC_B3) einzugrenzen. Eine weitere Verkleinerung führte zu einem Stabilitätsverlust der Interaktion. Eine ungewöhnliche Akkumulation einiger C-terminaler MLL Fragmente, die während der Interaktionsstudien beobachtet wurde, führte zu der Hypothese, dass die generierten Fragmente mit dem zellulären Wildtyp MLL interagieren und möglicherweise als Inhibitor der intramolekularen Interaktion agieren können. Zusätzlich wurde bei diesen Transfektionen eine abnorm hohe Anzahl abgestorbener Zellen festgestellt. Dies wäre damit zu erklären, dass das zelluläre MLL, durch Interaktion mit dem kleinen MLL Fragment, nicht mehr in der Lage ist, seinen natürlichen Funktionen nachzukommen. Der Nachweis der Interaktion des minimierten C-terminalen MLL Proteinfragments FYRC_B3 mit den full length Proteinen MLL sowie AF4/MLL konnte über Co-Immunopräzipitationsversuche erbracht werden. Durchflusscytometrische Analysen transfizierter und Propidiumiodid gefärbter HeLa Zellen sowie t(4;11)-positiver SEM Zellen zeigten eindeutig letale Effekte einiger FYRC-Fragmente auf. Anhand dieser Daten kann postuliert werden, dass die Fragmente FYRB_B3 und FYRC_B1 durch Interaktion mit MLL_N bzw. der4_N die Interaktion der nativen Proteinfragmente MLL_N/der4_N mit MLL_C verhindern und dies in der Folge zum Absterben der Zellen führt. Die Tatsache, dass diese Fragmente einen solch deutlichen Effekt auf die sehr therapieresistenten SEM Zellen haben, zeigt, dass die Inhibierung der intramolekularen Proteininteraktion einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz für Leukämien mit einer Translokation t(4;11) darstellt.