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Dosing accuracy of two disposable insulin pens according to new ISO 11608-1: 2012 requirements.
(2015)
OBJECTIVE: The aim was to compare 2 disposable insulin pens, FlexTouch® (Novo Nordisk, insulin aspart) and SoloSTAR® (Sanofi, insulin glulisine), according to new ISO 11608-1:2012 requirements for dosing accuracy.
METHODS: Sixty pens of each type were tested at 1, 40, and 80 U doses. Following the new ISO requirements, each dose was delivered from the front, middle, and rear one-third of the pen. Statistical analysis was performed using Student's t test.
RESULTS: Both pens delivered all doses within ISO limits. The difference between the average measured dose and the target dose was significantly smaller for SoloSTAR than FlexTouch at 40 U (P = .009) and 80 U (P = .008), but not at 1 U (P = .417).
CONCLUSION: Both insulin pens fulfilled the dosing accuracy requirements defined by ISO 11608-1:2012 at all 3 dosage levels.
The utilization of Ginkgo biloba in medicinal practice dates back to 1505 A.D. Ironically, the mechanisms of action of Ginkgo are not fully clarified till now. Nowadays, Ginkgo biloba leaf extracts are mainly indicated for mild to moderate cerebrovascular insufficiency and different forms of dementia. The fact that it is an herbal extract composed of several different components indeed adds to the intricacy of finding its mechanisms of actions. Indisputably, many scientists tried to elucidate the mechanisms of actions of Ginkgo. The first step to achieve this goal was to standardize the leaf extract. The standardized Ginkgo leaf extract contains 22-27 % flavonol glycosides, 2.8-3.4 % of ginkgolide A, B and C, as well as approximately 2.6-3.2 % bilobalide and below 5 ppm ginkgolic acids. A widespread standardized Ginkgo extract is the EGb 761, which was utilized in the current work. One of the earliest proposed mechanisms is the ability of the Ginkgo extract to act as an anti-oxidant, which could be explained by its high flavonoid contents. However, without doubt EGb 761 encompasses other characteristics which distinguish it from other herbal extracts that are also rich in flavonoids. Since free radicals and reactive oxygen species are highly associated with the mitochondrial functions, examination of the effect of EGb 761 on mitochondrial functions was lately addressed. Moreover, this was encouraged as the link between Alzheimer’s disease [AD] and the mitochondria started to emerge. Previously, our group observed mitochondrial protective actions of EGb 761 on cell culture in vitro. Furthermore, anti-apoptotic effects were previously described for EGb 761. However, only very few studies addressed the single constituents and their effect on mitochondrial functions. Flavonoids were studied in several other plant extracts and their radical scavenging activity is unquestionable, but EGb 761 has anti-apoptotic actions which may be attributed to its terpenoid fraction. Exclusively found in the Ginkgo plant, are the ginkgolides and therefore their actions are not yet fully elucidated. Moreover, those who attempted to address these constituents concentrated on one or two candidates, for example bilobalide or ginkgolide B and ignored the rest. Unfortunately, this led to incomplete results, and one couldn’t compare the relative activities of all EGb 761 components in order to state whether all the components are effective or not. ...
Hepatitis Delta virus (HDV) is a satellite of Hepatitis B virus with a single-stranded circular RNA genome. HDV RNA genome synthesis is carried out in infected cells by cellular RNA polymerases with the assistance of the small hepatitis delta antigen (S-HDAg). Here we show that S-HDAg binds the bromodomain (BRD) adjacent to zinc finger domain 2B (BAZ2B) protein, a regulatory subunit of BAZ2B-associated remodeling factor (BRF) ISWI chromatin remodeling complexes. shRNA-mediated silencing of BAZ2B or its inactivation with the BAZ2B BRD inhibitor GSK2801 impairs HDV replication in HDV-infected human hepatocytes. S-HDAg contains a short linear interacting motif (SLiM) KacXXR, similar to the one recognized by BAZ2B BRD in histone H3. We found that the integrity of the S-HDAg SLiM sequence is required for S-HDAg interaction with BAZ2B BRD and for HDV RNA replication. Our results suggest that S-HDAg uses a histone mimicry strategy to co-activate the RNA polymerase II-dependent synthesis of HDV RNA and sustain HDV replication.
Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are expressed at high levels in many cancers and contribute to apoptosis resistance. Therefore, they represent promising anticancer drug targets. Here, we report that small molecule IAP inhibitors at subtoxic concentrations cooperate with monoclonal antibodies against TRAIL receptor 1 (Mapatumumab) or TRAIL receptor 2 (Lexatumumab) to induce apoptosis in neuroblastoma cells in a highly synergistic manner (combination index <0.1). Importantly, we identify RIP1 as a critical regulator of this synergism. RIP1 is required for the formation of a RIP1/FADD/caspase-8 complex that drives caspase-8 activation, cleavage of Bid into tBid, mitochondrial outer membrane permeabilization, full activation of caspase-3 and caspase-dependent apoptosis. Indeed, knockdown of RIP1 abolishes formation of the RIP1/FADD/caspase-8 complex, subsequent caspase activation and apoptosis upon treatment with IAP inhibitor and TRAIL receptor antibodies. Similarly, inhibition of RIP1 kinase activity by Necrostatin-1 inhibits IAP inhibitor- and TRAIL receptor-triggered apoptosis. By comparison, over-expression of the dominant-negative superrepressor IκBα-SR or addition of the TNFα-blocking antibody Enbrel does not inhibit IAP inhibitor- and Lexatumumab-induced apoptosis, pointing to a NF-κB- and TNFα-independent mechanism. Of note, IAP inhibitor also significantly reduces TRAIL receptor-mediated loss of cell viability of primary cultured neuroblastoma cells, underscoring the clinical relevance. By demonstrating that RIP1 plays a key role in the IAP inhibitor-mediated sensitization for Mapatumumab- or Lexatumumab-induced apoptosis, our findings provide strong rationale to develop the combination of IAP inhibitors and TRAIL receptor agonists as a new therapeutic strategy for the treatment of human cancer.
Polypharmakologie hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung in der pharmazeutischen Forschung gewonnen und könnte in Zukunft zu einem Umdenken in der Entwicklung neuer Wirkstoffe führen. Das wachsende Verständnis für biologische Zusammenhänge, im speziellen für die starke Vernetzung zwischen verschiedenen Signalwegen oder Gewebearten, und die daran beteiligten Proteine, könnten zu gänzlich neuen Strategien führen. Beispiele aus dem Bereich der Onkologie und der Entwicklung von Neuroleptika haben bereits gezeigt, dass eine Intervention an mehreren Stellen eines solchen komplexen Netzwerkes zu wirksameren und gleichzeitig sichereren Wirkstoffen führen kann. Erkenntnisse aus der Systembiologie und die retrospektive Analyse bereits zugelassener Wirkstoffe machen deutlich, dass viele erfolgreiche Wirkstoffe nur aufgrund ihres polypharmakologischen Wirkprofils so effektiv sind – wenngleich dies bei Ihrer Entwicklung oftmals nicht beabsichtigt war.
Das rationale Design sogenannter „multitarget Wirkstoffe“ stellt bis heute eine große Herausforderung dar. Aus Sicht eines medizinischen Chemikers bedeutet es die Verknüpfung zweier, auf unterschiedliche Targets aktiver, Liganden zu einem neuen Wirkstoff, ohne einen signifikanten Aktivitätsverlust auf die einzelnen Targets herbeizuführen. Ein naheliegender Ansatz zur Verbindung zweier Liganden ist die Verknüpfung der Moleküle über einen flexiblen Linker. Dieser Ansatz kann zwar in vitro zu sehr potenten Wirkstoffen führen, birgt jedoch pharmakokinetische Nachteile, bedingt durch das hohe Molekulargewicht, die sich oft erst in vivo zeigen. Die Schwierigkeit besteht also zum einen in der Aufrechterhaltung der individuellen Aktivität auf das jeweilige Target und zum anderen im Erreichen einer guten Balance zwischen Aktivität und Komplexität des Liganden. Damit soll ausreichend Raum für spätere Optimierung von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften gewährleistet werden. Bisher wurden nur wenige Computer-gestützte Ansätze entwickelt um diese und ähnliche Fragestellungen zu bearbeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer in silico Verfahren zur Identifzierung von multitarget Liganden ein Kernthema dieser Arbeit. Die Implementierung eines Fragment-basierten Ansatzes hält die Komplexität der Liganden möglichst gering und bietet genügend Raum für eine anschließende, multi-dimensionale Optimierung an zwei oder mehreren Targets.
In der ersten Studie wurde eine Pharmakophor-basierte Strategie verfolgt. Die Repräsentation eines Liganden durch ein Pharmakophormodell stellt eine abstrakte dreidimensionale Darstellung der für die biologische Aktivität relevanten Strukturmerkmale dar. Diese Abstraktion vereinfacht den Vergleich zweier Verbindungen und erlaubt gleichzeitig Spielraum für chemische Variabilität. Bei diesem Ansatz wurden Pharmakophormodelle, jeweils für eine Vielzahl aktiver Liganden zweier Targets, erzeugt und paarweise miteinander verglichen. Sobald zwei Pharmakophormodelle eine genügend große Anzahl an Pharmakophorpunkten in räumlich ähnlicher Orientierung teilen, stellt dieses gemeinsame Pharmakophor die Basis eines potentiellen multitarget Liganden dar. In der beschriebenen Studie wurde dieses Verfahren anhand von aktiven Liganden der löslichen Epoxid Hydrolase (sEH) und 5-Lipoxygenase (5-LO) evaluiert. Die auf dieser Grundlage identifizierten multitarget Pharmakophormodelle wurden zum anschließenden Screening einer Fragement-Datenbank verwendet und führten zu 9 aktiven Liganden für sEH und 5-LO. Diese Liganden besitzen chemische Grundgerüste (Scaffolds), die in der Literatur bisher noch nicht als aktive sEH- oder 5-LO-Liganden beschrieben wurden und somit eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe darstellen. Für eine der gefundenen Verbindungen, basierend auf einem Benzimidazol-Gerüst, wurden Aktivitäten im niedrig mikromolaren Bereich für beide Targets bestimmt. Diese Verbindung und weitere Derivate werden zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert um eine erste Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufzustellen und die Eignung dieser Substanzklasse als potentielle Leitstruktur für neue, duale sEH/5-LO Liganden zu überprüfen.
Parallel dazu wurde eine Substruktur-basierte Strategie verfolgt um Rückschlüsse auf jene Strukturmerkmale zu ziehen, die für die Aktivität auf dem jeweiligen Target verantwortlich sein könnten. Dazu wurden in einem ersten Schritt alle aktiven Liganden zweier Targets auf ihre möglichst maximalen gemeinsamen Substrukturen reduziert. Für jedes Target wird damit ein Set von Substrukturen generiert, welches die für die Bindung an das jeweilige Target charakteristische Strukturmerkmale enthält. Diese Substrukturen, repräsentieren den chemischen Raum des jeweiligen Targets und stellten die Trainingsdaten für den entwickelten multiSOM Ansatz dar. Dieser Ansatz basiert auf dem automatisierten Vergleich von selbst-organisierenden Karten und hebt Gemeinsamkeiten zwischen diesen Substruktursets in einer leicht zu interpretierenden, visuellen Form hervor. Dies erlaubt die Identifizierung von gemeinsamen Substrukturen aus beiden verwendeten Substruktursets, welche potentielle duale Strukturelemente darstellen.
Die Validierung dieses Ansatzes erfolgte erneut auf Basis bekannter 5-LO- und sEH-Liganden. Unter 24 ausgewählten Verbindungen konnten neun Fragmente identifiziert werden, die auf einem der beiden Targets und 5 Fragmente, die auf beiden Targets im niedrig mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Einer dieser dualen Fragmente wurden anschließend als Basis für eine Substruktursuche in einer Inhouse Datenbank verwendet. Die daraus resultierende Verbindung, die einen Teil des ursprünglichen Fragments beinhaltet, wirkt sowohl auf sEH als auch 5-LO in nanomolaren Konzentrationen inhibierend. Auch diese Verbindung wird zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert und stellt eine vielversprechende Basis als Leitstruktur neuer dualer sEH/5-LO-Liganden dar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellten Methoden neue Möglichkeiten bieten, das rationale Design von multitarget Liganden zu unterstützen. Die Pharmakophor-basierte Methode kann besonders dann von Vorteil sein, wenn bereits Strukturinformationen für beide Targets bzw. die bioaktiven Konformationen der Liganden vorliegen. Für einen ausschließlichen Liganden-basierten Ansatz stellt die Verwendung der MultiSOM, und damit die Identifizierung gemeinsamer Strukturelemente der Liganden, die bessere Methode dar.
Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Studien zur Identifizierung neuer Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Partialagonisten beschrieben. Auch in diesem Fall wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Da FXR eine starke strukturelle Anpassung abhängig vom gebundenen Liganden aufweist („induced fit“), sind rein strukturbasierte virtuelle Screening-Methoden nur eingeschränkt einsetzbar. Aus diesem Grund sollte zunächst ein Liganden-basierter Drug Repurposing Ansatz verfolgt werden, bei dem bereits zugelassene Wirkstoffe mit potentiell FXR-modulierenden Eigenschaften identifiziert werden sollten. Der Vorteil des Drug Repurposing besteht darin, dass die betrachteten Wirkstoffe bereits intensiv hinsichtlich Sicherheit und Bioverfügbarkeit untersucht wurden. Somit kann man sich bei der Entwicklung verstärkt auf die biologische Aktivität auf das neue Target konzentrieren.
Erneut wurden selbstorganiserende Karten (SOMs) verwendet, um zugelassene Wirkstoffe mit FXR-Aktivität zu identifizieren. Trainiert wurde die SOM auf einem Datensatz bestehend aus bekannten FXR-Agonisten zum einen und der DrugBank Datenbank mit zugelassen Wirkstoffen zum anderen. Die Eigenschaft der SOM Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität in räumlicher Nähe auf der Karte zu clustern führte zu einer Anhäufung an bekannten FXR-Agonisten auf einigen wenigen Neuronen. Auf solchen sogenannten Aktivitätsinseln wurden zusätzlich auch zugelassene Wirkstoffe platziert, wenn ihre Ähnlichkeit zu den FXR-Agonisten ausreichend hoch war. Die auf den Aktivitätsinseln angesiedelten Wirkstoffe wurden anschließend bestellt und hinsichtlich ihrer FXR-Aktivität in einem Transaktivierungs-Assay untersucht. Unter den bestellten Verbindungen konnten sechs Liganden mit einer signifikanten relativen FXR-Aktivierung identifiziert werden. Weitere Hinweise auf eine mögliche FXR-Aktivierung der Verbindungen gaben in der Literatur beschriebene Nebeneffekte, die mit einer FXR-Aktivierung in Zusammenhang stehen könnten. Die potentenste Verbindung, der zugelassenen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib, wurde zusätzlich in Bezug auf FXR-basierte SHP mRNS Induktion untersucht. In qPCR-Experimenten konnte dabei eine mit GW4064 vergleichbare Induktion in HepG2 Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse untermauern die aus der Literatur gewonnen Vermutung, dass Imatinib FXR-modulierende Eigenschaften besitzt und somit eine interessante Grundlage für die Entwicklung neuer FXR-Partialagonisten darstellt. Zu diesem Zeitpunkt werden weitere Imatinib-Derivate synthetisiert und diese Struktur als mögliche Leitstruktur charakterisiert.
In einer zweiten Studie wurde eine Kombination aus Liganden- und Struktur-basierten Ansatz verfolgt. Dabei wurden sämtliche Struktur-Informationen aus publizierten FXR-Kristallstrukturen und den darin kokristallisierten Liganden gebündelt, um die Auswirkungen des zu Beginn erwähnten induced-fit Effekts zu minimieren. Auf Basis der ko-kristallisierten Liganden wurden zunächst zwei Konsensus-Pharmakophormodelle erstellt. Diese Modelle wurden in einem anschließenden Schritt jeweils mit einem Konsensus-Pharmakophormodell, das mit Hilfe von Protein-Ligand-Interaktions-Fingerprints (PLIF) aus den korrespondieren Kristallstrukturen abgeleitet wurde, überlagert und kombiniert. Diese kombinierten Modelle vereinten sowohl Informationen der strukturellen Gemeinsamkeiten der Liganden als auch gemeinsame, relevante Interaktionspunkte zwischen Ligand und Rezeptor aus den Kristallstrukturen. Das Pharmakophor-Screening mit anschließender Docking Analyse führte zu 42 getesteten Verbindungen, von denen 12 Strukturen eine signifikante relative FXR-Aktivierung zeigten. Darunter konnte ein Partial-Agonist mit einem EC50 von 480 nM bei einer maximalen Aktivierung von ca. 14% im Vergleich zur Referenz GW4064 identifiziert werden. Auch diese Verbindung wird zum aktuellen Zeitpunkt weiter charakterisiert und könnte in Zukunft als Leitstruktur für neue FXR-Partialagonisten dienen.
In beiden Studien konnten neue FXR-Agonisten mit bisher noch nicht beschriebenen Scaffolds identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung bereits zugelassener Wirkstoffe für neue Indikationen eine attraktive Quelle für neue Leitstrukturen darstellen kann und im Zuge dessen bisher ungeklärte Nebeneffekte bekannter Wirkstoffe aufgeklärt werden können.
Abschließend lässt sich festhalten, dass selbstorganisierende Karten eine universelle Methode zur Erkennung und Analyse von polypharmakologischen Zusammenhängen darstellen. Des Weiteren lassen sich mit ihrer Hilfe chemische Räume repräsentieren und durch den in dieser Arbeit entwickelten MultiSOM-Ansatz direkt vergleichen. Dies ermöglicht auf intuitive und effiziente Weise die Identifizierung von überlappenden chemischen Räumen und somit möglicher polypharmakologischer Zusammenhänge.
Over the past two decades the “one drug – one target – one disease” concept became the prevalent paradigm in drug discovery. The main idea of this approach is the identification of a single protein target whose inhibition leads to a successful treatment of the examined disease. The predominant assumption is that highly selective ligands would avoid unwanted side effects caused by binding to secondary non-therapeutic targets. In recent years the results of post-genomic and network biology showed that proteins rarely act in isolated systems but rather as a part of a highly connected network [1]. In addition this connectivity leads to more robust systems that cannot be interfered by the inhibition of a single target of that network and consequently might not lead to the desired therapeutic effect [2]. Furthermore studies prove that robust systems are rather affected by weak inhibitions of several parts than by a complete inhibition of a single selected element of that system [3]. Therefore there is an increasing interest in developing drugs that take effect on multiple targets simultaneously but is concurrently a great challenge for medicinal chemists. There has to be a sufficient activity on each target as well as an adequate pharmacokinetic profile [4]. Early design strategies tried to link the pharmacophors of known inhibitors, however these methods often lead to high molecular weight and low ligand efficacy. We present a new rational approach based on a retrosynthetic combinatorial analysis procedure [5] on approved ligands of multiple targets. These RECAP fragments are used to design a large combinatorial library containing molecules featuring chemical properties of each ligand class. The molecules are further validated by machine learning models, like random forests and self-organizing maps, regarding their activity on the targets of interest.
Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are in prime focus of current research in cancer immunotherapy. Facilitating CAR T cell generation is among the top goals. We have recently demonstrated direct in vivo generation of human CD19-CAR T cells by targeting CD8+ cells using lentiviral vectors (LVs). The anti-tumor potency of in vivo generated CAR T cells was assessed in human PBMC-transplanted NSG mice carrying i.v. injected CD19+ Nalm-6 tumor cells. A single injection of CD8-targeted LV delivering CD19-CAR was sufficient to completely eliminate the tumor cells from bone marrow and spleen, whereas control animals contained high levels of CD19+ cells. Tumor elimination was due to in vivo generated CAR+ cells. Notably, these were not only composed of T lymphocytes but also included CAR+ natural killer cells (NK and NKT). This is the first demonstration of tumor elimination by in vivo generated human CAR T cells.
The human 5-lipoxygenase (5-LO), encoded by the ALOX5 gene, is the key enzyme in the formation of pro-inflammatory leukotrienes. ALOX5 gene transcription is strongly stimulated by calcitriol (1α, 25-dihydroxyvitamin D3) and TGFβ (transforming growth factor-β). Here, we investigated the influence of MLL (activator of transcript initiation), AF4 (activator of transcriptional elongation) as well as of the leukemogenic fusion proteins MLL-AF4 (ectopic activator of transcript initiation) and AF4-MLL (ectopic activator of transcriptional elongation) on calcitriol/TGFβ-dependent 5-LO transcript elongation. We present evidence that the AF4 complex directly interacts with the vitamin D receptor (VDR) and promotes calcitriol-dependent ALOX5 transcript elongation. Activation of transcript elongation was strongly enhanced by the AF4-MLL fusion protein but was sensitive to Flavopiridol. By contrast, MLL-AF4 displayed no effect on transcriptional elongation. Furthermore, HDAC class I inhibitors inhibited the ectopic effects caused by AF4-MLL on transcriptional elongation, suggesting that HDAC class I inhibitors are potential therapeutics for the treatment of t(4;11)(q21;q23) leukemia.
Remodeling of extracellular matrix (ECM) is an important physiologic feature of normal growth and development. In addition to this critical function in physiology many diseases have been associated with an imbalance of ECM synthesis and degradation. In the kidney, dysregulation of ECM turnover can lead to interstitial fibrosis, and glomerulosclerosis. The major physiologic regulators of ECM degradation in the glomerulus are the large family of zinc-dependent proteases, collectively refered to matrix metalloproteinases (MMPs). The tight regulation of most of these proteases is accomplished by different mechanisms, including the regulation of MMP gene expression, the processing and conversion of the inactive zymogen by other proteases such as serine proteases and finally the inhibition of active MMPs by endogenous inhibitors of MMPs, denoted as tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Namely, the MMP-9 has been shown to be critically involved in the dysregulation of ECM turnover associated with severe pathologic conditions such as rheumatoid arthritis or fibrosis of lung, skin and kidney. In the present work I searched for a possible modulation of MMP-9 expression and/or activity in glomerular mesangial cells which are thought as key players of many inflammatory and non-inflammatory glomerular diseases. I found that various structurally different PPARalpha agonists such as WY-14,643, LY-171883 and fibrates potently suppress the cytokine-induced MMP-9 expression in renal MC. Furthermore, I demonstrate that the inhibition of MMP-9 expression by PPARalpha agonists was paralleled by a strong increase of cytokine-induced iNOS expression and subsequent NO formation, suggesting that PPARalpha-dependent effects on MMP-9 expression level primarily result from alterations in NO production which in turn reduces the MMP-9 mRNA half-life. Searching for the detailed mechanism of NO-dependent effects on MMP-9 mRNA stability, I found that NO either given from exogenous sources or endogenously produced increases the MMP-9 mRNA degradation by decreasing the expression of the mRNA stabilizing factor HuR. Furthermore, I demonstrate a reduction in the RNA-binding capacity of HuR containing complexes to MMP-9 ARE motifs in cells treated with NO. Since the reduction of HuR expression can be mimicked by the cGMP analog 8-Bromo-cGMP, I suggest that NO reduces in a cGMP-dependent manner the expression of HuR. Finally, I elucidated the modulatory effect of extracellular nucleotides, mainly ATP, on cytokine-triggered MMP-9 expression. Interestingly, I found that in contrast to NO, gamma-S-ATP the stable analog of ATP potently amplifies the IL-beta mediated MMP-9 expression. The increase in mRNA stability was paralleled by an increase in the nuclear-cytosolic shuttling of the mRNA stabilizing factor HuR. Furthermore, I demonstrate an increase in the RNA-binding capacity of HuR containing complexes to the 3'-UTR of MMP-9 by ATP. In summary, the data presented here may help to find new targets (posttranscriptional regulation) that could be used to manipulate or modulate the expression of not only MMP-9 but also other genes regulated on the level of mRNA stability.
Binding free energy calculations that make use of alchemical pathways are becoming increasingly feasible thanks to advances in hardware and algorithms. Although relative binding free energy (RBFE) calculations are starting to find widespread use, absolute binding free energy (ABFE) calculations are still being explored mainly in academic settings due to the high computational requirements and still uncertain predictive value. However, in some drug design scenarios, RBFE calculations are not applicable and ABFE calculations could provide an alternative. Computationally cheaper end-point calculations in implicit solvent, such as molecular mechanics Poisson–Boltzmann surface area (MMPBSA) calculations, could too be used if one is primarily interested in a relative ranking of affinities. Here, we compare MMPBSA calculations to previously performed absolute alchemical free energy calculations in their ability to correlate with experimental binding free energies for three sets of bromodomain–inhibitor pairs. Different MMPBSA approaches have been considered, including a standard single-trajectory protocol, a protocol that includes a binding entropy estimate, and protocols that take into account the ligand hydration shell. Despite the improvements observed with the latter two MMPBSA approaches, ABFE calculations were found to be overall superior in obtaining correlation with experimental affinities for the test cases considered. A difference in weighted average Pearson () and Spearman () correlations of 0.25 and 0.31 was observed when using a standard single-trajectory MMPBSA setup ( = 0.64 and = 0.66 for ABFE; = 0.39 and = 0.35 for MMPBSA). The best performing MMPBSA protocols returned weighted average Pearson and Spearman correlations that were about 0.1 inferior to ABFE calculations: = 0.55 and = 0.56 when including an entropy estimate, and = 0.53 and = 0.55 when including explicit water molecules. Overall, the study suggests that ABFE calculations are indeed the more accurate approach, yet there is also value in MMPBSA calculations considering the lower compute requirements, and if agreement to experimental affinities in absolute terms is not of interest. Moreover, for the specific protein–ligand systems considered in this study, we find that including an explicit ligand hydration shell or a binding entropy estimate in the MMPBSA calculations resulted in significant performance improvements at a negligible computational cost.
IKZF1 deletion (ΔIKZF1) is an important predictor of relapse in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Because of its clinical importance, we previously mapped breakpoints of intragenic deletions and developed a multiplex PCR assay to detect recurrent intragenic ΔIKZF1. Since the multiplex PCR was not able to detect complete deletions (IKZF1 Δ1-8), which account for ~30% of all ΔIKZF1, we aimed at investigating the genomic scenery of IKZF1 Δ1-8. Six samples of cases with IKZF1 Δ1-8 were analyzed by microarray assay, which identified monosomy 7, isochromosome 7q, and large interstitial deletions presenting breakpoints within COBL gene. Then, we established a multiplex ligation-probe amplification (MLPA) assay and screened copy number alterations within chromosome 7 in 43 diagnostic samples with IKZF1 Δ1-8. Our results revealed that monosomy and large interstitial deletions within chromosome 7 are the main causes of IKZF1 Δ1-8. Detailed analysis using long distance inverse PCR showed that six patients (16%) had large interstitial deletions starting within intronic regions of COBL at diagnosis, which is ~611 Kb downstream of IKZF1, suggesting that COBL is a hotspot for ΔIKZF1. We also investigated a series of 25 intragenic deletions (Δ2–8, Δ3–8 or Δ4–8) and 24 relapsed samples, and found one IKZF1-COBL tail-to-tail fusion, thus supporting that COBL is a novel hotspot for ΔIKZF1. Finally, using RIC score methodology, we show that breakpoint sequences of IKZF1 Δ1-8 are not analog to RAG-recognition sites, suggesting a different mechanism of error promotion than that suggested for intragenic ΔIKZF1.
Boswelliasäuren (BAs) sind pentazyklische Triterpene, die als biologisch aktive Komponenten des Weihrauchharzes aus Boswellia serrata identifiziert wurden. Weihrauchpräparate werden seit langer Zeit in der indischen Medizin zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen angewandt. Klinische Untersuchungen an Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und peritumoralen Hirnödemen zeigen ebenfalls vielversprechende Effekte. Bislang wurde die 5-Lipoxygenase (5-LO) als Schlüsselenzyms der Leukotrien(LT)-Biosynthese und die Elastase als molekulare Targets der BAs identifiziert und in direkten Zusammenhang mit der antiinflammatorischen Wirkung gebracht. LTs sind wirksame Mediatoren entzündlicher und allergischer Reaktionen, die von Leukozyten freigesetzt werden und ihre Effekte über spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) vermitteln. Unter den verschiedenen getesteten BAs ist 3-O-Acetyl-11-Keto-BA (AKBA) der potenteste 5-LO Inhibitor, wohingegen 11-Keto-BA (KBA) etwa 3-fach weniger aktiv ist und BAs ohne 11-Keto-Funktion (ß-BA und A-ß-BA) kaum wirksam sind. Darüber hinaus lassen AKBA und KBA eine wesentlich potenterer Hemmung der 5-LO Aktivität in intakten Zellen als in zellfreien Systemen erkennen. Die Hemmung der 5-LO bzw. der LT-Biosynthese als antiinflammatorisches Wirkprinzip der BAs wird derzeit sehr kontrovers diskutiert und ist aufgrund der Diskrepanz zwischen den erreichbaren Blutspiegeln und den IC50-Werten für die 5-LO Hemmung eher unwahrscheinlich. Ziel der Arbeit war es die molekularen Grundlagen der pharmakologischen Eigenschaften von BAs aufzuklären. Der Schwerpunkt lag bei der Identifizierung und Charakterisierung zentraler Signaltransduktionsmechanismen, die von BAs in menschlichen Blutzellen (polymorphkernigen Leukozyten (PMNL), Thrombozyten) vermittelt werden. Daneben sollten funktionelle Zellantworten untersucht und in einen kausalen Zusammenhang mit der Signaltransduktion und einer Rezeptoraktivierung gebracht werden. Parallel dazu wurde die Wirkung der BAs auf eukaryontische Zelllinien (MM6 Zellen, HL60 Zellen) untersucht. Überraschenderweise konnte festgestellt werden, dass KBA und AKBA in Konzentrationen > 10 µM potente Aktivatoren von PMNL sind, während BAs ohne 11-Keto-Gruppe kaum aktiv sind. Vergleichbar mit chemotaktischen Stimuli (z.B. fMLP, PAF), erhöhen AKBA und KBA die intrazelluläre Ca2+-Konzentration und aktivieren die Mitogenaktivierten Proteinkinasen p38 MAPK und p42/44MAPK. Untersuchungen der proximalen Signaltransduktionswege ergaben, dass die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI 3-K), nicht jedoch die Proteinkinase C, in die AKBA-induzierte MAPK Aktivierung involviert ist. In Analogie zu chemotaktischen Liganden von GPCR (z.B. fMLP, PAF) kommt es durch Zellstimulation mit BAs zu funktionellen Zellantworten in Leukozyten, Es konnte gezeigt werden, dass 11-Keto-BAs in der Lage sind, die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von Arachidonsäure (AA) und ihre anschließende Metabolisierung durch 5-LO in PMNL zu induzieren, Dies ist einleuchtend, da diese Prozesse u.a. durch Ca2+ Mobilisierung und MAPK Aktivierung vermittelt werden können. Die pharmakologische Charakterisierung der zugrundeliegenden Signalwege liefert Hinweise auf eine Abhängigkeit von Ca2+, die Beteiligung der PI 3-K und der p42/44MAPK. Im Gegensatz zu AKBA und KBA sind BAs ohne 11-Keto-Gruppe (ß-BA und A-ß-BA) potente Agonisten für Thrombozyten und stimulieren, in ähnlichem Ausmaß wie Thrombin, die Ca2+ Mobilisierung und die Aktivierung von MAPK. Auch funktionelle Zellantworten wie die Bereitstellung von AA sowie deren Metabolisierung durch 12-LO werden durch BAs ohne Keto-Funktion induziert. Zusammenfassend sind also BAs in hohen, pharmakologisch nicht-relevanten Konzentrationen als multifunktionelle Agonisten inflammatorischer Prozesse aufzufassen. Es ist jedoch denkbar, dass BAs in niedrigen Konzentrationen eine antagonistische Wirkung an bestimmten Rezeptoren gegenüber chemotaktischen Faktoren (z.B. PAF, LTB4) ausüben. Dies könnte eine plausible Erklärung für die entzündungshemmenden Wirkungen der Boswelliasäuren sein.
Systematisch verabreichte Chemotherapeutika sind oft uneffektiv bei der Behandlung von Krankheiten des zentralen Nervensystems (ZNS). Eine der Ursachen hierfür ist der unzureichende Arzneistoff-Transport ins Gehirn aufgrund der Blut-Hirn-Schranke. Eine der Strategien für den nicht-invasiven Wirkstoff-Transport ins Gehirn ist die Verwendung von Nanopartikeln. Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikel, die mit Polysorbat 80 (Tween® 80) überzogen wurden, können die Blut-Hirn-Schranke passieren und somit Wirkstoffe ins Gehirn transportieren. Wird die Blut-Hirn-Schranke durch einen Hirntumor partiell beschädigt und hierdurch ihre Permeabilität am Ort des Tumors erhöht, können Nanopartikel den Tumor zusätzlich durch den sogenannten EPR-Effekt erreichen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beladung der Nanopartikel durch Variation der Formulierungparameter mit dem Ziel optimiert, eine Formulierung mit höherer Wirksamkeit für die Therapie von Glioblastom-tragenden Ratten zu entwickeln. Außerdem wurde das Potential von Doxorubicin, das an mit „Stealth Agents“ überzogenen Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikel gebunden war, für die Chemotherapie von Hirntumoren untersucht. Im zweiten Teil dieser Studie wurden die Gehirn- und Körperverteilung in gesunden und in Glioblastom-101/8-tragenden Ratten nach i.v.-Gabe von Poly(butyl-2-cyano[3- 14C]acrylat)-Nanopartikeln, die mit Polysorbat 80 beschichtet wurden, und solchen, die noch zusätzlich mit Doxorubicin geladen waren (DOX-14C-PBCA + PS), untersucht. Die Standardformulierung von Doxubicin-Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikeln (DOX-NP) wurde durch anionische Polymerisierung von Butylcyanoacrylat in Anwesenheit von DOX hergestellt. Zusätzlich wurden unterschiedliche DOX-NP Formulierungen durch Veränderung der Herstellung produziert. Das therapeutische Potential der Formulierungen wurde in Ratten mit ins Gehirn transplantieren Glioblastom 101/8 untersucht. Neben Polysorbat 80 wurden Poloxamer 188 und Poloxamin 908 als Überzugsmaterial verwendet. Die Resultate ergaben, dass die mit Polysorbat 80 überzogene Standardformulierung am effektivsten war. Die höhere Wirksamkeit von DOX-NP+PS 80 könnte durch die Fähigkeit dieser Träger erklärt werden, den Wirkstoff während eines frühen Stadiums der Tumorentwicklung durch einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus, der durch den PS 80-Überzug aktiviert wurde über die intakte Blut-Hirn-Schranke, zu transportieren. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass Poloxamer 188 und Poloxamin 908 den antitumoralen Effekt von DOX-PBCA beträchtlich verbessern. Der anti-tumorale Effekt dieser Formulierungen könnte möglicherweise dem EPR-Effekt zugeschrieben werden. Es ist bekannt, dass die tumorale Arzneistoff-Aufnahme durch den EPR-Effektes für lang-zirkulierende Wirkstoffträger ausgeprägter ist und so mehr Wirkstoff durch die Tumor-geschädigte Blut-Hirn-Schranke gelangt. Unbeschichtete Nanopartikel, Polysorbat 80-beschichtete Nanopartikel oder mit Doxorubicin beladene und mit Polysorbat 80 beschichtete Nanopartikel wurden in gesunden und Tumor-tragenden Ratten injiziert. Diese Nanopartikel-Präparationen zeigten einer unterschiedliche Korpenverteilung in den Ratten. Unbeschichtete Nanopartikel sammelten sich in den RES-Organen an. Mit PS 80 beschichtete NP reduzierten die Aufnahme der NP in Leber und Milz, während sich die Konzentration der NP in der Lunge erhöhte. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Änderung der Oberflächeneigenschaften der NP durch das Tensid, zu einer Interaktion mit unterschiedlichen Opsoninen führt, welches die Aufnahme der NP von verschiedenen phagozitierenden Zellen erleichtert. Hingegen war die Aufnahme der mit DOX beladenen, PS 80-beschichteten Nanopartikel den unbeschichteten Partikel ähnlich. Im Vergleich mit gesunden Ratten und mit Tumor-tragenden Ratten hingegen war die Konzentration der NP im Gehirn von Tumor tragenden Ratten 10 Tage nach der Tumor-implantation signifikant höher. In Anwesenheit des Glioblastoms ist der Transport von NP in das Gehirn das Resultat verschiedener Faktoren: zusätzlich zur Fähigkeit von PS 80-Nanopartikeln, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, extravasieren diese Träger wegen des EPR Effekts über das durch den Tumor undichte Endothelium. Die Konzentration von PS 80 [14C]-PBCA NP war im Glioblastom signifikant höher als mit DOX [14C]-PBCA NP. Dieses Phänomen kann durch die unterschiedliche Mikroumgebung von zerebralem intra-tumoralen und intaktem Gehirngewebe erklärt werde. Insbesondere können sich die positive Ladung der tumoralen Regionen und die positive Ladung der DOX [14C]-PBCA NP negativ beeinflussen. Dennoch waren die Doxorubicin-Konzentration in Glioblastom ausreichend, einen therapeutischen Effekt zu ermöglichen.
Seit der erstmaligen Beschreibung der MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionisation) durch Michael Karas und Franz Hillenkamp, welche die massenspektrometrische Analyse auch großer Proteine über 100 kDa erlaubt, fand diese Technik sowohl unter den Massenspektrometrie-Gruppen als auch in Biochemischen Laboratorien rasche Verbreitung. MALDI kann inzwischen auf eine breite Palette von Biomolekülen angewendet werden und stellt heute - neben Elektrospray (ESI) -eine der beiden gebräuchlichsten massenspektrometrischen Methoden überhaupt dar. In ähnlicher Weise erlangte das Gebiet der Proteomics, der "systematischen Erforschung der zahlreichen und unterschiedlichsten Eigenschaften von Proteinen in paralleller Weise mit der Zielsetzung einer detaillierten Beschreibung der Struktur, Funktion und Steuerung biologischer Systeme im gesunden und krankhaften Zustand" eine Schlüsselstellung in der Biologie und damit einen erheblichen Einfluss auf alle Gebiete der Biologie, der Pharmazie und medizinisch verwandter Bereiche. In der Tat sind Proteine an allen biologischen Aktivitäten beteiligt und weisen die vielfaltigsten Eigenschaften auf, die in ihrer Gesamtheit zu unserem Verständnis biologischer Systeme beitragen. Die systematische Untersuchung dieser Eigenschaften macht das Gebiet der Proteomics aus und beinhaltet die Erforschung der Sequenz, Menge, Modifikationen, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, der biologischen Aktivität, sub-zellulären Verteilung und dreidimensionalen Struktur. .... Letztlich wäre es für den Analytiker wünschenswert, aiie Schritte der MS-basierten Proteomics im Detail zu verstehen und damit vollständig zu beherrschen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb die drei entscheidenden Probenvorbereitungsschritte der MALDI-MS - gestützten Pmteomics näher untersucht. Proteinverdau: Der gebräuchliche Ansatz der MS-basierten Proteomics beinhaltet im ersten Schritt den (enzymatischen) Verdau der Proteinprobe, meist mit Trypsin aufgrund seiner sauber definierten Schnittstellen auf der C-terminalen Seite der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K) bei pH um 8. Dazu wurden in den vergangenen Jahrzehnten etliche Protokolle entwickelt, die auf eine möglichst vollständige Proteolyse und damit hohe Ausbeute an Spaltpeptiden abzielen. Probenaufreinigung: Als Bindeglied zwischen Proteinisolierung und MS-Analyse kommt der Aufieinigung des beim Verdau anfallenden Peptidgemischs entscheidende Bedeutung zu, da die Reinheit der Proben letzten Endes ausschlaggebend für die Qualität der Spektren ist. Auch hier sind kontinuierliche Anstrengungen zur Verbesserung im Gange, wobei in den letzten Jahren insbesondere auch spezielle Aufreinigungsmethoden für den Mikro-Maßstab beschrieben wurden, die den Bedürfnissen der Proteomics besonders entgegenkommen. Probenpräparation: Der letzte entscheidende Schritt vor der MALDI-Analyse besteht im ,,Spotting", dem Auftrag der zu analysierenden Probe zusammen mit der Matrix und deren Co-Kristallisation auf dem Probenteller. Hier bestimmen u.a. die Wahl der Matrix, der verwendeten Lösungsmittel sowie die Zugabe verschiedener Additive das Ergebnis. Obwohl der Einfluss der Matrix und Additiven auf den Desorptionsprozess einleuchtend und aus empirischen Erfahrungen seit langem bekannt ist, fehlt einem rationalen Vorgehen hier insofern die Grundlage, als dass leider noch immer kein Desorptions- und Ionisationsmechanismus gesichert ist. .... Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die vorliegenden Untersuchungen viele interessante Details und neue Ideen lieferten, die zur Verbesserung der MALDI-TOF-Analytik bei Proteomics beitragen können, so etwa: - die Portierung der einfachen, schnelle und preiswerten Probenaufreinigung mittels PVDF- und Nitrozellulosemembranen auf titerplattenbasierte Robotersysteme, bei denen eine automatisierte Zugabe der geeigneten Membranstücke, gefolgt von einfachen Wasch- und Extraktions-Schritten das Probenhandling wesentlich erleichtern sollten, - eine mögliche Verbesserung der Proteinidentifizierung durch Selektion eher hydrophiler Peptide durch neue Materialien wie HILIC, da die Mehrzahl der zur herangezogenen Peptide eher hydrophoben Charakter besitzt, - die weitere Verwendung und Erweiterung der im Rahmen dieser Arbeit erstellten Datenbanken zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen Peptidsequenz, der damit verbundenen physikochemischen Eigenschaften und Selektivitäts- / Unterdrückungseffekten bei der MALDI-MS.
Top-down and bottom-up approaches are the general methods used to analyse proteomic samples today, however, the bottom-up approach has been dominant in the last decade. Establishing a bottom-up method involves not only the choice of adequate instruments and the optimisation of the experimental parameters, but also choosing the right experimental conditions and sample preparation steps. LC-ESI MS/MS has widely been used in this field due to its advanced automation. The primary objective of the present study was to establish a sensitive high-throughput nLC-MALDI MS/MS method for the identification and characterisation of proteins in biological samples. The method establishment included optimisation and validation of parameters such as the capillaries in the HPLC systems, gradient slopes, column temperature, spotting frequencies or the MS and MS/MS acquisition methods. The optimisation was performed using two HPLC-systems (Agilent 1100 series and Proxeon Easy nLC system), three spotters and the 4800 MALDI-TOF/TOF analyzer. Furthermore, samples preparation protocols were modified to fit to the established nLCMALDI- TOF/TOF-platform. The potentials of this method was demonstrated by the successful analysis of complex protein samples isolated from lipid particles, pre-adipocytes/adipocytes tissues, membrane proteins and proteins pulled-down from protein-proteins interaction studies. Despite the small amount of proteins in the lipid particles or oil bodies, and the challenges encountered in studying such proteins, 41(6 novel + 14 mammal specific + 21 visceral specific) proteins were added to the already existing proteins of the secretome of human subcutaneous (pre)adipocytes and 6 novel proteins localised in the yeast lipid particles. Protein-protein interaction studies present another area of application. Here the analytical challenges are mostly due to the loss of binding partner upon sample clean-up and to differentiate from non-specific background. Novel interaction partners for AF4•MLL and AF4 protein complex were identified. Furthermore, a novel sample protocol for the analysis of membrane proteins, based on the less specific protease, elastase, was established. Compared to trypsin, a higher sequence coverage and higher coverage of the transmembrane domains were achieved. The use of this enzyme in proteomics has been limited because of its non specific cleavage. However, from the results obtained in these studies, elastase was found to cleave preferentially at the C-terminal site of the amino acids AVLIST. The advantage of the established protocol over conventional protocols is that the same enzyme can be used for shaving of the soluble dormains of intact proteins in membranes and the digestion of the hydrophobic domain after solubilisation. Furthermore, the solvents used are compatible with the nLC-MALDI method setup. In addition, it was also shown that for less specific enzymes, a higher mass accuracy is required to reduce the rate of false positive identifications, since current search engines are not perfectly adapted for these types of enzymes. A brief statistical analysis of the MS/MS data obtained from the LC-MALDI TOF/TOF system showed that for less specific enzymes, under high-energy collision conditions, approximately 43 % of the fragment ions could not be matched to the known y- b type ions and their resultant internal fragments. This limitation greatly influenced the search results. However, this limitation can be overcome by modifying the N-terminal amino acids with basic moieties such as TMT. The use of elastase as a digestion enzyme in proteomic workflow further increased the complexity of the sample. Therefore, orthogonal multidimensional separation was necessary. Offgel-IEF was used as the separation technique for the first dimension. Here peptides are separated according to the pI. However, the acquired samples could not be loaded to the nLC due to the high viscosity of the concentrated samples when using the standard protocol. In order to achieve compatibility of the Offgel-IEF to the nLC-MALDI-TOF/TOF-platform, the separation protocol of the Offgel-IEF was modified by omitting the glycerol, which was the cause of the viscous solution. The novel glycerol free protocol is advantageous over the conventional method because the samples could directly be picked-up and loaded onto the pre-column without resulting in an increase in back pressure or a subsequent pre-column clogging. The glycerol free protocol was then assessed using purple membrane and membrane fraction of C. glutamicum. The results obtained were comparable to those applied in published reports. Therefore, the absence of glycerol did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In addition the applicability of elastase and the glycerol free Offgel-IEF for quantitation of membrane proteins was assessed. Most of the unique peptides identified were in the acidic region and 85 % were focused only into one fraction and approximately 95 % in only two fractions. These results are in accordance with previously published results (Lengqvist et al., 2007). When compared with theoretical digests of the proteins identified in this study, it can be concluded that basic moiety (TMT) on the peptide backbone, did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In an applied study, changes in the protein content of yeast strain grown in two different media were relatively quantified. For example, prominent proteins, such as the hexose tranporter proteins responsible for transporting glucose accross the membrane, were successfully quantified. Last but not least, the nLC-MALDI-TOF/TOF platform also served as a basis for the development of a high-throughput method for the identification of protein phosphorylation. The establishment of such a method using MALDI has been challenging due to the lack of sensitive matrices, such as CHCA for non-modified peptides, which exhibit a homogenous crystallisation and thus yield stable signal intensity over a long period of time in an automated setup. The first step of this method was the establishment of a matrix/matrix mixture with better crystal morphology and higher analyte signal intensity than the matrix of choice, i.e. DHB. From MS and MS/MS measurements of standard phosphopeptides, a combination of FCCA and CHAC in a 3:1 ratio and 3 mM NH4H2PO4 facilitated high analyte signal intensities and good fragmentation behaviour. Combining a custom-packed biphasic column for the enrichment of phosphopeptides, the applicability of the matrix mixture was assessed in anautomated phosphopeptide analysis using standard phosphopeptides spiked to a 20-fold excess BSA digest. These analyses showed that this method is reproducibile and both flow throughs can be analysed. Applying the method to the analysis of 2 standard phosphoproteins, alpha/beta-casein, and a leukemia related protein, ENL, 13 phosphopeptides from both alpha/beta-Casein and 13 phosphopeptides with 6 phosphorylation sites from the ENL were identified. As a general conclusion, it can be stated that the nLC-MALDI-TOF/TOF method established here in various modifications for different analytical purposes is a robust platform for proteomic analyses.
P2X receptor subunits assemble in the ER of Xenopus oocytes to homomultimeric or heteromultimeric complexes that appear as ATP-gated cation channels at the cell surface. In this work it was intended to investigate the posttranslational modifications such as N-linked glycosylation and disulfide bond formation that is undergone by P2X1 receptors. In addition, the aim of this study was to examine the expression and the quaternary structure of selected P2X receptor isoforms in Xenopus oocytes. The investigation of the quaternary structure of the metabolically or surface labeled His-P2X2 receptor by BN-PAGE revealed that, while the protein complex is only partially assembling in oocytes, the plasma membrane form of the His-P2X2 receptor assembled into trimeric and even hexameric complex as was shown by the BN-PAGE analysis. Besides this finding, it is shown that the His-P2X5 protein that was purified from metabolically or surface labeled oocytes appeared as one single band corresponding to a trimer when analyzed by BN-PAGE. The present study signified that His-P2X6 alone does not reach a defined assembly status and possibly needs the hetero-polymerisation with other P2X subunits to assemble properly for insertion into the plasma membrane. Another finding of this study is that the P2X1 and P2X2 subunits could exist as heteromultimeric protein complexes in the plasma membrane of cells. Purification of surface expressed His-P2X2 subunit allowed the detection of co-injected P2X1 subunit and vice versa in Xenopus oocytes. Incubation with glutardialdehyde led to the cross-linking of P2X2 and P2X1 subunits to dimers and trimers. BN-PAGE analysis of the P2X2/P2X1 complex isolated under nondenaturing conditions from surface-labeled oocytes yielded one distinct band corresponding to a trimeric complex. The analysis of a C-terminally GFP tagged His-P2X1 fusion protein by confocal fluorescence microscopy revealed small clusters of the protein complexes, approximately 4-6 µm in diameter from a diffuse distribution of the protein in the plasma membranes of Xenopus oocytes. The cross-linking or BN-PAGE analysis of the fusion protein resulted in proteins that migrated quantitatively as trimers when purified in digitonin. The analysis of some chimeric constructs confirmed the results of others, which showed that desensitization can be removed from the P2X1 or P2X3 receptor by providing the N-domain from the P2X2 receptor (Werner et al., 1996) The exchange of this domain did not alter the quaternary structure of the chimeras, which showed to be present as trimers when expressed in oocytes. In addition, glycan minus mutants of His-P2X1 receptor were analyzed to examine whether carbohydrate side chains are important for P2X1 subunit assembly, surface expression, or ligand recognition. SDS-PAGE analysis of glycan minus mutants carrying Q instead of N at five individual NXT/S sequons reveals that 284N remains unused because of a proline in the 4 position. The four other sites (153Asn, 184N, 210N, and 300N) carry N-glycans, but solely 300N acquires complex-type carbohydrates. Like parent P2X1 receptor, glycan minus mutants migrate as homotrimers when resolved by blue native PAGE. Recording of ATP-gated currents revealed that elimination of 153N or 210N diminishes or increases functional expression levels, respectively. In addition, elimination of 210N causes a 3-fold reduction of the potency for ATP. If three or all four N-glycosylation sites are simultaneously eliminated, formation of P2X1 receptors is severely impaired or abolished, respectively. It is concluded that at least one N-glycan per subunit of either position is absolutely required for the formation of P2X1 receptors. The SDS-PAGE analysis of surface-labeled His-P2X2 and His-P2X5 receptors revealed that, while the His-P2X2 subunit acquires three complex-type carbohydrates, in case of His-P2X5 polypeptide, only two of the three N-glycans could obtain complex-type carbohydrates during transit of the Golgi apparatus. Furthermore, it was shown that DTT treatment blocked the appearance of newly made His-P2X1 at the plasma membranes of Xenopus oocytes. Also, it was revealed that the effects of DTT on His-P2X1 biogenesis are fully reversible. Removal of the reducing agent leads to subsequent folding and assembly into His-P2X1 receptor complex, followed by transport to the cell surface. The characterization of cysteine minus mutants by SDS PAGE and BN-PAGE demonstrated that, the cysteine substitution in the first cysteine rich domain (C1 - C6) does not have a major effect on assembly for the mutant receptors. In contrast, the replacement of the four cysteine residues (C7 - C10) from the second cysteine rich domain demonstrate a critical importance of this domain for the functional surface expression of P2X1 receptor. The investigations of several double cysteine mutants revealed that according to a similarity in the sensitivity to ATP, the C1 and C6, as well as C2 and C4 and finally C3 and C5 are pairs forming two disulfide bonds in each P2X1 subunit.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder world wide, causing presenile dementia and death of millions of people. During AD damage and massive loss of brain cells occur. Alzheimer’s disease is genetically heterogeneous and may therefore represent a common phenotype that results from various genetic and environmental influences and risk factors. In approximately 10% of patients, changes of the genetic information were detected (gene mutations). In these cases, Alzheimer’s disease is inherited as an autosomal dominant trait (familial Alzheimer’s disease, FAD). In rare cases of familial Alzheimer’s disease (about 1-3%), mutations have been detected in genes on chromosomes 14 and 1 (encoding for Presenilin 1 and 2, respectively), and on chromosome 21 encoding for the amyloid precursor protein (APP), which is responsible for the release of the cell-damaging protein amyloid-beta (ß-amyloid, Aß). Familial forms of early-onset Alzheimer’s disease are rare; however, their importance extends far beyond their frequency, because they allow to identify some of the critical pathogenetic pathways of the disease. All familial Alzheimer mutations share a common feature: they lead to an enhanced production of the Aß, which is the major constituent of senile plaques in brains of AD patients. New data indicates that Aß promotes neuronal degeneration. Therefore, one aim of these thesis was to elucidate the neurotoxic biochemical pathways induced by Aß, investigating the effect of the FAD Swedish APP double mutation (APPsw) on oxidative stress-induced cell death mechanisms. This mutation results in a three- to sixfold increased Aß production compared to wild-type APP (APPwt). As cell models, the neuronal PC12 (rat pheochromocytoma) and the HEK (human embryonic kidney 293) cell lines were used, which have been transfected with human wiltyp APP or human APP containing the Swedish double mutation. The used cell models offer two important advantages. First, compared to experiments using high concentrations of Aß at micromolar levels applied extracellularly to cells, PC12 APPsw cells secret low Aß levels similar to the situation in FAD brains. Thus, this cell model represents a very suitable approach to elucidate the AD-specific cell death pathways mimicking physiological conditions. Second, these two cell lines (PC12 and HEK APPwt and APPsw) with different production levels of Aß may additionally allow to study dose-dependent effects of Aß. The here obtained results provide evidence for the enhanced cell vulnerability caused by the Swedish APP mutation and elucidate the cell death mechanism probably initiated by intracellulary produced Aß. Here it seems likely that increased production of Aß at physiological levels primes APPsw PC12 cells to undergo cell death only after additional stress, while chronic high levels in HEK cells already lead to enhanced basal apoptotic levels. Crucial effects of the Swedish APP mutation include the impairments of cellular energy metabolism affecting mitochondrial membrane potential and ATP levels as well as the additional activation of caspase 2, caspase 8 and JNK in response to oxidative stress. Thereby ,the following model can be proposed: PC12 cells harboring the Swedish APP mutation have a reduced energy metabolism compared to APPwt or control cells. However, this effect does not leads to enhanced basal apoptotic levels of cultured cells. An exposure of PC12 cells to oxidative stress leads to mitochondrial dysfunction, e.g., decrease in mitochondrial membrane potential and depletion in ATP. The consequence is the activation of the intrinsic apoptotic pathway releasing cytochrome c and Smac resulting in the activation of caspase 9. This effect is amplified by the overexpression of APP, since both APPsw and APPwt PC12 cells show enhanced cytochrome c and Smac release as well as enhanced caspase 9 activity as vector transfected control. In APPsw PC12 cells a parallel pathway is additionally emphased. Due to reduced ATP levels or enhanced Aß production JNK is activated. Furthermore, the extrinsic apoptotic pathway is enhanced, since caspase 8 and caspase 2 activation was clearly enhanced by the Swedish APP mutation. Both pathways may then converge by activating the effector enzyme, caspase 3, and the execution of cell death. In addition, caspase independent effects also needs to be considered. One possibility could be the implication of AIF since AIF expression was found to be induced by the Swedish APP mutation. In APPsw HEK cells high chronic Aß levels leads to enhanced apoptotic levels, reduce mitochondrial membrane potential and ATP levels even under basal conditions. Summarizing, a hypothetical sequence of events is proposed linking FAD, Aß production, JNK-activation, mitochondrial dysfunction with caspase pathway and neuronal loss for our cell model. The brain has a high metabolic rate and is exposured to gradually rising levels of oxidative stress during life. In Swedish FAD patients the levels of oxidative stress are increased in the temporal inferior cortex. This study using a cell model mimicking the in vivo situation in AD brains indicates that probably both, increased Aß production and the gradual rise of oxidative stress throughout life converge at a final common pathway of an increased vulnerability of neurons to apoptotic cell death from FAD patients. Presenilin (PS) 1 is an aspartyl protease, involved in the gamma-secretase mediated proteolysis of Amyloid-ß-protein (Aß), the major constituent of senile plaques in brains of Alzheimer’s disease (AD) patients. Recent studies have suggested an additional role for presenilin proteins in apoptotic cell death observed in AD. Since PS 1 is proteolytic cleaved by caspase 3, it has been prosposed that the resulting C-terminal fragment of PS1 (PSCas) could play a role in signal transduction during apoptosis. Moreover, it was shown that mutant presenilins causing early-onset of familial Alzheimer's disease (FAD) may render cells vulnerable to apoptosis. The mechanism by which PS1 regulates apoptotic cell death is yet not understood. Therefore one aim of our present study was to clarify the involvement of PS1 in the proteolytic cascade of apoptosis and if the cleavage of PS1 by caspase 3 has an regulatory function. Here it is demonstrated that both, PS1 and PS1Cas lead to a reduced vulnerability of PC12 and Jurkat cells to different apoptotic stimuli. However a mutation at the caspase 3 recognition site (D345A/ PSmut), which inhibits cleavage of PS1 by caspase 3, show no differences in the effect of PS1 or PSCas towards apoptotic stimuli. This suggest that proteolysis of PS1 by caspase 3 is not a determinant, but only a secondary effect during apoptosis. Since several FAD mutation distributed through the whole PS1 gene lead to enhanced apoptosis, an abolishment of the antiapoptotic effect of PS1 might contribute to the massive neurodegeneration in early age of FAD patients. Here, the regulate properties of PS1 in apoptosis may not be through an caspase 3 dependent cleavage and generation of PSCas, but rather through interaction of PS1 with other proteins involved in apoptosis.
Rho-family GTPases like RhoA and Rac-1 are potent regulators of cellular signaling that control gene expression, migration and inflammation. Activation of Rho-GTPases has been linked to podocyte dysfunction, a feature of chronic kidney diseases (CKD). We investigated the effect of Rac-1 and Rho kinase (ROCK) inhibition on progressive renal failure in mice and studied the underlying mechanisms in podocytes. SV129 mice were subjected to 5/6-nephrectomy which resulted in arterial hypertension and albuminuria. Subgroups of animals were treated with the Rac-1 inhibitor EHT1846, the ROCK inhibitor SAR407899 and the ACE inhibitor Ramipril. Only Ramipril reduced hypertension. In contrast, all inhibitors markedly attenuated albumin excretion as well as glomerular and tubulo-interstitial damage. The combination of SAR407899 and Ramipril was more effective in preventing albuminuria than Ramipril alone. To study the involved mechanisms, podocytes were cultured from SV129 mice and exposed to static stretch in the Flexcell device. This activated RhoA and Rac-1 and led via TGFβ to apoptosis and a switch of the cells into a more mesenchymal phenotype, as evident from loss of WT-1 and nephrin and induction of α-SMA and fibronectin expression. Rac-1 and ROCK inhibition as well as blockade of TGFβ dramatically attenuated all these responses. This suggests that Rac-1 and RhoA are mediators of podocyte dysfunction in CKD. Inhibition of Rho-GTPases may be a novel approach for the treatment of CKD.
Urothelkarzinome entstehen aus dem Epithel (Urothel) der unteren Harnwege (Nierenkelche und -becken, Harnleiter und -blase, sowie proximale Harnröhre). Die Harnblase ist der bevorzugte Ort der Urothelkarzinome. Krebserregende chemische Verbindungen (Karzinogene), die im Urin konzentriert vorliegen, sind Hauptverursacher der Urothelkarzinome. Größter einzelner Risikofaktor ist das Rauchen. Urothelkarzinome alarmieren durch Mikro- oder Makrohämaturie, und werden durch zytologische Bestimmung der Urinzellen (exfoliative Urinzytologie) und durch endoskopische Untersuchung der Harnblase (Zystoskopie) diagnostiziert. Es gibt kein pathognomisches Zeichen das auf ein Urothelkarzinom hinweisen würde. Da gutdifferenzierte Urothelkarzinomzellen kaum von den normalen Urothelzellen zu unterscheiden sind, ist die falsch-negative Rate bei der Diagnose dieser G 0-1 Tumoren mit 42% besonders hoch. Bei den endoskopisch schwer zu erkennenden in situ Karzinomen, die weitgehend entdifferenziert (anaplastisch) sind, liegt die Treffsicherheit bei 94%. Keiner der bis heute vorgeschlagenen Tumormarker hat die geforderte Spezifität, Sensitivität und prognostische Aussagekraft, um für die Diagnostik des Harnblasenkarzinoms von Wert zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurde bei der Suche nach einem geeigneten Marker für den Nachweis eines Urothelkarzinoms eine Doppelstrategie verfolgt: 1. Die Expression einiger bekannter Gene wurde mit Reverser Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) an einer Reihe von Urothelkarzinomen unterschiedlicher Malignitätsgrade (G1 bis G4) und an normalen Urothelien untersucht. Uroplakine, die einzigen bislang bekannten urothelspezifischen Moleküle, bildeten dabei den Schwerpunkt. Ein Uroplakin-RT-PCR Bluttest wurde entwickelt, mit dem es möglich ist, disseminierte Urothelkarzinomzellen zu entdecken, noch bevor sie Metastasen gebildet haben. Die Nachweisempfindlichkeit des Tests liegt bei einer Zelle pro ml Blut. Von den untersuchten Urothelkarzinomprimärtumoren exprimierten alle gut bis mäßig differenzierten Tumoren (G1 und G2) Uroplakin (UP), bei den wenig differenzierten und anaplastischen Tumoren (G3 und G4) war etwa die Hälfte UP-positiv. 2. Die differentielle Genexpression derselben Urothelkarzinome und Urothelien wurde mittels Differential Display RT-PCR (ddRT-PCR) dargestellt, um auch unbekannte Genprodukte zu erfassen, die an der Krebsentstehung beteiligt sein und als spezifische Marker dienen könnten. Die gebräuchliche ddRT-PCR wurde durch eine Homologiedomänen-Konsenssequenz-RT-PCR ergänzt. Es konnten einige bekannte Gene identifiziert werden, darunter das DNA-bindende und transkriptionsregulierende HMG-1 (high mobility group) Protein und das mit Metastasierung assoziierte mts-1 Produkt. Einige Sequenzen zeigten keine Übereinstimmung mit bekannten Genen und sind damit potentiell neue Krebsgenkanditaten.
IL-18, a recently identified member of IL-1 family, is now recognized as an important regulator of innate and acquired immune responses. Therefore, the antitumor activities of IL-18 have been investigated. IL-18 has been shown to induce IFN-γ production by T, B, and NK cells, enhances NK cell activity, activates Fas ligandmediated apoptosis of the tumor cells, and improves the overall antitumor immunity. KG-1 cells were derived from a patient with acute myeloid leukemia (AML). IL-18 has been shown to induce IFN-γ production in those leukemic cells. TLR-3, in addition to its ability to recognize viral double stranded RNA, also can recognize the synthetic analogue poly(I:C) and induces type I IFN, inflammatory cytokine production, e.g TNF-α, and maturation of denderitic cells. In the present work the potential modulatory effect of PIC on IFN-γ and TNF-α production by KG-1 cells treated with IL-18 was investigated. Indeed, PIC strongly amplified the production of IFN-γ induced by IL-18 on mRNA and protein levels via NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Compared to IFN-γ, TNF-α showed different behaviour in KG-1 cells. On mRNA level I found only weak induction of TNF-α by IL-18 which was potentiated in the presence of PIC. Similarly, the release of TNF-α by IL-18 plus PIC required NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Furthermore, in the present work I found that TLR-3 is required for IFN-γ and TNF-α production. In addition, it is demonstrated by immunofluoresence that TLR-3 is localized in cytoplasm but not on the cell surface in KG-1 cells. Recently, it has been demonstrated that IFN-γ shows therapeutic potential as detected in AML blasts, specifically via inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Thus our data could serve as a rationale for the clinical use of PIC and IL-18 in combination therapy. In search for new cytokines potentially modulated by the combination IL-18 plus PIC in KG-1 cells, cytokine antibody array analysis was performed. I found an upregulation of expected genes like IP-10 but most interestingly unexpected upregulation of PDGF-AA. Searching for detailed mechanisms of PDGF-AA induction, I found that neither p38 nor JNK is involved in PDGF-AA production but NF-κB is essential for the expression of PDGF-AA. Furthermore, I found that PDGF-AA is not able to increase the proliferation of KG-1 cells. PDGF and TGF-β are examples of signaling molecules which control the growth, survival, motility, and differentiation of cells. Therefore, the release of TGF-β by IL-18 plus PIC was monitored by ELISA. The level of TGF-β in cellular supernatants revealed that neither PIC nor IL-18 was able to significantly mediate release of TGF-β indicating that only PDGF-AA but not TGF-β is induced by PIC and IL-18 in KG-1 cells. To the best of our knowledge this is the first time that IL-18 or PIC is shown to induce the expression of PDGF-AA in KG-1 cells.
Um das Potential von modernen Arzneistoffe wie Nukleinsäuren und ihren Analoga ausnutzen zu können und sie an ihren Wirkort ins Zellinnere bringen können, benötigt man Transportvehikel, da sie selbst nur über eine schlechte Zellmembrangängigkeit verfügen. Bei der Entwicklung zukunftsträchtiger Arzneiformen spielen biokompatible, kolloidale Trägersysteme, die zielgerichtet bestimmte Gewebe / Zellen ansteuern, eine große Rolle. Ihre Aufgabe ist es dem Wirkstoff zur Überwindung von Zellmembranen zu verhelfen, wobei gleichzeitig ein Schutz vor enzymatischem Abbau gewährleistet wird. Zur Erhöhung der Zell- und Gewebeselektivität können die Träger dann mit diversen Targeting-Liganden bestückt werden. Als Trägerstoff können verschiedenste synthetische und natürliche Polymere eingesetzt werden. Zum Einsatz kamen hier die beiden natürlichen Proteine Gelatine und Albumin, die untoxisch, biokompatibel und bioabbaubar sind. Die partikulären Strukturen wurden durch Lösungsmittelzusatz zu einer wässrigen Proteinlösung in einem Desolvatationsprozess gewonnen. Der Nukleinsäureeinschluss erfolgte adsorptiv und kovalent in die Polymermatrix oder kovalent an die Oberfläche. Als Drug-Targeting-Ligand wurden aufgrund ihrer großen Spezifität, Selektivität und Variabilität Antikörper eingesetzt. Durch chemische Oberflächenmodifikationen wurde die Voraussetzung geschaffen, biotinylierte Strukturen kovalent an die Nanopartikeloberfläche zu binden, so dass ein spezifisches Drug-Targeting-System entstand. Die kolloidalen, proteinbasierten Nanopartikel wurden hinsichtlich ihrer verschiedenen physikalischen Parameter analysiert. Neben den Parametern wie Größe, Zetapotential, Morphologie und Stabilität wurde auch die Zelltoxizität untersucht. Das Antikörper-beladene Trägersystem wurde auf seine Funktionalität und Effizienz in Zellkultur getestet. Albumin Nanopartikel: Zur Schaffung eines universell einsetzbaren Trägersystems wurden auf der Nanopartikeloberfläche reaktive SH-Gruppen eingeführt. Der Einsatz eines bifunktionalen Crosslinkers schuf die Möglichkeit mit Avidin ein zweites Protein, welches einen stabilen Komplex mit Biotin bildet an die Oberfläche zu binden. Man verfügt jetzt über ein 200 – 350 nm große, negativ geladene und untoxische Trägerpartikel, die mit vielen unterschiedlichen biotinylierten Liganden verbunden werden können. Sie verfügen weiterhin über eine ausreichende Stabilität im Zellkulturmedium. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Oligonukleotid-Beladung der Nanopartikel wurde auf drei verschiedenen Bindungswegen vollzogen. Die Wirkstoffeinbindung erfolgte zum Ersten adsorptiv über elektrostatische Wechselwirkungen in die Trägermatrix beim partikelformenden Prozess selbst. Die folgende Einführung von Thiolgruppen und die Kopplung mit Avidin über einen bifunktionalen Crosslinker wurde erfolgreich umgesetzt. Zweitens wurde eine kovalente Wirkstoffverknüpfung wieder über einen bifunktionalen Crosslinker entwickelt. Dafür wurden durch die Umsetzung mit einem Spacer die freien Aminogruppen des Trägermaterials aktiviert. Das verwendete Oligonukleotid wurde mit einer Thiolgruppe versehen und so an das aktivierte HSA gebunden. Das gebildete lösliche Konjugat wurde wieder durch Desolvatation zu Nanopartikeln umgesetzt. Als dritte Möglichkeit erfolgte eine oberflächliche Komplexbildung über das Avidin-System mit biotinylierten Phosphorothioaten. Gelatine-Nanopartikel: Für die Herstellung der Nanopartikel wurde ein doppeltes Desolvatationsverfahren eingesetzt. Die Oberflächenmodifikationen wurden analog zu den Umsetzungsbedingungen von HSA-NP durchgeführt. Die Bindungsfähigkeit des NeutrAvidins kann auch hier wieder durch die Kopplung an die Partikeloberfläche und den Aufreinigungsprozess beeinträchtigt sein. Daher wurde eine Nachweisreaktion mit einem fluoreszenzmarkierten Biotinderivat etabliert und die Funktionsfähigkeit des Avidins nachgewiesen. Um ein spezifisches Drug-Targeting-System zu etablieren, wurde der Träger zur Überwindung der Zellmembranen mit zwei verschiedenen biotinylierten Antikörpern ausgestattet. Eingesetzt wurde ein biotinylierter anti-CD3-AK, der von T-Lymphozyten internalisiert wird und ein biotinylierter anti-Her2neu-AK (Trastuzumab). Für die Bestimmung der gebundenen Antikörpermenge wurden zwei Methoden etabliert und lieferten für beide Antikörper eine Bindungseffizienz von nahezu 100%. In den anschließenden Zellkulturversuchen konnte eindrucksvoll eine rezeptorvermittelte Zellaufnahme in Lymphozyten und Brustkrebszellen über die an Gelatine-Nanopartikel gekoppelten, spezifischen Drug-Targeting-Liganden anti-CD3 und Trastuzumab gezeigt werden.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
5-Lipoxygenase (5LO) is a key enzyme in biosynthesis of leukotrienes (LTs), lipid mediators of inflammation. To study the roles of the 5LO accessory proteins coactosin-like protein (CLP) and 5LO-activating protein (FLAP), we knocked down these proteins in human monocytic cells. Our results show that expression of CLP was required for full cellular 5LO activity when cells were activated with Ca2+ ionophore, as well as with a physiological stimulus (lipopolysaccharide followed by N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine). During LT biosynthesis in stimulated cells, 5LO typically translocates to the nuclear membrane. This redistribution, from cytosolic to perinuclear, was clearly compromised in both CLP- and FLAP-deficient cells. Our results suggest that the CLP–5LO interaction may be a target for reduced LT production.
Serine/arginine-protein kinase 1 (SRPK1) regulates alternative splicing of VEGF-A to pro-angiogenic isoforms and SRPK1 inhibition can restore the balance of pro/antiangiogenic isoforms to normal physiological levels. The lack of potency and selectivity of available compounds has limited development of SRPK1 inhibitors, with the control of alternative splicing by splicing factor-specific kinases yet to be translated. We present here compounds that occupy a binding pocket created by the unique helical insert of SRPK1, and trigger a backbone flip in the hinge region, that results in potent (<10 nM) and selective inhibition of SRPK1 kinase activity. Treatment with these inhibitors inhibited SRPK1 activity and phosphorylation of serine/arginine splicing factor 1 (SRSF1), resulting in alternative splicing of VEGF-A from pro-angiogenic to antiangiogenic isoforms. This property resulted in potent inhibition of blood vessel growth in models of choroidal angiogenesis in vivo. This work identifies tool compounds for splice isoform selective targeting of pro-angiogenic VEGF, which may lead to new therapeutic strategies for a diversity of diseases where dysfunctional splicing drives disease development.
Many cancers have the tumor suppressor p53 inactivated by mutation, making reactivation of mutant p53 with small molecules a promising strategy for the development of novel anticancer therapeutics. The oncogenic p53 mutation Y220C, which accounts for approximately 100,000 cancer cases per year, creates an extended surface crevice in the DNA-binding domain, which destabilizes p53 and causes denaturation and aggregation. Here, we describe the structure-guided design of a novel class of small-molecule Y220C stabilizers and the challenging synthetic routes developed in the process. The synthesized chemical probe MB710, an aminobenzothiazole derivative, binds tightly to the Y220C pocket and stabilizes p53-Y220C in vitro. MB725, an ethylamide analogue of MB710, induced selective viability reduction in several p53-Y220C cancer cell lines while being well tolerated in control cell lines. Reduction of viability correlated with increased and selective transcription of p53 target genes such as BTG2, p21, PUMA, FAS, TNF, and TNFRSF10B, which promote apoptosis and cell cycle arrest, suggesting compound-mediated transcriptional activation of the Y220C mutant. Our data provide a framework for the development of a class of potent, non-toxic compounds for reactivating the Y220C mutant in anticancer therapy.
Glutamat ist einer der wichtigsten erregenden Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (ZNS), der unter anderem metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) aktiviert. Die Signalübertragung der mGluRs erfolgt indirekt durch Aktivierung intrazellulär gekoppelter heterotrimerer G-Proteine, die daraufhin zelluläre Signalprozesse beeinflussen. Es sind acht verschiedene mGluRs bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, ihrer Struktur und ihren pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden. Die hauptsächlich präsynaptisch lokalisierten Gruppe III mGluRs sind an der Regulation der Neurotransmission an exzitatorischen Synapsen beteiligt. Sie fungieren als Autorezeptoren, die rückkoppelnd die Glutamatausschüttung hemmen. Um eine möglichst exakte Übersetzung der extrazellulären Glutamatsignale durch mGluRs zu gewährleisten, muss die Signaltransduktion dieser Rezeptoren sehr genau kontrolliert und reguliert werden. Als Regulatoren der Signalübertragung verschiedener G-Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) haben sich Vertreter der RGS-(Regulators of G protein Signalling)-Proteinfamilie erwiesen. RGS-Proteine können direkten Einfluss auf die Kinetik der Signalübermittlung eines GPCRs nehmen. RGS-Proteine beschleunigen mittels ihrer GAP (GTPase Accelerating Protein)-Funktion die GTP-Hydrolyse, wodurch die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Ga-Untereinheit und somit der Signalantwort des GPCRs deutlich erhöht wird. Bis heute wurden mehr als 30 verschiedene RGS-Proteine beschrieben, die alle eine konservierte RGS-Domäne besitzen, die die Bindung an die Ga-Untereinheit des G-Proteins und die GAP-Aktivität vermittelt. Für einige GPCRs wurde bereits eine spezifische und selektive Interaktion sowie Regulation durch bestimmte RGS-Proteine gezeigt. An Gruppe III mGluRs gab es bisher keine einschlägigen Untersuchungen, außer am in der Retina exprimierten mGluR6, der jedoch einen Sonderfall innerhalb dieser Rezeptorgruppe darstellt. Deshalb sollte in dieser Dissertation untersucht werden, ob Gruppe III mGluRs, mit besonderem Augenmerk auf eine der zwei bekannten Spleißvarianten des mGluR7 (mGluR7a), durch ein oder auch mehrere Mitglieder der RGS-Familie reguliert werden können. Zwei Vertreter der RGS-Protein Familie, RGS3 und RGS4, die beide im Gehirn exprimiert werden, wurden als potentielle Kandidaten ausgewählt. Biochemische Interaktionsanalysen dieser Dissertation zeigten, dass sowohl RGS3 als auch RGS4 direkt an mGluR7a binden. Die Bindung zwischen mGluR7a und RGS3 bzw. RGS4 war in Abwesenheit von Ca2+ deutlich verstärkt. Da Calmodulin (CaM) in Anwesenheit von Ca2+ sowohl an mGluR7a als auch an RGS3 und RGS4 bindet, wurde postuliert, dass gebundenes Ca2+/CaM ein räumliches Hindernis für die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und RGS-Protein darstellen könnte. Die Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Bindung von Ca2+/CaM an den C-Terminus des mGluR7a die Interaktion zwischen dem Rezeptor und RGS4 abschwächt. Ein physiologischer Effekt der beiden RGS-Proteine auf die mGluR7a-vermittelte Signalübermittlung wurde zunächst in transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen. Hierzu wurde die Signalantwort des mGluR7a in An- und Abwesenheit von RGS3 oder RGS4 durch Bestimmung der Menge der sekundären Botenstoffe gemessen und verglichen. RGS3 sowie RGS4 beschleunigten in diesem System durch ihre GAP-Aktivität die GTP-Hydrolyse an der Ga-UE und damit die Inaktivierung der Signaltransduktion des Rezeptors. Mittels hochauflösender Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass RGS3 und RGS4 wie auch mGluR7a in vivo an der präsynaptischen Membran kortikaler Maus-Neuronen zu finden sind. Da die Proteine in den Nervenzellen kolokalisieren, sollte die Interaktion und Regulation, die in vitro nachgewiesen wurde, auch in vivo möglich sein. Ein in vivo-Nachweis des regulatorischen Effektes von RGS4 auf die Signaltransduktion der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a erfolgte durch Vergleich der Signalantworten dieser Rezeptoren in kultivierten kortikalen Neuronen aus Wildtyp- und RGS4-defizienten Mäusen. Mit dem Gruppe III mGluR-spezifischen Agonisten L-AP4 konnte im Vergleich zu den Wildtyp-Neuronen keine Antwort der mGluRs in den RGS4-defizienten Nervenzellen gemessen werden. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Signalübermittlung der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a ohne das RGS4-Protein nicht korrekt ablaufen kann. Zusammenfassend kann mit den Daten der vorliegenden Arbeit das bereits bestehende Modell eines mGluR7a-Signalkomplexes erweitert werden: Dabei bildet der Rezeptor bereits vor Stimulation durch einen Agonisten einen Komplex mit dem G-Protein und nachgeschalteten Effektoren, die durch den Rezeptor beeinflusst werden. Durch eine solche lokale Organisation funktionell zusammengehöriger Proteine, die die Initiation (wie das G-Protein) und Termination (wie die RGS-Proteine) der Signaltransduktion bewirken, wird eine schnelle und feinregulierte Signalübermittlung gewährleistet.
Many oncogenic mutants of the tumor suppressor p53 are conformationally unstable, including the frequently occurring Y220C mutant. We have previously developed several small-molecule stabilizers of this mutant. One of these molecules, PhiKan083, 1-(9-ethyl-9H-carbazole-3-yl)-N-methylmethanamine, binds to a mutation-induced surface crevice with a KD = 150 μM, thereby increasing the melting temperature of the protein and slowing its rate of aggregation. Incorporation of fluorine atoms into small molecule ligands can substantially improve binding affinity to their protein targets. We have, therefore, harnessed fluorine–protein interactions to improve the affinity of this ligand. Step-wise introduction of fluorines at the carbazole ethyl anchor, which is deeply buried within the binding site in the Y220C–PhiKan083 complex, led to a 5-fold increase in affinity for a 2,2,2-trifluoroethyl anchor (ligand efficiency of 0.3 kcal mol–1 atom–1). High-resolution crystal structures of the Y220C–ligand complexes combined with quantum chemical calculations revealed favorable interactions of the fluorines with protein backbone carbonyl groups (Leu145 and Trp146) and the sulfur of Cys220 at the mutation site. Affinity gains were, however, only achieved upon trifluorination, despite favorable interactions of the mono- and difluorinated anchors with the binding pocket, indicating a trade-off between energetically favorable protein–fluorine interactions and increased desolvation penalties. Taken together, the optimized carbazole scaffold provides a promising starting point for the development of high-affinity ligands to reactivate the tumor suppressor function of the p53 mutant Y220C in cancer cells.
The ability to permeate accross the blood brain barrier (BBB) is essential for drugs acting on the central nervous system (CNS). Thus, systems that allow rapid and inexpensive screening of the BBB-permeability properties of novel lead compounds are of great importance for speeding up the drug discovery process in the CNS-area. We used immortalized porcine brain microvessel endothelial cells (PBMECICl-2) to develop a model for measurement of blood-brain barrier permeation of CNS active drugs. Investigation of different cell culture conditions showed, that a system using C6 astrocyte glioma conditioned medium and addition of a cyclic AMP analog in combination with a type IV phosphodiesterase inhibitor (R020-1724) leads to cell layers with transendothelial electrical resistance values up to 300 Ω.cm2. Permeability studies with U-[14C]sucroseg ave a permeability coefficient Pe of 3.24 + 0.14 × 10−4 cm/min, which is in good agreement to published values and thus indicates the formation of tight junctions in vitro.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Zielrichtungen verfolgt: 1. Vergleichende Testung von Kavainhaltsstoffen, Kava-Fertigarzneimitteln und chemischen Anxiolytika auf Hepatotoxizität Mit Hilfe der Hepatocarcinom-Zelllinie Hep-G2 wurden alle noch verfügbaren Kava-Fertigarzneimittel einem Cytotoxizitätstest unterzogen, durch die Herkunft der Zelllinie aus der Leber handelt es sich um eine spezifische Cytotoxizität – um Hepatotoxizität. Ebenso wurden isolierte, reine Inhaltsstoffe von Piper methysticum, Strukturverwandte und chemische Anxiolytika diesen Hepatotoxizitätstests unterzogen. Da alle Tests unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden und bei jedem Test auf den microtiter-plates Kontrollen mitgeführt wurden, erlauben die Ergebnisse eine vergleichende Aussage zur Cytotoxizität. Besonders die Kava-Fertigarzneimittel, weniger die reinen Kava-Inhaltsstoffe (Kava-Lactone) fallen durch eine gewisse Cytotoxizität bei Hep-G2 auf. Die mit getesteten, handelsüblichen, chemischen Anxiolytika waren deutlich weniger cytotoxisch im Hep-G2-Assay. 2. Aufklärung der möglichen Ursache für die Fälle von Hepatotoxizität in Zusammenhang mit Kava Parallel zu den Hep-G2-Tests wurde eine Arbeit über die starke Hepatotoxizität des Kava-Alkaloids Pipermethystin publiziert. Nach Extraktion und Synthese von Pipermethystin wurden noch zwei weitere Kava-Alkaloide synthetisiert und Strukturverwandte mit in die Tests aufgenommen. Die starke Hepatotoxizität des Pipermethystins konnte bestätigt werden. Durch weitere Versuche mit Abbauprodukten und Strukturverwandten des Pipermethystins konnte ein Dihydropyridon-Heterocyclus als toxisches Prinzip des Pipermethystins bestimmt werden. 3. Vergleichende Untersuchung der Ergebnisse mit Primärzellen, humanen Hepatocyten Durch Kooperation mit der Universität Mainz war es möglich, die in den Hep-G2-Tests aufgefallenen Substanzen an humanen Hepatocyten zu testen. Teilweise gab es bei diesen Untersuchungen Parallelen, teilweise variierten die Ergebnisse erheblich. Der Grund liegt in den unterschiedlichen enzymatischen Ausstattungen der Hep-G2-Zellen bzw. der humanen Hepatocyten und den daraus resultierenden unterschiedlichen metabolischen Fähigkeiten.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Background: A delta and C fibers are the major pain-conducting nerve fibers, activate only partly the same brain areas, and are differently involved in pain syndromes. Whether a stimulus excites predominantly A delta or C fibers is a commonly asked question in basic pain research but a quick test was lacking so far. Methodology/Principal Findings: Of 77 verbal descriptors of pain sensations, "pricking", "dull" and "pressing" distinguished best (95% cases correctly) between A delta fiber mediated (punctate pressure produced by means of von Frey hairs) and C fiber mediated (blunt pressure) pain, applied to healthy volunteers in experiment 1. The sensation was assigned to A delta fibers when "pricking" but neither "dull" nor "pressing" were chosen, and to C fibers when the sum of the selections of "dull" or "pressing" was greater than that of the selection of "pricking". In experiment 2, with an independent cohort, the three-descriptor questionnaire achieved sensitivity and specificity above 0.95 for distinguishing fiber preferential non-mechanical induced pain (laser heat, exciting A delta fibers, and 5-Hz electric stimulation, exciting C fibers). Conclusion: A three-item verbal rating test using the words "pricking", "dull", and "pressing" may provide sufficient information to characterize a pain sensation evoked by a physical stimulus as transmitted via A delta or via C fibers. It meets the criteria of a screening test by being easy to administer, taking little time, being comfortable in handling, and inexpensive while providing high specificity for relevant information.
Resistance in glucocorticoid-induced apoptosis is associated with poor prognosis for long term survival in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). As Smac mimetics have been shown to reactivate apoptosis by antagonizing Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins, we investigate the potential of the Smac mimetic BV6 to overcome glucocorticoid-resistance in ALL. This study shows that BV6 synergistically cooperates with glucocorticoids to trigger apoptosis and to suppress clonogenic growth of pediatric ALL cells. Of note, the BV6/glucocorticoid combination treatment also induces cell death in cells having defects in the apoptotic signaling cascade by inducing a switch from apoptotic to necroptotic cell death. The clinical relevance of our novel combination treatment is underscored by parallel experiments in primary pediatric ALL samples, in which glucocorticoids and BV6 act together to induce cell death in a synergistic manner. Importantly, the addition of BV6 enhances the anti-leukemic effects of glucocorticoids in an in vivo mouse model of pediatric ALL without causing substantial side effects, highlighting the potency of a BV6/glucocorticoid combination treatment. In contrast, BV6 does not increase cytotoxicity of glucocorticoids against several non-malignant cell types of the lympho-hematopoietic system. Furthermore, we have identified the novel underlying mechanism of BV6/glucocorticoid-induced apoptosis by showing that BV6 and glucocorticoids synergistically act together to promote assembly of the ripoptosome, a RIP1/FADD/caspase-8-containing cell death complex. Ripoptosome assembly is critically required for BV6/Dexamethasone-induced cell death, since genetic silencing of its members, i.e. RIP1, reduces ROS production, caspase activation and most importantly cell death induction. BV6/glucocorticoid combination treatment promotes ripoptosome assembly by inhibition of both of its negative regulators, IAP proteins and cFLIP. Thus, we identify that BV6 and glucocorticoids cooperate together to reduce cIAP1, cIAP2 and XIAP protein levels and cFLIP expression. Ripoptosome formation occurs independently of autocrine/paracrine loops of death receptor ligands, since blocking antibodies for TNFα, TRAIL or CD95L or genetic silencing of their corresponding receptors fail to rescue BV6/glucocorticoid-induced cell death. In summary, this study shows that the Smac mimetic BV6 sensitizes for glucocorticoid-induced apoptosis by promoting ripoptosome assembly with important implications for the treatment of childhood ALL.
Ein weit verbreitetes Merkmal von Leukämien sind genetische Veränderungen, wobei die Entstehung der Leukämie häufig mit reziproken chromosomalen Translokationen assoziiert ist, welche zur Bildung chimärer Genprodukte führen. Eine Vielzahl dieser reziproken Translokationen basieren auf Translokationen des MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia), die mit dem Krankheitstyp einer AML oder einer ALL verbunden sind. Die häufigste chromosomale Translokation ist die t(4;11) Translokation. Sie tritt vor allem bei Kleinkindern bzw. auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie auf und resultiert in einer akuten lymphatischen Leukämie. Es handelt sich um eine Hochrisikoleukämie, welche aufgrund ihrer nahezu Therapie-resistenten Blasten mit einer besonders schlechten Prognose assoziiert ist. Der Mechanismus der Leukämieentstehung durch die MLL-Translokationen und der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Für einige MLL-Translokationen, die mit einer myeloischen Leukämie verknüpft sind, konnte zunächst das onkogene Potenzial der Fusionsproteine im Mausmodell belegt werden. Im Bezug auf die t(4;11) Translokation blieben Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells jedoch lang erfolglos. Erst 2006 konnten mittels einer knock-in-Strategie bzw. einem „inverter“-System Mausmodelle für MLL•AF4 entwickelt werden, in denen die Mäuse nach sehr langer Latenzzeit ein disseminiertes B-Zell-Lymphom aufwiesen. Ein neueres konditionales MLL•AF4 knock-in-Modell, in dem MLL•AF4 unter der Kontrolle des endogenen Zellzyklus-abhängigen MLL-Promotors steht, resultierte hingegen in einer ALL oder AML. Im Allgemeinen steht somit bislang das MLL•AF4-Fusionsprotein im Vordergrund der Erforschung des pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation. Aufgrund der Tatsache, dass in der Regel jedoch neben dem MLL•AF4- ebenso ein AF4•MLL-Fusionstranskript nachgewiesen werden kann, befassten sich Studien unserer Arbeitsgruppe mit der Funktion des AF4•MLLFusionsproteins. Diese Untersuchungen zeigten, dass das AF4•MLL-Fusionsprotein in der Zelle akkumuliert und in der Entwicklung onkogener Effekte sowie der Wachstumstransformation der Zelle resultiert. Ergänzend belegten retrovirale Transduktions-/Transplantations-Experimente die Entwicklung einer akuten Leukämie im Mausmodell, wenn zuvor mit AF4•MLL bzw. mit AF4•MLL und MLL•AF4 transduzierte Stammzellen transplantiert wurden. Um nun die Funktion des AF4•MLL-Proteins sowie die molekularen Ursachen der beobachteten Eigenschaften besser verstehen zu können, wurde der AF4•MLL-Proteinkomplex mittels einer Strep-Tag-Affinitätschromatographie erfolgreich gereinigt und ein Molekulargewicht von ca. 2 MDa über Größenausschlusschromatographie bestimmt. Damit nicht nur ein Vergleich mit dem MLL- sondern auch mit dem AF4-Wildtyp- Proteinkomplex möglich war, wurden ebenfalls eine Größenbestimmung und eine Reinigung des AF4-Proteinkomplexes durchgeführt. Die folgenden Analysen der Komplexkomposition über Immunopräzipitationen, Western Blot-Analysen sowie massenspektrometrische Analysen zeigten, dass sich der AF4•MLL-Proteinkomplex aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt; es wurden P-TEFb, HEXIM1, NFKB1, NPM1, DDX6 und das AF4-Wildtypprotein aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, CREBBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex nachgewiesen. Auf diese Weise werden im AF4•MLL-Proteinkomplex Eigenschaften bzw. Funktionen beider Wildtyp-Proteinkomplexe kombiniert. Um einen weiteren Hinweis auf die Funktion zu erhalten, wurde ergänzend ein in vitro Histon-Methyltransferase-Assay etabliert, der für beide gereinigten Proteinkomplexe eine Histonmethyltransferase-Aktivität zeigte. Basierend auf den vorliegenden Daten kann eine Konkurrenzsituation zwischen dem AF4•MLL-Proteinkomplex und den beiden Wildtyp-Proteinkomplexen um die entsprechenden Faktoren angenommen werden, welche die Assemblierung vollständiger und funktioneller Wildtyp-Proteinkomplexe verhindern könnte. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf Funktionen des AF4•MLL-Proteins in transkriptionellen Prozessen, Histonacetylierungen sowie der H3K4-Trimethylierung hin. Die Fehlregulation epigenetischer und transkriptioneller Prozesse durch die Anwesenheit des AF4•MLL-Proteinkomplexes spielt somit vermutlich eine entscheidende Rolle im pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation.
Background: Birch pollen-allergic subjects produce polyclonal cross-reactive IgE antibodies that mediate pollen-associated food allergies. The major allergen Bet v 1 and its homologs in plant foods bind IgE in their native protein conformation. Information on location, number and clinical relevance of IgE epitopes is limited. We addressed the use of an allergen-related protein model to identify amino acids critical for IgE binding of PR-10 allergens.
Method: Norcoclaurine synthase (NCS) from meadow rue is structurally homologous to Bet v 1 but does not bind Bet v 1-reactive IgE. NCS was used as the template for epitope grafting. NCS variants were tested with sera from 70 birch pollen allergic subjects and with monoclonal antibody BV16 reported to compete with IgE binding to Bet v 1.
Results: We generated an NCS variant (Δ29NCSN57/I58E/D60N/V63P/D68K) harboring an IgE epitope of Bet v 1. Bet v 1-type protein folding of the NCS variant was evaluated by 1H-15N-HSQC NMR spectroscopy. BV16 bound the NCS variant and 71% (50/70 sera) of our study population showed significant IgE binding. We observed IgE and BV16 cross-reactivity to the epitope presented by the NCS variant in a subgroup of Bet v 1-related allergens. Moreover BV16 blocked IgE binding to the NCS variant. Antibody cross-reactivity depended on a defined orientation of amino acids within the Bet v 1-type conformation.
Conclusion: Our system allows the evaluation of patient-specific epitope profiles and will facilitate both the identification of clinically relevant epitopes as biomarkers and the monitoring of therapeutic outcomes to improve diagnosis, prognosis, and therapy of allergies caused by PR-10 proteins.
Single long-chain omega-3 fatty acids (e.g. docosahexaenoic acid (DHA) or eicosapentaenoic acid (EPA)) are known for their neuroprotective properties associated with ischemic stroke. This pilot study aimed to test the effectiveness of an acute treatment with a long-chain omega-3 lipid emulsion (Omegaven 10%®, OGV) that contains fish oil (DHA 18 mg/ml; EPA 21 mg/ml) and α-tocopherol (0.2 mg/ml) in a transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) model of ischemic stroke in mice. For this purpose, female CD-1 mice were anesthetized and subjected to 90 minutes of MCAO. To reflect a clinically relevant situation for an acute treatment, either after induction of stroke or after reperfusion, a single dose of OGV was injected intravenously into the tail vein (5 ml/kg b.w.). A neurological severity score was used to assess motor function and neurological outcome. Stroke-related parameters were determined 24 hours after MCAO. Microdialysis was used to collect samples from extracellular space of the striatum. Mitochondrial function was determined in isolated mitochondria or dissociated brain cells. Inflammation markers were measured in brain homogenate. According to control experiments, neuroprotective effects could be attributed to the long-chain omega-3 content of the emulsion. Intravenous injection of OGV reduced size and severity of stroke, restored mitochondrial function, and prevented excitotoxic glutamate release. Increases of pro-inflammatory markers (COX-2 and IL-6) were attenuated. Neurological severity scoring and neurochemical data demonstrated that acute OGV treatment shortly after induction of stroke was most efficient and able to improve short-term neurological outcome, reflecting the importance of an acute treatment to improve the outcome. Summarising, acute treatment of stroke with a single intravenous dose of OGV provided strong neuroprotective effects and was most effective when given immediately after onset of ischemia. As OGV is an approved fishoil emulsion for parenteral nutrition in humans, our results may provide first translational data for a possible early management of ischemic stroke with administration of OGV to prevent further brain damage.
Therapy of acute myeloid leukemia (AML) is unsatisfactory. Histone deacetylase inhibitors (HDACi) are active against leukemic cells in vitro and in vivo. Clinical data suggest further testing of such epigenetic drugs and to identify mechanisms and markers for their efficacy. Primary and permanent AML cells were screened for viability, replication stress/DNA damage, and regrowth capacities after single exposures to the clinically used pan-HDACi panobinostat (LBH589), the class I HDACi entinostat/romidepsin (MS-275/FK228), the HDAC3 inhibitor RGFP966, the HDAC6 inhibitor marbostat-100, the non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) indomethacin, and the replication stress inducer hydroxyurea (HU). Immunoblotting was used to test if HDACi modulate the leukemia-associated transcription factors β-catenin, Wilms tumor (WT1), and myelocytomatosis oncogene (MYC). RNAi was used to delineate how these factors interact. We show that LBH589, MS-275, FK228, RGFP966, and HU induce apoptosis, replication stress/DNA damage, and apoptotic fragmentation of β-catenin. Indomethacin destabilizes β-catenin and potentiates anti-proliferative effects of HDACi. HDACi attenuate WT1 and MYC caspase-dependently and -independently. Genetic experiments reveal a cross-regulation between MYC and WT1 and a regulation of β-catenin by WT1. In conclusion, reduced levels of β-catenin, MYC, and WT1 are molecular markers for the efficacy of HDACi. HDAC3 inhibition induces apoptosis and disrupts tumor-associated protein expression.
Krebs stellt die zweithäufigste Todesursache in Europa dar. Obwohl sich Diagnose und Heilungschancen über die letzten Jahre verbessert haben, besteht bei bestimmten neoplastischen Erkrankungen eine unverändert schlechte Prognose. Grundlage für eine langfristige Verbesserung des Behandlungserfolges ist ein molekulares Verständnis der Mechanismen, welche zur Krankheitsentstehung, Progression und Therapieresistenz beitragen. Nur so ist es möglich, nach neuen pharmakologischen und oder/genetischen Inhibitoren zu suchen, welche spezifische Eigenschaften dieser Faktoren blockieren und somit die Entwicklung neuer Therapiestrategien erlauben („from bench to bedside“). In diesem Zusammenhang spielen Proteasen nicht nur eine wichtige Rolle in pathobiologischen Prozessen, sondern stellen auch klinisch anerkannte Zielstrukturen derzeitiger Behandlungsstrategien dar. So wurde auch die Threonin-Protease Taspase1 als potenzielles Therapieziel der von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Translokationen verursachten Leukämien postuliert. Die Taspase1-induzierte Spaltung des MLL Proteins spielt eine wichtige physiologische Rolle in Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen. Darüber hinaus scheint Taspase1 durch die Prozessierung von MLL-Translokationsprodukten, im speziellen des Produkts der t(4;11), maßgeblich zur Leukämieentstehung beizutragen. Zusätzlich gibt es, wie auch in dieser Arbeit gezeigt, erste Hinweise, dass Taspase1 auch für solide Tumore bedeutsam sein könnte. Jedoch sind unsere Kenntnisse über die molekularen Mechanismen, welche für die (patho)biologischen Funktionen von Taspase1 verantwortlich sind, bislang noch lückenhaft. Obwohl neben MLL-Proteinen einige wenige Taspase1-Zielproteine postuliert wurden, fehlt derzeit eine Übersicht über das „Taspase1-Degradom“. Die Kenntnis aller humanen Taspase1-Zielproteine stellt eine wichtige Voraussetzung dar, um die biologischen Funktionen dieser Typ2-Asparaginase gezielter erforschen und verstehen zu können. Zudem stehen im Gegensatz zu anderen Proteasen für Taspase1 bislang keine wirksamen Inhibitoren zur Verfügung, welche nicht nur als potenzielle Wirkstoffe, sondern vor allem als „chemische Werkzeuge“ der Funktionsaufklärung dienen könnten. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das erste effiziente zellbasierte Taspase1- Testsystem entwickelt. Das Translokations-Testsystem basiert auf einem autofluoreszierenden Indikatorprotein, welches eine Taspase1-Spaltstelle enthält und durch die Wahl geeigneter Transportsignale zwischen Kern und Zytoplasma wandert. Nach Koexpression aktiver Taspase1, nicht aber inaktiver Taspase1-Mutanten bzw. anderer Proteasen, wird dieser Biosensor gezielt gespalten und dessen Akkumulation im Zellkern induziert. Die Spezifität des Testsystems mit seinem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erlaubte dessen Anpassung an eine Mikroskopie-basierte Hochdurchsatz-Plattform (Knauer et al., PloS ONE eingereicht). Durch gerichtete Mutagenese der Taspase1-Spaltstelle im Biosensor-Kontext konnte eine optimierte Konsensus-Erkennungssequenz für Taspase1 (Aminosäuren Q3[F,I,L,V]2D1¯G1’X2’D3’D4’) definiert werden, welche erstmalig eine zuverlässige bioinformatische Vorhersage des humanen Taspase1-Degradoms erlaubte. Die biologische Relevanz dieser Analyse wurde durch Validierung einzelner Zielproteine unterstrichen, wobei bisher noch nicht beschriebene Taspase1-Zielproteine wie beispielsweise Myosin1F und der Upstream Stimulating Factor 2 identifiziert wurden. Obwohl für beide Proteine bereits eine tumor-assoziierte Funktion beschrieben ist, bleibt die kausale Rolle von Taspase1 für deren (patho)physiologische Funktionen noch zu klären (Bier et al., JBC). Die Tatsache, dass Taspase1 als nukleäres/nukleoläres Protein identifiziert werden konnte, es sich bei den vorhergesagten Zielproteinen jedoch nicht ausschließlich um Kernproteine handelt, belegte die Notwendigkeit, die Regulation der intrazellulären Lokalisation von Taspase1 zu entschlüsseln. Experimentelle und bioinformatische Analysen zeigten erstmalig, dass Taspase1 über ein zweigeteiltes Importsignal über Importin-a aktiv in den Kern transportiert wird, jedoch kein nukleäres Exportsignal besitzt. Interessanterweise ist sowohl die cis- als auch die trans-Aktivität von diesem Kerntransport abhängig. Die nukleoläre Akkumulation wird hingegen durch die Wechselwirkung mit Nukleophosmin vermittelt. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Taspase1 am Nukleolus aktiviert wird und möglicherweise durch die Kernexportfunktion von Nukleophosmin transient Zugang zum Zytoplasma erhält, um so auch zytoplasmatische Proteine zu prozessieren (Bier et al., Traffic eingereicht). Zusätzlich konnten erstmalig multiple post-translationale Modifikationen von Taspase1 nachgewiesen werden (Bier et al., Manuskript in Vorbereitung). So kann Taspase1 über die Interaktion mit den Peptidasen Senp1-3 sowohl durch Sumo1 als auch durch Sumo2 sumoyliert werden. Diese so vermittelten dynamischen (De)Sumoylierungszyklen könnten eine Feinregulation der Enzym-Substrat-Interaktion darstellen. Zusätzlich wird Taspase1 durch verschiedene Histon-Acetyltransferasen (HAT) acetyliert und dadurch möglicherweise in seiner enzymatischen Aktivität beeinflusst. Interessanterweise acetylieren die HATs p300 und GCN5 hauptsächlich die Proform von Taspase1, was mit einer verstärkten cis-Aktivität einhergeht, während CBP und pCAF eher die prozessierte Form acetylieren. Andererseits interagieren die Histon-Deacetylasen HDAC-3 und -6 mit Taspase1, was nur die cis-Aktivität zu beeinflussen scheint. HDAC1 hingegen verhindert die Prozessierung der zweiten MLL-Schnittstelle, was auf eine zyklische Regulation im Wechsel mit der Acetylierung schließen lässt. WeitereUntersuchungen müssen klären, ob und wie diese post-translationale Feinregulation die (patho)biologische Aktivität von Taspase1 beeinflussen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit entscheidende neue Einblicke in die biologische Funktion und Regulation von Taspase1 gewonnen werden.
The most frequently used parameters to describe the barrier properties of endothelial cells (ECs) in vitro are (i) the macromolecular permeability, indicating the flux of a macromolecular tracer across the endothelium, and (ii) electrical impedance of ECs grown on gold-film electrodes reporting on the cell layer's tightness for ion flow. Due to the experimental differences between these approaches, inconsistent observations have been described. Here, we present the first direct comparison of these assays applied to one single cell type (human microvascular ECs) under the same experimental conditions. The impact of different pharmacological tools (histamine, forskolin, Y-27632, blebbistatin, TRAP) on endothelial barrier function was analyzed by Transwell(®) tracer assays and two commercial impedance devices (xCELLigence(®), ECIS(®)). The two impedance techniques provided very similar results for all compounds, whereas macromolecular permeability readings were found to be partly inconsistent with impedance. Possible reasons for these discrepancies are discussed. We conclude that the complementary combination of both approaches is highly recommended to overcome the restrictions of each assay. Since the nature of the growth support may contribute to the observed differences, structure-function relationships should be based on cells that are consistently grown on either permeable or impermeable growth supports in all experiments.
In einer vorangegangenen Studie konnten bereits duale sEH / PPAR-Modulatoren identifiziert werden, welche allerdings nicht in vivo applizierbar waren 73. Der Vorteil des Multi-Target-Liganden Ansatzes konnte demnach nicht evaluiert werden. Das Ziel der folgende Arbeit beschreibt demnach Design, Synthese und Charakterisierung in vivo applizierbarer sEH / PPAR-Modulatoren. Dieser Prozess sollte in drei Phasen gliederte werden:
o Identifizieren einer geeigneten Strukturklasse
o Etablieren einer Struktur-Aktivitäts-Beziehung zu beiden Targets
o Leitstrukturoptimierung
Die gesuchte Zielverbindung sollte nach oraler in vivo Applikation eine ausreichend hohe Plasmakonzentration in vivo erreichen, um konzentrationsabhängig die Targets sEH und PPAR zu modulieren. Mit dieser Modellverbindung wäre es möglich eine vergleichbare Studie zur sEH / PPAR-Kombinationstherapie von Imig et al. 72, durchzuführen. Letztendlich könnte mit dem Vergleich dieser zwei Studien gezeigt werden, ob die simultane Modulation dieser zwei Targets das Potenzial besitzt mehrere Risikofaktoren zu therapieren.
Full reconstruction of large lobula plate tangential cells in Drosophila from a 3D EM dataset
(2018)
With the advent of neurogenetic methods, the neural basis of behavior is presently being analyzed in more and more detail. This is particularly true for visually driven behavior of Drosophila melanogaster where cell-specific driver lines exist that, depending on the combination with appropriate effector genes, allow for targeted recording, silencing and optogenetic stimulation of individual cell-types. Together with detailed connectomic data of large parts of the fly optic lobe, this has recently led to much progress in our understanding of the neural circuits underlying local motion detection. However, how such local information is combined by optic flow sensitive large-field neurons is still incompletely understood. Here, we aim to fill this gap by a dense reconstruction of lobula plate tangential cells of the fly lobula plate. These neurons collect input from many hundreds of local motion-sensing T4/T5 neurons and connect them to descending neurons or central brain areas. We confirm all basic features of HS and VS cells as published previously from light microscopy. In addition, we identified the dorsal and the ventral centrifugal horizontal, dCH and vCH cell, as well as three VSlike cells, including their distinct dendritic and axonal projection area.
Background: The alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor (alpha 7-nAChR) is well known as a potent calcium ionophore that, in the brain, has been implicated in excitotoxicity and hence in the underlying mechanisms of neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease. Previous research implied that the activity of this receptor may be modified by exposure to a peptide fragment derived from the C-terminal region of the enzyme acetylcholinesterase. This investigation was undertaken to determine if the functional changes observed could be attributed to peptide binding interaction with the alpha 7-nAChR, or peptide modulation of receptor expression. Methodology/Principal Findings: This study provides evidence that two peptides derived from the C-terminus of acetylcholinesterase, not only selectively displace specific bungarotoxin binding at the alpha 7-nAChR, but also alter receptor binding properties for its familiar ligands, including the alternative endogenous agonist choline. Of more long-term significance, these peptides also induce upregulation of alpha 7-nAChR mRNA and protein expression, as well as enhancing receptor trafficking to the plasma membrane. Conclusions/Significance: The results reported here demonstrate a hitherto unknown relationship between the alpha 7-nAChR and the non-enzymatic functions of acetylcholinesterase, mediated independently by its C-terminal domain. Such an interaction may prove valuable as a pharmacological tool, prompting new approaches for understanding, and combating, the process of neurodegeneration.
Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder marked by progressive loss of memory and cognitive ability. The pathology of AD is characterised by the presence of amyloid plaques, intracellular neurofibrillary tangles and pronounced cell death. The aim of this thesis was to investigate pathways involved in the Aß cascade of neurodegeneration. Since novel findings indicate that already this Aß species exerts neurotoxic effects long before hyperphosphorylated tau, neurofibrillary tangles and extracellular Aß plaques appear, the investigations were accomplished with specific regard to the effects of intracellular Aß. The Swedish double mutation in the APP gene results in six- to eightfold increased Aß production of both Aß1-40 and Aß1-42 compared to human wildtype APP cells (APPwt). Data obtained from PC12 cells indicate that it is possible to specifically increase the Aß load without enhancing APP expression levels. On the basis of these findings, it seemed possible to investigate dose-dependent effects of Aß in multiple experimental designs. These assay designs were created in order to mimick different in-vivo situations that are discussed to occur in AD patients: APPsw PC12 cells exhibit low physiological concentrations of Aß within picomolar range in contrast to APPsw HEK cells, expressing Aß levels within the nanomolar range. Of note, the APPsw HEK cells showed a specific and highly significant increase in the intracellular accumulation of insoluble Aß1-42. Moreover, an intracellular accumulation of Aß and APP was found in the mitochondria of the HEK APPsw cells suggesting a direct impact on mitochondrial function on these cells. This effect might finally lead to disturbances in the energy metabolism of the cell or to increased cell death. Furthermore, baseline g- and ß-secretase activity was assessed since these enzymes represent promising therapeutic targets to slow or halt the disease process. As expected, ß-secretase activity was significantly elevated in all APPsw cell lines. This might be due to the proximity of the Swedish double mutation next to the N-terminus of the Aß sequence. Interestingly, g-secretase activity was similarly increased in PC12 APPsw cells. In addition, the toxicity of different Aß species was investigated in SY5Y and PC12 cells with regard to their effect on cellular viability mirrored by mitochondrial activity using MTT assay. Here, it turned out that not monomers, but already dimers are neurotoxic correlates. Fibrillar Aß species showed the highest toxicity. In the next step, SY5Y cells forming endogenous, dimeric APP and Aß were investigated. In accordance with previous findings, these cells showed a decreased MTT reduction potential in comparison to APPwt and control SY5Y cells reflecting a decrease of cellular viability. The impaired energy metabolism of the cells was even more drastically mirrored by reduced baseline ATP levels. In the second part of this thesis, the expression and intracellular distribution of Bcl-2 family proteins and pro-apoptotic mitochondrial factors under baseline conditions and during oxidative stress were analyzed in the APPwt and APPsw bearing cells. The most prominent finding was the reduction of expression levels of the anti-apoptotic factor Bcl-xL in the cytosolic fractions of APPwt and APPsw PC12 cells. This might indicate that a lack of anti-apoptotic factors or their altered intracellular distribution, rather than an increase in caspase-dependent pro-apoptotic factors, could be responsible for the increased vulnerability of APPwt- and APPsw-transfected PC12 cells against oxidative stress. Since total Bcl-xL expression was unaffected in PC12 cells, in contrast to APPwt and APPsw-expressing SY5Y and HEK cells revealing significantly decreased Bcl-xL expression levels. Thus, alterations in Bcl-xL distribution seem to be an early event in the disease process. Increasing Bcl-xL expression might potentially be one promising strategy for AD modification. PC12 and HEK cells bearing APPsw or APPwt were treated with the potent g-secretase inhibitor DAPT. Of note, DAPT did not only efficiently block Aß production, but additionally led to an elevation of the MTT reduction potential, reflecting an increase in cellular viability. As another disease-modifying strategy, several efforts are undertaken to ameliorate AD-relevant symptoms by the treatment with nerve growth factor (NGF). Generally, it is known that substituted pyrimidines have modest growth-promoting effects. Here, KP544, a novel substituted pyrimidine, was characterised. This drug increased MTT reduction potential in terminally differentiated and undifferentiated PC12 cells. Furthermore, treatment with KP544 led to a reduction in Aß1-40 secretion. Thus, one may conclude that the target of KP544, GSK-3ß, represents a connecting link between the two main pathological hallmarks of AD and might thus be a very promising therapeutic target for AD.
Die Herstellung von Poly(butylcyanoacrylat)-Nanopartikeln (PBCA-NP) ist seit fast 25 Jahren bekannt. Sie erfolgt meist durch anionische Emulsionspolymerisation von Butylcyanoacrylat unter Verwendung von Dextran 70.000 als Stabilisator. Vereinzelt wurde in früheren Arbeiten bereits Pluronic® F68 als Emulgator für die Polymerisationsreaktion verwendet. Diese Arbeit hat ihren Schwerpunkt in der Herstellung von PBCA-NP mit F68 als Stabilisator. Es konnte gezeigt werden, dass sich mit diesem Hilfsstoff ebenfalls nanopartikuläre Trägersysteme reproduzierbar und im gewünschten Größenbereich um 200 nm herstellen lassen. Diese Partikel besitzen im Gegensatz zu Dextran-stabilisierten NP eine sehr enge Größenverteilung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die hergestellten NP im Bezug auf ihr Molekulargewicht und ihre Dichte charakterisiert. Ein Partikel besitzt die Masse von ca. 2,5 * 109 Dalton und hat eine Dichte von etwa 1,148 g/cm³. Bei einem PBCA-Nanopartikel handelt es sich jedoch nicht um ein Riesenmolekül, vielmehr wird er durch Agglomeration von relativ kurzen Polymerketten gebildet. Ein Partikel besteht aus ca. einer Million Polymerketten, welche ein Molekulargewicht von ca. 2500 g/mol besitzen. Der Einfluss der Herstellungsparameter auf leere und arzneistoffbeladene Partikel wurde untersucht. Die Partikel wurden hierbei durch die Parameter Partikelgröße, Polydispersität, Partikelausbeute, Zetapotential und Molekulargewicht charakterisiert. Neben der Herstellung durch anionische Emulsionspolymerisation wurden NP durch radikalische Emulsionspolymerisation und Nanopräzipitation erhalten. Auch unter Verwendung dieser Verfahren wurden Trägersysteme im gewohnten Größenbereich um 200 nm gebildet. Zusätzlich zur Herstellung von NP hat sich diese Arbeit auch mit den Charakterisierungsmethoden für kleinpartikuläre Arzneiformen auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die häufig angewendete dynamische Lichtstreuung ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung des mittleren Partikeldurchmessers darstellt. Die Ergebnisse dieser Methode stimmen weitgehend mit den Resultaten der zusätzlich verwendeten mikroskopischen Verfahren und der analytischen Ultrazentrifugation überein. Der Einsatz der analytischen Ultrazentrifugation lieferte die best aufgelöste Partikelgrößenverteilung und ermöglichte darüber hinaus die Bestimmung der Dichte der Partikel. Neben der mittleren Größe der Trägersysteme wurde auch das mittlere Molekulargewicht der gebildeten Polymerketten bestimmt. Die hierfür als Standard eingesetzte Gel-Permeations-Chromatographie wurde mit einem relativ neuen Verfahren, der MALDI TOF Massenspektrometrie verglichen. Beide Verfahren lieferten ein zahlenmittleres Molekulargewicht der Polymerketten von 2500 – 3000 Da. Lediglich im Bezug auf das gewichtsmittlere Molekulargewicht zeigten sich größere Unterschiede zwischen beiden Messverfahren, welche jedoch auf das zugrunde liegende Messprinzip und nicht auf das untersuchte PBCA zurückzuführen sind. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte die chemische Struktur der Polymerketten näher aufgeklärt werden. Neben den Produkten des seit langem postulierten Reaktionsmechanismus finden sich Derivate des Polymers, welche formal durch Abspaltung bzw. Anlagerung von Formaldehyd entstehen. Die Menge an frei vorliegendem Formaldehyd scheint jedoch so gering zu sein, dass sie kaum die Hauptursache für die relative Toxizität der PACA-NP darstellen kann. Darüber hinaus ist es möglich, durch Wahl der Reaktionsbedingungen die Bildung von Derivaten des Ursprungspolymers und von Formaldehyd zu minimieren. Die Ergebnisse in der Herstellung und Charakterisierung von leeren Pluronic® F68-stabilisierten PBCA-NP ließen die Verwendung von Doxorubicin-beladenen NP unter Verwendung dieses Stabilisators für die Gehirntumor-Therapie viel versprechend erscheinen. Die hergestellten Nanopartikel zeigten eine im Vergleich zu Dextran-stabilisierten Doxorubicin-NP signifikant niedrigere Arzneistoffbeladung. Die dessen ungeachtet durchgeführte experimentelle Chemotherapie an Glioblastom-tragenden Ratten lieferte jedoch ermutigende Ergebnisse. Die neu entwickelte Zubereitung führte zu einem vergleichbaren Prozentsatz an Remissionen wie die bisherige Standard-PBCA-Formulierung. Die F68-stabilisierte Formulierung und die bisherige Standard-Formulierung mit Polysorbat 80 zeigten nach Inkubation mit humanem Plasma ein vergleichbares Adsorptionsmuster an Plasmaproteinen. Auf Basis der vorangegangenen Studien und dieser Arbeit erscheint es möglich, eine potente nanopartikuläre Doxorubicin-Zubereitung zu entwickeln, welche ausreichend charakterisiert ist, um ihre Anwendung am Menschen zu vertreten.
Als Teil der Atmungskette des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus besteht die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus 13 Untereinheiten, die durch 24 unterschiedliche Gene codiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für den massenspektrometrischen Nachweis dieser Untereinheiten nach der Aufreinigung des Komplexes eine SDS-PAGE durchgeführt, an die sich eine tryptische Proteolyse und eine Messung per MALDI MS und MS/MS anschlossen. Mit dieser analytischen Strategie war es möglich, jede nicht-homologe Untereinheit nachzuweisen und 20 von 24 genombasierten Isoformen eindeutig zu identifizieren. Selbst kleine bzw. sehr hydrophobe Untereinheiten mit vielen Transmembranhelices konnten mit Hilfe dieser Methode analysiert werden. Die hohe Anzahl an präsenten, unterschiedlichen Isoformen und die vorherrschenden Verunreinigungen durch Fremdproteine (z.B. ATP-Synthase) könnten Indizien dafür sein, dass bis jetzt keine hinreichend stabile und reproduzierbare Enzympräparation gelungen ist, um eine Kristallstrukturanalyse durchzuführen. Im Allgemeinen kann der Ablauf eines solchen Proteomics-Experiments in drei Teile gegliedert werden: die Auftrennung eines Protein- oder Peptidgemischs zur Verringerung der Probenkomplexität, die Identifikation des Proteins per Massenspektrometrie und die damit verbundene bioinformatische Datenanalyse. Neben chromatographischen Methoden ist die Elektrophorese in Polyacrylamidgelen immer noch das am häufigsten angewandte Trennverfahren im Proteomics-Bereich. Vor der MS-Messung werden die aufgetrennten Proteine in der Regel direkt in der Gelmatrix verdaut. Die Qualität der Ergebnisse wird stark durch Proteinmenge und die auftretenden Probenverluste beeinflusst. Diese werden beispielsweise durch eine unzureichende Peptidextraktion aus dem Gel hervorgerufen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Das Monomer Acrylamid wird hierzu mit den beiden Quervernetzern N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldiacrylat (EDA) polymerisiert. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören.   Die gemischten Gele mit MBA und EDA als Crosslinkern sind sowohl für Tris-Glycin- als auch Tris-Tricin-Puffersysteme einsetzbar. Die Evaluierung der Daten erfolgte meist gegen ein Standardgel mit T= 14% und C= 2,6%. Durch eine experimentell ermittelte Anpassung der Mischgele auf T+10% und C+45% mit einem MBA/EDA-Verhältnis von 0,5 verhalten sich die beiden Gelsysteme empirisch gleich und zeigen eine übereinstimmende elektrophoretische Trennung und Auflösung. Es gibt keine wesentlichen Nachteile in Bezug auf die Handhabung, die elektrophoretische Trennung und die anschließenden Analysen und Techniken, solange diese in sauren bis leicht basischen pH-Bereichen durchgeführt werden. So wurde das gemischte Gelsystem sowohl bei einer 2D IEF/SDS-PAGE als auch bei einem Western Blot-Experiment angewendet und für vollständig kompatibel befunden. Die gemessenen MS-Daten profitieren im Fall von Trypsin und Elastase erheblich von der besseren Zugänglichkeit des Enzyms zum Substratprotein und der verbesserten Peptidextraktion. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren Ergebnissen, die größtenteils auf höhere S/N-Werte zurückzuführen sind. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Der Nachweis von je 1 pmol der Proteine BSA, Serotransferrin und Alkoholdehydrogenase profitiert stark von den zusätzlich erhaltenen Daten, da die Zunahme an identifizierten Peptiden bei der PMF-Suche im Bereich von 40 bis 80% liegt. Auch bei geringen Proteinmengen wie 250 bzw. 50 fmol BSA ist die Anzahl der zugeordneten Signale um den Faktor 2-3 besser. Der in-Gel Verdau von 1 pmol Bacteriorhodopsin mit Elastase zeigt ebenfalls einen Anstieg der Peptidsignale um 60% im Vergleich zum Referenzgel. Da die Proteine im Gel alle mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass sich die guten MS-Ergebnisse auf jede mit diesem Farbstoff visualisierte Probe übertragen lassen. Für den Fluoreszenzfarbstoff RuPBS trifft dies ebenso zu, insgesamt wurden aber weniger Peptide als bei kolloidaler Coomassie Brilliant Blue-Färbung detektiert. Dementsprechend handelt es sich bei Acrylamidgelen mit MBA/EDA-Vernetzung um ein vielversprechendes alternatives Gelsystem, dass auf eine Vielzahl anderer Methoden angewendet werden kann.
Purpose: The Action Plan for Medication Safety by the German Federal Ministry of Health introduced a standardized medication plan (MP), a printable document for the patient. The practical handling needs to be tested before the nationwide implementation in Germany. Therefore, the aims of our study were 1) to develop an instrument to evaluate the usage of the standardized MP, 2) to assess if patients can locate, and 3) understand important information. Moreover, we explored patients’ opinion and suggestions regarding the standardized MP template.
Patients and methods: We conducted a cross-sectional study to evaluate the practical handling of the standardized MP. We interviewed 40 adult patients in seven community pharmacies in Germany, who took at least five medicines regularly and gave their written informed consent. The interview consisted of questions regarding finding and understanding information provided on a mock-up MP, patients’ opinion and the execution of the information on the MP by filling pill boxes. We eventually developed a new evaluation method to quantify the practical handling of the MP by rating the pill boxes filled by the patients.
Results: Overall, the participants rated the MP positively. Thirty-nine (98%) participants found important information on a mock-up standardized MP. Patients were questioned to identify if they understood information on medical intake as it relates to meals. In particular, they were questioned about medicine intake "1 hour before a meal", which 98% (n=39) interpreted correctly, and "during a meal", which 100% (n=40) interpreted correctly. The less precise advice of "before a meal" was interpreted correctly by 73% (n=29), and only 15% (n=6) correctly interpreted the term "after the meal". The evaluation of the filled pill boxes resulted in the "Evaluation Tool to test the handling of the Medication Plan" (ET-MP) – a weighted scoring system.
Conclusion: The standardized MP is clearly arranged, and patients are able to find important information. The findings of this study resulted in minor but important revisions of the standardized MP template. The developed evaluation tool ET-MP may serve as an objective instrument to assess patients’ ability to transfer written information on the MP into practical handling of medicines.
Die Applikation von therapeutischen Peptiden oder Proteinen kann im Patienten durch Mechanismen des Immunsystems zu unerwünschten Nebenwirkungen führen, die die biologische Wirksamkeit vermindern können. Dies geht mit einer erhöhten Wirkstoffgabe oder einer Therapieresistenz einher und stellt damit ein Sicherheitsrisiko für den Patienten dar. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel HIV-inhibitorischer Peptide eine Möglichkeit aufgezeigt, mit der die peptidspezifische humorale und zelluläre Immunogenität vermindert, die Wirksamkeit indes beibehalten werden kann. Als Ausgangspunkt wurden die bereits publizierten Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C34-EHO ausgewählt, welche äußerst effektiv den Eintritt von HIV in dessen Zielzellen verhindern. Alle fünf Peptide sind von der Aminosäuresequenz des transmembranen Hüllproteins gp41 des HIV-1 (T-20, C46, SC35EK), HIV-2 (C34-EHO) bzw. HIV-1/-2/SIV (T-1249) abgeleitet. In dieser Arbeit wurde das HIV-2 Peptid C34-EHO C-terminal um 12 Aminosäuren des HIV-1 verlängert (neue Bezeichnung: C46-EHO). Für die Initiierung einer zellulären Immunantwort muss unter anderem ein Peptidfragment (sog. MHC-I-Epitop) über Ankeraminosäuren an ein MHC-I-Molekül binden. Die in silico Analyse der Aminosäuresequenzen der Peptide ergab diesbezüglich für das Hybridpeptid C46-EHO die geringste potentielle zelluläre Immunogenität, wobei insgesamt fünf starke potentiell immunogene MHC-I-Epitope von den Vorhersageprogrammen BIMAS und SYFPEITHI identifiziert wurden. Die in vitro Analyse der humoralen Antigenität zeigte zudem, dass die überwiegende Mehrheit der HIV-1-infizierten Patienten Antikörper gegen die HIV-1-abgeleiteten Peptide C46 und T-20 im Serum aufwies, nicht jedoch gegen C46-EHO, T-1249 und SC35EK. Die Antikörper waren überwiegend gegen die am C-Terminus lokalisierte HIV-1 MPER (membrane-proximale external region) gerichtet. In den Seren von HIV-2-infizierten Patienten waren hingegen Antikörper gegen T-1249 und C46-EHO detektierbar. Die Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C46-EHO verhinderten spezifisch die Infektion von HIV-1 im nanomolaren Konzentrationsbereich. C46-EHO hemmte überdies den Eintritt von SIVmac251 als auch T-20- und C46-resistenter HI-Viren. T-Zelllinien wurden durch die membranständige Expression von C46-EHO effektiver vor einer HIV-1 Infektion geschützt im Vergleich zu membranständigen C46 Peptid. Aufgrund der geringen Immunogenität und der äußerst breiten und effektiven antiviralen Wirksamkeit wurde C46-EHO für die weitere Optimierung verwendet. Im C46-EHO wurden Aminosäuren an Hauptankerpositionen der MHC-I-Epitope gegen weniger stark bindende Aminosäuren bei fünf potentiellen 9mer MHC-I-Epitopen ausgetauscht. Dies resultierte in den Peptidvarianten V1, V2, V3 und V4, wobei V2 die aussichtsreichsten Eigenschaften aufwies: 1) niedrigste humorale Antigenität in HIV-1 Patientenseren; 2) potente antivirale Wirksamkeit; 3) verringerte potentielle zelluläre Immunogenität. Abschließend wurde basierend auf V2 die optimierte Peptidvariante V2o generiert. Die Glykosylierungsstelle im V2 Peptid wurde an die entsprechende C46 Position verschoben, wodurch die in silico vorhergesagte zelluläre Immunogenität weiter vermindert wurde. Zudem wurde das HIV-1-abgeleitete MPER-Motiv durch die Aminosäuresequenz des HIV-2 Stammes EHO ersetzt, so dass V2o nicht mehr von prä-existierenden Antikörpern in HIV-1 Patientenseren erkannt wurde. Im ELISpot Assay wiesen weder Patienten mit einer HIV-1 bzw. HIV-2 Infektion noch SIV-infizierte Rhesus Makaken eine zelluläre Immunantwort gegen C46-EHO, V2 oder V2o auf. V2o verhinderte den Eintritt von diversen HIV-1 Viren im pikomolaren Konzentrationsbereich und wies somit eine deutlich verbesserte antivirale Wirksamkeit auf. Somit konnte in dieser Arbeit durch Austausch von Aminosäuren die intrinsische Immunogenität des HIV-inhibitorischen Peptids C46-EHO vermindert und zugleich die biologische Wirksamkeit verstärkt werden. Das hieraus resultierende Peptid V2o steht nunmehr für die weitere klinische Entwicklung als Präventativ oder Therapeutikum für die subkutane oder gentherapeutische Applikation zur Verfügung.
In an ongoing clinical phase I/II study, 16 pediatric patients suffering from high risk leukemia/tumors received highly purified donor natural killer (NK) cell immunotherapy (NK-DLI) at day (+3) +40 and +100 post haploidentical stem cell transplantation. However, literature about the influence of NK-DLI on recipient's immune system is scarce. Here we present concomitant results of a noninvasive in vivo monitoring approach of recipient's peripheral blood (PB) cells after transfer of either unstimulated (NK-DLI(unstim)) or IL-2 (1000 U/ml, 9–14 days) activated NK cells (NK-DLI(IL-2 stim)) along with their ex vivo secreted cytokine/chemokines. We performed phenotypical and functional characterizations of the NK-DLIs, detailed flow cytometric analyses of various PB cells and comprehensive cytokine/chemokine arrays before and after NK-DLI. Patients of both groups were comparable with regard to remission status, immune reconstitution, donor chimerism, KIR mismatching, stem cell and NK-DLI dose. Only after NK-DLI(IL-2 stim) was a rapid, almost complete loss of CD56(bright)CD16(dim/−) immune regulatory and CD56(dim)CD16(+) cytotoxic NK cells, monocytes, dendritic cells and eosinophils from PB circulation seen 10 min after infusion, while neutrophils significantly increased. The reduction of NK cells was due to both, a decrease in patients' own CD69(−) NCR(low)CD62L(+) NK cells as well as to a diminishing of the transferred cells from the NK-DLI(IL-2 stim) with the CD56(bright)CD16(+/−)CD69(+)NCR(high)CD62L(−) phenotype. All cell counts recovered within the next 24 h. Transfer of NK-DLI(IL-2 stim) translated into significantly increased levels of various cytokines/chemokines (i.e. IFN-γ, IL-6, MIP-1β) in patients' PB. Those remained stable for at least 1 h, presumably leading to endothelial activation, leukocyte adhesion and/or extravasation. In contrast, NK-DLI(unstim) did not cause any of the observed effects. In conclusion, we assume that the adoptive transfer of NK-DLI(IL-2 stim) under the influence of ex vivo and in vivo secreted cytokines/chemokines may promote NK cell trafficking and therefore might enhance efficacy of immunotherapy.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Consequences of altered eicosanoid patterns for nociceptive processing in mPGES-1-deficient mice
(2007)
Cyclooxygenase-2 (COX-2)-dependent prostaglandin (PG) E2 synthesis in the spinal cord plays a major role in the development of inflammatory hyperalgesia and allodynia. Microsomal PGE2 synthase-1 (mPGES-1) isomerizes COX-2-derived PGH2 to PGE2. Here, we evaluated the effect of mPGES-1-deficiency on the noci-ceptive behavior in various models of nociception that depend on PGE2 synthesis. Surprisingly, in the COX-2-dependent zymosan-evoked hyperalgesia model, the nociceptive behavior was not reduced in mPGES-1-deficient mice despite a marked decrease of the spinal PGE2 synthesis. Similarly, the nociceptive behavior was unaltered in mPGES-1-deficient mice in the formalin test. Importantly, spinal cords and primary spinal cord cells derived from mPGES-1-deficient mice showed a redirection of the PGE2 synthesis to PGD2, PGF2α and 6-keto-PGF1α (stable metabolite of PGI2). Since the latter prostaglandins serve also as mediators of noci-ception they may compensate the loss of PGE2 synthesis in mPGES-1-deficient mice.
Prostaglandin E2 (PGE2) plays an important role in bone development and metabolism. To interfere therapeutically in the PGE2 pathway, however, knowledge about the involved enzymes (cyclooxygenases) and receptors (PGE2 receptors) is essential. We therefore examined the production of PGE2 in cultured growth plate chondrocytes in vitro and the effects of exogenously added PGE2 on cell proliferation. Furthermore, we analysed the expression and spatial distribution of cyclooxygenase (COX)-1 and COX-2 and PGE2 receptor types EP1, EP2, EP3 and EP4 in the growth plate in situ and in vitro. PGE2 synthesis was determined by mass spectrometry, cell proliferation by DNA [3H]-thymidine incorporation, mRNA expression of cyclooxygenases and EP receptors by RT-PCR on cultured cells and in homogenized growth plates. To determine cellular expression, frozen sections of rat tibial growth plate and primary chondrocyte cultures were stained using immunohistochemistry with polyclonal antibodies directed towards COX-1, COX-2, EP1, EP2, EP3, and EP4. Cultured growth plate chondrocytes transiently secreted PGE2 into the culture medium. Although both enzymes were expressed in chondrocytes in vitro and in vivo, it appears that mainly COX-2 contributed to PGE2-dependent proliferation. Exogenously added PGE2 stimulated DNA synthesis in a dose-dependent fashion and gave a bell-shaped curve with a maximum at 10-8 M. The EP1/EP3 specific agonist sulprostone and the EP1-selective agonist ONO-D1-004 increased DNA synthesis. The effect of PGE2 was suppressed by ONO-8711. The expression of EP1, EP2, EP3, and EP4 receptors in situ and in vitro was observed; EP2 was homogenously expressed in all zones of the growth plate in situ, whereas EP1 expression was inhomogenous, with spared cells in the reserve zone. In cultured cells these four receptors were expressed in a subset of cells only. The most intense staining for the EP1 receptor was found in polygonal cells surrounded by matrix. Expression of receptor protein for EP3 and EP4 was observed also in rat growth plates. In cultured chrondrocytes, however, only weak expression of EP3 and EP4 receptor was detected. We suggest that in growth plate chondrocytes, COX-2 is responsible for PGE2 release, which stimulates cell proliferation via the EP1 receptor.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
Background: Treatment complexity rises in line with the number of drugs, single doses, and administration methods, thereby threatening patient adherence. Patients with multimorbidity often need flexible, individualised treatment regimens, but alterations during the course of treatment may further increase complexity. The objective of our study was to explore medication changes in older patients with multimorbidity and polypharmacy in general practice.
Methods: We retrospectively analysed data from the cluster-randomised PRIMUM trial (PRIoritisation of MUltimedication in Multimorbidity) conducted in 72 general practices. We developed an algorithm for active pharmaceutical ingredients (API), strength, dosage, and administration method to assess changes in physician-reported medication data during two intervals (baseline to six-months: ∆1; six- to nine-months: ∆2), analysed them descriptively at prescription and patient levels, and checked for intervention effects.
Results: Of 502 patients (median age 72 years, 52% female), 464 completed the study. Changes occurred in 98.6% of patients (changes were 19% more likely in the intervention group): API changes during ∆1 and ∆2 occurred in 414 (82.5%) and 338 (67.3%) of patients, dosage alterations in 372 (74.1%) and 296 (59.2%), and changes in API strength in 158 (31.5%) and 138 (27.5%) respectively. Administration method changed in 79 (16%) of patients in both ∆1 and ∆2. Simvastatin, metformin and aspirin were most frequently subject to alterations.
Conclusion: Medication regimens in older patients with multimorbidity and polypharmacy changed frequently. These are mostly due to discontinuations and dosage alterations, followed by additions and restarts. These findings cast doubt on the effectiveness of cross-sectional assessments of medication and support longitudinal assessments where possible.
Trial registration: 1. Prospective registration: Trial registration number: NCT01171339; Name of registry: ClinicalTrials.gov; Date of registration: July 27, 2010; Date of enrolment of the first participant to the trial: August 12, 2010.
2. Peer reviewed trial registration: Trial registration number: ISRCTN99526053; Name of registry: Controlled Trials; Date of registration: August 31, 2010; Date of enrolment of the first participant to the trial: August 12, 2010.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Interaktionspartner des einwärtsrektifizierenden, renalen ROMK-Kaliumkanals identifiziert und funktionell in Xenopus Oozyten untersucht. Zunächst wurde mit Hilfe eines modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-Systems und dem zytosolischen C-Terminus von ROMK als Köderprotein eine cDNS-Bibliothek der humanen Niere durchmustert. Eine Besonderheit hierbei war, daß das Köderprotein im Gegensatz zu dem herkömmlichen Hefe-Zwei-Hybrid-System in der nativen, tetrameren Konformation vorlag. Die Interaktion der isolierten Proteine mit dem ROMK-C-Terminus wurde anschließend in der Hefe in direkten Bindungsstudien bestätigt. Auf diese Weise konnten 25 neue Interaktionspartner für ROMK gefunden werden. Aufgrund ihrer teilweise bekannten Funktionen und Strukturen wurden einige, insbesondere das Golgi-Protein Golgin-160, das Adapterprotein GRB7 und die Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Untereinheit PP2A B56β, für eine weitergehende Charakterisierung ausgewählt. Die vermutete Beteiligung von Golgin-160 am vesikulären Membrantransport machte die gefundene Interaktion mit ROMK besonders interessant, da über den Transport des Kanals vom Endoplasmatischen Retikulum über den Golgi-Apparat bis an die Zelloberfläche nur wenig bekannt ist. Zunächst konnte die Bindung von Golgin-160 an das ROMK Kanalprotein durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Lysaten transfizierter Säugerzellen unterstützt werden. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen bestätigten weiterhin, daß beide Proteine tatsächlich und ausschließlich im Bereich des Golgi-Apparats kolokalisiert sind. Dies verstärkte die Vermutung, daß Golgin-160 am Membrantransport von ROMK beteiligt ist. Funktionelle Untersuchungen in Xenopus Oozyten mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ergaben nach Koexpression beider Proteine reproduzierbar eine Verdopplung der ROMK-Stromamplitude. Mittels einer Chemolumineszenz-Oberflächenexpressionsanalyse konnte dies auf eine Zunahme der Dichte des Kanalproteins in der Plasmamembran zurückgeführt werden. Ähnliche Resultate wurden auch für das nahe verwandte Kir2.1-Kanalprotein erhalten. Diese Untersuchungen zeigten zudem, daß nur das Kanalprotein an der Zelloberfläche, nicht aber die Gesamtmenge des Proteins in der Zelle erhöht war. Dementsprechend waren auch die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des ROMK-Kanals durch das koexprimierte Golgin-160 nicht verändert. Um die Bedeutung der gefundenen Interaktion näher zu untersuchen, wurden Bindungsstudien mit C-terminalen Bartter-Mutanten von ROMK durchgeführt. Alle untersuchten Punkt- und Trunkationsmutanten waren noch zur Bindung von Golgin-160 fähig, und zwei Punktmutanten konnten durch Golgin-160 auch funktionell stimuliert werden. Daraus kann geschlossen werden, daß diese hochkonservierten Aminosäurereste des Kanalproteins nicht an der Bindung von Golgin-160 beteiligt sind, und daß der defekte Membrantransport dieser krankheitsverursachenden Mutanten nicht auf einer gestörten Interaktion mit dem untersuchten Golgi-Protein beruht. Mit diesen Untersuchungen wurde erstmalig gezeigt, daß Golgin-160 am Golgi-Apparat selektiv mit transportierten Membranproteinen interagiert und dadurch deren Zelloberflächenexpression reguliert. Eine spezifische Rolle beim Transport von Oberflächenproteinen zur Plasmamembran wird durch das Ergebnis unterstrichen, daß auch die Oberflächenexpression der entfernt verwandten Kv1.5- und Kv4.3-Kanalproteine stimuliert wird, aber nicht die des HERGKaliumkanals. In weiteren funktionellen Untersuchungen konnten auch für GRB7 und PP2A B56β erstmalig Einflüsse auf die ROMK-Kanalaktivität gezeigt werden. Die Koexpression von GRB7 führte sowohl bei ROMK als auch bei verwandten Kir2-Kanalproteinen zu einer Verringerung der Stromamplitude. Bei PP2A B56β war der Effekt von der Expressionshöhe dieser regulatorischen Phosphatase- Untereinheit abhängig. So waren die ROMK-Ströme bei geringen Mengen an injizierter PP2A B56β erhöht, nach Injektion größerer Mengen dagegen reduziert. Die Regulation der ROMK-Kanalaktivität wird größtenteils durch die Kontrolle der Kanaldichte an der Zelloberfläche erzielt. Da unterschiedliche Signalwege die Häufigkeit des Kanalproteins an der Zelloberfläche modulieren können, kann vermutet werden, daß nicht nur Golgin-160 sondern auch GRB7 und PP2A B56β an der Regulation der Oberflächenexpression von ROMK beteiligt sind (Abb. 36). Die Identifizierung dieser neuen Interaktionspartner stellt deshalb einen ersten wichtigen Schritt bei der Aufklärung der dieser Regulation zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dar.
The prevalence of food allergies has increased in the westernized countries during the past decades. Clinical manifestations of food allergies involve the skin (e.g. atopic dermatitis), the respiratory tract (e.g. rhinitis, and asthma), the ocular area (e.g. conjunctivitis), the gastrointestinal tract (e.g. food-protein-induced enterocolitis syndrome, food-induced proctocolitis, and eosinophilic gastroenteropathies), and the cardiovascular system (e.g. anaphylaxis). A curative treatment of these diseases has not been established yet. Oral immunotherapy (OIT) has gained attention as a potential therapy for food allergies. Continuous feeding of allergenic diet applied in the model described here mirrors to a certain extent an OIT treatment. It might be therefore useful to investigate efficacy and safety of OIT pre-clinically.
Mouse models have been widely used to analyse novel treatment approaches. Unfortunately, most of them have focussed on IgE-mediated hyperreactivity. Only a limited number of mouse models presenting mixed IgE- and non-IgE-mediated gastrointestinal symptoms and inflammation upon allergen-challenge are available. To study the mechanisms underlying the induction of food-induced gastrointestinal inflammation and subsequent oral tolerance induction, a mouse model of food-induced gastrointestinal allergy was established. BALB/c mice were sensitised with Ovalbumin (OVA) plus ALUM and subsequently challenged by feeding a diet containing egg white (EW diet). During the first seven days on EW diet, OVA-sensitised mice (OVA/ALUM EW mice) developed gastrointestinal symptoms (e.g. weight loss, ruffed fur, soft stool and less mobility) and inflammation in the small intestines accompanied by a strong induction of OVA-specific IgE antibodies and mouse mast cell protease-1 (mMCP-1). Proliferation of CD4+ T cells from spleen of OVA/ALUM EW mice was reduced compared controls. The result indicated that feeding EW diet induced T cell tolerance systemically. In contrast, CD4+ T cells isolated from MLN of OVA/ALUM EW mice showed stronger proliferation upon OVA stimulation in vitro than mice OVA-sensitised but fed a conventional diet, indicating that tolerance was not induced by short-term EW diet. Histological analysis of the small intestinal tissue of OVA/ALUM EW mice revealed strong inflammation present in the duodenum, jejunum and ileum at this time point.
Interestingly, the observed symptoms in OVA/ALUM EW mice resolved spontaneously after 7 days on EW diet, if the feeding was continued. In the next steps the CD4+ T cell-mediated immune response after 28 days continuous EW diet was assessed and revealed that tolerance was induced systemically as well as locally. This was shown by reduced proliferation and cytokine secretion of CD4+ T cells from MLN of OVA/ALUM EW mice after long-term EW diet. However, the inflammation in the jejunum was aggravated instead of resolved at this time point of allergenic diet. Our results suggest that application of OIT in food-allergic patients with gastrointestinal inflammation may need to be reconsidered, since continuous administration of allergenic food may aggravate inflammation in the local tissue. Interestingly, only the jejunum was affected by a worsened condition, whereas duodenum and ileum resolved inflammation. In accordance to the observed jejunal inflammation mMCP-1 levels in the sera were not changed. Allergen-specific IgE levels did not reach baseline level after long-term EW diet, although they were reduced compared to levels in mice after 7 days on EW diet. This result suggests that residual OVA-specific IgE antibodies would promote the jejunal inflammation by sustained activation of mast cells. Furthermore, our results suggest that IL-4 produced by activated Th2 cells could be an effector molecule to induce intestinal inflammation.
The second part of this thesis was aimed at verifying the hypothesis that IgE-mediated mast cell activation is a major effector mechanism in induction of chronic inflammation induced by long-term EW diet. For that mice deficient for FcεRI, a high affinity IgE receptor, were used. These mice were sensitised with OVA and fed EW diet as described for WT mice. Although FcεRI-deficient mice showed an intact Th2 immunity with IgE production, weight loss in the receptor-deficient mice was moderately induced by EW diet compared to WT mice, suggesting that this clinical symptom during the acute phase of allergic response is associated with IgE-mediated mechanisms. Surprisingly, the deficient mice presented comparable intestinal inflammation on day seven of EW diet as WT mice did. However, if EW diet was continued, recovery of intestinal inflammation was observed in FcεRI-deficient mice in contrast to WT mice. These results suggest that the induction of intestinal inflammation is not IgE-dependent. Nevertheless, this does not rule out a potential role of mast cells in the inflammation, because of their IgE-independent activation pathways. It also suggests the involvement of T cell-mediated mechanisms during induction of jejunal inflammation. Interestingly, the aggravated inflammation seen after long-term EW diet in WT mice seems to be IgE-dependent, considering that it was not observed in FcεRI-deficient mice. The elevated number of mast cells in the intestine of WT mice further led to a hypothesis that their continuous activation might be responsible for the chronification of allergic inflammation observed after long-term EW diet. In the context of OIT it further implies that IgE might be a poor prognostic factor for recovery of intestinal inflammation during and after an OIT treatment. In the third part of this thesis regulatory mechanisms employed by the immune system were analysed. Initial results from CD4+ T cells isolated from MLN from OVA/ALUM EW mice showed elevated IL-10 levels in their supernatants after short-term EW diet. IL-10-deficient mice were used to analyse the effect of this immunosuppressive cytokine in the mouse model presented here. However, IL-10-deficient mice tend to develop a strong Th1-dominated immune response. Nevertheless, an accelerated weight loss and slight inflammation of the jejunum was observed after short-term EW diet. Analysis of OVA-specific proliferation and cytokine production CD4+ T cells from Spleen and MLN of IL-10-deficient mice on EW diet suggested that systemic as well as local tolerance was induced after short-term and long-term EW diet feeding, respectively. The result suggests that IL-10 is dispensable for induction of T cell tolerance in our mouse model.
However, the presence of functionally active Tregs was observed during this study in WT mice fed short-term EW diet, suggesting that Tregs might have an important role in regulating the systemic or local immune response. T cell deletion as an alternative immune regulatory mechanism was also observed. Additionally, the efficacy of continuous EW diet (mirroring to a certain extent an OIT treatment) in induction of permanent tolerance was assessed. In OVA-sensitised WT mice continuous allergenic diet was stopped after resolution of clinical symptoms and reintroduced after a defined period on conventional diet. Evaluating the weight development showed that reintroduction of EW diet induced weight loss again, but not as pronounced as seen after short-term EW diet. Also the CD4+ T cell-mediated response was elevated again upon allergen stimulation in vitro. The results suggested that permanent tolerance was not induced in the chosen feeding regime.
The mouse model established and analysed here was used to investigate inflammatory and regulatory mechanisms underlying food-induced gastrointestinal allergy. It presents clinical symptoms and intestinal inflammation (Burggraf et al., 2011). This model is easy to be reproduced in different laboratories, and is useful for testing novel therapy approaches (Schülke et al., 2011; Bohnen et al., 2013). It further provides an opportunity to investigate basic mechanisms underlying OIT. This therapy approach is currently extensively investigated and our mouse model would help to understand the therapeutic mechanism of OIT.
Krebszellen zeichnen sich häufig durch Expression von tumorassoziierten Antigenen aus, über die grundsätzlich eine spezifische Erkennung durch das Immunsystem möglich ist. Ansätze zur Immuntherapie von Krebserkrankungen zielen darauf ab, das Potential der körpereigenen Immunabwehr zur Tumorabwehr auszunutzen. Für die Aktivierung von tumorspezifischen T-Zellen ist die Präsentation von Peptidepitopen eines Tumorantigens zusammen mit effizienter Kostimulierung durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs), insbesondere dendritische Zellen (DCs), entscheidend. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2/HER2 neuartige zelluläre Vakzine generiert und ihre Aktivität in der Therapie bestehender ErbB2-exprimierender Tumoren analysiert. ErbB2 ist ein Mitglied der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptorfamilie und wird von vielen humanen Tumoren epithelialen Ursprungs überexprimiert. Als Rezeptortyrosinkinase ist ErbB2 direkt an der Tumorpathogenese beteiligt und stellt eine wichtige Zielstruktur für unterschiedliche immuntherapeutische Ansätze dar. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde ein chimäres Tumorvakzin entwickelt, das über die extrazelluläre Domäne des humanen B7-Liganden CTLA-4 die spezifische Beladung von B7-exprimierenden APCs mit einem immunogenen Abschnitt des humanen ErbB2 (HER2/neu) in vivo ermöglicht. Die Immunisierung von naiven Mäusen mit DNA-Vektoren, die für sekretierte CTLA-4-ErbB2 Fusionspoteine kodieren, induzierte in den vorangegangenen Arbeiten eine protektive Immunität gegen anschließend injizierte ErbB2-exprimierende murine Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2). Allerdings war eine therapeutische Vakzinierung mit den DNA-Vektoren gegenüber bereits bestehenden Tumoren nicht mehr wirksam. Zur Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit des CTLA-4-ErbB2 Tumorvakzins wurde in dieser Doktorarbeit eine alternative Behandlungsstrategie entwickelt, bei der das APC-spezifische Fusionsprotein durch ein zelluläres Vakzin in vivo zur Verfügung gestellt wird. Durch stabile Transfektion der aus BALB/c Mäusen stammenden nicht tumorigenen Mammaepithelzelllinie HC11 mit einem CTLA-4-ErbB2 kodierenden DNA-Konstrukt wurde dazu das klonale zelluläre Vakzin HC11/CTLA-4-ErbB2 abgeleitet und funktionell charakterisiert. Von diesem Zellvakzin wurde anhaltend CTLA-4-ErbB2 Fusionsprotein in das umgebende Milieu sezerniert, das in der Lage war, effizient an B7-exprimierende Zellen zu binden. Die dreimalige Immunisierung mit dem zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin im wöchentlichen Intervall löste im immunkompetenten BALB/c Mausmodell eine ErbB2-spezifische Immunantwort aus. Mit Hilfe des bereits zuvor in den prophylaktischen DNA-Vakzinierungsexperimenten eingesetzten BALB/c Renca-lacZ/ErbB2 Tumortransplantationsmodells wurde zunächst untersucht, ob das zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin einen Einfluss auf das Wachstum von etablierten ErbB2-exprimierenden Tumoren hat. Die Inokulation des Vakzins in die Nähe von subkutan wachsenden Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren führte in BALB/c Mäusen zu einer kompletten Tumorregression in der Mehrzahl der behandelten Tiere. Dabei war der antitumorale Effekt von der starken Induktion ErbB2-spezifischer Antikörper und einer mäßigen ErbB2-spezifischen Aktivität systemischer zytotoxischer T-Zellen begleitet. Durch Vakzinierung und Tumorabstoßung wurde ein Langzeitschutz induziert, der die erneute Abstoßung einer zwei Monate nach dem Primärtumor systemisch applizieren letalen Dosis von Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen bewirkte. Die Vakzinierung mit HC11/CTLA-4-ErbB2 hatte keinen Einfluss auf das Wachstum ErbB2-negativer Tumorzellen. Ebenso führte die Behandlung mit HC11 Zellen, die ein irrelevantes CTLA-4 Fusionsprotein sezernieren, nicht zur Abstoßung von RencalacZ/ ErbB2 Tumoren. Diese Resultate bestätigen die antigenspezifische Wirkung des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins. Für die Evaluierung von ErbB2-spezifischen Immuntherapien stehen eine Reihe transgener Mausmodelle zur Verfügung, welche die Untersuchung des Einflusses einer bestehenden immunologischen Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf die therapeutische Aktivität zulassen. Ein gut etabliertes und häufig verwendetes Tiermodell sind dabei transgene WAP-Her-2 Mäuse, für die der humane ErbB2-Rezeptor ein Selbstantigen darstellt. In dieser Arbeit wurden durch Kreuzung mit BALB/c WAP-Her-2 F1 Mäuse mit einem genetischen CB6F1 Hintergrund erzeugt. Diese Tiere wiesen eine ausgeprägte immunologische Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf und eigneten sich somit für die Analyse der Aktivität des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins in einem physiologisch relevanten Kontext. Eine therapeutische Vakzinierung mit dem ursprünglichen HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin führte in diesen WAP-Her-2 F1 Tieren nicht zu einer Abstoßung von Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren. Zur Erhöhung der Effektivität von HC11/CTLA-4-ErbB2 in der Therapie von ErbB2-positiven Tumoren in immunologisch toleranten Mäusen wurde daher ein ähnliches zelluläres Vakzin generiert, das zusätzlich das immunmodulatorische Zytokin IL-15 sezerniert. Im Gegensatz zu HC11/CTLA-4-ErbB2 war das optimierte zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2/IL-15 Vakzin auch in immuntoleranten WAP-Her-2 F1 Mäusen therapeutisch wirksam und verzögerte signifikant das Wachstum von ErbB2-exprimierenden Tumoren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die andauernde Expression und Sekretion des APC-spezifischen CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteins durch peritumoral injizierte Epithelzellen eine wirksame antigenspezifische Immunantwort und antitumorale Aktivität gegen etablierte Tumoren induzieren kann. Es ist wahrscheinlich, dass sich ähnliche Zellvakzine auch in menschlichen Krebspatienten als wirksam und nützlich erweisen können. Eine weitere Entwicklung dieses Ansatzes hin zu einer klinisch anwendbaren Immuntherapie erscheint daher sinnvoll.
Lipid mediators have been referred as bioactive lipids, whose change in lipid levels resulted in functional or pathophysiological consequences. They are in the focus of biological research, nevertheless this is a late recognition due to the many difficulties of working with bioactive lipids due to their properties: hydrophobic, unstable and they occur in only in small quantities. Liquid chromatography and mass spectrometry have facilitated the work with them. Especially in this field, cardiovascular diseases and inflammatory mediated diseases and cancer are pathophysiological events where LMs are deregulated. Additionally, if the modulation of one LM pathway is not sufficient to overcome a disease, the combination of targeting two or more pathways could be effective. Needless to say, lipid signaling cascades are complicated pathways and possible shunting into other pathways when inhibiting or genetically deleting enzymes should be taken into consideration.
The first part of this work has focused on enzymes that metabolize eicosanoids, like mPGES-1 and 5-LO. mPGES-1 is an important enzyme metabolizing PGH2 and one of the key players of the AA cascade. Its product, PGE2 plays an important role in different inflammatory processes. Inhibition of the mPGES-1 might be a promising step to circumvent COX dependent side effects of NSAIDs. The class of quinazoline compounds around the lead structure FR20 has been investigated on isolated human and murine enzyme, in HeLa cells and in different human whole blood (HWB) settings to establish the possible effects of these compounds on eicosanoid profiling. Novel compounds with inhibitory activities in the submicromolar range (IC50: 0.13 µM - 0.37 µM on isolated enzyme) were obtained which were also effective in cells and HWB. Furthermore, pharmacological profiling of toxicity and lipid screening with LC/MS-MS revealed that compounds also reduce PGE2 levels in intact cells and whole blood; they do not impair cell viability but lack the ability to inhibit the murine mPGES-1 enzyme. This problem could be overcome by means of chemical synthesis varying the scaffold (quinoline, quinazoline) or introducing biosteric replacement in the phenyl moieties.
5-LO is a relevant enzyme that plays an important role in eicosanoid signaling in particular in leukotriene biosynthesis. Leukotrienes are involved in asthma, allergic rhinitis, glomerulonephritis, rheumatoid arthritis, sepsis, cancer and atherosclerosis. Moreover, genetic variants in the genes of the 5-LO pathway have been associated with the risk of development of acute myocardial infarction and stroke. Eicosanoids are increased in infectious exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). They are also elevated in the airways of stable COPD patients compared to healthy subjects. Therefore, 5-LO has attired the scientific community as a possible therapeutic target to treat the several disease conditions listed before. In this study an extensive evaluation of imidazo[1,2-a]pyridines as a suitable lead structure for novel 5-LO targeting compounds was presented Within the three publications, 5-LO inhibitory activity of synthesized compounds was investigated in intact PMNL, a cell-free assay, in human whole blood and rodent cells to both elucidate structure-activity relationships and compounds were in vitro pharmacological evaluated. Chemical modifications for lead optimization via straight forward synthesis were used to combine small polar groups (hydroxy, and methoxy groups) which led to a suitable candidate with desired in vitro pharmacokinetic profile in terms of solubility and intrinsic clearance without showing any cytotoxicity. More than 70 imidazo[1,2-a]pyridine derivatives have been synthesized, resulting in more than 50 active compounds. Although it was not possible to introduce a solubility group without impairing the 5-LO inhibitory activity, combination of small polar groups lead to a more favorable solubility and in vitro metabolic stability. Overall, the development of 5-LO inhibitors with high efficacy and selectivity in vivo will provide a possible treatment for patients having one of the diseases where leukotriene biosynthesis plays an important role.
Other types of 5-LO inhibitors have been synthesized during this work, NO-NSAIDs can be postulated as novel 5-LO inhibitors that could circumvent the undesired side-effects of inhibiting COX isoforms (ulcer perforation, gastrointestinal bleeding and in some cases death). It is suggested that NO group is released in situ or after compounds are metabolized. NO-NSAIDs maintain the same anti-inflammatory properties by inhibiting 5-LO in clinical relevant concentrations. NO-NSAIDs are currently under clinical trial for the treatment of diseases where inflammation plays an important role. Synthesis of NO-NSAIDs is straightforward and can be applied for most NSAIDs recently published. Among them, the most promising candidate is NO-sulindac that was able to inhibit 5-LO product formation in intact PMNL, purified 5-LO and HWB in micromolar concentration. Additional experiments regarding their mechanism are currently being performed.
The present study could show that dual inhibitors are an interesting approach that is practicable. It has been used in the recent years to overcome side-effects and diseases concerning more pathophysiological conditions. MetS is an example of a conjunction of symptoms: hyperglycemia, hypertriglyceridemia, hypertension and obesity. Due to its complex nature, the current treatment strategies of MetS require multiple pharmacological compounds regulating lipid and glucose homeostasis as well as blood pressure and coagulation. This study describes the first synthesis of dual sEH/PPAR modulators as potential agents for treatment of MetS. Following a combinatorial approach, an acidic head group known as a pharmacophore important for PPARα/γ dual agonistic activity was combined with different hydrophobic urea derivatives in order to introduce an epoxide mimetic (sEH pharmacophore). The resulting compounds yielded high inhibition of sEH and different patterns of PPAR agonistic activity. This study demonstrates that the pharmacophores of PPAR agonists and sEH inhibitors can be easily combined, resulting in a simplified blueprint of a dual sEH/PPAR modulator. Further in vivo pharmacological evaluation studies are needed in order to evaluate, which pattern of PPAR activation shows the most promising profile for treatment of metabolic syndrome.
Another example of dual pharmacology has been presented in this work. Natural products derived compounds were able to target sEH and exhibit promising antiproliferative properties. The principle of addressing multiple targets by natural products can be transferred to synthetic multi-target ligands. In conclusion, several (E)-styryl-1H-benzo[d]imidazoles were synthesized and evaluated on recombinant sEH after an initial hit (IPS) that lead to potent sEH inhibitors exhibiting antiproliferative activities. Following the natural product-inspired design, the desired biological activity from a bacterial secondary metabolite has been enhanced and transferred to a synthetic compound series. The resulting compounds were accessible via an easy synthetic route and offered a possibility to investigate the structure-activity relationships. The natural product inspired drug design extends the valuable role of natural products as drugs and drug precursors to templates for fully synthetic bioactive molecules. Simplification of natural products by means of chemical synthesis could lead to an interesting field in the treatment of cancer.
Affinity chromatography has been used to unravel unknown- and off-target effects which either contribute to the biological effect of the inhibitor or that counteract or lead to undesired side-effects. During this PhD work, two main projects related to this technique have been established. In the first one, related to an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor (EP6), it has been shown that epoxide-sepharose is a reliable material in order to couple compounds bearing an alcohol. Coupling of an analogue of EP6 to the sepharose has been accomplished and affinity towards 5-LO was demonstrated. The challenging step is to discern from unspecific protein binders and analysis via SDS-PAGE separation and mass spectrometry. Further experiments using other cell types or improving SDS-PAGE analysis (e.g. 2D gel analysis) should be useful to unravel EP6 off-target effect. During the second project related to off-target effects of celecoxib and DMC, the main problem was the coupling of the functional group to the sepharose. Affinity towards COX-2 could not be demonstrated pointing out the inefficient coupling method. Higher pH values during coupling reaction should be tested in further experiments. Nevertheless, affinity chromatography is a useful technique to unravel cellular mechanisms.
Sphingolipid metabolism is also a recent area that attired the attention of cancer researchers, due to their important roles in cell proliferation and apoptosis. Ceramide metabolism inhibitors were synthesized and evaluated on different assay systems in order to assess their efficacy on several cancer lines. Remarkably, 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methanamine (32) was a useful scaffold to mimic the sphingoid base. This key intermediate was used to produce ceramide analogues that could enter the cell and target apoptosis machinery. EB143 (38) increased ceramide levels in an in vitro ceramide synthase assay in a dose-response manner meaning that ceramide synthase was not inhibited but the ceramide de novo synthesis was activated. This effect was due to the fact that EB143 is a cytotoxic compound with an interesting antiproliferative profile. Further chemical modifications should be carried out to modulate this effect.
COX and LO inhibitors are cancer-preventive not only by inhibiting specific antiapoptotic AA metabolites but also by facilitating accumulation of AA which promotes neutral SMase activity and increases the proapoptotic ceramide. Several 5-LO inhibitors have been evaluated on several cancer lines and sphingolipid levels were measured in order to obtain a relationship. A549, Capan-2 and MCF-7 cells line were incubated with synthetic 5-LO inhibitors and zileuton. Compounds were cytotoxic to all cancer cell lines except from A549. Needless to say, zileuton did not exhibit a cytotoxic profile. Synthetic 5-LO inhibitors were able to modify ceramide levels but were useless when coincubating with sphingolipid metabolism inhibitors (myoricin, amitryptiline etc.) and inconsistent results were obtained. On the contrary, zileuton selectively increased Cer-C16 levels and in less extend Cer-C24:1. When using a SPT inhibitor (myoricin) alone was able to reduce C24:1 and Cer-C16:0 levels below the control, a similar effect occurred when incubation the cells with zileuton and myriocin. Interestingly, treatment of zileuton together with either amitryptiline or desipramine led to a decrease in Cer-C24:1 and levels Cer-C16:0 but the inhibition was not complete indicating that probably the de novo pathway has an important role. Further investigations on mRNA level should be carried out in order to discern which CerS is activated.
The main objective of the present thesis was the synthesis of lipid signaling modulators and their evaluation in vitro as therapeutic strategy to overcome pathophysiological conditions (cancer, metabolic syndrome, etc). It has been accomplished on many relevant targets like 5-LO, mPGES-1, sEH and PPAR and these lipid signaling modulators could be used in the treatment of diseases conditions where lipid mediators play an important role.
Die Proteomforschung wurde die letzten beiden Dekaden maßgeblich durch die Massenspektrometrie geprägt und vorangetrieben. Ohne die Ionisationstechniken MALDI und ESI wäre die Analyse von Peptiden und Proteinen nicht in dem Maße möglich. Durch das Zusammenspiel zwischen Probenvorbereitung und effektiven Trennmethoden mit hochauflösenden Massenspektrometern und Auswertungssoftware können heute problemlos komplexe Proteinmischungen oder ganze Proteome untersucht werden.
Um Proteine in Peptide zu schneiden, wird in den allermeisten Fällen die Protease Trypsin verwendet, deren Eigenschaften in vielerlei Hinsicht die bestmögliche Lösung für die nachfolgende Analyse mit Massenspektrometern bieten. Allerdings stößt die Anwendbarkeit dieses Enzyms bei der Analyse von einigen Proteinen oder Proteinklassen wie Membranproteinen an ihre Grenzen, da nur sehr wenige potentielle Schnittstellen vorhanden sind. In solchen Fällen wurden eine Reihe von weniger spezifischen Enzymen wie Chymotrypsin, Proteinase K oder Elastase in den vergangenen Jahren genutzt, die Proteine auch in für Trypsin weniger gut zugänglichen Bereichen wie Transmembranhelices, in massenspektrometrisch analysierbare Peptide spalten können.
Allerdings stellen die wenig spezifischen Enzyme und die von ihnen generierten Peptide die Massenspektrometrie vor neue Herausforderungen. Für eine Identifizierung benötigen die Peptide eine sehr hohe Massengenauigkeit, daneben sind insbesondere bei der Verwendung von MALDI-Massenspektrometern neutrale und sehr saure Peptide schwerer ionisierbar und analysierbar als basische.
Genügte es bis vor einigen Jahren, nur die Identität einzelner Proteine in komplexen Proben zu bestimmen, hat sich die Fragestellung mittlerweile einem Wandel unterzogen. Heute ist man daran interessiert, wie viel eines bestimmten Proteins vorliegt, besonders im Vergleich mit anderen, unterschiedlich behandelten Proben ist die Regulation von Proteinen von Interesse. Zum Quantifizieren stehen viele unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Eine solche stellen die isobaren Derivatisierungsreagenzien TMT und iTRAQ dar, mit denen unterschiedliche Proben nach Peptidfragmentierung quantifiziert werden können.
Fast alle Arbeiten zur Quantifizierung in der Vergangenheit benutzten Trypsin als Protease.
Im Zuge dieser Arbeit sollten die Vorteile, die durch die Verwendung von Elastase bei der Identifizierung von Membranproteinen bereits gezeigt werden konnten, auf die Quantifizierung mit TMT erweitert werden.Wurde in der Vergangenheit noch in manchen Publikationen davon abgeraten, Elastase zu verwenden,weil die Nutzbarkeit der dabei gebildeten komplexen Peptidmischungen in Frage gestellt wurde, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Elastase wie auch Trypsin sich eignen, als Enzym für Quantifizierungsexperimente verwendet zu werden. Dies wurde an Modellproteinen evaluiert und dann auf komplexe Membranproben von Hefezellen erweitert.
Bei Vorexperimenten zur Derivatisierung mit TMT wurde desweiteren festgestellt, dass Peptidklassen, die zuvor nur mit ESI als Ionisationsmethode identifiziert werden konnten, durch die Derivatisierung nun auch mit MALDI zugänglich waren. Die dadurch analysierten kleinen, hydrophoben und sehr sauren Peptide lieferten bei der Kombination mit der underivatisierten Probe einen deutlichen Zugewinn in der Sequenzabdeckung der identifizierten Proteine.
Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der nachträglichen Korrektur von gemessenen Peptidmassen über selbst geschriebene Softwarelösungen für verschiedene Massenspektrometer. Es wurde das Ziel verfolgt, eine möglichst hohe Massengenauigkeit und damit hohe Anzahl an Identifizierungen von Proteinen nach Verdau mit wenig spezifischen Proteasen zu erreichen. Weitere Computerprogramme wurden mit dem Ziel geschrieben, den Arbeitsablauf zu erleichtern und zu verbessern.
Für die früher schon beschriebene Kombination zweier Massenspektrometer mit hoher Massengenauigkeit und Auflösung auf der einen Seite und effizienter Peptidfragmentierung auf der anderen Seite konnte durch Veränderung der Instrumentierung und Software nun eine Automatisierbarkeit geschaffen werden, die es ermöglicht, die Methode standardmäßig bei Routineanalysen zu verwenden.
So ergeben sich viele neue Möglichkeiten neben den oft gewählten Standardprotokollen mit der Analyse tryptischer Verdauansätze mittels LC-ESI-MS/MS, die häufig nur der Einfachheit halber und ohne Anpassung an die eigene Zielsetzung gewählt werden.
Die Arbeit zeigt aber auch auf, dass die Verwendung weniger spezifischer Enzyme sowohl eine Optimierung des Arbeitsablaufs als auch eine Datenauswertung benötigt, die die Besonderheiten der Proteasen berücksichtigt. Wenn dies gewährleistet wird, kann vor allem mit dem Zugewinn durch die Derivatisierung mit TMT eine wertvolle Alternative zu Trypsin genutzt werden.
Biopharmazeutika sind heutzutage ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelmarktes. Ihr komplexer Aufbau und ihre Mikroheterogenität erfordern eine genaue strukturelle Charakterisierung auf verschiedenen Ebenen der Moleküle, wobei die Anwendung neuer Methoden von den entsprechenden Richtlinien durchaus erwünscht ist. Die Massenspektrometrie als Analysemethode hat sich in diesem Gebiet bereits fest etabliert. Verschiedenste massenspektrometrische Untersuchungen können an den intakten Biopharmazeutika sowie an größeren und kleineren Bruchstücken derselben durchgeführt werden. Trotzdem wird meist auf wenige, lange etablierte Protokolle zurückgegriffen, die häufig mit langwieriger Probenvorbereitung verbunden sind. Bei der Analyse der Glykosylierung wird immer noch die chromatographische Trennung mit anschließender Detektion durch UV- oder Fluoreszenzmessung bevorzugt.
In dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten der Massenspektrometrie bei der Analyse von Biopharmazeutika genauer untersucht werden. Dazu gehört auch, den hohen Informationsgehalt der üblichen chromatographischen Auftrennung von Peptiden aus einem proteolytischen Verdau vollständig zu nutzen. Es wurde gezeigt, dass die manuelle Auswertung der Analyse zusätzliche Ergebnisse bringt, und dass gleichzeitig eine Analyse von posttranslationalen und prozessbedingten Modifikationen möglich ist. Zudem wurde der Verdau mit der Protease Trypsin auf das jeweilige Biopharmazeutikum und auf das Ziel der Analyse optimiert. Da mit Trypsin eine vollständige Sequenzabdeckung nicht erreichbar war, wurden zusätzlich verschiedene weniger spezifische Proteasen angewendet. Alle untersuchten weniger spezifischen Proteasen (Elastase, Chymotrypsin und Thermolysin) waren für eine solche Analyse gut geeignet. Die Komplementarität von MALDI- und ESI-MS-Analysen konnte durch ihre Kombination optimal ausgeschöpft werden. Zudem wurden weitere Methoden zur Erhöhung der Sequenzabdeckung wie die Derivatisierung der Peptide mit TMTzero vorgestellt.
Für die Analyse intakter Biopharmazeutika wurden neben der Größenausschlusschromatograph und gelelektrophoretischen Trennungen sowohl MALDI- als auch ESI-MS-Analysen verwendet. Die Trennung großer Proteinmoleküle in kleinere Untereinheiten erleichterte dabei die massenspektrometrische Analyse maßgeblich. Die Fragmentierung der Biopharmazeutika mittels MALDI-ISD war für die Bestimmung der Protein-N- und C-Termini sehr gut geeignet.
Die Analyse der Glykosylierung wurde an den freien N-Glykanen aus einem PNGaseF-Verdau sowie an Glykopeptiden aus einem Verdau mit Pronase durchgeführt. Die freien N-Glykane konnten zudem für die MALDI-MS-Analyse mit der MALDI-Matrix 3-Aminochinolin direkt auf dem Probenteller derivatisiert werden. Die Derivatisierung und Vermessung der N-Glykane wurde zunächst an verschiedenen Standardoligosacchariden, Humanmilcholigosacchariden und N-Glykanen aus Standardglykoproteinen optimiert. Durch die Fragmentierung der N-Glykane konnten diese sequenziert und isomere Strukturen unterschieden werden.
Bei einem Pronaseverdau wurden Proteine so weit verdaut, dass nur noch einzelne Aminosäuren bzw. Di- oder Tripeptide übrig blieben. Lediglich die Glykosylierungsstellen waren durch die voluminösen Glykanstrukturen vor dem Verdau geschützt und behielten eine kurze Peptidsequenz, die für eine Identifizierung der Glykosylierungsstelle ausreichend war. So konnten die N- und O-Glykopeptide direkt ohne Aufreinigung mittels MALDI-MS aus den Verdauansätzen analysiert werden, ohne dass nicht glykosylierte Peptide störten. Das Verdauprotokoll wurde zunächst an mehreren Standard-N- und -O-Glykoproteinen optimiert und anschließend auf die untersuchten Biopharmazeutika angewendet. N- und O-Glykopeptide konnten sogar nebeneinander analysiert werden. Die hohe Massengenauigkeit des verwendeten MALDI LTQ-Orbitrap Massenspektrometers ließ eine eindeutige Identifizierung der Glykopeptide mit Hilfe eines dafür entwickelten Programms zu. Weiterhin konnte die Identifizierung durch die Fragmentierung der Glykopeptide unterstützt werden.
Somit konnten in dieser Arbeit verschiedene massenspektrometrische Analysen von Biopharmazeutika neu entwickelt, optimiert oder vereinfacht werden. Dabei wurden für jede Strukturebene (intaktes Molekül, größere und kleinere Fragmente) sowohl Ansätze mit MALDI-MS als auch mit ESI-MS verfolgt. Einige Methoden, die in der Proteomforschung bereits Anwendung fanden, konnten erfolgreich auf Biopharmazeutika übertragen werden. Die Arbeit zeigt, dass die Massenspektrometrie ein großes Potential in der Analyse der Biopharmazeutika besitzt, das aber bisher noch nicht vollständig ausgeschöpft wird. Durch die Wahl der richtigen Methoden und der geeigneten Instrumentierung wird eine vollständige strukturelle Charakterisierung ermöglicht.
HIV vaccine preclinical testing is difficult because HIV’s only relevant hosts are humans and no correlates of protection are known. To this end, we are working on the humanization of different mouse strains with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as human hematopoietic stem cells (HSC) to generate a useful small animal model.
We generated immune deficient mice (NOD Scid IL2gc -/- /NOD Rag1-/- IL2gc -/-) expressing human MHC class II (HLA-DQ8) on a mouse class II deficient background (Ab-/-). Here, the human HLA-DQ8 should interact with the matching T cell receptors of transferred matching human PBMCs and therefore could support the functionality of the transferred human CD4+ cells in the mice.
Mice that were adoptively transferred with human HLA-DQ8 PBMCs only showed engraftment of CD3+ T cells. Surprisingly, the presence of HLA class II did not significantly change the repopulation rates in the mice. Also, the presence of HLA class II did not advance B cell engraftment, such that humoral immune responses were undetectable. However, the overall survival of DQ8-expressing mice was significantly prolonged, compared to mice expressing mouse MHC class II molecules, and correlated with an increased time span until onset of GvHD.
To avoid GVHD and to increase and maintain the level of human cell reconstitution over a long period of time, the same mouse strains were reconstituted with human HSC. Compared to PBMC-repopulated mice, HSC-reconstituted mice develop almost all subpopulations of the human immune system detectable at week 12 after HSC transfer. These mice developed adaptive immune responses after Tetanus Toxoide (TT) immunizations. In addition, we are testing the susceptibility of these humanized mice to different HIV strains with a detailed look at immune responses.
Role in routing to the plasma membrane of the L 0 domain of the multidrug resistance protein MRP1
(2003)
Die mehrfache Chemotherapieresistenz (Multidrug Resistance) beruht auf vermehrtem Transport von Xenobiotika aus der Zelle, was zu einer dramatischen Verringerung der intrazellulären Konzentration von chemotherapeutischen Substanzen führt. Dieser Effekt wird von transmembranen Transporter-Proteinen der ABC-Familie verursacht. Zu dieser Familie gehört MRP1, die eine große Vielfalt an Substraten transportieren kann. MRP1 ist ein 190 kDa Glykoprotein mit einer vermuteten Topologie, die zusätzlich zum typischen P-gp ähnlichen Kern (Delta MRP1) eine amino-proximale transmembrane Domäne aufweist, die aus fünf transmembranen Alpha-Helices besteht. Sie ist durch einen cytoplasmatischen Verbindungs-Loop (L0) mit Delta MRP1 verbunden. Wenn MRP1 in polarisierten Zellen exprimiert wird, wird es zu der basolateralen Membran geleitet. In der vorliegenden Arbeit sollte nun die Funktion des amino-terminalen Bereichs von MRP1, der aus der ersten transmembranen Domäne TMD0 und dem cytoplasmischen Verbindungs-Loop L0 besteht, durch Expression und Koexpression von diversen MRP1 Mutanten in polarisierten MDCKII Zellen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass in der L0 Region eine amphipathische Helix vorhanden ist, die für die Funktionalität der MRP1 notwendig ist; dass das isolierte L0-Peptid in der Lage ist, sich mit Delta MRPI zu assoziieren (dadurch erlangt das Protein wieder seine Funktion und lokalisiert sich in der basolateralen Membrane); dass TMD0L0 sich teilweise in der basolaterale Membrane befindet und dass seine Anwesenheit genügt, um die Glycosilierung (Fig. 4.17 in der Dissertation) und die Lokalisierung in der basolateralen Membrane des Delta MRP1 zu ermöglichen (Fig. 4.18 in der Dissertation); dass die Koexpression der zwei komplementären Fragmente eine wild-type-ähnliche Transportaktivität ergibt (Fig. 4.19 in der Dissertation) und dass die beiden Fragmente interagieren (Fig. 4.21 in der Dissertation). Es wurde ausserdem ein chimerisches Protein hergestellt, welches aus TMD0 von MRP1 und L0 von MRP2 besteht und in MDCKII und MDCKII-Delta MRP1 Zellen exprimiert. Es wurde festgestellt, dass das unvollständig glycosiliert ist (Fig. 4.24 in der Dissertation) und dass es sich im endoplasmatischen Reticulum lokalisiert (Fig. 425 in der Dissertation).
Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by uncontrolled proliferation and accumulation of immature myeloblasts, which impair normal hematopoiesis. While this definition categorizes the disease into a distinctive group, the large number of different genetic and epigenetic alterations actually suggests that AML is not a single disease, but a plethora of malignancies. Still, most AML patients are not treated with targeted medication but rather by uniform approaches such as chemotherapy. The identification of novel treatment options likely requires the identification of cancer cell vulnerabilities that take into account the different genetic and epigenetic make-up of the individual tumors. Here we show that STK3 depletion by knock-down, knock-out or chemical inhibition results in apoptotic cells death in some but not all AML cell lines and primary cells tested. This effect is mediated by a premature activation of cyclin dependent kinase 1 (CDK1) in presence of elevated cyclin B1 levels. The anti-leukemic effects seen in both bulk and progenitor AML cells suggests that STK3 might be a promising target in a subset of AML patients.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Haematopoietic stem cells (HSCs) are regarded as the prime target for gene therapy of inherited and acquired disorders of the blood system, e.g. X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD). The major reason for this is that HSCs posses the ability to self renew as well as the potential to differentiate into all lineage-specific cell types. However, the need to reach and to maintain sufficient therapeutic levels of genetically modified stem cells and their progeny after gene delivery still presents major challenges for current HSC gene therapy approaches. In particular, one of the main limitations for most genetic defects is the lack of a selective growth advantage of gene-modified cells after engraftment. In vitro and in vivo methods have been developed that focus on either positive or negative selection of HSCs. An artificial selection advantage can be conferred to transduced HSCs by incorporating a selection marker in addition to the therapeutic transgene. In the present study, two novel strategies for positive selection of murine gp91phox gene-modified haematopoietic stem cells were developed and tested, bearing in mind that with selective growth advantage, the possibility of uncontrolled proliferation arises. The first strategy to be investigated was based on the homeobox transcription factor HOXB4, which plays an important role in the control of haematopoietic stem cell proliferation and differentiation. Overexpression of a retroviral bicistronic construct containing the therapeutic gene gp91phox and HOXB4 in murine primary bone marrow cells led to a significant 3–4-fold expansion of transduced cells ex vivo. The numbers of transgene-expressing cells increased 2–3-fold after 2 weeks cultivation under cytokine stimulation. Furthermore, the clonogenic progenitor cell assay (CFU assay) demonstrated that the number of colony-forming cells had increased to levels 2-fold higher than those of mock-transduced cells after 1 week of culture, thereby augmenting the presence of a significant number of stem/progenitor cells in the selected cell population. However, in our experiments, HOXB4-overexpressing murine HSCs did not show any repopulating advantage in transplanted recipient mice over control construct-transduced HSCs. These results indicate that selective expansion of gp91phox gene-modified HSCs can be induced by the HOXB4 transcription factor ex vivo but not in vivo. This is possibly dependent on HOXB4 expression levels, which are too low in vivo to achieve selection. The second strategy made use of a chemically inducible dimerizer system consisting of the therapeutic gene gp91phox and a fusion protein, containing sequences from a growth factor receptor signalling domain (epidermal growth factor receptor, EGFR, or prolactin receptor, PrlR) and the drug binding protein FKBP12, as the selection cassette. This strategy aimed to allow inducible selection that could be easily switched off. The activity of these fusion proteins is controlled through the small molecular dimerizer AP20187. Transduction of BaF/3 cells with lentiviral vectors expressing the EGFR construct induced proliferation and led to complete selection within 18 days (99%). However, removing AP20187 could not turn off proliferation. This construct is, therefore, not suitable as a selection cassette for the expansion of gene-modified HSCs due to its oncogenic potential. Transduction of the construct containing the intracellular domain of PrlR caused significant selective expansion of AP20187-treated BaF/3 cells. Following expression in cells, the fusion protein, which lacks membrane-anchoring sequences, mainly localized to the cytoplasm. Evidence was found to indicate that activated STAT5 might be responsible for this effect. Upon expression of the prolactin construct, phosphorylation of STAT5 and its DNA-binding activity to a ß-casein promoter sequence was strongly increased. Importantly, the induced proliferation was reversible after removal of AP20187. Transduced Sca1+ bone marrow cells obtained from C57BL/6-CD45.1 mice could be expanded about 20–100-fold ex vivo in the presence of AP20187 and mSCF without losing progenitor cell features and the capability to contribute to all lineages of the haematopoietic system. To exclude oncogenic outgrowth of one single clone, the polyclonality of selected cells was proven by ligation-mediated PCR (LM-PCR) analysis. In mouse transplantation experiments, ex vivo-expanded cells repopulated the bone marrow of lethally irradiated mice suggesting that the ex vivo expansion took place at the level of haematopoietic stem and/or progenitor cells. Genomic gp91phox sequences were detected in the bone marrow, spleen and peripheral blood cells of transplanted animals, indicating that gp91phox-containing cells most likely contributed to the reconstitution of haematopoiesis in these mice.
Für viele pädiatrische Patienten mit Leukämie ist die Durchführung einer Hoch-Dosis- Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation oft die einzige Möglichkeit die Heilungsrate zu verbessern. Die Eliminierung der residualen leukämischen Blasten basiert einerseits auf der Konditionierung mit hoch-aggressiver Chemotherapie. Andererseits ist sie auf immunologische Reaktionen zwischen immunkompetenten Zellen, die entweder in dem Transplantat enthalten sind, oder aus diesem neu entstehen und den verbliebenen leukämischen Blasten zurückzuführen. Diese immunologische Interaktion wird auch als Graftversus- Leukämie-Reaktion (GVL) bezeichnet und hauptsächlich von T-und NK-Zellen vermittelt. Trotz zunächst erfolgreicher allogener Transplantation erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten ein Rezidiv. Während ein offenes Rezidiv oft nicht mehr behandelbar ist, können Patienten mit drohendem Rezidiv oder minimaler Resterkrankung (MRD) durch Infusion immunkompetenter Zellen des Spenders, sogenannte Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI), teilweise erfolgreich behandelt werden. Die Behandlung mit DLI ist limitiert durch die Graft-versus-host-disease (GVHD), eine mit zum Teil schweren Komplikationen verbundene Reaktion, die potentiell tödlich verlaufen kann. Die gentechnische Veränderung der alloreaktiven Zellen mit einem Suizidgen ermöglicht eine kontrollierte, spezifische Eliminierung dieser Zellen im Falle einer GVHD Entwicklung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene retrovirale Selektions/Suizid- Fusionsvektoren für die Transduktion von Spender T-Zellen im Kontext einer DLI entwickelt. Beide Selektions/Suizid-Fusionselemente wurden in einem für die Transduktion in T-Zellen optimierten retroviralen Vektor generiert. Die Selektionsmarker waren so gewählt, dass eine Anreicherung der Transgen-positiven Zellen über eine immunomagnetische Selektion möglich war. Ein Vektor kodierte für ein Fusionsmolekül aus dem zytoplasmatisch trunkierten humanen CD34-Oberflächenmarker (tCD34) und der Zellzyklus-abhängigen GCV-hypersensitiven HSVtk39 (Herpes-simplex Virus I Thymidin Kinase) Mutante. Durch GCV-Applikation konnte in den transduzierten, tCD34/HSV-tk39 exprimierenden Zellen spezifisch die Apoptose induziert werden. Der zweite Vektor wurde so konstruiert, dass ein Fusionsprotein aus dem humanen DLNGFR-Oberflächenmarker und der Zellzyklus-unabhängigen death-effector-domain (DED) des humanen FADD (Fas-associated-protein with death domain) Moleküls entstand. Über zwei zwischengeschaltete FKBP (FK506-binding protein) Domänen wurden die beiden Elemente miteinander fusioniert. In DLNGFR/Fv'Fv/DED-exprimierenden Zellen konnte die Apoptose durch die Applikation eines spezifisch an die beiden FKBP-Domänen bindenden synthetischen Substrats (AP20187), das die Dimerisierung des DED-Moleküls induzierte, ausgelöst werden. Durchflusszytometrische Analysen von transduzierten und selektierten humanen primären TZellen zeigten, dass beide Fusions-Transgene korrekt in den Zielzellen exprimiert wurden. Die spezifische Induktion der Apoptose durch Aktivierung des jeweiligen Suizidmoleküls wurde in Funktionalitätstestungen nachgewiesen. Beide Fusionsmoleküle vermittelten eine effiziente Eliminierung der transduzierten Zellen (90 %-98 %). In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die beiden Suizidmechanismen einer unterschiedlichen Kinetik unterlagen. Während die DED-induzierte Apoptose sehr schnell auf die Applikation des Suizidaktivators folgte, vermittelte der HSV-tk39 Mechanismus eine deutlich langsamere aber etwas effizientere Eliminierung der Zellen. Erste Untersuchungen einer Kombination beider Fusionsmoleküle deuten auf einen additiven/synergistischen Effekt hin, der zu einer schnellen und effizienten Eliminierung der Zellen führt (>=99 %). Zur Zeit stellt die Strategie der Suizidgen-transduzierten T-Zellen die am vielversprechendste Methode zur Kontrolle einer GVHD-Reaktion dar. Die hier entwickelten Vektoren ermöglichen eine effiziente, kontrollierte Eliminierung der Zellen und bieten Potential zur Weiterentwicklung einer optimierten Strategie.
Das Non-LTR-Retrotransposon TRE5 A.1 aus Dictyostelium discoideum integriert positionsspezifisch 48 ± 2 bp oberhalb von tRNA Genen. Es konnte gezeigt werden, dass TRE5 A.1 Wechselwirkungen zwischen ORF1p und dem RNA Polymerase III spezifischen Transkriptionsfaktor DdTFIIIB nutzt, um seinen Integrationsort zu identifizieren. Damit wurden in dieser Arbeit erstmals direkte Proteininteraktionen zwischen einem Non-LTR-Retrotransposon und Komponenten des Chromatins zur Definition des Integrationsortes nachgewiesen. DdTFIIIB wurde durch Blastp Suchen in silico identifiziert. Wie auch in S. cerevisiae wird innerhalb des D. discoideum TFIIIB Komplexes eine stabile Interaktion zwischen der N terminal gelegenen Helix H2 von DdTBP und dem C Terminus von DdBrf1 gebildet. Es konnte sowohl mittels bakterieller Zweihybrid Versuche als auch durch biochemische Pulldown Experimente gezeigt werden, dass TRE5 A kodiertes ORF1 Protein (ORF1p) mit allen drei Untereinheiten von DdTFIIIB in Wechselwirkung tritt. Am ausgeprägtesten war diese mit DdTBP. Durch Mutations und Deletionsanalysen wurden die Kontaktflächen auf DdTBP und ORF1p näher charakterisiert. Demnach interagiert ORF1p über seinen N Terminus (AS 112 158) mit DdTBP, während die C terminalen 40 Aminosäuren sowohl von DdBrf1 als auch von ORF1p beansprucht werden und beide Proteine vermutlich um diese Bindestelle konkurrieren. DdTBP bindet hauptsächlich mit der C terminalen  Helix H2’ an ORF1p. Eine wichtige Position für diese Interaktion ist Ser195 auf DdTBP. Obwohl HsTBP selbst nicht mit ORF1p interagiert, kann die Einführung der Helix H2’ aus DdTBP in das humane Protein die Interaktion mit ORF1p wiederherstellen. Interaktionen zwischen DdTFIIIB und TRE5 A ORF2p wurden nicht detektiert, allerdings konnte ein vermutliches Dimerisationsmotiv in ENp entdeckt werden. Für weiterführende Versuche, die die Relevanz der hier gefundenen Proteininteraktionen für die Target Identifizierung in D. discoideum Zellen untersuchen soll, wurden in dieser Arbeit zwei monoklonale Antikörper gegen DdTBP und einen zufällig entdeckten „Epitop Tag“ isoliert und charakterisiert. Die genaue Rolle von ORF1p während der Retrotransposition von TRE5 A.1 ist noch ungeklärt. Erste grundlegende Einblicke weisen darauf hin, dass ORF1p Teil des Präintegrationskomplexes von TRE5 A sein muss.
Gene transfer vectors such as lentiviral vectors offer versatile possibilities to express transgenic antigens for vaccination purposes. However, viral vaccines leading to broad transduction and transgene expression in vivo, are undesirable. Therefore, strategies capable of directing gene transfer only to professional antigen-presenting cells would increase the specific activity and safety of genetic vaccines. A lentiviral vector pseudotype specific for murine major histocompatibilty complex class II (LV-MHCII) was recently developed and the present study aims to characterize the in vivo biodistribution profile and immunization potential of this vector in mice. Whereas the systemic administration of a vector pseudotyped with a ubiquitously-interacting envelope led to prominent detection of vector copies in the liver of animals, the injection of an equivalent amount of LV-MHCII resulted in a more specific biodistribution of vector and transgene. Copies of LV-MHCII were found only in secondary lymphoid organs, essentially in CD11c+ dendritic cells expressing the transgene whereas B cells were not efficiently targeted in vivo, contrary to expectations based on in vitro testing. Upon a single injection of LV-MHCII, naive mice mounted specific effector CD4 and CD8 T cell responses against the intracelllular transgene product with the generation of Th1 cytokines, development of in vivo cytotoxic activity and establishment of T cell immune memory. The targeting of dendritic cells by recombinant viral vaccines must therefore be assessed in vivo but this strategy is feasible, effective for immunization and cross-presentation and constitutes a potentially safe alternative to limit off-target gene expression in gene-based vaccination strategies with integrative vectors.
Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Teilaspekte des S1P-Signalsystems näher untersucht. Der erste Teil der Arbeit geht der Frage nach, welche Störungen das Ausschalten der S1P-Lyase in der Ca2+-Homöostase verursacht. Die Messung der zellulären Lipidkonzentrationen ergab in Sgpl1-/--MEFs einen sechsfach höherer Wert für S1P und einen doppelt so hohen Wert für Sphingosin als in den Sgpl1+/+-MEFs. [Ca2+]i wurde an Einzelzellen mit Hilfe des Proteinfarbstoffs Cameleon untersucht, wobei [Ca2+]i-Anstiege durch den SERCA-Inhibitor Thapsigargin induziert wurden. So konnte gezeigt werden, dass sowohl in Sgpl1+/+-MEFs als auch in Sgpl1-/--MEFs zwei verschiedene Subtypen existieren, die sich hinsichtlich Geschwindigkeit und Ausmaß des [Ca2+]i-Anstiegs unterscheiden. Die basale [Ca2+]i war im Subtyp der Sgpl1-/--MEFs mit einem schnellen und kurzen [Ca2+]i-Anstieg signifikant erhöht, während das Maximum des Thapsigargin-induzierten [Ca2+]i-Anstiegs im Subtyp der Sgpl1-/--MEFs mit einem langsamen und langen [Ca2+]i-Anstieg signifikant erhöht war. Die AUC des Zeitverlaufs nach der Stimulation mit Thapsigargin war in beiden Subtypen der Sgpl1-/--MEFs signifikant erhöht, was bedeutet, dass der Ca2+-Gehalt der Thapsigargin-sensitiven Speicher in Sgpl1-/--MEFs höher als in Wildtyp-MEFs war.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Aspekte der Modulation des S1P-Signalsystems durch das Sphingosin-Analogon cis-4-Methylsphingosin näher untersucht. Die Messung der Lipidkonzentrationen von cis-4-Methylsphingosin und dem Phosphorylierungsprodukt cis-4-Methyl-S1P erfolgte dabei in HEK-293-Zellen und deren Überständen mittels LC-MS/MS. Hierbei wurde erstmals cis-4-Methyl-S1P im Zellkulturüberstand nachgewiesen, was bedeutet, dass cis-4-Methylsphingosin nach der intrazellulären Phosphorylierung sezerniert werden kann. Dieser Mechanismus bildet die Grundlage dafür, dass cis-4-Methylsphingosin nicht nur intrazellulär wirken, sondern ebenso wie FTY720 als S1P-Rezeptor-Modulator fungieren kann. Der dritte und umfangreichste Teil der Arbeit befasst sich mit der Regulation der SK1 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Um die Rolle von Gαq/11-Proteinen bei der Ansteuerung der SK1 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren weiter zu analysieren, wurde zunächst die Rezeptor-induzierte Translokation der SK1 in MEFs untersucht, die sowohl in Gαq als auch in seinem Homolog Gα11 doppelt defizient waren (Gαq/11 -/--MEFs). Die SK1-Translokation war nur nach Transfektion mit Gαq möglich. Um Hinweise auf die strukturellen Erfordernisse für die SK1-Ansteuerung durch Gαq zu erhalten, wurde der Einfluss verschiedener Gαq-Mutanten auf die Translokationshalbwertszeit der SK1 untersucht. So waren alle untersuchten Mutanten in der Lage, die SK1-Translokation in Gαq/11-/--MEFs zu vermitteln. Die Expression der Gαq-W263D-Mutante führte dabei zu einer signifikant verlangsamten SK1-Translokation. Die durch Gαq-T257E-vermittelte Translokation war erst nach mehreren Minuten feststellbar. Die Abhängigkeit der SK1-Translokation von Gαq wurde auf zellulärer Ebene durch Coexpression einer katalytisch inaktiven Mutante der G-Protein gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2) als Gαq-scavenger in HEK3-Zellen nachgewiesen. Dies führte zu einer vollständigen Inhibierung der Carbachol-induzierten SK1-Translokation. Hingegen führte die Überexpression der SK1 in den M3-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen zu einer reduzierten Carbachol-induzierten Aktivierung der PLCβ. Dieser Effekt war unabhängig von der katalytischen Aktivität der SK1. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die SK1 mit den Effektoren GRK2 und PLCβ um gemeinsame Bindungsstellen der aktivierten G-Protein Untereinheit Gαq konkurriert. Zusätzlich wurde die direkte Interaktion zwischen Gαq und SK1 auf Proteinebene mittels optischer Thermophorese nachgewiesen. Dazu wurde die humane SK1 als N-terminal getaggtes His6-MBP-Fusionsprotein exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass die mit dem Fluoreszenzfarbstoff NT647-markierte hSK1 (hSK1*) mit dem TNF Rezeptor-assoziiertem Faktor 2 (TRAF2), nicht jedoch mit dem N-terminalen Fragment des TRAF family member-associated NF-kappa-B activator (TANK) interagierte. Sowohl inaktives Gαq als auch [AlF4]--aktiviertes Gαq interagierten mit der hSK1* mit einem vergleichbaren kD-Wert. Auch mit NT-647-markiertes Gαq interagierte mit der hSK1 sowohl in der inaktiven als auch in der [AlF4]--aktivierten Form, wohingegen es nicht mit TANK oder TRAF2 interagierte.
Insgesamt zeigen die erhaltenen Daten, dass die SK1 ein direktes Target von Gαq ist und sie an genau dieselben Gαq-Reste bindet, an die auch die klassischen Effektoren PLCβ, p63RhoGEF und GRK2 binden.
Der G-Protein-gekoppelte Histamin-H3-Rezeptor (H3R) ist einer von vier bekannten Histamin-Rezeptorsubtypen. Die Verbreitung erstreckt sich hauptsächlich auf das ZNS, wo der Rezeptor maßgeblich an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der Kognition, der Aufmerksamkeit und dem Ernährungsverhalten beteiligt ist. Als Autorezeptor reguliert er die Darstellung und Freisetzung von Histamin im Gehirn und moduliert darüberhinaus als Heterorezeptor auch die Konzentration anderer wichtiger Neurotransmitter. Ein Ansatz für die Entwicklung neuer Arzneistoffe bei multifaktoriellen Erkrankungen entspringt der Hybridtheorie. In dieser Arbeit wurde der Hybridansatz durch verschiedene Varianten realisiert, bei denen die jeweiligen Pharmakophore durch Überlappung oder Aneinanderkopplung verknüpft wurden. Als Grundstruktur für das H3-Pharmakophor diente das 4-(3-Piperidin-1-ylpropoxy)-phenyl-Element, als andersartige Pharmakophore dienten neben Arzneistoffen aus der Gruppe der Neuroleptika, Antidepressiva und SSRI auch solche Pharmakophore, die das Wirkprofil von H3R-Liganden durch spezifische Eigenschaften (z. B. neuroprotektiv) ergänzen können. Bei der Kopplung der Pharmakophore lag der Fokus auf der Untersuchung von Aminvariationen. Mit Hilfe des Hybridansatzes wurden in dieser Arbeit zahlreiche neue und potente Histamin-H3-Hybridliganden entwickelt. Es wurden hohe Bindungsaffinitäten im nano- bis subnanomolare Bereich erzielt und wichtige Struktur-Wirkungsbeziehungen abgeleitet. In-vitro zeigte sich eine hohe Toleranz des H3R bezüglich der heterogenen Liganden, darunter solche mit sterisch anspruchsvollen, stark basischen und sauren Gruppen.
Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.
Na+/H+ antiporters are located in the cytoplasmic and intracellular membranes and play crucial roles in regulating intracellular pH, Na+, and volume. The NhaA antiporter of Escherichia coli is the best studied member of the Na+/H+ exchanger family and a model system for all related Na+/H+ exchangers, including eukaryotic representatives. Several amino acid residues are important for the transport activity of NhaA, including Lys-300, a residue that has recently been proposed to carry one of the two H+ ions that NhaA exchanges for one Na+ ion during one transport cycle. Here, we sought to characterize the effects of mutating Lys-300 of NhaA to amino acid residues containing side chains of different polarity and length (i.e. Ala, Arg, Cys, His, Glu, and Leu) on transporter stability and function. Salt resistance assays, acridine-orange fluorescence dequenching, solid supported membrane-based electrophysiology, and differential scanning fluorometry were used to characterize Na+ and H+ transport, charge translocation, and thermal stability of the different variants. These studies revealed that NhaA could still perform electrogenic Na+/H+ exchange even in the absence of a protonatable residue at the Lys-300 position. However, all mutants displayed lower thermal stability and reduced ion transport activity compared with the wild-type enzyme, indicating the critical importance of Lys-300 for optimal NhaA structural stability and function. On the basis of these experimental data, we propose a tentative mechanism integrating the functional and structural role of Lys-300.
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
Crohn´s disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are idiopathic inflammatory disorders. Environmental factors, infectious microbes, ethnic origin, genetic susceptibility, and a dysregulated immune system can result in mucosal inflammation. However, the etiology of both CD and UC still remains largely unclear. Inflammatory bowel diseaserelated animal models suggest that a combination of genetic susceptibility factors and altered immune response driven by microbial factors in the enteric environment may contribute to the initiation and chronification of the disease. The intestinal immune system represents a complex network of different lymphoid and non-lymphoid cell populations as well as humoral factors. In inflammatory bowel disease, the controlled balance of the intestinal immune system is disturbed at all levels. In CD, naïve T cells preferably differentiate into Th1 or Th17 producing cells, while in UC, these cells differentiate into aberrant Th2 cells. Overall, in active inflammatory bowel disease effector T cell activity (Th1, Th17, Th2) predominates over regulatory T cells. Animal models of intestinal inflammation are indispensable for our understanding of the pathogenesis of CD and UC. When chosen appropriately, these models proved to be a helpful tool to investigate pathophysiological mechanisms, as well as to test emerging therapeutic options in the preclinical phase. 2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and oxazolone are the two major chemicals applied to induce Th1- and Th2-skewed intestinal inflammation, respectively. Colitis can be induced in susceptible strains of mice by intrarectal instillation of the haptenating substances TNBS or oxazolone in ethanol, which is necessary for an initial desintegration of the epithelial barrier. TNBS or oxazolone are believed to haptenize colonic autologous or microbiotic proteins rendering them immunogenic to the host immune system. While TNBS administration in the presence of ethanol results in a transmural infiltrative disease in the entire colon based on an IL-12/IL-23 driven, Th1-or Th17 mediated response, oxazolone instillation finally leads to a colitis caused by a polarized Th2 IL-13-dominated lymphocyte response. Rectal oxazolone instillation in ethanol produces a more superficial inflammation that affects the distal half of the colon rather than the whole colon. Therapeutic modulation of the disturbed immune response in patients with inflammatory bowel disease still represents a complex challenge in the clinic. Currently, none of the therapeutic measure are disease specific and they generally target the pathophysiology downstream of the driving immunpathology. So, there is still the need to develop a tailored approach to prevention of the initiation and perpetuation of the inflammatory cascade before tissue injury occurs. One important aspect of this approach might involve the induction or re-establishment of immunological tolerance. FTY720 following rapid phosphorylation to FTY-P by endogenous sphingosine kinases acts as a sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist and represents the prototype of a new generation of S1P receptor modulators. While changing currently its proposed mode of action still focus on the fact, that FTY720 effectively inhibits the egress of T-cells from lymph nodes, thereby reducing the number of antigen-primed/restimulated cells that re-circulate to peripheral inflammatory tissues. However, recent studies indicate, that its immunomodulatory properties might be more complex and exerted not only via interactions with other S1P receptor subtypes but also via a direct modulation of the inflammatory capacity of dendritic cells (DC) resulting in a modified regulation of T cell effector functions as well as in an induction of regulatory T cells and function. 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, is a secosteroid hormone that has in addition to its central function in calcium and bone metabolism pronounced immune regulatory properties. The biological effects of calcitriol are mediated by the vitamin D receptor (VDR), a member of the superfamily of nuclear hormone receptors. A number of studies identified calcitriol/VDR as prominent negative regulators of Th1-type immune responses, whereas Th2 responses are not affected or even augmented. These effects have been mainly explained by direct activities on lymphocytes, subsequent studies clearly supported a role of calcitriol in modulating monocyte differentiation or DC maturation. However, to translate the immunosuppressive capacities of calcitriol into an effective immunointervention, a great challenge was the design of structural analogs of calcitriol that are devoid of adverse effects related to hypercalcemic activity. The intense study of the 25-oxa series generated a large number of calcitriol analogs exhibiting substantial dissociation between possible immunomodulatory capacities and undesired hypercalcemia. Especially, the combination of the 22-ene modification with the 25-oxa element as realized in ZK156979 yielded a very promising set of new analogs for further characterization in animal models resembling human autoimmune diseases. So, the overall aim of the studies presented here was to evaluate strategies of enhancing regulatory immunity in mouse models of Th1- and Th2-mediated colitis as a new therapeutic approach. To this end we used FTY720, 22-ene-25-oxa vitamin D (ZK156979), as well as the combination of calcitriol and dexamethasone to evaluate the respective pro-tolerogenic potential in intestinal inflammation models in mice. First, to induce Th1-mediated colitis a rectal enema of TNBS was given to Balb/c mice. FTY720 was administered i.p. from day 0-3 or 3-5. FTY720 substantially reduced all clinical, histopathologic, macroscopic, and microscopic parameters of colitis analyzed. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a down-regulation of IL-12p70 and subsequent Th1 cytokines. Importantly, FTY720 treatment resulted in a prominent up-regulation of FoxP3, IL-10, TGFβ and CTLA4. Moreover, we observed a significant increase of CD25 and FoxP3 expression in isolated lamina propria CD4+ T cells of FTY720-treated mice. The impact of FTY720 on regulatory T cell induction was further confirmed by concomitant in vivo blockade of CTLA4 or IL-10R which significantly abrogated its therapeutic activity. Thus, our data provide new and strong evidence that besides its well-established migratory properties FTY720 down-regulates proinflammatory signals while simultaneously inducing the functional activity of CD4+CD25+ regulatory T cells. In a second approach, the rectal instillation of oxazolone yielded a Th2-mediated colitis. Treatment with FTY720 prominently reduced the clinical and histopathologic severity of oxazolone-induced colitis, abrogating body weight loss, diarrhea, and macroscopic and microscopic intestinal inflammation. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a prominent reduction of the key Th2 effector cytokines IL-13, IL-4 and IL-5. Moreover, FTY720 inhibited GATA3 and T1/ST2 expression, which represent distinct markers for Th2 differentiation and Th2 effector function. Thus, our data are supportive for the view that FTY720 exhibits beneficial prophylactic as well as therapeutic effects in Th2-mediated experimental colitis by directly affecting Th2 cytokine profiles, probably by reducing GATA3 and T1/ST2. Recently, we described 22-ene-25-oxa-vitamin D (ZK156979) as a representative of a novel class of low calcemic vitamin D analogs showing prominent immunomodulative capacities. Here, we used the Th1-mediated TNBS colitis to test its anti-inflammatory properties in vivo. We found that treatment with ZK156979 clearly inhibited the severity of TNBS-induced colitis without exhibiting calcemic effects. Both early and late treatment abrogated all the clinical macroscopic and microscopic parameters of colitis severity; in addition we observed a clear down-regulation of the relevant Th1 cytokine pattern including the T-box transcription factor, T-bet. On the other hand, application of ZK156979 increased local tissue IL-10 and IL-4. Finally, as a new approach we evaluated the pro-tolerogenic potential of calcitriol and dexamethasone in acute Th1-mediated colitis. Calcitriol and/or dexamethasone were administered i.p. from day 0-3 or from day 3-5 following the instillation of the haptenating agent. The combination of these steroids most effectively reduced the clinical and histopathologic severity of TNBS colitis. Th1-related parameters were down- while Th2 markers like IL-4 and GATA3 were up-regulated. Clearly distinguishable from known steroid effects calcitriol in particular promoted regulatory T cell profiles as indicated by a marked increase of IL-10, TGFß, FoxP3 and CTLA4. Furthermore, analysis of DC mediators responsible for a pro-inflammatory differentiation of T cells revealed a clear reduction of IL-12p70, and IL23p19 as well as IL-6 and IL-17. Thus, our data suggest the concept of a steroid-sparing application of calcitriol derivatives in inflammatory bowel disease. Furthermore, the data presented suggest that early markers of inflammatory DC and Th17 differentiation might qualify as new target molecules for both calcitriol as well as for selective immune modulating vitamin D analogs. In conclusion the data of these published investigations added to the substantial progress in understanding the biology of tolerogenic DC and regulatory T cells with respect to their roles in health and disease achieved in the past years. This has led to an increasing interest in the possibility of using DC and regulatory T cells as biological therapeutics to preserve and restore tolerance to self antigens and alloantigens. Especially DC may be helpful to exert their important roles in directing tolerance and immunity by modulation of subpopulations of effector T cells and regulatory T cells. The data demonstrated in the present studies may assist to define the divergent implications of new therapeutic concepts for the treatment of inflammatory bowel disease, especially with regard to a possible auspicious impact on pro-tolerogenic DC and regulatory T cell functions. However, further studies are needed to fulfil our understanding of the complex immunomodulatory profiles of FTY720 as well as of calcitriol and its low calcemic analog ZK156979, thus accelerating their entry into the clinic as new therapeutic options for the cure of inflammatory bowel disease.
Das Auftreten von plötzlichem Herztod, das häufig durch ventrikuläre Tachyarrhythmien ausgelöst wird, stellt bis heute eine Herausforderung bei der Therapie der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz dar. Derartige Arrhythmien werden bei über 85% der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz beschrieben und über 50% der Todesursachen werden dabei auf das Auftreten von plötzlichem Herztod zurückgeführt. Es wird vermutet, dass das elektrische Remodeling als Teil der gesamten kardialen Umbauvorgänge bei der Entstehung einer Herzinsuffizienz die pathophysiologische Grundlage dieser Arrhythmien darstellt. Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System spielt eine zentrale Rolle bei der Ausbildung des elektrischen Remodeling und insbesondere erhöhte Aldosteronkonzentrationen korrelieren mit dem Risiko kardiovaskulärer Zwischenfälle. Darüberhinaus konnte in zwei klinischen Studien (RALES und EPHESUS) gezeigt werden, dass die Therapie herzinsuffizienter Patienten mit den Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon die Mortalität und Morbidität und insbesondere auch das Auftreten von plötzlichem Herztod signifikant senken konnte. Weitere Studien zeigen eine Verbindung zwischen dem Auftreten einer Herzinsuffizienz und Veränderungen in der Funktion und Expression kardiospezifischer repolarisierender K+-Kanäle. Neben den klinischen Daten, die einen protektiven Effekt der Aldosteronantagonisten bei plötzlichem Herztod belegen, ist wenig über die Auswirkungen von Aldosteron auf das elektrische Remodeling des Herzens bekannt. In dieser Arbeit sollte daher die Auswirkung einer chronischen Aldosteronexposition in Ratten auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens untersucht werden. Dazu wurde Wistar-Ratten Aldosteron verabreicht und einigen Tieren die Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon, um die Effekte der unspezifischen (Spironolacton) und spezifischen (Eplerenon) MR Blockade auf die elektrischen Eigenschaften der Kardiomyozyten zu untersuchen. Die Aldosteron exponierten Tiere entwickelten eine linksventrikuläre Hypertrophie, die sich unabhängig von Blutdruckveränderungen entwickelte, sowie ein signifikant verlängertes QT-Intervall, vermehrt auftretende ventrikuläre Extrasystolen und ventrikuläre Tachykardien. Die Elektrolytwerte (K+, Na+, Cl-) waren dabei nicht verändert. Die Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon waren in der Lage, die unter Aldosteron auftretenden Veränderungen zu verhindern. Die Transkription der Untereinheiten kardiospezifischer K+-Kanäle (Ito, IKur, IK1) und des L-Typ Ca2+-Kanals war unter Aldosteronstimulation im linken Ventrikel signifikant erniedrigt. Auf Proteinebene konnte dies für die Kanaluntereinheiten Kv1.5 (IKur), Kir2.3 (IK1) und Cav1.2 (L-Typ Ca2+-Kanal) bestätigt werden. Die Untersuchung eventuell zugrunde liegender Signaltransduktionswege lieferte erniedrigte mRNA Expressionslevel der kardiospezifischen Proteinkinase C Isoformen PKC-α und PKC-ε, wohingegen die mRNA-Expression von PKC-δ unter Aldosteronstimulation unverändert war. Diese Veränderungen in der Transkription der PKC Isoformen wurden durch Behandlung der Tiere mit den Aldosteronantagonisten inhibiert, was für einen MR vermittelten Effekt spricht. Weiterhin zeigte eine chronische Aldosteronstimulation eine erniedrigte mRNA Expression von Calcineurin Aß (PPP3CB) sowie Calcineurinaktivität in linksventrikulärem Gewebe der Tiere. Dieser Effekt konnte durch die Aldosteronantagonisten nicht aufgehoben werden, so dass ein Signaltransduktionsweg, der nicht über den MR vermittelt wird, zugrunde liegen könnte. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass chronisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Rattenherz blutdruckunabhängig zu strukturellen und elektrischen Veränderungen führen, die das Auftreten maligner ventrikulärer Arrhythmien begünstigen. Beide Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon sind in der Lage, die durch Aldosteron vermittelten Effekte in gleicher Weise zu inhibieren. Die Ergebnisse zeigen pathophysiologische Zusammenhänge auf, die die Bedeutung von Aldosteron und der Therapie mit Aldosteronantagonisten für die Behandlung der Herzinsuffizienz und in Zukunft möglicherweise der Hypertrophie unterstreichen.
Ultraviolet-B (UVB)-induced inflammation produces a dose-dependent mechanical and thermal hyperalgesia in both humans and rats, most likely via inflammatory mediators acting at the site of injury. Previous work has shown that the gene expression of cytokines and chemokines is positively correlated between species and that these factors can contribute to UVB-induced pain. In order to investigate other potential pain mediators in this model we used RNA-seq to perform genome-wide transcriptional profiling in both human and rat skin at the peak of hyperalgesia. In addition we have also measured transcriptional changes in the L4 and L5 DRG of the rat model. Our data show that UVB irradiation produces a large number of transcriptional changes in the skin: 2186 and 3888 genes are significantly dysregulated in human and rat skin, respectively. The most highly up-regulated genes in human skin feature those encoding cytokines (IL6 and IL24), chemokines (CCL3, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3 and CXCL5), the prostanoid synthesising enzyme COX-2 and members of the keratin gene family. Overall there was a strong positive and significant correlation in gene expression between the human and rat (R = 0.8022). In contrast to the skin, only 39 genes were significantly dysregulated in the rat L4 and L5 DRGs, the majority of which had small fold change values. Amongst the most up-regulated genes in DRG were REG3B, CCL2 and VGF. Overall, our data shows that numerous genes were up-regulated in UVB irradiated skin at the peak of hyperalgesia in both human and rats. Many of the top up-regulated genes were cytokines and chemokines, highlighting again their potential as pain mediators. However many other genes were also up-regulated and might play a role in UVB-induced hyperalgesia. In addition, the strong gene expression correlation between species re-emphasises the value of the UVB model as translational tool to study inflammatory pain.
In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Ansätze gewählt, um kardiale Ionenkanäle zu charakterisieren, die möglicherweise einen Einfluss auf das atriale Aktionspotential haben könnten und die somit potentielle neue Ziel-Gene für die Entwicklung neuer Antiarrhythmika darstellen könnten. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die pharmakologische Untersuchung der Rolle des Schwellungsaktivierten Chloridkanals I Cl,swell für das atriale Aktionspotential. In einer weiteren Studie wurde eine neue regulatorische Untereinheit des hKv4.3-Kanals identifiziert sowie deren physiologische Bedeutung für die Aktivität des transienten Kalium-Auswärtsstroms I to1 charakterisiert. Schließlich wurde ein neuer Kaliumkanal, TASK-4, kloniert, der im humanen Herzen ausschließlich im Atrium vorkommt und deshalb einen Einfluss auf die Erregbarkeit des Herzvorhofs ausüben könnte. Unter mehreren Ethacrynsäure-Derivaten konnte mit DCPIB ein neuer potenter Blocker des I Cl,swell identifiziert werden. Nachfolgende Patch-Clamp und Zwei-Mikroelektroden Spannungsklemmen-Analysen verschiedener nativer und heterolog exprimierter Anionen und Kationenkanäle zeigten, dass DCPIB spezifisch den I Cl,swell Strom hemmt. Dies war eine Voraussetzung, um die Funktion des I Cl,swell beim atrialen Aktionspotential während osmotischer Zellschwellung zu untersuchen. Die Schwellung atrialer Kardiomyozyten führte zur Aktivierung des I Cl,swell und als Folge davon zu einer starken Verkürzung der Aktionspotentialdauer. Diese war durch DCPIB vollständig hemmbar. Unter basalen Bedingungen hatte DCPIB keinen Effekt auf das Aktionspotential. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Aktivierung des I Cl,swell unter pathologischen Bedingungen, die mit einer kardialen Zellschwellung einhergehen, eine ursächliche Rolle beim Auftreten von Arrhythmien spielen kann. Viele frühere Untersuchungen über die Rolle des I Cl,swell bei Arrhythmien erfolgten am Rattenherzen. Unter Verwendung von DCPIB konnten wir aber zeigen, dass die in atrialen und ventrikulären Myozyten von normalen und von hypertrophierten Rattenherzen beschriebenen Chloridströme nicht durch den I Cl,swell hervorgerufen werden. Das Fehlen des I Cl,swell im Rattenherzen stellt damit diese früheren Ergebnisse in Frage. Eine weitere Leitfähigkeit, die im menschlichen Herzen zur Repolarisation der kardialen Membranen während dem Aktionspotential beiträgt, ist der 'Plateau-Strom" I Kp , der in seinen kinetischen Eigenschaften TWIK oder TASK-artigen Kaliumkanälen ähnelt. Als erster Schritt bei der Identifizierung der molekularen Identität dieses Kaliumkanals wurde in dieser Arbeit mit TASK-4 ein neues Mitglied der Säuresensitiven Tandem-von-zwei-Poren-Kaliumkanälen kloniert. Die heterologe Expression des TASK-4 in Xenopus-Oozyten erzeugte Kaliumströme, die eine starke Auswärts-Rektifizierung zeigten, die jedoch bei Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration verloren ging. Die TASK-4-Ströme waren abhängig vom extrazellulären pH-Wert, wobei die pH-Sensitivität im Vergleich zu den anderen TASK-Kanälen zu mehr alkalischen Werten verschoben war. Außerdem zeigten die TASK-4-Ströme die für TASK- Kanäle typischen pharmakologischen Eigenschaften. Aufgrund des Vorkommens von TASK-4 im Atrium und dem Atrioventrikular-Knoten des menschlichen Herzens stellt dieser Kaliumkanal einen neuen potentiellen Angriffspunkt für die Entwicklung eines Vorhof spezifischen Antiarrhythmikums dar. Im Gegensatz zu dem I Kp Strom ist der Ca 2 unabhängige transiente Kalium-Auswärtsstrom I to1 des Herzens für die initiale Phase der Repolarisation während des Aktionspotentials verantwortlich. In vielen Regionen des Herzens trägt die Untereinheit des hKv4.3 Kaliumkanals zum I to1 Strom bei. In dieser Arbeit wurde mit hKChIP2 erstmals eine regulatorische Untereinheit des I to1 identifiziert. Northern-Blot-Analysen haben gezeigt, dass das hKChIP2-Gen ausschließlich im humanen Herzen exprimiert ist, wobei es im Atrium und Ventrikel des adulten humanen Herzens, aber nicht im fötalen Herzen, vorkommt. Weiterhin konnten wir eine neue kurze Spleiß-Variante des hKChIP2-Gens (hKCNIP2) isolieren und durch PCR-Analyse nachweisen, dass diese im menschlichen Herzen die Hauptform des hKChIP2 darstellt. Die Koexpression des hKv4.3 mit beiden hKChIP2-Isoformen in Xenopus - Oozyten bewirkte eine Zunahme der Stromamplitude, eine Verschiebung der Spannung der halbmaximalen Inaktivierung und eine stark beschleunigte Erholung von der Inaktivierung der hKv4.3-Kanäle, die in Anwesenheit von hKChIP2 deutlich mehr dem nativen I to1 Kanal des humanen Epikards ähnelten. Unsere Ergebnisse sprechen sehr stark dafür, dass hKChIP2 eine physiologisch wichtige regulatorische Untereinheit des hKv4.3 ist, die auch zur Heterogenität der I to1 Ströme im humanen Herzen beiträgt. Da der I to1 Kanal an der Entstehung und dem Fortschreiten verschiedener Herzkrankheiten wie den Arrhythmien und der Herzinsuffizienz beteiligt ist, stellt hKChIP2 ein neues Ziel-Gen für die Entwicklung neuer zukünftiger Klasse III-Antiarrhythmika dar. Die in Kooperation mit der Universität Istanbul durchgeführte Aufklärung der Exon-Intron-Organisation des hKCNIP2-Gens liefert zudem die Grundlage für ein zukünftiges systematisches Screening nach Mutationen im hKChIP2-Gen in Familien mit vererbbaren Arrhythmien.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Amorphous formulation technologies to improve oral absorption of poorly soluble active pharmaceutical ingredients (APIs) have become increasingly prevalent. Currently, polymer-based amorphous formulations manufactured by spray drying, hot melt extrusion (HME), or co-precipitation are most common. However, these technologies have challenges in terms of the successful stabilization of poor glass former compounds in the amorphous form. An alternative approach is mesoporous silica, which stabilizes APIs in non-crystalline form via molecular adsorption inside nano-scale pores. In line with these considerations, two poor glass formers, haloperidol and carbamazepine, were formulated as polymer-based solid dispersion via HME and with mesoporous silica, and their stability was compared under accelerated conditions. Changes were monitored over three months with respect to solid-state form and dissolution. The results were supported by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SS-NMR) and scanning electron microscopy (SEM). It was demonstrated that mesoporous silica was more successful than HME in the stabilization of the selected poor glass formers. While both drugs remained non-crystalline during the study using mesoporous silica, polymer-based HME formulations showed recrystallization after one week. Thus, mesoporous silica represents an attractive technology to extend the formulation toolbox to poorly soluble poor glass formers.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.
Protein kinases are highly tractable targets for drug discovery. However, the biological function and therapeutic potential of the majority of the 500+ human protein kinases remains unknown. We have developed physical and virtual collections of small molecule inhibitors, which we call chemogenomic sets, that are designed to inhibit the catalytic function of almost half the human protein kinases. In this manuscript we share our progress towards generation of a comprehensive kinase chemogenomic set (KCGS), release kinome profiling data of a large inhibitor set (Published Kinase Inhibitor Set 2 (PKIS2)), and outline a process through which the community can openly collaborate to create a KCGS that probes the full complement of human protein kinases.
P2X-Rezeptoren sind ligandengesteuerte Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Bisher wurden sieben Isoformen kloniert (P2X1-P2X7), die eine gemeinsame Topologie besitzen, bestehend aus intrazellulären N- und C-Termini, zwei Transmembranregionen und einer großen Ektodomäne. Um funktionelle Ionenkanäle ausbilden zu können, müssen P2X-Untereinheiten in Homo- oder Heterotrimere assemblieren. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war das Identifizieren von Proteindomänen, die zu der Trimerisierung von P2X-Untereinheiten beitragen. Hierzu diente in erster Linie die humane P2X5- (hP2X5-) Untereinheit, der durch Herausspleißen von Exon 10 eine Region fehlt, die in der Literatur als eventuell wichtig für die Assemblierung beschrieben wird. Exon 10 kodiert 22 Aminosäuren, die in der distalen Ektodomäne und der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion liegen. Das Fehlen dieser Aminosäuren führt zu Untereinheiten, die nicht in der Lage sind, zu trimerisieren und funktionelle Ionenkanäle auszubilden. Durch das schrittweise Einsetzen der von Exon 10 kodierten Aminosäuren in die hP2X5-Untereinheit sowie die Expression verschiedener Alanin-Mutanten mit nachfolgender Analyse durch Blaue-Native-PAGE konnte gezeigt werden, dass das fehlerhafte Assemblierungsverhalten der hP2X5-Untereinheit in erster Linie durch das Fehlen der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion bewirkt wird. Zusätzliche gezielte Mutationen und die Konstruktion von Deletionsmutanten ergaben weiterhin, dass die zweite Transmembranregion vornehmlich als hydrophober Membrananker dient, um die korrekte Topologie und Positionierung von Assemblierungsdomänen zu gewährleisten. Die wichtigsten Assemblierungs-informationen scheinen in der Ektodomäne zu liegen. Die einzige Aminosäure in der zweiten Transmembranregion, die einen spezifischen Einfluss auf die Trimerisierung von hP2X5-Untereinheiten hatte, war 355D. Einzelmutationen in dieser Position zeigten, dass nur Aminosäuren, deren Seitenketten in der Membran interhelikale Wasserstoffbrücken ausbilden können, eine effiziente Trimerisierung ermöglichen. Dieses Ergebnis legte den Schluss nahe, dass 355D die Assemblierung unterstützt, indem es die Interaktion zwischen den Untereinheiten über eine Wasserstoffbrückenbildung stabilisiert. Die Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner von 355D in der ersten Transmembranregion durch Einzelmutationen und Cystein-Crosslinking war allerdings nicht erfolgreich. Dies könnte bedeuten, dass die beiden Transmembranregionen jeweils benachbarter Untereinheiten nicht, wie für P2X2-Untereinheiten gezeigt, in einer „head to tail“-Orientierung angeordnet sind, sondern nur die zweiten Transmembranregionen miteinander in Kontakt stehen. Limitierte Proteolyse von hP2X5-Rezeptormutanten ergab einen engen Zusammenhang zwischen der Trimerisierung und der Resistenz gegenüber einer Proteolyse durch Trypsin. Daraus folgt, dass trimerisierungsfähige P2X-Mutanten korrekt gefaltet sind, während ein Verlust der Trimerisierungsfähigkeit eine Fehlfaltung anzeigt. Neben dem hP2X5-Rezeptor wurden auch Ratten-P2X1- (rP2X1-) Rezeptoren untersucht. rP2X1-Konstrukte, die lediglich aus der Ektodomäne sowie einem abspaltbaren Signalpeptid bestanden, konnten zwar partiell multimerisieren, aber keine definierten Trimere bilden. Die Analyse weiterer Konstrukte zeigte, dass beide Transmembranregionen für die Trimerisierung wichtig sind, auch wenn sie keine spezifischen Assemblierungsinformationen enthalten. Ein systematisches Alanin-Scanning der gesamten Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit ergab, dass die Ektodomäne multiple Sequenzmotive enthält, die zu der Trimerisierung beitragen. Die genaue Rolle der identifizierten Sequenzmotive muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Zusätzlich wurden Chimären aus rP2X1- und Ratten-P2X6- (rP2X6-) Untereinheiten untersucht. Da rP2X6-Untereinheiten nicht in der Lage sind zu trimerisieren, könnten sie in Kombination mit Sequenzelementen aus rP2X1-Untereinheiten ermöglichen, trimerisierungsrelevante Proteindomänen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass eine Chimäre, die die Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit und die Transmembranregionen und zytosolischen Domänen der rP2X6-Untereinheit enthielt, trimerisieren konnte, während die umgekehrte Chimäre dies nicht vermochte. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass die Motive, die für die Trimerisierung von P2X-Untereinheiten essentiell sind, in der Ektodomäne liegen. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, dass die Transmembranregionen bei der Assemblierung im Wesentlichen eine Funktion als hydrophobe Membrananker haben, die die korrekte Topologie und Positionierung der extrazellulären Assemblierungsdomänen ermöglichen. Die initiale Assemblierung wird durch die Ausbildung einer interhelikalen Wasserstoffbrücke über 355D stabilisiert. Somit können die wichtigsten Assemblierungsdomänen in Kontakt treten, die in der Ektodomäne lokalisiert sind.
The chemopreventive and anticancer effects of resveratrol (RSV) are widely reported in the literature. Specifically, mechanisms involving epigenetic regulation are promising targets to regulate tumor development. Bromodomains act as epigenetic readers by recognizing lysine acetylation on histone tails and boosting gene expression in order to regulate tissue-specific transcription. In this work, we showed that RSV is a pan-BET inhibitor. Using Differential Scanning Fluorimetry (DSF), we showed that RSV at 100 µM increased the melting temperature (∆Tm) of BET bromodomains by around 2.0 °C. The micromolar dissociation constant (Kd) range was characterized using Isothermal Titration Calorimetry (ITC). The RSV Kd value accounted to 6.6 µM in case of BRD4(1). Molecular docking proposed the binding mode of RSV against BRD4(1) mimicking the acetyl-lysine interactions. All these results suggest that RSV can also recognize epigenetic readers domains by interacting with BET bromodomains.
Das NANOG2-Gen ist ein Genduplikat des nur in embryonalen Stammzellen exprimierten Stammzellfaktors NANOG1, der eine Schlüsselrolle bei der Pluripotenz und der Selbsterneuerung der Stammzellen und möglicherweise der Krebsstammzellen hat. Zur Analyse, ob NANOG2 die beschriebenen Funktionen von NANOG1 in Gewebestammzellen und Krebsstammzellen übernimmt und ursächlich für die Leukämieentstehung verantwortlich ist, wurden embryonale Zellen und primäre Leukämiezellen auf NANOG2-Expression durch RT-PCR-Experimente, Western Blot Analysen und ChIP Assays untersucht. Dabei konnte eine Methode zur Unterscheidung der NANOG1 und NANOG2-Transkripte etabliert, neue Genstrukturen dieser Gene charakterisiert und NANOG2-Transkripte in hämatopoetischen Stammzellen und in allen primären Leukämiezellen detektiert werden. Außerdem konnte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen eine äquivalente Funktion von NANOG2 zu NANOG1 festgestellt werden.
As major sources of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial structures are exposed to high concentrations of ROS and may therefore be particularly susceptible to oxidative damage. Mitochondrial damage could play a pivotal role in the cell death decision. A decrease in mitochondrial energy charge and redox state, loss of transmembrane potential (depolarization), mitochondrial respiratory chain impairment, and release of substances such as calcium and cytochrome c all contribute to apoptosis. These mitochondrial abnormalities may constitute a part of the spectrum of chronic oxidative stress in Alzheimer's disease. Accumulation of amyloid beta (Abeta) in form of senile plaques is also thought to play a central role in the pathogenesis of Alzheimer's disease mediated by oxidative stress. In addition, increasing evidence shows that Abeta generates free radicals in vitro, which mediate the toxicity of this peptide. In our study, PC12 cells were used to examine the protective features of EGb 761(definition see editorial) on mitochondria stressed with hydrogen peroxide and antimycin, an inhibitor of complex III. In addition, we investigated the efficacy of EGb 761 in Abeta-induced MTT reduction in PC12 cells. Moreover, we examined the effects of EGb 761 on ROS levels and ROS-induced apoptosis in lymphocytes from aged mice after in vivo administration. Here, we will report that EGb 761 was able to protect mitochondria from the attack of hydrogen peroxide, antimycin and Abeta. Furthermore, EGb 761 reduced ROS levels and ROS-induced apoptosis in lymphocytes from aged mice treated orally with EGb 761 for 2 weeks. Our data further emphasize neuroprotective properties of EGb 761, such as protection against Abeta-toxicity, and antiapoptotic properties, which are probably due to its preventive effects on mitochondria.
Many cases of early-onset inherited Alzheimer's disease (AD) are caused by mutations in the presenilin-1 (PS1) gene. Expression of PS1 mutations in cell culture systems and in primary neurons from transgenic mice increases their vulnerability to cell death. Interestingly, enhanced vulnerability to cell death has also been demonstrated for peripheral lymphocytes from AD patients. We now report that lymphocytes from PS1 mutant transgenic mice show a similar hypersensitivity to cell death as do peripheral cells from AD patients and several cell culture systems expressing PS1 mutations. The cell death-enhancing action of mutant PS1 was associated with increased production of reactive oxygen species and altered calcium regulation, but not with changes of mitochondrial cytochrome c. Our study further emphasizes the pathogenic role of mutant PS1 and may provide the fundamental basis for new efforts to close the gap between studies using neuronal cell lines transfected with mutant PS1, neurons from transgenic animals, and peripheral cells from AD patients. Copyright 2001 Academic Press.
Lipid rafts are specialized plasma membrane micro-domains highly enriched in cholesterol, sphingolipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins. Lipid rafts are thought to be located in the exofacial leaflet of plasma membranes. Functionally, lipid rafts are involved in intracellular trafficking of proteins and lipids, secretory and endocytotic pathways, signal transduction, inflammation and in cell-surface proteolysis. There has been substantial interest in lipid rafts in brain, both with respect to normal functioning and with certain neurodegenerative diseases. Based on the impact of lipid rafts on multitude biochemical pathways, modulation of lipid rafts is used to study related disease pathways and probably offers a target for pharmacological intervention. Lipid rafts can be targeted by modulation of its main components, namely cholesterol and sphingolipids. Other approaches include the modulation of membrane dynamics and it has been reported that protein-lipid interactions can vary the occurrence and composition of these membrane micro-domains. The present review summarizes the possibilities to modulate lipid rafts with focus on neuronal cells. Keywords: Lipid raft, cholesterol, membrane fluidity, statin, cyclodextrine, docosahexaenoic acid.
Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der zentralen Lipidhomöostase durch Statine
(2009)
Typische neuropathologische Befunde bei der Alzheimer-Demenz (AD) sind die Bildung von Beta-Amyloid-Plaques, die Akkumulation von intrazellulären neurofibrillären Bündeln (Tangles) und ein ausgeprägter Verlust der Nervenzellen im Gehirn (siehe Estifanos Ghebremedhin und Thomas Deller »Risikofaktoren der Alzheimer-Krankheit. Was verraten uns die Gene?«, Seite 90). Insbesondere die Anhäufung von Beta-Amyloid-Peptid (Aß) scheint eine zentrale Rolle in der in der in der Pathogenese zu spielen und kausal für den Zelluntergang verantwortlich zu sein. Befunde unserer Arbeitsgruppe deuten darauf hin, das Aß zu mitochondrialer Dysfunktion in den Nervenzellen führt. Wir untersuchen die Kaskade der Mechanismen, die von der Bildung von Aß über mitochondriale Dysfunktion letztlich zu Synapsenverlust und Zelltod führen, mithilfe von Zelllinien und Mäusestämmen mit Alzheimer-typischen Merkmalen. Ziel ist, einen Angriffspunkt für die medikamentöse Behandlung der Alzheimer-Demenz zu finden. Als vielversprechend hat sich die Wirkung von Statinen erwiesen, die als Cholesterinhemmer eingesetzt werden. ...
Schützen Statine vor Schlaganfall und Alzheimer? : neue Therapiemöglichkeiten im Zentralnervensystem
(2005)
Statine stellen heute Medikamente der ersten Wahl bei zu hohen Cholesterin- Blutwerten dar. Denn sie hemmen die Hydroxymethylglutaryl-CoA Reduktase (HMG-CoA Reduktase), ein wichtiges Schlüsselenzym, das für die körpereigene Herstellung von Cholesterin notwendig ist. Bei der pharmakologischen Bewertung der Statine muss allerdings auch der Cholesterinstoffwechsel im Gehirn berücksichtigt werden, dem cholesterinreichsten Organ des menschlichen Körpers. Bislang existieren nur wenige Daten zu den Effekten dieser Medikamente im zentralen Nervensystem. Im Rahmen eines Leitprojekts des Zentrums für Arzneimittelforschung, -Entwicklung und Sicherheit (ZAFES) wird derzeit die Pharmakologie der Statine im Gehirn intensiv untersucht, um die therapeutischen Einsatzmöglichkeiten von Statinen im Zusammenhang mit der Therapie von Erkrankungen, wie Schlaganfall und Alzheimer-Demenz, aufzuklären und gegebenenfalls zu erweitern.
To understand neurodegenerative diseases is one of the major challenges of the 21st century. This also includes Alzheimer´s disease (AD), which represents a chronic neurodegenerative disorder, with long preclinical and prodromal phases (approx. 20 years) and an average clinical duration of 8–10 years. In the early phase of this disease, patients show deterioration of memory, difficulties in finding the right words for everyday objects or mood swings. The risk of AD grows exponentially with age, doubling approximately every 5 to 6 years. AD may contribute to 60–70% of all dementia cases, being the most common cause of this disease. Dementia is one of the major causes of disability and dependency among older people worldwide. The causes of the sporadic form of AD with late onset (LOAD) are not yet known, but it seems to be a result of multiple factors. Neuropathological features are extracellular senile plaques, containing beta-amyloid peptides (Aβ) and intracellular neurofibrillary tangles, containing paired helical tau proteins, which have been associated with neuronal loss and atrophy of the cerebral cortex. Thus, misfolded proteins seem to contribute to the pathogenesis, but are not the only players in the disease process. Developing feasible therapies is difficult due to the multifactorial pathology of AD. Currently approved drugs only attenuate symptoms, but do not cure the disease. Research into AD also has had several failures in terms of developing disease-modifying therapies. Thus, new therapeutic targets in order to develop a causal therapy are desperately needed. Since AD starts many years far before the first symptoms occur, new scientific approaches focus on the early stage, which are discussed to be important in aging and the onset of AD. Today, the hypothesis of the advanced mitochondrial cascade becomes more and more the leading model for LOAD, integrating physiological aging as the main risk factor. Thus, new interventions targeting mitochondrial dysfunction are of substantial interest. Accordingly, the efficacy of Dimebon and TRO19622 to ameliorate mitochondrial dysfunction in cellular and murine models of AD were investigated. Dimebon (Latrepirdine) was, originally developed in Russia as an H1-antiallergic drug. It might specifically interfere with mechanisms relevant for the cognitive decline, especially by improving impaired mitochondrial function and/or dynamics in AD. TRO19622 (Olesoxim) has been identified in a phenotypic screening approach to promote the survival of primary motor neurons. Olesoxim is easily absorbed by cells and accumulates in mitochondria. Olesoxim’s mode of action is not fully understood, however it has been shown to modulate mitochondrial membranes and interact with the voltage-dependent anion channel (VDAC) and the translocator protein (TSPO; also known as PBR). Thereby it inhibits mitochondrial permeability transition. In this study, the effects of Aβ overproduction on mitochondrial function were investigated. The effects of Dimebon and Olesoxim were examined, using a HEK cell line stably transfected with the Swedish APP double mutation (HEKsw) and un-transfected control cells (HEKut). Mitochondrial membrane potential, ATP concentrations, and respirometry were measured. Western Blot analysis of marker proteins for fission & fusion, autophagy, mitogenesis and mPTP formation were performed. Confocal laser scanning microscopy was introduced as a novel method to visualize mitochondrial dynamics. Olesoxim was also tested in Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice representing a murine model of AD. For the in vivo model mitochondria from brain tissue were isolated and dissociated brain cells were prepared to determine respiration, lipid peroxidation, MMP, and ATP-levels. Both, the in vitro and in vivo models were compared and discussed in relation to human post-mortem data. The research was conducted in frame of the EU-project entitled „MITOTARGET“ (Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases: towards new therapeutics) funded under FP7-Health (http://cordis.europa.eu/result/rcn/54471_en.html). HEKsw cells showed an overall reduction in the mitochondrial respiration, a significant lower MMP, and significantly reduced ATP levels compared to HEKut cells. Mitochondrial mass was equal in both cell lines. In addition most mitochondria in HEKsw cells showed truncated morphology, followed by punctuated mitochondria. Levels of the fission related protein Drp were significantly elevated in HEKsw cells whereas protein levels of fusion related OPA were strongly reduced, leading to a shift in the distribution pattern towards shorter mitochondria. Moreover, HEKsw cells showed reduced mitochondrial density. Protein levels of the translocase of the inner mitochondrial membrane (TIMM50) were strongly diminished in HEKsw cells. The OXPHOS machinery is located in the inner membrane, where the MMP is build up and ATP is generated. Reduced TIMM50 levels in HEKsw indicated a reduction of the inner mitochondrial membrane, which could explain the described deficits in OXPHOS, MMP, ATP and mitochondrial morphology and density. Concentration of both mPTP markers, the voltage-depended anion channel (VDAC) and the peripheral benzodiazepine receptor (PBR), were broadly increased in HEKsw cells. Thy1-APPSL transgenic mice were characterized as in vivo model of AD. Those mice are modified to express the human form of APP, containing both, the Swedish (KM670/671NL) and the London (V717L) double mutations under the murine Thy1 promotor. Beginning at the age of 3 months, Thy1-APPSL mice develop elevated Aβ levels and mitochondrial dysfunction. Mitochondria isolated from brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice showed significant impaired respiration, resulting in a reduced MMP. However, ATP levels in dissociated brain cells did not differ compared to controls. Protein levels of FIS were unchanged, whereas Drp levels were significantly increased. Levels of the mitochondrial fusion marker optic atrophie-1 (Opa) protein were significantly reduced. Peroxisome proliferation-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1) is a transcription factor, which represents a master regulator of mitochondrial biogenesis. PGC1 expression was significantly elevated in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice. However, mitochondrial mass seemed to be equal in both mouse lines. Both LC3-Isoforms, the cytosolic and the autophagosomal form, were not changed in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice, which indicates equal mitophagic activity. In brain homogenates, isolated from Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice, both mPTP marker, VDAC and PBR, were considerably increased, which is in accordance with the findings in HEKsw cells. In conclusion, both, the cellular (HEKsw) and the animal model of AD (Thy1-APPSL) broadly match pathophysiological features, which have been found in post-mortem samples from AD patients. Thus, HEKsw cells and Thy1-APPSL mice seem to be suitable models to study new treatments against AD. Incubation of HEKsw cells with Dimebon resulted in a remarkable increase in respiratory activity and restored the MMP after impairing the cells with rotenon. Dimebon had no effects on ATP levels in both cell lines, neither after challenging cells with rotenon, nor under basal conditions. By adding Dimebon, citrate synthase (CS) activity in HEKsw cells was increased and mitochondrial morphology was shifted to a tubular shape. Dimebon further enhanced protein levels of Drp and resulted in the compensation of reduced OPA levels. Moreover, Dimebon restored the increased expression levels of the mPTP markers VDAC and PBR. Aβ1-40 levels were significantly decreased in HEKsw cells. However, changes in Aβ1-40 levels seemed to be too small, to solely explain the much larger effects of Dimebon on impaired mitochondrial function. In conclusion, Dimebon treatment restored diverse defects in Aβ overexpressing cells: Aβ levels were reduced, autophagy marker were increased, mitophagy as repair and renewal mechanism was elevated, mitochondrial mass and density were increased, OXPHOS capacity was restored, mitochondrial dynamics were balanced, mitochondrial shape showed a normal distribution, expression levels of the mPTP constituents were reduced, TIMM50 levels augmented to control levels and stress induced MMP and ROS levels were reduced. All these effects were observed after incubation of cells with a rather low concentration of 100 nmol/L. Based on these findings and in addition to already existing literature, Dimebon presents a potential therapeutic option for diseases with accompanied mitochondrial dysfunction. Although, clinical findings published so far are inconsistent. Olesoxim induced a general increase in respiratory activity and enhanced the electron transport (ETS) capacity in HEKsw cells. In addition it normalized the OXPHOS activity almost to control levels. However, incubation using different Olesoxim concentrations led to a dose independent decline in the MMP and decreased ATP levels. Adding Olesoxim caused a dose-dependent change in the length of mitochondria strongly shifting the pattern towards longer mitochondria. In HEKsw cells a reduced mitochondrial density was observed which was reversed by Olesoxim dose-dependently. Olesoxim completely compensated the severely reduced expression levels of TIMM50, but had no effects on TOMM22 levels. An unexpected finding was that 10 µM Olesoxim significantly increased Aβ1-40 levels. Effects of Olesoxim were also tested in vivo. Treatment of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice with Olesoxim restored the impaired MMP in dissociated brain cells, but had no effects on ATP-levels. Olesoxim increased the respiratory activity in isolated brain mitochondria and restored impaired respiration complex activities almost to control levels, without having an effect on CS activity. However, treatment with Olesoxim caused an increase of PGC1 protein levels in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice,beyond basal levels of littermate controls. The mPTP marker proteins voltage-depended anion channel (VDAC) and peripheral benzodiazepine receptor (PBR) were significantly reduced. As well as in the cell models, treatment of Thy-1-C57 BJ/6-APPSL mice with Olesoxim significantly enhanced total human, soluble human and soluble mouse Aβ1-40 levels. Further investigation needs the observation that Olesoxim caused partly negative effects in controls. For instance, Olesoxim reduced the OXPHOS capacity and enhanced protein levels of VADAC and PBR in brains of C57BJ/6 littermate control mice, which could limit the applicability of Olesoxim in further preclinical studies.
Am Anfang dieser Arbeit wurde die CE als hervorragende Methode zur Identifizierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Analoga etabliert. Die Anwendung der kommerziell erhältlichen Gelkapillaren führte zwar zu guten Trennergebnissen, zeigte jedoch erhebliche Mängel im praktischen Umgang (Giftigkeit der Agentien), eingeschränkte Lebensdauer der Gele aufgrund von Degradations-prozessen, in der Sensitivität sowie in der Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse. Aus diesem Grund wurde die Methode im Bezug auf die Gelbildner und die verwendete Detektionsmethode erheblich verbessert. Die Verwendung von Cellulosederivaten als Gelbildner führte zu einer extrem robuster, sensitiven, preiswerten und ungiftigen Methode zur Trennung von komplexen Nukleinsäuregemischen. Die Möglichkeit die Trennmatrix für jeden Lauf zu erneuern, verbesserte die Reproduzierbarkeit der Methode enorm. Für verschiedene Trennprobleme kann durch einfache Veränderung der Viskosität oder der Konzentration des Gelbildners die Methode einfach und schnell optimiert werden. Die etablierte Standardmethode konnte zur Detektion und Charakterisierung unterschiedlichster DNA Fragmente herangezogen werden. So konnte eine Reinheitsprüfung für Oligonukleotide eingeführt werden, Mutationen detektiert werden oder ein weiterer Parameter zur Charakterisierung von Antisense Oligonukleotide etabliert werden. Die zusätzliche Einführung der laserinduzierten Detektion (LIF) in die Standardmethode führte zu einer enormen Steigerung der Sensitivität der Methode. Hiermit können 100-fach kleinere Konzentrationen von Nukleinsäuren detektiert werden, als mit der herkömmlichen UV-Detektion. Basierend auf diesen Optimierungen ist es gelungen die entwickelte CE Methode als ein wesentlichen Bestandteil eines hochselektiven und spezifischen zellbasierten Modells zur Detektion von apoptotischen Vorgängen zu etablieren. Dieses Modell hat, im Gegensatz zu den zahlreichen, existierenden Cytotox-Assays, den entscheidenden Vorteil, dass es auf Wirkebene detektiert und nicht nur Surrogatparameter, wie zum Beispiel Zellmembranschäden, erfasst. Trotzdem ist es einfach und schnell durchführbar. Dadurch ist das etablierte Modell zur klaren Unterscheidung von Apoptose und Nekrose in der Lage. Diese klare Unterscheidung macht ein Wirkstoff-Screening von potentiell apoptose-induzierenden Wirkstoffen einfach und schnell möglich. Wie gezeigt wurde, kann durch die Verwendung von Tumorzelllinien mit verschiedenen Prädispositionen die Unterscheidung von unspezifisch induzierter Apoptose, wie z.B. durch Serumentzug, und von spezifisch induzierter Apoptose, wie z.B. durch Etoposid bei Caspase-3 enthaltenden Zelllinien und Vitamin-D-Analoga bei Vitamin-D3-Rezeptor tragenden Tumorzelllinien, möglich gemacht werden. Das Potential des etablierten Modells kann durch Einsatz verschiedenster Tumorzellen erweitert werden. So kann man die Wirksamkeit sowie die Resistenz der Tumorzellen gegenüber vorhandenen und neuen Tumortherapeutika ohne größere Probleme zeigen.
Die Hodgkin/Reed-Sternberg Zellen des klassischen Hodgkin Lymphoms stammen von Keimzentrums-B-Zellen ab. Dennoch prägen sie fast keine B-Zell-spezifischen Gene aus, stattdessen ko-exprimieren sie Marker anderer hämatopoetischer Linien. Die Ursache für den Verlust des B-Zell-Phänotyps ist weitestgehend unbekannt, da die Transkriptionsfaktoren E2A und PAX5, die in reifen B-Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression B-Zell-spezifischer Gene essentiell sind, von primären HRS Zellen ausgeprägt werden. Allerdings wird PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen deutlich schwächer exprimiert. E2A wird durch direkte Interaktion mit dem inhibitor of DNA binding, ID2, negativ reguliert. ID2 besitzt eine bHLH-Struktur und dimerisiert mit Transkriptionsfaktoren. Da ihm jedoch die DNA-bindende Domäne fehlt, wird die Bindung der Heterodimere an die DNA verhindert und die Transkriptionsfaktoren somit inaktiviert. In hämatopoetischen Zellen scheint die ID2-Expression die B-Zell-Entwicklung und auch die Expression B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und stattdessen die Ausprägung von Genen anderer Linien zu unterstützen. In reifen B-Zellen wird ID2 während der Plasmazellentwicklung bei gleichzeitigem Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene stark exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ID2, das in normalen B-Zellen nicht detektiert werden konnte, dagegen in allen HL-Fällen nicht nur auf RNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene stark exprimiert wird. Ko-Immunopräzipitation des E2A mit ID2 aus HL-Zelllinien zeigte die Interaktion und somit vermutlich auch die transkriptionelle Inaktivierung des E2A durch ID2, wodurch es zum Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene kommt. Darüber hinaus wird PAX5 zusammen mit EBF durch E2A induziert. So führt die ID2-vermittelte E2A-Inaktivierung im HL vermutlich dazu, dass ID2 via EBF auch die Regulation von PAX5 beeinflusst. PAX5 spielt bei der Differenzierung eine duale Rolle, denn es aktiviert nicht nur B-Zell-spezifische Gene, sondern es unterdrückt auch die Gene anderer Linien. Demnach könnte ID2 auch an der Expression der nicht-B-Zell-spezifischen Gene im HL beteiligt sein. Darüber hinaus ist ID2 im HL durch die E2A-Inaktivierung via EBF auch möglicherweise an der schwächeren Expression des PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen beteiligt. Obwohl das ID2-Protein in den HL-Zelllinien durch RNA-Interferenz erfolgreich reduziert werden konnte, zeigte sich allerdings weder eine Änderung der Proteinexpression der B-Zell-spezifischen Gene CD19 und CD79A noch der Gene anderer hämatopoetischer Linien GATA-3 und M-CSF-R. Unabhängig von seiner möglichen Beteiligung an der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL, spielt ID2 vermutlich auch eine weitere Rolle in der Pathogenese des HL. Verschiedene Interaktionen weisen darauf hin, dass ID2 auch an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Zum einen konnte in dieser Arbeit die Interaktion des ID2 mit dem HLH-Protein HEF1 zumindest in einer der HL-Zelllinien gezeigt werden. HEF1 ist ein Aktivator der Aurora Kinase 1, welche nach Aktivierung Gene phosphoryliert, die den Ablauf der Mitose begünstigen. Zum anderen konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 in HL-Zelllinien durch RNAi-vermittelte Reduktion des ID2-Proteins als ID2-Target-Gen identifiziert werden. Auch wenn die Interaktion mit RB, dem zur Familie der Pocket-Proteine gehörenden Schlüsselregulator des Zellzyklusverlaufs, in HL-Zelllinien nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die aberrante ID2-Expression offenbar an der Veränderung des Zellzyklus im HL beteiligt ist. Sie lassen jedoch noch keinen endgültigen Schluss zu. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird ID2 ebenfalls im analplastisch großzelligen T-Zell-Lymphom aberrant exprimiert. Auch eine Interaktion mit E2A, das auch in der T-Zell-Entwicklung eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden. Nicht zuletzt scheint demnach ID2 auch in der Dedifferenzierung des ALCL ein wichtiger Faktor zu sein. ID2 wird im HL aberrant exprimiert und es konnte die Interaktion mit E2A in den HL-Zelllinien nachgewiesen werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität des E2A vermutlich inhibiert wird. Auch wenn in Folge der RNAi-vermittelten Herunterregulation von ID2 in den HL-Linien weder eine Re-Expression B-Zell-spezifischer Gene noch eine Beeinflussung der Expression Marker andere hämatopoetischer Linien gefunden werden konnte, spielt ID2 vermutlich dennoch eine wichtige Rolle in der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL. Unabhängig davon konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 als ID2-Target-Gen identifiziert und eine Interaktion mit HEF1 gezeigt werden. Demnach ist ID2 möglicherweise nicht nur an der Dedifferenzierung, sondern auch an der Dysregulation des Zellzyklus im HL beteiligt und somit ein wichtiger Faktor in der Pathogenese des HL.
Background: Acute leukemia in early age (EAL) is characterized by acquired genetic alterations such as MLL rearrangements (MLL-r). The aim of this case-controlled study was to investigate whether single nucleotide polymorphisms (SNPs) of IKZF1, ARID5B, and CEBPE could be related to the onset of EAL cases (<24 months-old at diagnosis).
Methods: The SNPs (IKZF1 rs11978267, ARID5B rs10821936 and rs10994982, CEBPE rs2239633) were genotyped in 265 cases [169 acute lymphoblastic leukemia (ALL) and 96 acute myeloid leukaemia (AML)] and 505 controls by Taqman allelic discrimination assay. Logistic regression was used to evaluate the association between SNPs of cases and controls, adjusted on skin color and/or age. The risk was determined by calculating odds ratios (ORs) with 95% confidence interval (CI).
Results: Children with the IKZF1 SNP had an increased risk of developing MLL-germline ALL in white children. The heterozygous/mutant genotype in ARID5B rs10994982 significantly increased the risk for MLL-germline leukemia in white and non-white children (OR 2.60, 95% CI: 1.09-6.18 and OR 3.55, 95% CI: 1.57-8.68, respectively). The heterozygous genotype in ARID5B rs10821936 increased the risk for MLL-r leukemia in both white and non-white (OR 2.06, 95% CI: 1.12-3.79 and OR 2.36, 95% CI: 1.09-5.10, respectively). Furthermore, ARID5B rs10821936 conferred increased risk for MLL-MLLT3 positive cases (OR 7.10, 95% CI:1.54-32.68). Our data do not show evidence that CEBPE rs2239633 confers increased genetic susceptibility to EAL.
Conclusions: IKZF1 and CEBPE variants seem to play a minor role in genetic susceptibility to EAL, while ARID5B rs10821936 increased the risk of MLL-MLLT3. This result shows that genetic susceptibility could be associated with the differences regarding MLL breakpoints and partner genes.
Die größte Gruppe der Krebserkrankungen bei Kindern sind die Leukämien. Die größte Untergruppe stellen dabei die Leukämien unter Beteiligung des MLL-Gens auf Chromosom 11q23 dar. Die bei MLL-Translokationen gefundenen Partnergene sind äußerst vielfältig. Der häufigste Partner ist jedoch das AF4-Gen auf Chromosom 4. Die bei der t(4;11)-Translokation entstehenden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL sind die Auslöser der Leukämie, wobei in unterschiedlichen Forschungsarbeiten beiden Fusionsproteinen eine Transformatorische Wirkung bescheinigt werden konnte. Das Wildtyp MLL-Protein liegt in der Zelle in einem Multiproteinkomplex vor, der durch seine Histon-Methyltransferase-Aktivität an Lysin 4 des Histon H3, zu einer offenen Chromatinstruktur führt und dadurch für die Transkriptionsinitiierung essentiell ist. Eine besondere Rolle kommt den MLL-Protein bei der Aufrechterhaltung von epigenetischen Signaturen beispielsweise bei der Embryogenese oder dem Durchlaufen des Zellzyklus zu. Im Gegensatz dazu nimmt der F4-Multiproteinkomplex eine wichtige Stellung in der Transkriptionselongation ein und ermöglicht der RNA-Polymerase II zusammen mit seinen Komplexpartnern die Elongation der mRNA. Die Taspase1 wurde als das Protein entdeckt, dass für die Prozessierung des MLL-Proteins verantwortlich ist und es an den Schnittstellen CS1 bzw. CS2 proteolytisch spaltet. Die hierbei entstehenden Fragmente N320 und C180 können daraufhin dimerisieren und werden gegenüber einem proteasomalen Abbau stabilisiert. Diese Taspase1-Schnittstellen sind auch in dem Fusionsprotein AF4-MLL enthalten und ermöglichen die Stabilisierung des AF4-MLLs nach proteolytischer Spaltung gegenüber seinem proteasomalen Abbau. Die Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase aus der Familie der Typ-2 Asparaginasen zu deren weiteren Vertretern die L-Asparaginase sowie die Glycosylasparaginase zählen. Als einziger Vertreter dieser Gruppe ist die Taspase1 jedoch eine Protease. Gemein ist allen Vertretern der Familie, die autoproteolytische Aktivierung des exprimierten Proenzyms hin zu einer katalytisch aktiven Form. Im Falle der Taspase1 kommt es dabei zu einer Spaltung in die als Heterodimer vorliegenden α- und β-Untereinheiten. Das katalytische Nukleophil der aktiven Taspase1 ist dabei das N-terminale Thr234 der β-Untereinheit. Neben ihrer Rolle als Protease des AF4-MLLs und der damit verbundenen Stabilisierung des Onkogens, wird der Taspase1 auch bei den soliden Tumoren eine Rolle als für die Transformation wichtiges Protein zugewiesen, was sich in ihrer häufigen Überexpression in verschiedenen Tumorarten widerspiegelt. Die Taspase1 ist demnach ein interessantes Ziel für die Wirkstoffentwicklung. Hierfür ist die Generierung eines quantitativen Aktivitätstest besonders wichtig und war Ziel dieser Arbeit. Der entwickelte Aktivitätstest basiert auf einem Reporter bestehend aus den beiden Fluoreszenzproteinen TagBFP sowie TagGFP2, die über eine Taspase1 Schnittstelle verbunden wurden. Dieses FRET-Paar lässt dabei die kontinuierliche Beobachtung der Reaktion zu und ermöglicht eine Auswertung der kinetischen Parameter der Reaktion. Von den beiden FRET-Reportern mit den unterschiedlichen Schnittstellen CS1 und CS2,konnte nur der mit der CS2 Schnittstelle exprimiert werden. Dieser Reporter konnte dann für die Validierung des Aktivitätstests eingesetzt werden und ließ die Bestimmung der kinetischen Parameter der Taspase1 für diese Reaktion zu. Die erhaltenen Parameter bewegen sich in einer ähnlichen Größenordnung wie schon publizierte kinetische Parameter eines Peptid-basierten Aktivitätstests. Ausgehend hiervon wurden die dnTaspase, eine dominant negative Taspase1-Mutante, kinetisch untersucht und ihre Inhibition der Taspase1-Aktivität beschrieben. Der Aktivitätstest ließ die Bestätigung der Konzentrationsabhängigen Inhibition der Taspase1-Aktivität durch die dnTaspase zu. Diese Beobachtung konnte auch in einer Zell-basierten Variante des Aktivitätstests bestätigt werden und zeigte sich ferner auch in einer Wachstumsverlangsamenden Wirkung der dnTaspase in der t(4;11)-Zelllinie SEM, wobei dieser Effekt nicht auf einer Zunahme der Apoptose der Zellen zurückzuführen war. Desweiteren wurde der Aktivitätstest benutzt, um eine Reihe von gegen das aktive Zentrum der Taspase1 gerichtete Substanzen auf ihre inhibitorische Wirksamkeit zu untersuchen.Hierbei gelang es einen Kandidat als Leitsubstanz zu identifizieren, der eine konzentrationsabhängige Inhibition der Taspase1 zeigte. Eine Bindung dieser Substanz an die Taspase1 konnte jedoch durch einen Thermal Shift Assay nicht nachgewiesen werden und ein Einfluss auf die Viabilität von proB-ALL Zelllinien konnte nicht beobachtet werden.
GProteingekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine der größten in der Natur vorkommenden Proteinfamilien dar (Watson and Arkinstall, 1994). GPCRs sind plasmamembranständige Proteine, die mit heterotrimären GProteinen interagieren und eine Vielzahl an Signaltransduktionswegen aktivieren. Trotz der strukturellen Vielfalt der an GPCRs angreifenden Liganden stimulieren die meisten GPCRs nur eine begrenzte Anzahl strukturell sehr ähnlicher GProteine (Hedin et al., 1993; Conklin and Bourne, 1993). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dieser Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität zugrunde liegen, ist von fundamentaler Wichtigkeit für das Verständnis zellulärer Signaltransduktion. Ausführliche StrukturFunktionsanalysen verschiedener Neurotransmitter rezeptoren, einschließlich der Muskarinrezeptoren (Wess, 1996) und adrenergen Rezeptoren (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994), haben einen beträchtlichen Beitrag zur Identifizierung der strukturellen Elemente, die für die GProteinKopplungsselektivität dieser Rezeptorgruppe verantwortlich sind, geleistet. Im Gegensatz dazu ist bisher noch weitgehend ungeklärt, welche molekularen Mechanismen der Kopplungsselektivität von GPCRs, die durch Peptidliganden aktiviert werden, zugrunde liegen. Das Ziel dieser Arbeit war daher, molekulare Grundlagen der GProtein Kopplungsselektivität von PeptidGPCRs näher zu untersuchen und aufzuklären. Die Vasopressinrezeptorfamilie unterscheidet sich von nahezu allen anderen PeptidGPCRs darin, daß die einzelnen Rezeptorsubtypen deutlich unterschiedliche GProtein Kopplungspräferenzen aufweisen. Die V1a und V1bVasopressinrezeptoren stimulieren selektiv GProteine der Gq/11 Familie, was zur Aktivierung von PhospholipaseCbeta-Isomeren führt. Im Gegensatz dazu koppelt der V2Vasopressinrezeptor vornehmlich an das GProtein G s , was in einem Anstieg an intrazellulärem cAMP resultiert. Daher stellen die Vasopressinrezeptorsubtypen ein attraktives Modellsystem zum Studium der Peptid GPCRRezeptordomänen, die für die selektive GProteinAktivierung verantwortlich sind, dar. Als Modellsystem für diese Arbeit diente primär der V2Vasopressinrezeptor. Molekulare Faktoren, die die Gs Kopplungsselektivität des V2 Vasopressinrezeptors bestimmen. Eine frühere Studie zeigte, daß die Gegenwart der V1aRezeptorsequenz in der zweiten intrazellulären (i2) Schleife notwendig war, um den Wildtyp V1a und V1a/V2 Rezeptorchimären effizient an Gq/11 Proteine zu koppeln (Liu and Wess, 1996). Effiziente Interaktionen zwischen Wildtyp V2 oder V1a/V2Rezeptorchimären und dem GProtein G s waren hingegen hauptsächlich von V2Rezeptorsequenzen in der dritten intrazellulären (i3) Schleife abhängig. Um die molekularen Grundlagen der Gs Kopplungsselektivität des V2Rezeptors näher zu untersuchen, wurden zunächst klassische Mutagenesetechniken (zielgerichtete Mutagenese'') angewandt. Definierte V2Rezeptorsegmente (oder einzelne Aminosäuren) wurden in den V1aRezeptor transferiert, und die resultierenden HybridVasopressinrezeptoren wurden anschließend in funktionellen Studien auf ihre Fähigkeit, hormonabhängig intrazelluläre cAMP Konzentrationen zu steigern (G s vermittelt), getestet. Diese Strategie schien besonders geeignet, da die Aktivierung des V1aWildtyprezeptors nahezu keine Auswirkungen auf intrazelluläre cAMPSpiegel hat. Wie bereits erwähnt, ist die effiziente Kopplung des V2Rezeptors an das Gs Protein vornehmlich von V2Rezeptorsequenzen in der i3Schleife abhängig (Liu and Wess, 1996). Eine V1aRezeptormutante, deren i3Schleife durch die homologe V2 Rezeptorsequenz ersetzt worden war, war in der Lage, effizient mit Gs zu interagieren. Die Fähigkeit dieser Rezeptormutante, Gs zu aktivieren, war jedoch im Vergleich zum V2Wildtyprezeptor vermindert. Diese Beobachtung ließ die Vermutung zu, daß noch andere intrazelluläre V2Rezeptordomänen zur optimalen Gs Kopplung notwendig sind. Daher wurde zunächst eine Reihe von V1a/V2Rezeptorchimären erzeugt, die den Beitrag der zweiten (i2) und vierten intrazellulären (i4) Rezeptordomäne zur V2 Rezeptor/G s Kopplungsselektivität klären sollten. Funktionelle Untersuchungen der resultierenden HybridRezeptormutanten in Säugetierzellen (COS7) zeigten, daß ein kurzes Segment im Nterminalen Abschnitt der i4Domäne einen deutlichen Beitrag zur V2Rezeptor/G s Kopplungsselektivität leistet. Eine V1aRezeptormutante, welche in der i3Schleife und dem Nterminalen Segment der i4Domäne (Ni4) homologe V2 Rezeptorsequenzen enthielt, zeigte ein funktionelles Profil (EC 50 und E max ), welches mit dem V2Wildtyprezeptor nahezu deckungsgleich war. Anschließend wurden strukturelle Elemente innerhalb der i3Schleife näher untersucht. Funktionelle Analysen zeigten, daß der Nterminale Abschnitt der i3Schleife weitgehend das GProteinKopplungsprofil des V2Rezeptors bestimmt. Eine Reihe von V1aRezeptormutanten wurde erzeugt, in denen kurze Segmente des Nterminalen Bereichs der i3Schleife mit der entsprechenden V2Rezeptorsequenz ausgetauscht wurden. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß ein Aminosäurepaar (Gln225, Val226) und triplet (Phe229, Arg 230, Glu231) am Beginn der i3Schleife des V2 Rezeptors für die effiziente Aktivierung von Gs von entscheidender Bedeutung sind. Durch Punktmutationen in diesem Bereich wurden zwei polare Aminosäuren, Gln225 und Glu231, identifiziert, die für die effiziente V2Rezeptor/G s Interaktion essentiell sind. Untersuchungen mit anderen GPCRKlassen (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994; Wess, 1996) haben ebenfalls gezeigt, daß dem N Terminus der i3Schleife eine besondere Rolle im Rezeptor/GProteinKopplungsprozeß zukommt. In diesen Studien wird berichtet, daß vornehmlich hydrophobe und ungeladene Aminosäuren Schlüsselrollen in der rezeptorvermittelten GProteinAktivierung einnehmen. Die hier beschriebenen Untersuchungen hingegen ergaben, daß zwei polare/geladene Aminosäuren, Gln225 und Glu231, für die V2Rezeptor/G s Kopplung von besonderer Wichtigkeit sind und zeigen daher, daß die Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität nicht auf ausschließlich hydrophoben Wechselwirkungen beruht. Desweiteren konnte beobachtet werden, daß die Länge der i3Schleife die Effizienz, mit der der V2Rezeptor GProteine der Gs Klasse zu aktivieren vermag, beeinflußen kann. Die V1a und V2Rezeptoren weisen unterschiedlich lange i3 Schleifen auf (die i3Schleife des V2Rezeptors ist 13 Aminosäuren kürzer als die des V1aRezeptors). Eine V1aRezeptormutante, deren Nterminaler Abschnitt der i3 Schleife durch homologe V2Rezeptorsequenz ersetzt wurde, konnte deutlich effizienter mit Gs interagieren, wenn der mittlere Abschnitt der i3Schleife um elf Aminosäuren verkürzt wurde. Gleichermaßen konnte die effiziente Kopplung bestimmter V1a/V2Hybridrezeptoren an Gs durch Einfügen von elf Aminosäuren in den zentralen Bereich der i3Schleife deutlich gehemmt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der zentrale Bereich der i3Schleife die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität beeinflussen kann, obgleich diese Rezeptordomäne vermutlich nicht direkt mit dem GProtein interagiert. Es ist denkbar, daß die Länge der i3Schleife den Zugang des GProteins zu funktionell wichtigen Rezeptordomänen, z.B. Aminosäuren im Bereich der fünften Transmembrandomäne (TM V) und der i3Schleife, reguliert. Identifizierung einzelner Aminosäuresubstitutionen und Aminosäuredeletionen, die die GProteinKopplungsselektivität des V2Rezeptors beeinflussen: Einsatz von Hefeexpressionstechnologie und zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Hefe(Saccharomyces cerevisiae) Expressionstechnologien angewandt, um StrukturFunktionsanalysen des V2Rezeptors zu erleichtern und Beschränkungen klassischer Mutagenesetechniken zu überwinden. Der V2Wildtyprezeptor und verschiedene GProteinchimären aus Hefe und SäugetierGalpha Untereinheiten wurden in genetisch modifizierten Hefelinien, deren Zellwachstum von effizienter Rezeptor/GProteinKopplung abhängig war, coexprimiert. In diesem System aktiviert produktive Rezeptor/GProteinKopplung den HefeMAPKinase/Pheromon Signaltransduktionsweg. Dies führt zur Transkription des FUS1HIS3Reportergens und somit zur Expression von His3Protein, was den Histidinauxotrophen (his3) Hefelinien ermöglicht, in histidinfreiem Medium zu wachsen (Pausch et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, daß heterolog exprimierte V2Rezeptoren weder mit der HefeGProtein alphaUntereinheit (Gpa1p) noch mit einem mutierten Gpa1Protein, in dem die Cterminalen fünf Aminosäuren gegen homologe Galpha q Sequenz ausgetauscht worden waren (Gq5), effizient interagierten. Im Gegensatz dazu erwies sich die Interaktion zwischen dem V2 Rezeptor und einem mutierten Gpa1Protein, dessen Cterminale fünf Aminosäuren die homologe Galpha s Sequenz enthielten (Gs5), als hocheffizient. Diese Beobachtungen zeigten, daß der V2Rezeptor im Hefesystem sein physiologisches Kopplungsprofil beibehielt. Zur weiteren Validierung des Hefeexpressionssystems wurden die G q/11 gekoppelten M 1 , M 3 und M 5 Muskarinrezeptoren und verschiedene mutierte Vasopressin und M 3 Muskarinrezeptoren mit veränderten funktionellen Eigenschaften heterolog in Hefe exprimiert. Funktionelle Analysen zeigten, daß die Wildtyprezeptoren und die verschiedenen Rezeptormutanten in Hefe und Säugetierzellen ähnliche Phänotypen aufwiesen. Um zu untersuchen, weshalb der V2Rezeptor nicht effizient an GProteine der Gq/11 Familie koppelt, sollte der in Hefe exprimierte V2Rezeptor zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') unterzogen und Mutanten mit veränderten G ProteinKopplungeigenschaften isoliert werden. Im speziellen wurde die i2Schleife untersucht, da eine frühere Studie gezeigt hatte, daß vornehmlich die i2Schleife des V1a Rezeptors für die V1aRezeptor/G q/11 Kopplungsselektivität verantwortlich ist (Liu and Wess, 1996). Mittels zufallsgerichteter Mutagenesetechnik wurde in Hefe eine Bibliothek von V2Rezeptormutanten erzeugt, deren i2Schleife Mutationen mit einer Mutageneserate von ungefähr 10% (auf der Nukleotidebene) enthielt. Anschließend wurden in einem Selektionsverfahren (screen'') 30 000 V2Rezeptormutanten auf ihre Fähigkeit, mit Gq5 zu interagieren, überprüft. Es konnten vier V2Rezeptormutanten isoliert werden, welche effizient an Gq5 (jedoch nicht an HefeGpa1p) koppelten. Funktionelle Untersuchungen mit diesen und anderen mittels zielgerichteter Mutagenese erzeugter V2Rezeptormutanten zeigten, daß die Substitution einer einzigen Aminosäure (Met145) im zentralen Bereich der i2Schleife beträchtliche Auswirkungen auf die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität hatte. Die Fähigkeit des V2Rezeptors, produktiv mit Gq5 zu interagieren, war von der Anwesenheit relativ großer, hydrophober Aminosäuren wie Leucin und Tryptophan abhängig. Austausch von Met145 mit kleinen Aminosäuren wie Glycin oder Alanin erlaubte dem V2Rezeptor nicht, Gq5 zu aktivieren. Interessanterweise interagierten alle V2Rezeptormutanten, die eine Met145 Punktmutation aufwiesen, mit Gs5 ähnlich effizient wie der V2Wildtyprezeptor. Die Unfähigkeit der V2(Met145Gly) und V2(Met145Ala)Rezeptoren, Gq5 zu aktivieren, beruht daher nicht auf einem Faltungsdefizit. Gleichermaßen basierte die Fähigkeit der V2(Met145Trp) und V2(Met145Leu)Rezeptoren, produktiv an Gq5 zu koppeln, nicht auf der Überexpression von Rezeptorprotein. Diese Ergebnisse zeigen, daß die chemische Eigenschaft der Aminosäure an Position 145 die V2Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität reguliert. Interessanterweise befindet sich in allen anderen Subtypen der Vasopressin/OxytocinRezeptorfamilie (V1a, V1b, und Oxytocin Rezeptoren), welche selektiv an GProteine der G q/11 Klasse gekoppelt sind, ein Leucin an der Stelle, die zu Met145 (V2Rezeptorsequenz) homolog ist. Eine der vier ursprünglich isolierten V2Rezeptormutanten enthielt neben verschiedenen Punktmutationen eine Deletion in Position Met145. In detaillierteren zielgerichteten MutageneseStudien wurden zwei V2Rezeptormutanten erzeugt, die alle drei GProteine (Gq5, Gs5 und Gpa1p) aktivieren konnten. Um zu untersuchen, ob ein generelles Verkürzen der i2Schleife um eine Aminosäure der Grund für die beobachtete Rezeptor/GProteinPromiskuität ist, wurden verschiedene V2Rezeptormutanten erzeugt, in denen einzelne Aminosäuren unmittelbar N und Cterminal von Met145 deletiert worden waren. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß die Deletion einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 (Ile141delta, Cys142delta, Arg143delta oder Pro144delta) in V2Rezeptormutanten resultierte, die nicht mit GProteinen interagieren konnten. RadioligandBindungsstudien zeigten, daß diese V2Rezeptormutanten keine V2Liganden binden konnten, was darauf schließen läßt, daß Deletionen einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 zu mißgefalteten Rezeptoren führen. Die Aminosäuren Ile141Pro144 befinden sich am Beginn der i2Schleife, unmittelbar neben der alphahelikalen zytoplasmatischen Verlängerung der dritten Transmembrandomäne (TM III) in der Nähe des hochkonservierten DRY(H)Motivs. Es ist denkbar, daß Aminosäuren innerhalb des Ile141Pro144Segments mit den zytoplasmatischen Abschnitten von TM III und/oder TM V interagieren und diese Wechselwirkungen die Rezeptorstruktur stabilisieren. Im Gegensatz dazu hatten Deletionen unmittelbar C terminal von Met145 (Leu146delta, Ala147delta, Tyr148delta oder Arg149delta) keinerlei Auswirkungen auf die Funktion des V2Rezeptors. Diese Aminosäuren befinden sich im zentralen Bereich der i2Schleife, der nicht mit den transmembranären Domänen des Rezeptorproteins interagieren kann.
Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur
Zwei flavonoidhaltige Pflanzenextrakte, der neuartige Extrakt WS1261, sowie der standardisierte Ginkgo biloba L.-Extrakt EGb761 wurden auf antidepressive Wirkungsmechanismen untersucht, zusätzlich als chemisch definierte Einzelsubstanz das in beiden enthaltene Flavonoid Isorhamnetin. Methodisch wurden hierzu Effekte auf Transporter und Enzyme des Monoaminstoffwechsels, depressionsrelevante Stresshormone neurotrophe Eigenschaften untersucht.
WS1261 hemmte in höheren Konzentrationen in vitro die (Wieder-) Aufnahmetransportmechanismen von NA und 5-HT. Ex vivo war ein Effekt auf die Aufnahme von NA und 5-HT weder nach 1 h, noch 4 h nach Akutbehandlungen zu sehen, sondern erst nach (14-taegiger) subchronischer Behandlung, und dann auch nur Ufer 5-HT zu messen. Nach subchronischer Behandlung konnte eine ebenfalls in vitro festgestellte Hemmung der MAO-A durch WS1261 ebenfalls ex vivo gezeigt werden.
EGb761 hemmte in vitro die Wiederaufnahme von NA, 5-HT und DA. Ex vivo war dieser Effekt weder 1 h, noch 4 h nach einer Akutgabe, allerdings nach 14-taegiger Dauerbehandlung im Bezug auf eine Hemmung der NA-Aufnahme messbar, ohne dass MAO-A oder MAO-B-Aktivitaet beeinflusst wurden.
WS1261 erhoehte nach 14-taegiger Behandlung konzentrationsabhaengig die Plasma-Corticosteronspiegel. WS1261 war in der Lage, die Ausdifferenzierung von PC12-Zellen konzentrationsabhaengig zu fördern, wodurch auf eine Wirkung ähnlich dem neurotrophen Wachstumsfaktor NGF geschlossen werden kann. Die Konzentration des Wachstumsfaktor BDNF wurde in zwei relevanten Hirnregionen durch WS1261 nicht, in einer jedoch durch Isorhamnetin allein erhoeht.
Zusammengefasst ergaben sich Hinweise darauf, dass eine mögliche antidepressive Wirkung von WS1261 durch eine Wirkung auf eine Beeinflussung des Monoaminstoffwechsels, oder die Erhöhung depressionsrelevanter Stresshormonlevel erklärbar sein koennte, insbesondere nach subchronischer Behandlung. Es ergaben sich ausserdem Hinweise auf wachstumsfaktoraehnliche Wirkungsweisen. Eine Wirkung ueber eine Erhšhung zentraler BDNF-Konzentrationen konnte durch die vorliegende Untersuchung im Beobachtungszeitrum nicht festgestellt werden.
Die literaturbekannte kognitionsverbessernde Wirkung des Ginkgo biloba-Extraktes EGb761 koennte erklärbar sein durch eine nach subchronischer Behandlung feststellbare Hemmung des Noradrenalintransporters NET, da im frontalen Cortex vor allem ueber diesen die synaptische Elimination des hier mit Aufmerksamkeit und Lernprozessen im Zusammenhang stehenden Neurotransmitters Dopamin erfolgt.
Das in beiden Extrakten enthaltene Flavonoid Isorhamnetin kann hšchstens mit einem Teil dieser festgestellten Effekte in Verbindung stehen, da die Extrakte sich in ihrer Wirkungsweise unterschieden, und Isorhamnetin alleine teilweise andere Effekte zeigte, als die isorhamnetinhaltigen Extrakte WS1261 und EGb761. Dies koennte jedoch auch durch die unterschiedlichen in den Extrakten enthaltenen Mengen erklärbar sein.
Gegenstand dieser Dissertation war das Ermitteln der Verbesserung der peroralen Bioverfügbarkeit Fenofibrat (FFB) durch lipid-basierte Formulierung (LBF). Eine weitere Aufgabe bestand darin, verschiedene analytische Methoden zur Bewertung der Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit von Fenofibrat einzusetzen. Diese schlossen in vitro biorelevante Löslichkeits-, Dispersions-, Auflösungs- und Präzipitationstests ein. Auf Basis der analytischen Ergebnisse wurden dann PBPK-Modelle verwendet, um menschliche Plasmaprofile nach der Verabreichung der FFB-Formulierungen zu simulieren. Die daraus resultierenden in silico-Vorhersagen stimmten mit den in vivo-Beobachtungen überein. Durch Anwendung der Parametersensitivitätsanalyse war es weiterhin möglich, ein mechanistisches Verständnis der beteiligten geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte zu erreichen.
Formulierungen auf Lipidbasis können nach dem Pouton-Klassifizierungssytem eingeteilt werden. Typ I Formulierungen bestehen ausschließlich aus Ölen, während am anderen Ende der Skala die Typ IV Formulierung weitestgehend aus Tensiden ist. In dieser Arbeit wurden in erster Linie Lipidformulierungen Typ IIIA und Typ IIIB untersucht.
Es wurde gezeigt, dass Dispersionstests an FFB-Lipidformulierungen am besten unter Verwendung der USP 3-Apparatur durchgeführt werden, da in diesem Apparat die GI-Motilität in vivo am besten reflektiert wird. Um die Hydrodynamik in verschiedenen Auflösungsapparaten zu vergleichen, wurde der Auflösungsversuch von LBF Nr. 1 – Nr. 4 von FFB auch unter Verwendung von USP 2 durchgeführt. Ungeachtet von kompendialen oder biorelevanten Medien führten die meisten dieser Lipidformulierungen zur Auflösung eines Großteils des beladenen Medikaments, im Gegensatz zum unformulierten Fenofibrat, das sich in nüchternem Zustand kaum auflöst. Weiter zeigten die Transfermodellexperimente an den Lipidformulierungen von FFB, dass eine intestinale Präzipitation nach einer Magenauflösung unwahrscheinlich ist.
Durch mathematische Transformation der Noyes-Whitney-Gleichung kann ein Excel-Toolkit zur Berechnung des z-Werts aus in-vitro-Auflösungsprofilen verwendet werden. Die z-Werte werden dann in physiologisch-basierte pharmakokinetische in silico Modelle, STELLA® und Simcyp®, eingesetzt. Anhand der erforderlichen post-absorptiven Parameter kann mithilfe dieser Modelle die Plasma-Arzneistoff-Konzentration nach oraler Verabreichung von verschiedenen Formulierungen vorhergesagt werden. Darüber hinaus ermöglicht der Simcyp®-Simulator eine Reihe von virtuellen Versuchen, die PK-Variabilität vom Wirkstoff in verschiedenen Bevölkerungsgruppen zu bestimmen. Um diese Möglichkeiten für LBF von Fenofibrat zu testen, wurde LBF Nr. 4 modelliert. Das Simulationsergebnis von Simcyp® entsprach dem aus der STELLA®-Software. Weiterhin wurden die Plasmafenofibrinsäure-Konzentrationsprofile von den Modellen genau vorhergesagt. Die Punktschätzwerte für Cmax und AUC, berechnet aus den In-silico und in vivo Plasmaprofilen, lagen sogar im Bereich von 0,8-1,25 für die SMEDDS Lösung und Kapselformulierungen. Diese Übereinstimmung von in vitro-in silico mit in vivo wurde weiterhin durch Berechnung der jeweiligen f2 Faktoren unterstützt.
Basierend auf diesen Ergebnissen scheint es, dass der In-vitro-In-Silico-In-vivo-Ansatz ein nützliches Werkzeug zum Identifizieren und Vergleichen von Beschränkungen der oralen Absorption für Formulierungen auf Lipidbasis und zum Optimieren der Lipidformulierungsentwicklung von schlecht löslichen Arzneimitteln darstellt.