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Polypharmakologie hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung in der pharmazeutischen Forschung gewonnen und könnte in Zukunft zu einem Umdenken in der Entwicklung neuer Wirkstoffe führen. Das wachsende Verständnis für biologische Zusammenhänge, im speziellen für die starke Vernetzung zwischen verschiedenen Signalwegen oder Gewebearten, und die daran beteiligten Proteine, könnten zu gänzlich neuen Strategien führen. Beispiele aus dem Bereich der Onkologie und der Entwicklung von Neuroleptika haben bereits gezeigt, dass eine Intervention an mehreren Stellen eines solchen komplexen Netzwerkes zu wirksameren und gleichzeitig sichereren Wirkstoffen führen kann. Erkenntnisse aus der Systembiologie und die retrospektive Analyse bereits zugelassener Wirkstoffe machen deutlich, dass viele erfolgreiche Wirkstoffe nur aufgrund ihres polypharmakologischen Wirkprofils so effektiv sind – wenngleich dies bei Ihrer Entwicklung oftmals nicht beabsichtigt war.
Das rationale Design sogenannter „multitarget Wirkstoffe“ stellt bis heute eine große Herausforderung dar. Aus Sicht eines medizinischen Chemikers bedeutet es die Verknüpfung zweier, auf unterschiedliche Targets aktiver, Liganden zu einem neuen Wirkstoff, ohne einen signifikanten Aktivitätsverlust auf die einzelnen Targets herbeizuführen. Ein naheliegender Ansatz zur Verbindung zweier Liganden ist die Verknüpfung der Moleküle über einen flexiblen Linker. Dieser Ansatz kann zwar in vitro zu sehr potenten Wirkstoffen führen, birgt jedoch pharmakokinetische Nachteile, bedingt durch das hohe Molekulargewicht, die sich oft erst in vivo zeigen. Die Schwierigkeit besteht also zum einen in der Aufrechterhaltung der individuellen Aktivität auf das jeweilige Target und zum anderen im Erreichen einer guten Balance zwischen Aktivität und Komplexität des Liganden. Damit soll ausreichend Raum für spätere Optimierung von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften gewährleistet werden. Bisher wurden nur wenige Computer-gestützte Ansätze entwickelt um diese und ähnliche Fragestellungen zu bearbeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer in silico Verfahren zur Identifzierung von multitarget Liganden ein Kernthema dieser Arbeit. Die Implementierung eines Fragment-basierten Ansatzes hält die Komplexität der Liganden möglichst gering und bietet genügend Raum für eine anschließende, multi-dimensionale Optimierung an zwei oder mehreren Targets.
In der ersten Studie wurde eine Pharmakophor-basierte Strategie verfolgt. Die Repräsentation eines Liganden durch ein Pharmakophormodell stellt eine abstrakte dreidimensionale Darstellung der für die biologische Aktivität relevanten Strukturmerkmale dar. Diese Abstraktion vereinfacht den Vergleich zweier Verbindungen und erlaubt gleichzeitig Spielraum für chemische Variabilität. Bei diesem Ansatz wurden Pharmakophormodelle, jeweils für eine Vielzahl aktiver Liganden zweier Targets, erzeugt und paarweise miteinander verglichen. Sobald zwei Pharmakophormodelle eine genügend große Anzahl an Pharmakophorpunkten in räumlich ähnlicher Orientierung teilen, stellt dieses gemeinsame Pharmakophor die Basis eines potentiellen multitarget Liganden dar. In der beschriebenen Studie wurde dieses Verfahren anhand von aktiven Liganden der löslichen Epoxid Hydrolase (sEH) und 5-Lipoxygenase (5-LO) evaluiert. Die auf dieser Grundlage identifizierten multitarget Pharmakophormodelle wurden zum anschließenden Screening einer Fragement-Datenbank verwendet und führten zu 9 aktiven Liganden für sEH und 5-LO. Diese Liganden besitzen chemische Grundgerüste (Scaffolds), die in der Literatur bisher noch nicht als aktive sEH- oder 5-LO-Liganden beschrieben wurden und somit eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe darstellen. Für eine der gefundenen Verbindungen, basierend auf einem Benzimidazol-Gerüst, wurden Aktivitäten im niedrig mikromolaren Bereich für beide Targets bestimmt. Diese Verbindung und weitere Derivate werden zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert um eine erste Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufzustellen und die Eignung dieser Substanzklasse als potentielle Leitstruktur für neue, duale sEH/5-LO Liganden zu überprüfen.
Parallel dazu wurde eine Substruktur-basierte Strategie verfolgt um Rückschlüsse auf jene Strukturmerkmale zu ziehen, die für die Aktivität auf dem jeweiligen Target verantwortlich sein könnten. Dazu wurden in einem ersten Schritt alle aktiven Liganden zweier Targets auf ihre möglichst maximalen gemeinsamen Substrukturen reduziert. Für jedes Target wird damit ein Set von Substrukturen generiert, welches die für die Bindung an das jeweilige Target charakteristische Strukturmerkmale enthält. Diese Substrukturen, repräsentieren den chemischen Raum des jeweiligen Targets und stellten die Trainingsdaten für den entwickelten multiSOM Ansatz dar. Dieser Ansatz basiert auf dem automatisierten Vergleich von selbst-organisierenden Karten und hebt Gemeinsamkeiten zwischen diesen Substruktursets in einer leicht zu interpretierenden, visuellen Form hervor. Dies erlaubt die Identifizierung von gemeinsamen Substrukturen aus beiden verwendeten Substruktursets, welche potentielle duale Strukturelemente darstellen.
Die Validierung dieses Ansatzes erfolgte erneut auf Basis bekannter 5-LO- und sEH-Liganden. Unter 24 ausgewählten Verbindungen konnten neun Fragmente identifiziert werden, die auf einem der beiden Targets und 5 Fragmente, die auf beiden Targets im niedrig mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Einer dieser dualen Fragmente wurden anschließend als Basis für eine Substruktursuche in einer Inhouse Datenbank verwendet. Die daraus resultierende Verbindung, die einen Teil des ursprünglichen Fragments beinhaltet, wirkt sowohl auf sEH als auch 5-LO in nanomolaren Konzentrationen inhibierend. Auch diese Verbindung wird zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert und stellt eine vielversprechende Basis als Leitstruktur neuer dualer sEH/5-LO-Liganden dar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellten Methoden neue Möglichkeiten bieten, das rationale Design von multitarget Liganden zu unterstützen. Die Pharmakophor-basierte Methode kann besonders dann von Vorteil sein, wenn bereits Strukturinformationen für beide Targets bzw. die bioaktiven Konformationen der Liganden vorliegen. Für einen ausschließlichen Liganden-basierten Ansatz stellt die Verwendung der MultiSOM, und damit die Identifizierung gemeinsamer Strukturelemente der Liganden, die bessere Methode dar.
Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Studien zur Identifizierung neuer Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Partialagonisten beschrieben. Auch in diesem Fall wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Da FXR eine starke strukturelle Anpassung abhängig vom gebundenen Liganden aufweist („induced fit“), sind rein strukturbasierte virtuelle Screening-Methoden nur eingeschränkt einsetzbar. Aus diesem Grund sollte zunächst ein Liganden-basierter Drug Repurposing Ansatz verfolgt werden, bei dem bereits zugelassene Wirkstoffe mit potentiell FXR-modulierenden Eigenschaften identifiziert werden sollten. Der Vorteil des Drug Repurposing besteht darin, dass die betrachteten Wirkstoffe bereits intensiv hinsichtlich Sicherheit und Bioverfügbarkeit untersucht wurden. Somit kann man sich bei der Entwicklung verstärkt auf die biologische Aktivität auf das neue Target konzentrieren.
Erneut wurden selbstorganiserende Karten (SOMs) verwendet, um zugelassene Wirkstoffe mit FXR-Aktivität zu identifizieren. Trainiert wurde die SOM auf einem Datensatz bestehend aus bekannten FXR-Agonisten zum einen und der DrugBank Datenbank mit zugelassen Wirkstoffen zum anderen. Die Eigenschaft der SOM Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität in räumlicher Nähe auf der Karte zu clustern führte zu einer Anhäufung an bekannten FXR-Agonisten auf einigen wenigen Neuronen. Auf solchen sogenannten Aktivitätsinseln wurden zusätzlich auch zugelassene Wirkstoffe platziert, wenn ihre Ähnlichkeit zu den FXR-Agonisten ausreichend hoch war. Die auf den Aktivitätsinseln angesiedelten Wirkstoffe wurden anschließend bestellt und hinsichtlich ihrer FXR-Aktivität in einem Transaktivierungs-Assay untersucht. Unter den bestellten Verbindungen konnten sechs Liganden mit einer signifikanten relativen FXR-Aktivierung identifiziert werden. Weitere Hinweise auf eine mögliche FXR-Aktivierung der Verbindungen gaben in der Literatur beschriebene Nebeneffekte, die mit einer FXR-Aktivierung in Zusammenhang stehen könnten. Die potentenste Verbindung, der zugelassenen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib, wurde zusätzlich in Bezug auf FXR-basierte SHP mRNS Induktion untersucht. In qPCR-Experimenten konnte dabei eine mit GW4064 vergleichbare Induktion in HepG2 Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse untermauern die aus der Literatur gewonnen Vermutung, dass Imatinib FXR-modulierende Eigenschaften besitzt und somit eine interessante Grundlage für die Entwicklung neuer FXR-Partialagonisten darstellt. Zu diesem Zeitpunkt werden weitere Imatinib-Derivate synthetisiert und diese Struktur als mögliche Leitstruktur charakterisiert.
In einer zweiten Studie wurde eine Kombination aus Liganden- und Struktur-basierten Ansatz verfolgt. Dabei wurden sämtliche Struktur-Informationen aus publizierten FXR-Kristallstrukturen und den darin kokristallisierten Liganden gebündelt, um die Auswirkungen des zu Beginn erwähnten induced-fit Effekts zu minimieren. Auf Basis der ko-kristallisierten Liganden wurden zunächst zwei Konsensus-Pharmakophormodelle erstellt. Diese Modelle wurden in einem anschließenden Schritt jeweils mit einem Konsensus-Pharmakophormodell, das mit Hilfe von Protein-Ligand-Interaktions-Fingerprints (PLIF) aus den korrespondieren Kristallstrukturen abgeleitet wurde, überlagert und kombiniert. Diese kombinierten Modelle vereinten sowohl Informationen der strukturellen Gemeinsamkeiten der Liganden als auch gemeinsame, relevante Interaktionspunkte zwischen Ligand und Rezeptor aus den Kristallstrukturen. Das Pharmakophor-Screening mit anschließender Docking Analyse führte zu 42 getesteten Verbindungen, von denen 12 Strukturen eine signifikante relative FXR-Aktivierung zeigten. Darunter konnte ein Partial-Agonist mit einem EC50 von 480 nM bei einer maximalen Aktivierung von ca. 14% im Vergleich zur Referenz GW4064 identifiziert werden. Auch diese Verbindung wird zum aktuellen Zeitpunkt weiter charakterisiert und könnte in Zukunft als Leitstruktur für neue FXR-Partialagonisten dienen.
In beiden Studien konnten neue FXR-Agonisten mit bisher noch nicht beschriebenen Scaffolds identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung bereits zugelassener Wirkstoffe für neue Indikationen eine attraktive Quelle für neue Leitstrukturen darstellen kann und im Zuge dessen bisher ungeklärte Nebeneffekte bekannter Wirkstoffe aufgeklärt werden können.
Abschließend lässt sich festhalten, dass selbstorganisierende Karten eine universelle Methode zur Erkennung und Analyse von polypharmakologischen Zusammenhängen darstellen. Des Weiteren lassen sich mit ihrer Hilfe chemische Räume repräsentieren und durch den in dieser Arbeit entwickelten MultiSOM-Ansatz direkt vergleichen. Dies ermöglicht auf intuitive und effiziente Weise die Identifizierung von überlappenden chemischen Räumen und somit möglicher polypharmakologischer Zusammenhänge.
Als zellulärer Sensor für Gallensäuren und als Regulator zahlreicher metabolischer und inflamma-torischer Gene stellt der nukleäre Farnesoid X Rezeptor (FXR) ein vielversprechendes neues Wirkstofftarget dar. Die Aktivierung von FXR mit natürlichen oder synthetischen Liganden führte in vitro und in vivo zu zahlreichen wünschenswerten Effekten wie gesteigerter Insulinfreisetzung, verringerter Insulinresistenz oder verbessertem Lipidprofil. Daneben stellt die Aktivierung von FXR ein Prinzip zur Behandlung von Lebererkrankungen wie nicht-alkoholischer Fettleber und primärer billiärer Zirrhose dar, das mit dem FXR-Agonisten Obeticholsäure bereits in klinischen Studien überprüft wird. Existierende synthetische FXR-Liganden sind Fettsäure- bzw. Gallensäuremimetika und imitieren die physiologischen FXR-Agonisten. Die meisten synthetischen FXR-Liganden sind jedoch aufgrund von Toxizität, geringer Selektivität oder schlechter Bioverfügbarkeit nicht zur wie-teren klinischen Entwicklung geeignet. Sie stellen außerdem vornehmlich vollagonistische FXR-Ligan-den dar, doch die klinischen Erfahrungen mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren wie den Peroxi-somen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) oder den Estrogenrezeptoren (ER) haben gezeigt, dass eine zu starke Aktivierung eines Ligand-aktivierten Transkriptionsfaktors Risiken erheblicher Nebenwirkungen bergen kann. Eine Möglichkeit, dieser Gefahr vorzubeugen, bietet die Entwicklung partialagonistischer FXR-Liganden, die den Rezeptor nur mit moderater Amplitude aktivieren.
In dieser Arbeit wurde ausgehend von der in einem virtuellen Screening identifizierten Leitstruktur 1, durch medizinisch chemische Optimierung und Studien zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) ein potenter und selektiver FXR-Partialagonist entwickelt. Die drei Molekülteile der Leitstruktur 1 (azide Kopfgruppe, zentraler Anthranilamidkörper und Acylsubstituent) wurden einzeln hinsichtlich ihrer Potenz an FXR untersucht und optimiert. In der Untersuchung der SAR des Acylsubstituenten zeigten sich ein 2-Naphthoyl- und ein 4-tert-Butylbenzoylsubstituent der in 1 enthaltenen 4-Methylbenzoylgruppe überlegen. Unter Beibehaltung des 2-Naphthoylsubstituenten wurde hierauf durch selektive Methylierung bzw. Reduktion die Notwendigkeit beider Amidbindungen der Subs-tanzklasse für Aktivität an FXR nachgewiesen. Durch Erweiterung der aziden Kopfgruppe um einen zusätzlichen aromatischen Ring gelang eine weitere Potenzsteigerung, die sich durch eine Methyl-gruppe an 6-Position dieses neu eingeführten Ringes noch erhöhen ließe. Andere Substituenten am aromatischen Ring der Kopfgruppe führten dagegen an keiner Position zu einer Aktivitätsverbes-serung. Der Austausch der freien Carbonsäure durch metabolisch stabilere Bioisostere wie ein Methylketon oder ein Nitril stellte sich als ohne Aktivitätsverlust möglich heraus, wobei das Tetrazol als klassisches Carbonsäurebioisoster eine Ausnahme mit geringerer Potenz bildete. Die entscheiden-de Steigerung der Aktivität der Acylanthranilamide an FXR resultierte aus der Einführung eines zusätzlichen Substituenten in 4-Position des zentralen aromatischen Ringes, wobei eine Methoxy-gruppe zur größten Potenz führte. Das resultierende Anthranilamid 2 stellt einen hochpotenten FXR-Partialagonisten mit einem EC50-Wert von 8±3 nM in einem flFXR-Reportergenassay bei 18±1% Maximalaktivierung dar und ist der Leitstruktur somit um mehr als einen Faktor 1000 überlegen.
Die optimierte Verbindung 2 wurde aufgrund ihrer großen Potenz ausführlich in vitro pharma-kologisch charakterisiert. Dabei stellte sich die Substanz als metabolisch sehr stabil, moderat löslich in Wasser und gemessen an ihrer hohen Aktivität an FXR als wenig toxisch heraus. Darüber hinaus er-wies sich 2 als selektiv für FXR über den membranständigen G-Protein-gekoppelten Gallen-säurerezeptor TGR5 (Faktor >1000) sowie über die nukleären Rezeptoren PPARα (>1000), PPARγ (~375) und PPARδ (>1000). Bei der Quantifizierung seiner Effekte auf die FXR-Targetgene SHP, CYP7A1, BSEP, OSTα und IBABP durch qRT-PCR übte 2 im Bereich 0,1 µM bis 10 µM einen konzen-trationsunabhängigen partialagonistischen Effekt von etwa 40% des Effektes des physiologischen FXR-Agonisten Chenodeoxycholsäure (CDCA) aus. Mit der Verbindung 2 wurde somit ein hochpotenter, selektiver und metabolisch stabiler FXR-Partialagonist entwickelt und charakterisiert, der sich für künftige in vitro und in vivo Studien zu partieller FXR-Aktivierung empfehlen kann.
Little attention so-far has been paid to the influence of chronobiology on the processes of nanoparticle uptake and transport into the brain, even though this transport appears to be chronobiologically controlled to a significant degree. Nanoparticles with specific surface properties enable the transport across the blood–brain barrier of many drugs that normally cannot cross this barrier. A clear dependence of the central antinociceptive (analgesic) effects of a nanoparticle-bound model drug, i.e., the hexapeptide dalargin, on the time of day was observable after intravenous injection in mice. In addition to the strongly enhanced antinociceptive effect due to the binding to the nanoparticles, the minima and maxima of the pain reaction with the nanoparticle-bound drug were shifted by almost half a day compared to the normal circadian nociception: The maximum in the pain reaction after i.v. injection of the nanoparticle-bound dalargin occurred during the later rest phase of the animals whereas the normal pain reaction and that of a dalargin solution was highest during the active phase of the mice in the night. This important shift could be caused by an enhanced endo- and exocytotic particulates transport activity of the brain capillary endothelial cells or within the brain during the rest phase.
In Deutschland erhalten jährlich etwa 12.500 Patienten die Diagnose Leukämie. Unter ihnen befinden sich ca. 6 % Kinder, welche mit 33,8 % den größten Anteil der kindlichen Krebsneuerkrankungen repräsentieren. Die überwiegende Form im Kindesalter ist die akute lymphatische Leukämie (ALL), deren genetische Ursache meistens in einem hyperdiploiden Karyotyp oder einer chromosomalen Translokation zu finden ist. Bei 8 % der pädiatrischen ALLs ist ein Rearrangement des MLL-Gens involviert. Unter Beteiligung des häufigsten Translokationspartnergens (TPG) AF4 entsteht die t(4;11)(q21;q23)-Translokation mit den beiden Fusionsproteinen AF4•MLL sowie MLL•AF4. Die Therapie erfolgt in der Regel gemäß Hochrisikoprotokollen aufgrund der extrem schlechten Prognose und der mit hoher Therapieresistenz assoziierten Rezidivrate. Eine Studie zur Korrelation zwischen klinischen Merkmalen und molekularen Charakteristika belegte die Abhängigkeit des Outcomes von der Verteilung des Bruchpunkts im MLL-Gen. Bei älteren Patienten treten die Bruchpunkte überwiegend in MLL Intron 9 oder 10 auf und bedeuten eine signifikant bessere Prognose im Vergleich zu den besonders bei Säuglingen präsenten Bruchpunkten im MLL Intron 11. Die damit verbundene Verkürzung der Plant Homeodomain (PHD) 1 kann neben einer modifizierten Funktion des PHD1 auch in einer veränderten Konformation der gesamten PHD-Domäne resultieren. Besondere Bedeutung hat die PHD1-3-Domäne wegen der Fähigkeit des PHD3 einerseits H3K4me-Signaturen zu erkennen und auf der anderen Seite mit CYP33 zu interagieren. Die mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziierten H3K4me-Signaturen sowie die CYP33-vermittelte repressive Aktivität bedingen einen ambivalenten Charakter des MLL-Proteins. Daneben ist der PHD3 allein interessant wegen des Vorkommens von 4 differenten Varianten mit keinen, 3, 11 oder 14 fehlenden Aminosäuren, welche durch alternatives Spleißen an der MLL Exon 15/16-Verknüpfung entstehen (PHD3-0, PHD3-3, PHD3 11 und PHD3-14). Semiquantitative Bestimmungen in verschiedenen Zelllinien verdeutlichen die nahezu ähnliche Transkription aller 4 Varianten. Weiterführende Untersuchungen mit dem Yeast Two-Hybrid (Y2H)-System sowie folgende Koimmunpräzipitations (CoIP)-Experimente zeigten, dass der PHD3-0 die beste Dimerisierungsfähigkeit aufweist. Dagegen ist der am schlechtesten dimerisierende PHD3-3 allein in der Lage, CYP33 bzw. dessen RRM-Domäne zu binden. Die Interaktion mit inhibitorischen Proteinen und die folgende Funktion als transkriptioneller Repressor sind allein mit der PHD3-3-Variante möglich. Bei Betrachtung der gesamten PHD1-3-Domäne sowie deren verkürzter Variante (ΔPHD1-3) fällt die reduzierte Bindungsfähigkeit der ΔPHD1-3-Domäne an die CYP33 RRM-Domäne sowie deren fehlende Dimerisierung auf. Über die resultierende geringere Bindung an inhibitorische Proteine kann die transkriptionell repressive Aktivität reduziert werden, während die transkriptionell aktive Funktion an Bedeutung gewinnt. Neben der Untersuchung der PHD-Domänen des MLL-Proteins wurde das Y2H-System zur weiteren Aufklärung der AF4- und AF4•MLL-Multiproteinkomplexe (MPC) verwendet. Ähnlich den Wildtypproteinen MLL und AF4 sind auch die beiden aus der t(4;11)(q21;q23)-Translokation resultierenden Fusionsproteine an der Assemblierung von MPCs beteiligt. Besonders das reziproke AF4•MLL scheint bezüglich des Therapieerfolgs für die Leukämogenese entscheidend zu sein. Die Identifizierung und Verifizierung sowohl bekannter als auch neuer Komponenten der AF4- und AF4•MLL-MPCs gelang in verschiedenen Experimenten. Allerdings wurde meist nur die Präsenz der Proteine im MPC nachgewiesen. Die Y2H-Untersuchungen konnten Interaktionen zwischen den verschiedenen Proteinen der Komplex identifizieren und damit die Kenntnis über die Zusammensetzung der MPCs wesentlich erweitern und vertiefen. Aufgrund der Beteiligung viraler Proteine an der Krebsentstehung sowie der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren der Wirtszelle für die virale Replikation erscheint auch die Nutzung der Superelongationskomplexe (SEC) durch virale Proteine plausibel. Die Funktion des AF4-Proteins als Kofaktor von viralen Proteinen, besonders der HCMV und EBV immediate early (IE)-Proteine, wurde bereits gezeigt. Außerdem konnte der Einfluss des HCMV IE1 auf AF4-abhängige Effekte sowie dessen Beteiligung am AF4-MPC nachgewiesen werden. Mithilfe der Y2H-Experimente konnten nicht nur Interaktionen des HCMV IE1 sondern auch Wechselwirkungen der Onkoproteine E6/E7 des HPV mit den Proteinen der AF4- und AF4•MLL-MPCs identifiziert werden.
Fettsäuren vermitteln ebenso wie Gallensäuren über ihre G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPR40 bzw. TGR5) und nukleären Rezeptoren Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs) bzw. Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Signale zur Regulation wichtiger Stoffwechselwege, wie dem Fettstoffwechsel, Cholesterolstoffwechsel und der Glukosehomöostase. Gerade die nukleären Rezeptoren stellen durch ihre Regulation einer Vielzahl an Targetgenen vielversprechende Wirkstofftargets dar. Die Aktivierung von PPARα und PPARγ wird seit Jahren therapeutisch genutzt zur Therapie der Dyslipidämie (Fibrate) und des Typ-2 Diabetes (Glitazone). Dennoch zeigte sich durch diese Vollaktivierung ein bedenkliches Profil unerwünschter Nebenwirkungen eng mit der therapeutischen Wirkung verknüpft. Im Falle des FXR befindet sich derzeit ein semisynthetisches Derivat, welches sich von den endogenen Liganden CDCA ableitet, in Phase III der klinischen Entwicklung zur Therapie von Lebererkrankungen, wie der nicht-alkoholischen Fettleber und der primären billiären Zirrhose. In vitro und in vivo-pharmakologische Untersuchungen weisen auf positive Effekte von FXR-Agonisten aber auch mit FXR-Antagonisten auf den Zucker- und Cholesterolstoffwechsel hin. Doch hier bleibt abzuwarten, ob agonistisch oder antagonistisch aktive Substanzen das größte therapeutische Potential besitzen, wobei die Erfahrung mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren, wie den PPARs und Estrogenrezeptoren (ER) zeigt, dass die partielle Aktivierung der Vollaktivierung zu bevorzugen ist. Diese Arbeit unterteilt sich in zwei Projekte, die sich von der an PPAR dual aktiven Pirinixinsäure (1) ableiten. Ausgangspunkt des ersten Projekts bildet die Substanz MD78 (2), die sich aus Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) vorangegangener Arbeiten entwickelt hat. Mit ihrem potenten dual PPARα/γ-agonistischen Profil hebt sie sich in ihrer Aktivität von den anderen Derivaten ab. Ziel war es die Ursache dieser Aktivität mit Hilfe einer konkretisierten SAR zu identifizieren. Die nähere Untersuchung der Verbrückung des lipophilen Substituenten zeigte einen deutlichen Einfluss des sekundären Amins auf die Aktivität, vor allem am PPARα-Subtyp. Eine Dockingstudie unterstützte die These, dass ein Wasserstoffbrückendonor an dieser Stelle für die Aktivität von Vorteil sei, da dadurch ein Wasserstoffbrückennetzwerk zu einem konserviert vorliegendem Wasserkluster ausgebildet werden konnte. Dieses Wasserkluster wird durch die Aminosäure Thr279 in der Ligandbindetasche fixiert, sodass eine Mutationsstudie durchgeführt wurde, die diese These belegen konnte. Ebenfalls aus vorangegangenen Arbeiten entwickelte sich ausgehend von der Pirinixinsäure Phenylthiohexansäuren, die in einem Screening als FXR-Liganden identifiziert wurden. Die Substanz HZ55 (3) bildete somit die Leitstruktur des zweiten Projekts dieser Arbeit, bei dem die Zielsetzung die Entwicklung selektiver FXR-Liganden war. Da die Leitstruktur 3 eine auf die Aktivität an PPAR und den Enzymen der Arachidonsäurekaskade mPGES-1 und 5-LO optimierte Substanz darstellte, wurde im ersten Schritt der SAR der substituierte Thioether deletiert, da dieser als potentes PPAR-Pharmakophor bekannt war. Anschließend erfolgte die weitere Optimierung durch Struktur-Wirkungs-Beziehung der sauren Kopfgruppe, des Linkers und des heteroaromatischen Substituenten. Erste agonistisch aktive Derivate wurden durch Austausch des Chinolin-Rings durch einen Pyridin-Ring erreicht, wobei die Position 2 des Stickstoffs bevorzugt war (4). Durch Variation der Substitutionsposition am Pyridin-Ring stellte sich die Position 3 als vorteilhaft heraus, um hier durch Vergrößerung des lipophilen Substituenten die Aktivität zu steigern. Bei dem Einsatz des Eduktes Pyridin-2-ol musste die Synthese optimiert werden, um das Tautomeren-Gleichgewicht zwischen Pyridin/Pyridon steuern zu können. Denn auch die Pyridon-Derivate zeigten vergleichbare partialagonistische Potenz zu ihren Isomeren. Hier führte jedoch die Vergrößerung des lipophilen Substituenten in 3-Position zu der Etablierung einer neuen FXR-antagonistischen Substanzklasse. Der hieraus potenteste Vertreter (5) wurde weitergehend charakterisiert und konnte seine antagonistische Wirkung auch auf die FXR-Targetgene SHP, BSEP, Ostα und IBABP nachweisen. Durch qRT-PCR quantifiziert zeigte sich, dass 5 die Aktivität des endogenen Liganden CDCA antagonisieren konnte. Weiterhin zeigte die Substanz eine gute Selektivität über die PPARs. Optimierungsbedarf besteht jedoch in der metabolischen Stabilität und Löslichkeit und der Selektivität gegenüber mPGES-1. Doch die Substanz 5 stellt einen interessanten Ausgangspunkt für eine neue Substanzklasse dar, da sie eine agonistische Aktivität an dem G-Protein gekoppelten Rezeptor der Gallensäuren, TGR5, zeigt. Somit stellt 5 die erste synthetische Substanz dar, die dieses duale Profil der Gallensäurerezeptoren besitzt. Dies stellt ein vielversprechendes neues Therapieprinzip dar, nachdem sowohl der FXR-Antagonistmus positive Wirkung auf die Insulinsensitivität in Mausmodellen des Diabetes gezeigt hat, als auch der TGR5-Agonismus durch die Sekretion von GLP-1 Auswirkungen auf den Glukosehomöostase hat.
Immune cells are key players in several physiological and pathophysiological events such as acute and chronic inflammation, atherosclerosis and cancer. Especially in acute inflammation, macrophages are indispensable for the switch from the acute inflammatory phase to the resolution phase. Not only the phagocytosis of apoptotic cells, but especially the surrounding cytokines and mediators are able to switch macrophage polarization from inflammatory- to anti-inflammatory phenotypes. Within this cytokine environment, sphingosine-1-phosphate (S1P) plays an important role for immune cell activation, polarization and migration.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) als neue potentielle antientzündliche Wirkstoffe. Beide Enzyme befinden sich innerhalb der Arachidonsäurekaskade und sind einerseits an der Prostaglandin E2 (PGE2) Biosynthese und andererseits an der Biosynthese der Leukotriene (LTs) beteiligt (siehe Abb. 1). Die mPGES-1 ist ein membranständiges
Enzym, das downstream lokalisiert ist, hauptsächlich unterhalb der induzierbaren COX-2, und katalysiert die Reaktion von PGH2 zu PGE2. PGE2 gilt innerhalb der Prostaglandine als prominentester Vertreter bezüglich Entzündungen, Schmerzen und Fieber. Die Leukotriene gehören ebenso wie die Prostaglandine zu den proinflammatorisch wirkenden Lipid-Mediatoren und sind unter anderem beteiligt an der Bronchokonstriktion oder erhöhen auch die vaskuläre Permeabilität. Während dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungsbeziehungen zweier verschiedener Substanzklassen untersucht. Leitstruktur I entstammt einem Pirinixinsäure-Derivat (siehe Abb. 2). Die Pirinixinsäure (Verbindung 1) selbst ist sowohl an der mPGES-1 als auch an der 5-LO inaktiv. Initiale Arbeiten haben gezeigt, dass eine Einführung eines n-Hexyl Restes in α-Position zu der Carbonsäure zu einer dualen Inhibition der 5-LO und mPGES-1 geführt hat (Verb. 2). Unter Beibehaltung dieses Restes sollte der lipophile Rückraum durch Austausch des 2,3-Xylidin-Gerüsts optimiert werden und hier hat sich insbesondere das 4-(4-Chlorphenyl)-1,3-thiazol-2-amin Gerüst als potent erwiesen (Verb. 3). Mit dieser Erkenntnis sollten verschiedene 2-Aminothiazolhaltige Pirinixinsäurederivate synthetisiert werden, und ihre Struktur-Wirkungsbeziehung als
duale 5-LO/ mPGES-1 Inhibitoren untersucht werden. Leitstruktur II entstammt einem virtuellen Screening Ansatz, in dem neue acidische mPGES-1 Inhibitoren identifiziert werden sollten. Das Benzensulfonamid Derivat FR4 (Verb. 4) stellt dabei eine neuartige Leitstruktur für mPGES-1 Inhibitoren dar, die nicht nur in der Lage sind die humane mPGES-1 zu hemmen, sondern ebenso die murine mPGES-1. Viele in der Literatur beschriebene mPGES-1 Inhibitoren sind zwar in der Lage, die humane mPGES-1 sehr potent zu inhibieren, haben allerdings keinen Effekt gezeigt in ersten präklinischen Versuchen, weil der Spezies Unterschied zwischen der murinen und humanen mPGES-1 zu groß ist. Dementsprechend liefern die Benzensulfonamide einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuartiger mPGES-1 Inhibitoren, um die Hürde der präklinischen Entwicklung zu überwinden.
Epicutanoeus immunotherapy as a novel prophylactic and therapeutic strategy for birch pollen allergy
(2014)
The development of a convenient, effective and safe allergen-specific immunotherapy (SIT) for birch pollen allergy, one of the most prevalent allergic diseases in Northern Europe, North America and Northern Japan, is of crucial importance. Epicutaneous immunotherapy (EPIT) has gained attention as a safe and non-invasive alternative for subcutaneous immunotherapy, a conventional SIT. However, clinical studies showed a limited effcacy of EPIT, indicating the necessity of improvement of the treatment regime. In this study, we hypothesized that a combination of a hypoallergen with an appropriate adjuvant could be a strategy to improve EPIT. To verify this hypothesis, we aimed at investigating the efficacy of epicutaneous treatment with rBet v 1, the major birch pollen allergen, plus Toll-like receptor (TLR) agonists for prophylaxis and therapy of birch pollen allergy using a murine model of birch pollen-induced allergic asthma. Furthermore, the efficacy of rBet v 1B2, a hypoallergenic variant of Bet v 1, as a therapeutic allergen in EPI was pre-clinically investigated. TLRs recognize conserved microbial molecules (like PAMPs), and are known to promote the counter-regulation of TH2 responses by the induction of TH1-type and/or regulatory cytokines by immune cells. The hypoallergen Bet v 1B2 is a folding-variant of the wild-type allergen rBet v 1 with reduced allergenicity, but retained T-cell immunogenicity. The low allergenicity, could allow the application of hypoallergens in higher doses, and therefore provide a safer and more effective treatment to regulate T-cell immune responses. First, the expression and purification of recombinant Bet v 1 and Bet v 1B2 was optimized. Compared to natural proteins, recombinant proteins offer the possibility to use well-defined molecules with a consistent pharmaceutical quality. Using optimal Escherichia coli expression strains in combination with immobilized metal chelate affinity chromatography (IMAC) and size exclusion chromatography (SEC), we successfully prepared a large amount of rBet v 1 and rBet v 1B2 with a high purity. The allergenic potency of rBet v 1 and the hypoallergenic characteristics of rBet v 1B2 were confirmed by measurement of IgE reactivity and mediator release capacity using ELISA and basophil activation tests, respectively. In a second part, a murine model of birch pollen-induced allergic asthma was established. It was shown that intraperetoneal sensitization with an optimal dose of rBet v 1 and intranasal challenge with birch pollen extract induced elevated IgE levels, airway eosinophilia and pulmonary inflammation in BALB/c mice. The clinical features are comparable to those in patients with allergic asthma, indicating that sensitized and challenged mice could be used for a pre-clinical study to assess the efficacy of the treatment for birch pollen allergy. Next, we investigated the adjuvant effects of Polyadenylic:polyuridylic acid (Poly(A:U)), a TLR3 agonist, and R848 (resiquimod), a TLR7 agonist, in prophylactic EPI with rBet v 1 to intervene with birch pollen allergy. Here, we hypothesized that TLR3 and TLR7 could be possible target receptors to induce adjuvant effects in EPI, since these receptors are expressed in Langerhans cells and dermal dendritic cells, persistent antigen presenting cells in the cutaneous tissues. BALB/c mice received EPI with rBet v 1 alone, or plus Poly(A:U), or R848 on their depilated back using patches. Mice treated epicutaneously were then sensitized with rBet v 1 plus ALUM and intranasally challenged with birch pollen extract. We found that prophylactic EPI with rBet v 1 plus R848 inhibited the production of Bet v 1-specific IgE antibodies in sensitization, suppressed pulmonary inflammation and airway hyperreactivity upon challenge. In contrast to R848, no adjuvant effect of Poly(A:U) on suppression of asthmatic features was observed. Our results indicated that R848, but not Poly(A:U), could be a potential adjuvant for prophylactic EPI of birch pollen induced allergic asthma. Finally, the therapeutic potency of EPI with rBet v 1, or rBet v 1B2 alone, or plus R848 was assessed. After sensitization and challenge, mice received therapeutic EPI with rBet v 1 alone, or plus R848, and re-challenge with birch pollen extract. We found that therapeutic treatment with Bet v 1B2 reduced established Bet v 1-specific IgE antibodies, pulmonary inflammation and airway hyperreactivity upon re-challenge. Therapeutic treatment with the recombinant wild-type allergen does not influence these key characteristics of allergic asthma. In contrast to the findings in the prophylactic treatment with rBet v 1 plus R848,no therapeutic benefit was found upon combination with R848. This could be due to the high number of treatment days. Reduction of this number may lead to a beneficial effect. However, these findings indicate that Bet v 1B2 could be a potential therapeutic agent for the treatment of established birch pollen induced allergic asthma. In conclusion, this study demonstrates for the first time that prophylactic EPI with the recombinant form of Bet v 1 in combination with R848 could prevent and suppress asthmatic features in an established birch pollen allergy. Not only therapeutic, but also prophylactic applications of EPI could be of importance to prevent allergic sensitization, considering the high prevalence of allergic diseases. R848 could be a potential adjuvant for enhancing the prophylactic potential of EPI for the treatment of birch pollen allergy. Furthermore, the beneficial use of the hypoallergen Bet v 1B2 in therapeutic EPI was demonstrated by intervention of established asthmatic features. In the future, a combination of hypoallergens alone or together with adjuvants in EPIT could lead to a more convenient and effective therapeutic treatment of established birch pollen induced allergic asthma.
Background: Birch pollen-allergic subjects produce polyclonal cross-reactive IgE antibodies that mediate pollen-associated food allergies. The major allergen Bet v 1 and its homologs in plant foods bind IgE in their native protein conformation. Information on location, number and clinical relevance of IgE epitopes is limited. We addressed the use of an allergen-related protein model to identify amino acids critical for IgE binding of PR-10 allergens.
Method: Norcoclaurine synthase (NCS) from meadow rue is structurally homologous to Bet v 1 but does not bind Bet v 1-reactive IgE. NCS was used as the template for epitope grafting. NCS variants were tested with sera from 70 birch pollen allergic subjects and with monoclonal antibody BV16 reported to compete with IgE binding to Bet v 1.
Results: We generated an NCS variant (Δ29NCSN57/I58E/D60N/V63P/D68K) harboring an IgE epitope of Bet v 1. Bet v 1-type protein folding of the NCS variant was evaluated by 1H-15N-HSQC NMR spectroscopy. BV16 bound the NCS variant and 71% (50/70 sera) of our study population showed significant IgE binding. We observed IgE and BV16 cross-reactivity to the epitope presented by the NCS variant in a subgroup of Bet v 1-related allergens. Moreover BV16 blocked IgE binding to the NCS variant. Antibody cross-reactivity depended on a defined orientation of amino acids within the Bet v 1-type conformation.
Conclusion: Our system allows the evaluation of patient-specific epitope profiles and will facilitate both the identification of clinically relevant epitopes as biomarkers and the monitoring of therapeutic outcomes to improve diagnosis, prognosis, and therapy of allergies caused by PR-10 proteins.
Sphingolipide sind an zahlreichen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im Körper beteiligt. Vor Allem das sowohl auto- als auch paracrinwirkende Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt dabei eine essentielle Rolle. Ein Großteil der S1P-vermittelten / regulatorischen Effekte beruht auf dessen Wechselwirkung mit den fünf G Protein-gekoppelten S1P-Rezeptoren (S1P1-5). S1P nimmt hierüber Einfluss auf das Schicksal der Zellen (Proliferation, Überleben, Migration), die Zellmobilität, die Angiogenese und das Immunsystem. Viele der über die S1P-Rezeptor-vermittelten Effekte sowie deren Rolle und Funktion in einzelnen Geweben oder Organen sind bis heute noch nicht komplett verstanden bzw. erklärbar. Pharmakologische Tools können einen wichtigen Beitrag zur weiteren Erforschung und zum Verständnis des komplexen Sphingolipidnetzwerks leisten. Ausgehend von einer substituierten Diaryl-1,2,4-oxadiazol-Leitstruktur, die in der Literatur als privilegierte Struktur für S1P1-Rezeptoragonisten gilt, und dem selektiven S1P1-Agonisten SEW2871 wurden verschiedene Liganden mit unterschiedlichen chemischen Gruppen synthetisiert. Nach der Etablierung eines Synthesewegs zu etherverknüpften Aminoethan-diphenyl-1,2,4-oxadiazolen wurden diese in die fluoreszierenden Dansyl-, Isoindolin-, Pyridinium-Dye- und Coumarin-gelabelten Derivate überführt. Außerdem wurde eine einfache und optimierte Syntheseroute zu dem kleinen, umgebungsempfindlichen Fluorophor 4-(Dimethyl-amino)phthalimid (4-DMAP) entwickelt, dass entlang eines linearen Synthesewegs in guten Aus-beuten auch mit den Trifluormethyl- und Methyl-substituierten Diphenyloxadiazol-Grundstrukturen zu fluoreszenzmarkierten Derivaten umgesetzt wurde. Neben den fluoreszenzmarkierten Liganden für den S1P1-Rezeptor wurden zudem drei substituierte Phenyloxadiazolaniline zu den entspre-chenden Acrylamiden umgesetzt, die als kovalente Labeling Tools eingesetzt werden können. Durch die Synthese von Trifluormethyl- und Cyano-substituierten 4-DMAP-markierten Diaryloxa-diazolen sowie von Arylpropansäurederivaten wurde die gewählte Leitstruktur auf Grundlage einer ersten Affinitätstestungen verfeinert. Dabei wurde die zuvor entwickelte Synthese-strategie optimiert. Der Aufbau der Arylpropansäuren erfolgte durch eine Heck-Reaktion mit Acroleindiethylacetal. Durch den Wechsel der Synthesestrategie von 1. Heck-Reaktion und 2. Oxadiazolringschluss zur umgekehrten Vorgehensweise konnte eine Reihe von synthetischen Problemen umgangen werden und die Gesamtausbeute gesteigert werden.
Zwei der fluoreszenzmarkierten S1P1-Liganden mit verfeinerter Grundstruktur zeigten eine durch die Bindung an den S1P1-Rezeptor verursachte Internalisierung des Rezeptors, die durch die GFP-Markierung unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurde. Diese Internalisierung lieferte weitere Hinweise, dass die beiden Substanzen eine durch Bindung am S1P1-Rezeptor verursachte, agonistische Wirkung haben. Die weitere pharmakologische Charakterisierung aller synthetisierten, funktionellen Liganden im Bereich der Sphingolipide steht noch aus. Leukotriene (LT) sind wichtige Lipidmediatoren, die durch Oxygenierung von Arachidonsäure entstehen. Sie nehmen eine zentrale Rolle ein in der Entstehung und dem Voranschreiten von Entzündungen, allergischen Reaktionen, Asthma, kardiovaskulären Erkrankungen und auch bei Krebserkrankungen. Das Schlüsselenzym der LT-Biosynthese ist das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO). Zur Behandlung von LT-assoziierten Krankheiten sind bis heute nur zwei Wirkstoffe zugelassen, die in den LT-Stoffwechsel eingreifen: der Cys-LT-Rezeptorantagonist Montelukast (Singulair®) und der eisenchelatisierende 5-LO-Inhibitor Zileuton (Zyflo®, nur in den USA zugelassen). Es besteht daher ein großer Bedarf an neuen, selektiven Liganden. C06 ist einer der am besten charakterisierten Vertreter einer neue Klasse an potenten, direkten und selektiven 5-LO-Inhibitoren: den Aryliden-Aryl-Thiazolonen, die ein großes Potential für die Entwicklung neuer anti-Leukotrien Arzneistoffe aufweisen. In-vivo-Experimente haben jedoch gezeigt, dass C06 und seine Derivaten nicht optimale pharmakologische Profile besitzen und zudem nur in geringem Maße im Wässrigen löslich sind. Durch die Optimierung und Etablierung einer mikrowellenassistierte Drei-Komponenten-one-pot-Synthese sowie einer verwandten zweistufigen Synthese zum Aufbau der Aryliden-Aryl-Thiazolone, konnte die Reaktionszeit verringert werden und daher die Isolierung und Aufreinigung vereinfacht werden. Zur Steigerung der Löslichkeit der Aryliden-Aryl-Thiazolone in wässrigen Systemen und zur weiteren Erforschung der SAR wurde einige Derivate mit polaren Substituenten, unterschiedlichen Wasserstoffbrückenbindungs-Eigenschaften, Morpholinderivate und verschiedene heteroaromatische Aryliden-Aryl-Thiazolone hergestellt, wobei die Heteroarylderivate aufgrund ihrer niedrigeren, berechneten Lipophilie (clogP) und höheren berechneter Löslichkeit (clogS) ausgewählt wurden. Für alle synthetisierten Derivate wurde die Inhibition der 5-LO-Produktbildung unter zellfreien (S100) und unter zellulären Bedingungen (PMNL) bestimmt. Zudem wurden für einige Derivate die experimentellen Löslichkeiten in DMSO und in Puffer grob ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle besser löslichen Derivate einen höheren IC50-Wert im zellbasierten Assay aufweisen bzw. die potentesten Substanzen nicht gut im Wässrigen löslich sind. Zur Charakterisierung der unbekannten, allosterischen Bindestelle der Aryliden-Aryl-Thiazolone wurde eine Reihe von zum kovalenten bzw. zum Photoaffinity-Labeling fähigen Aryliden-Aryl-Thiazolonderivaten synthetisiert. Alle Derivate wiesen gute bis sehr gute 5-LO Affinitäten auf und durch Vorversuche konnte die prinzipielle Eignung zum Photoaffinity-Labeling gezeigt werden. Da sowohl die polaren als auch die heteroarylbasierten Aryliden-Aryl-Thiazolone die bekannte kontinuierliche SAR wiederspiegelten und keine hohe Wasserlöslichkeit bei gleichzeitiger hoher 5-LO-Inhibition erreicht werden konnte, wurden die einzelnen Element des Aryliden-Aryl-Thiazolon-grundgerüstes durch individuelle Synthesen variiert. Diese Kernvariations- und die an der Aryliden-einheit variierten Derivate haben die SAR der Aryliden-Aryl-Thiazolone deutlich erweitert und konnten die für die 5-LO-Aktivität wichtigen Elemente identifizieren. Dadurch ist es gelungen, die 2-Aryl-5-aryl(methyl)thiazol-4-ole als 5-LO-Leitstruktur zu erschließen, die sowohl unter zellfreien Bedingungen (S100) als auch im zellbasierten Assay (PMNL) Aktivitäten im nanomolaren Bereich erreichen. Mit den 2-Aryl-5-arylmethylthiazol-4-olen konnte außerdem die Löslichkeit in DMSO und vor allem im Wässrigen, verglichen zu C06, deutlich erhöht werden. ST-1829 ist ein C06-Analogon, dass die Nachteile im pharmakologischen Profil von C06 eliminiert und zu einem neuen, effektiven Wirkstoff in der anti-Leukotrien Therapie weiter entwickelt werden kann.