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Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur
Bei anhaltenden Schmerzen wird im Rückenmark zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) gebildet, welches zur zentralen Sensibilisierung des nozizeptiven Systems beiträgt. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob zyklisch Nukleotid-gesteuerte Kanäle (CNG-Kanäle) im nozizeptiven System exprimiert werden und Effektoren der cGMP-vermittelten Schmerz-verarbeitung darstellen könnten. Im Rahmen der Untersuchungen wurden insbesondere die CNG-Kanal-Untereinheiten CNGA3 und CNGB1 als potentielle cGMP-‚Targets‘ in der Schmerzverarbeitung identifiziert. Die Expression von CNGA3 wird infolge einer nozizeptiven Stimulation der Hinterpfote der Maus im Rückenmark und in den Spinalganglien hochreguliert. Mittels In situ-Hybridisierung konnte eine neuronale Lokalisation von CNGA3 in inhibitorischen Interneuronen im Hinterhorn des Rückenmarks detektiert werden, wohingegen CNGA3 in den Spinalganglien nicht-neuronal exprimiert wird. Überraschenderweise wiesen Mäuse mit einem CNGA3-Knockout (CNGA3-/--Mäuse) ein gesteigertes nozizeptives Verhalten in Modellen für inflammatorische Schmerzen auf, während ihr Verhalten in Modellen für akute und neuropathische Schmerzen normal ausfiel. Zudem entwickelten CNGA3-/--Mäuse nach intrathekaler Applikation von cGMP-Analoga oder NO-Donoren eine verstärkte Allodynie. Die CNG-Kanal-Untereinheit CNGB1 wird ebenfalls in Rückenmark und Spinalganglien exprimiert. Im Rückenmark wird die CNGB1-Expression infolge eines nozizeptiven Stimulus der Hinterpfote nicht reguliert, während in den Spinalganglien eine Hochregulation stattfindet. Mit immunhistochemischen Färbungen konnte CNGB1 in Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks, aber auch diffus verteilt in Laminae I bis III des Hinterhorns lokalisiert werden. Auch Mäuse mit einem CNGB1-Knockout (CNGB1-/--Mäuse) zeigten ein gesteigertes nozizeptives Verhalten in einem Modell für inflammatorische Schmerzen und entwickelten außerdem eine verstärkte Allodynie nach i.t. Injektion eines cGMP-Analogons. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass CNGA3 und CNGB1 als ‚Targets‘ des cGMP-vermittelten Signalweges im Rückenmark in inhibitorischer Weise zur zentralen Sensibilisierung während inflammatorischer Schmerzen beitragen. Eine spezifische pharmakologische Aktivierung von CNG-Kanälen im Rückenmark könnte potentiell eine neue Möglichkeit sein, inflammatorische Schmerzen zu hemmen.
Suicide genes have been broadly used in gene therapy. They can serve as safety tools for conditional elimination of infused cells or for directed tumor therapy. To date, the Herpes simplex virus thymidine kinase/ ganciclovir (HSVtk/GCV) system is the most prominent and the most widely used suicidegene/prodrug combination. Despite its promising performance, the system displays limitations, which include relatively slow killing kinetics and toxicity of the prodrug GCV. Consequently, several groups have either developed new suicide-gene/prodrug combinations or attempted to improve the established HSVtk/GCV suicide system. The present study also aimed towards optimization of the HSVtk/GCV system. To do so, a novel, codon-optimized point mutant (A168H) of HSVtk was developed. The novel mutant was named TK.007. It was extensively tested for its efficiency in two relevant settings: (1) control of severe graft-versus-host disease (GvHD) after adoptive immunotherapy with Tlymphocytes, and (2) direct elimination of targeted tumor cells. TK.007 was compared to the broadly used wild-type, splice-corrected scHSVtk and to a codon-optimized HSVtk (coHSVtk) not bearing the above point mutation. (1) For experiments related to the adoptive immunotherapy approach, HSVtkvariants were expressed from a γ-retroviral MP71 vector as a fusion construct with the selection and marker gene tCD34. Expression levels for TK.007 in transduced lymphoid and myeloid cell lines were significantly higher at initial transduction and over a 12 week period compared to the commonly used scHSVtk and coHSVtk indicating reduced toxicity of TK.007. Killing kinetics of transduced cell lines (PM1 and K562) and primary human T cells were significantly faster for TK.007 in comparison to scHSVtk and coHSVtk in vitro. In vivo-functionality of TK.007 was assessed in an allogeneic transplantation model. T cells derived from C57BL/6J.Ly5.1 donor mice were transduced with MP71 vectors expressing scHSVtk or TK.007. Transduced cells were selected and transplanted into Balb/c Rag2-/- γ-/- immune-deficient recipient mice. Acute, severe GvHD occurred and was effectively abrogated in all mice transplanted with TK.007- transduced T cells, and in five out of six mice transplanted with scHSVtk-transduced cells. In a slightly modified quantitative allogeneic transplantation mouse model, significantly faster and more efficient in vivo killing was demonstrated for TK.007 as compared to scHSVtk, especially at low doses of GCV. (2) In order to assess TK.007 functionality in cells derived from solid tumors, HSVtk-variants were expressed from lentiviral gene ontology (LeGO) vectors in combination with an eGFP/neo-opt selection cassette. Transduced and selected tumor cell lines that derived from several tissues were eliminated at significantly lower GCV doses and to higher extents when transduced with TK.007 compared to scHSVtk. Moreover, a significantly stronger bystander effect of TK.007 was demonstrated. The superior in vitro efficiency of TK.007 was confirmed in an in vivo subcutaneous xenograft mouse model for glioblastoma in NOD/SCID mice. Mice transplanted with TK.007 transduced cells stayed tumor-free after treatment with different GCV-doses. On the contrary, mice of the scHSVtk group either demonstrated only transiently reduced tumor growth in the low-dose GCV group (10 mg/kg) compared to the control groups or suffered from relatively fast relapses after initial tumor shrinking in the standarddose (50 mg/kg) GCV group. As a result, all mice in the scHSVtk group died from vigorous tumor growth. In summary, in two different applications for suicide gene therapy the present study has demonstrated superior functional performance of the novel suicide gene TK.007 as compared to the broadly used wild-type scHSVtk. Differences became particularly pronounced at low doses of GCV. It can be concluded that the new TK.007-gene represents a promising alternative to the commonly used scHSVtk for gene therapeutic applications.
Over the last years there has been an increasing interest in the involvement of the MVA-pathway and of members of the small GTPases, in the development and progression of AD. Earlier investigations mainly focused on the role of cholesterol in disease pathology. This research was supported by retrospective cohort studies, initially showing beneficial effects of the long-term intake of cholesterol lowering statins, on the incidence of the development of sporadic AD. However, in more recent literature increasing attention has been paid to the isoprenoids, FPP and GGPP, due to their crucial role in the post-translational modifications of members of the superfamily of small GTPases. In AD, these proteins were amongst others shown to be involved in mechanisms affecting APP processing, ROS generation and synaptic plasticity. A major factor impeding the clarification of the role of the MVA-pathway intermediates in these mechanisms was the lack of a sensitive and accurate method to determine FPP and GGPP levels in brain tissue. Hence, a state of the art HPLC-FLD method for the quantification of the isoprenoids FPP and GGPP in brain tissue was successfully developed. After the introduction of a double clean-up step from complex brain matrix samples and the synthesis of an appropriate IS (DNP), the method was fully validated according to the latest FDA guideline for bioanalytical method validation. Furthermore, this method was transferred to a faster and more sensitive, state of the art UHPLC-MS/MS application. Additionally, the method was shown to be applicable for mouse brain tissue and data was generated from an in vivo mouse simvastatin study and for different mouse models. According to the aims of the thesis, the current work describes for the first time absolute isoprenoid concentrations in human frontal cortex white and grey matter. Furthermore, this is the first report of isoprenoid levels in the frontal cortex of human AD brains. Further results were shown from mouse brains originating from different mouse models, including the Thy-1 APP mouse model mimicking AD pathology in terms of Aβ formation or C57Bl/6 mice at different ages. AD prevalence can be clearly correlated with increasing age. Therefore, three different generations of mice were investigated. The study demonstrated constant isoprenoid and cholesterol levels in the first half of their life followed by a significant increase of FPP and GGPP in the second half (between 12 and 24 month of age). Cholesterol levels were also elevated in the aged group, but again the effect was less pronounced than shown for the isoprenoids. These results lead to the tentative conclusion that cerebral isoprenoid levels are elevated during aging and that this accumulation is amplified during AD leading to accelerated neuronal dysfunction. In a different mouse study, using the C57Bl/6 mice, in vivo drug intervention with the HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin revealed strong inhibition of the rate limiting step of the mevalonate/isoprenoid/cholesterol pathway and resulted in the first report of significantly reduced FPP and GGPP levels in brain tissue of statin treated mice. These results open for the first time the possibility to monitor drug effects on cerebral isoprenoid levels and correlate these data with a modulation of APP processing, which was shown by our group in previous studies. Interestingly, apart from the isoprenoid reduction following statin treatment the reduction of brain cholesterol was also significant but to a lesser extent. These findings support the notion that isoprenoid levels are more susceptible to statin treatment than cholesterol levels. Furthermore, this suggests a strong cellular dependence on FPP and GGPP, as the pool seems to be easily depleted, which finally could lead to cell death. The first investigations of farnesylated Ras and geranylgeranylated Rac protein levels by means of immuno-blotting, substantiated the notion of a decreased abundance of prenylated small GTPases under statin influence as a consequence of reduced isoprenoid levels. These findings demonstrate for the first time a correlation of FPP and GGPP levels with the abundance of small GTPases. These findings together with the results from the AD study prove that isoprenoid levels are not strictly subject to the same regulation as cholesterol levels. To further understand the physiological regulation in the cell, in vitro experiments with different inhibitors of the mevalonate/isoprenoid/cholesterol pathway were conducted. These results confirmed the isoprenoid and cholesterol reducing effects of statin treatment as observed in the aforementioned in vivo mouse study. Interestingly, cholesterol synthesis inhibition targeted after FPP as the branch point, led to significantly elevated FPP levels. FTase inhibition led to significantly reduced FPP levels, whereas inhibition of the GGTase I did not show a significant change of either isoprenoid levels.
Wie entsteht Schmerz? Und wie kann man ihn lindern? Um diese Fragen beantworten zu können, untersuchen Forscher eine Gruppe von Schlüsselmolekülen, die Eicosanoide, und ihre Abbauprodukte. Dabei machen sie immer wieder überraschende Entdeckungen: Blockiert man etwa durch Schmerzmittel wie Acetylsalicylsäure gezielt die Entstehung des Abbauprodukts Prostaglandin, schützt dies auch vor Krebs. Verhindert man die Entstehung von Leukotrienen, lassen sich allergische Reaktionen wie Asthma, aber auch Krebs, Osteoporose und Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen.
Over the past two decades the “one drug – one target – one disease” concept became the prevalent paradigm in drug discovery. The main idea of this approach is the identification of a single protein target whose inhibition leads to a successful treatment of the examined disease. The predominant assumption is that highly selective ligands would avoid unwanted side effects caused by binding to secondary non-therapeutic targets. In recent years the results of post-genomic and network biology showed that proteins rarely act in isolated systems but rather as a part of a highly connected network [1]. In addition this connectivity leads to more robust systems that cannot be interfered by the inhibition of a single target of that network and consequently might not lead to the desired therapeutic effect [2]. Furthermore studies prove that robust systems are rather affected by weak inhibitions of several parts than by a complete inhibition of a single selected element of that system [3]. Therefore there is an increasing interest in developing drugs that take effect on multiple targets simultaneously but is concurrently a great challenge for medicinal chemists. There has to be a sufficient activity on each target as well as an adequate pharmacokinetic profile [4]. Early design strategies tried to link the pharmacophors of known inhibitors, however these methods often lead to high molecular weight and low ligand efficacy. We present a new rational approach based on a retrosynthetic combinatorial analysis procedure [5] on approved ligands of multiple targets. These RECAP fragments are used to design a large combinatorial library containing molecules featuring chemical properties of each ligand class. The molecules are further validated by machine learning models, like random forests and self-organizing maps, regarding their activity on the targets of interest.
"Protein Associated with Myc" (PAM) hat aufgrund seiner enormen Größe von 510 kD und der Vielzahl an Proteinbindungsstellen das Potential viele regulatorische und physiologische Prozesse zu regulieren. Mit der Funktion als E3-Ubiquitinligase und davon unabhängigen Proteininteraktionen reguliert es beispielsweise Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, wie auch die Regulation des Pteridin Stoffwechsels und des cAMP-Signalweges. Im Gegensatz zur spinalen Schmerzverarbeitung war eine Beteiligung von PAM an der peripheren Nozizeption bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurden konditionale PAM-Knockout Mäuse generiert und charakterisiert. Zum einen wurde PAM in Vorläuferzellen von Neuronen und Gliazellen und zum anderen in allen nozizeptiven und thermorezeptiven Neuronen der Dorsalganglia und der Ganglia trigeminale deletiert. Der Knockout in Neuronen und Gliazellen führte zu einer pränatalen Letalität und unterstreicht so die Bedeutung von PAM während der Neuronenentwicklung. Mit Hilfe des spezifischen Knockouts in nozizeptiven Neuronen konnte eine Rolle von PAM bei der Regulation der thermischen Hyperalgesie gezeigt werden. Keinen Einfluss hatte die Deletion von PAM auf basale thermische und mechanische Schmerzschwellen, sowie auf Formalin-induzierte akute Schmerzen. Als potentieller Mechanismus wurde der mTOR- und der p38 MAPK-Signalweg untersucht. Dabei konnte eine Vermittlung der S1P-induzierten mTOR-Aktivierung durch PAM nachgewiesen werden und Rheb als eine Komponente dieser Aktivierung ermittelt werden. Der p38 MAPK Signalweg war in Abwesenheit von PAM konstitutiv aktiviert und einige Proteine des Rezeptortraffickings waren verstärkt exprimiert. Als ursächlich für die beobachtete verlängerte Hyperalgesie in PAM-defizienten Mäusen konnte die Unterbindung der Internalisierung des TRPV1-Rezeptors nachgewiesen werden. Dieser Effekt ist spezifisch für TRPV1, da der verwandte Ionenkanal TRPA1 durch die PAM-Deletion nicht beeinträchtigt wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass PAM in peripheren nozizeptiven Neuronen über die p38 MAPK-vermittelte Internalisierung von TRPV1 die Dauer der thermischen Hyperalgesie reguliert.
Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
Survivin wird in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert, während es in normalem Gewebe bis auf einige Ausnahmen kaum detektierbar ist. In den Krebszellen vermittelt Survivin eine erhöhte Resistenz gegenüber der Apoptose-Induktion, was eine Therapie jedoch meist bezweckt. Durch sein differenzielles Expressionsprofil wird Survivin mittlerweile als ein interessanter Angriffspunkt in der Entwicklung einer neuen, zielgerichteten Behandlung von Krebs betrachtet. Aus diesem Grund wurde zu Beginn der vorliegenden Arbeit die Eignung des anti-apoptotischen und Zellzyklus-regulierenden Proteins Survivin als Zielstruktur für eine Krebstherapie im Vergleich zu den veröffentlichten Publikationen verifiziert. Die Analyse der Survivin-Expression in unterschiedlichen Zelllinien ergab, dass sich in Tumorzellen eine charakteristische Überexpression des Survivin-Proteins zeigte im Vergleich zu gesunden, nicht-transformierten Zelllinien. Eine Inhibition der Survivin-Proteinexpression wurde mittels der Methode der RNA-Interferenz erzielt, bei der die Zielzellen mit shRNA-kodierenden Lentiviren infiziert wurden, welche eine gegen die Survivin-mRNA gerichtete Sequenz beinhalteten. Während Survivin-positive Tumorzelllinien und gesunde Endothelzellen eine starke Reduktion in der Lebend-Zellzahl in vitro aufwiesen, waren die Survivin-negativen Kontrollzelllinien von einem Verlust der Survivin-Expression nicht beeinträchtigt. Anschließend erfolgten eine Analyse der Survivin-Abhängigkeit etablierter Tumorzelllinien und die Untersuchung eines Survivin-Verlusts auf die murine Brustdrüsenentwicklung in vivo. Bei einer Inhibition der Survivin-Expression in Krebszellen in einem Transplanationsmodell konnte ein deutlich verzögertes Tumorwachstum beobachtet werden. Dagegen hatte Survivin in der Entwicklung der murinen Brustdrüse keinen Einfluss auf die Rekonstitution des Gewebes und die Proliferation bzw. Differenzierung der Brustepithelzellen. Um einen direkten protein-basierenden Inhibitor des Survivin-Proteins zu entwickeln und das Repertoire an allgemeinen Survivin-Interventionsstrategien zu erweitern, wurde im zweiten Teil der Arbeit mittels des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ein neues Survivin-bindendes Protein isoliert. Nach dem Optimierungsprozess bestehend aus einer Fusion mit einem Trägerprotein zur erleichterten Proteinexpression, der Mutagenese eines Cysteins gegen Serin und der Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne konnte das Protein rekombinant in Bakterien hergestellt und durch Affinitätschromatographie in monomerer Form aufgereinigt werden. Anschließend wurde der Einfluss des artifiziellen, rekombinanten Survivin-inhibierenden Proteins (rSip) auf die Funktionen von Survivin bestimmt. rSip zeigte eine Stabilität von bis zu 14 Stunden im Zellkulturmedium und konnte durch seine C-terminale Proteintransduktionsdomäne in das Zytoplasma der Zielzellen aufgenommen werden. In einer Co-Immunpäzipitation konnte die Bindung von rSip an endogenes Survivin bestätigt werden. In Brustkrebszellen führte rSip in einer Konzentration von 1,5 µM zu einem schnellen Verlust des Survivin-Proteins, was möglicherweise auf eine proteosomale Degradation von Survivin zurückzuführen war. Die Analyse der Konsequenzen einer rSip-Behandlung auf die Funktionen von Survivin in der Apoptose-Inhibition und der Zellzyklus-Progression wurde im letzten Abschnitt der Arbeit durchgeführt. Eine viertägige Inkubation mit 1,5 µM rSip bewirkte eine deutliche Reduktion der Lebend-Zellzahl von bis zu 50% im Falle der Survivin-abhängigen Krebszelllinien. Bei den Survivin-negativen Zelllinien trat dagegen kein veränderter Phänotyp auf. Durch einen TUNEL-Test in Brustkrebszellen konnte gezeigt werden, dass die Ursache für die Abnahme der Zellzahl die Apoptose-Induktion durch rSip ist. In den Zellzyklus-Profilen von rSip-behandelten Krebszellen konnte ebenfalls ein starker Anstieg in der apoptotischen Zell-Population beobachtet werden. Abschließend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit neben der Methode der lentiviralen Applikation von Survivin-spezifischen shRNA-Sequenzen eine neue Möglichkeit der Interferenz mit der Survivin-Funktion in Krebszellen vorgestellt wurde. Die Entwicklung des Survivin-inhibierenden Proteins rSip steht zugegebenermaßen erst am Anfang. Die ersten hier präsentierten Ergebnisse zeigen jedoch klar ein Potential dieses vielversprechenden direkten Survivin-Inhibitors als ergänzende Wirkstoffklasse auf dem Gebiet der therapeutischen Proteine zu den bereits existierenden niedermolekularen Substanzen bzw. antisense-Oligonukleotiden, die auf Ebene der Transkription bzw. der Translation von Survivin wirken.
Die Motivation dieser Arbeit lag in der Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Systems auf Basis von Poly(D,L Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) zum Transport eines antiangiogenen Antikörpers zur spezifischen Anreicherung in malignen Tumoren. Durch das partikuläre System soll eine optimierte Therapie mit erhöhten pharmazeutischen Wirkkonzentrationen am Wirkort bei gleichzeitig reduzierten Nebenwirkungen erreicht werden. In der Literatur wurden schon mehrfach unterschiedliche Herstellungsmethoden sowie diverse Untersuchungen der PLGA-Nanopartikel (NP) beschrieben. Dennoch fehlen bisher von Antikörperbeladenen PLGA-NP zur Tumortherapie systematische Untersuchungen der Herstellung, der Charakterisierung physikochemischer Eigenschaften, der Lagerstabilität und der Wirkung in biologischen Systemen. Diese Untersuchungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt und die Ergebnisse in vier Teilbereiche gegliedert. Im ersten Teilbereich wurde die Herstellung und Charakterisierung der PLGA-NP etabliert. Dabei wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Herstellungsparameter und Formulierungen auf unbeladene und Proteinbeladene PLGA-NP untersucht. Charakterisiert wurden die Nanopartikel anhand der Partikelgröße und Polydispersität, dem Zetapotential und den bildgebenden Verfahren TEM und SEM. Neben der Reproduzierbarkeit der physikochemischen Eigenschaften ist für die Entwicklung nanopartikulärer Systeme die exakte Bestimmung der Einbettungseffizienz hochpotenter Proteine von größter Bedeutung. Da an dieser Stelle keine normierten Methoden zur Verfügung standen, wurden drei Bestimmungsmethoden bewertet und die Einbettungseffizienzen untersucht. Im zweiten Teilbereich wurden die Lyophilisation und die Lagerstabilität der PLGA-NP untersucht. Um die kritischen Faktoren wie Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung bis zur Applikation gewährleisten zu können, wurde die Lyophilisation der entwickelten PLGA-NP anhand unterschiedlicher Kriterien analysiert. Die Stabilität des erhaltenen Lyophilisats wurde durch eine anschließende Lagerstabilitätsstudie bei unterschiedlichen Klimabedingungen bewertet. Die Charakterisierung der Partikelgrößen und Partikelgrößenverteilungen mittels PCS, AUZ und TEM der PLGA-NP in Gegenwart unterschiedlicher Stabilisatoren erfolgte vor und nach der Lyophilisation sowie nach 4, 8 und 13 Wochen Lagerung bei Klimabedingungen von 4°C, 25°C/60rF und 40°C/75rF. Im dritten Teilbereich der Arbeit werden Ergebnisse zum Freisetzungsverhalten der Proteine aus den PLGA-NP dargestellt. Für die kontrollierte Freigabe der Proteine aus den Nanopartikeln spielt der Abbaumechanismus der Partikel und damit des Polymers eine bedeutende Rolle. Das Abbauverhalten der PLGA-NP wurde daher zunächst über die Veränderung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung mittels PCS und AUZ untersucht. Dafür wurden PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen bis zu 100 Tage beobachtet und analysiert. Ein wichtiges Ziel dieser nanopartikulären Systeme ist die Freisetzung des Antikörpers über die gewünschte Zeit, damit eine pharmakologische Wirkung erzielt werden kann. Dafür wurden ebenso PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen in einem geeigneten Freisetzungsmedium mittels verschiedener Freisetzungsmodelle und analytischer Methoden untersucht. Neben unterschiedlichen Proteinen wurde auch der Proteinzustand, das Polymer sowie der Zusatz von Hilfsstoffen variiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die biologische Wirkung der Antikörperbeladenen PLGA-NP in Zellkulturversuchen ermittelt. Die Nanopartikel wurden hier auf ihren antiangiogenen Effekt mittels „Attachment- und Detachment-Assay“ sowie auf zellspezifische Bindung und Zellaufnahme mittels FACS und CLSM untersucht. Des Weiteren wurde ein präklinischer Transwell-Versuch entwickelt, um einen biologischen Nachweis des „sustained release“-Effektes der PLGA-NP zu erbringen. Auf Basis dieser Arbeit und der Erkenntnisse vorangegangener Studien scheint es möglich, gut charakterisierte Antikörper-beladene PLGA-NP zur Tumortherapie mit einer pharmakologischen Wirkung zu etablieren und für weiterführende präklinische Untersuchungen einzusetzen.
Krebszellen zeichnen sich häufig durch Expression von tumorassoziierten Antigenen aus, über die grundsätzlich eine spezifische Erkennung durch das Immunsystem möglich ist. Ansätze zur Immuntherapie von Krebserkrankungen zielen darauf ab, das Potential der körpereigenen Immunabwehr zur Tumorabwehr auszunutzen. Für die Aktivierung von tumorspezifischen T-Zellen ist die Präsentation von Peptidepitopen eines Tumorantigens zusammen mit effizienter Kostimulierung durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs), insbesondere dendritische Zellen (DCs), entscheidend. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2/HER2 neuartige zelluläre Vakzine generiert und ihre Aktivität in der Therapie bestehender ErbB2-exprimierender Tumoren analysiert. ErbB2 ist ein Mitglied der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptorfamilie und wird von vielen humanen Tumoren epithelialen Ursprungs überexprimiert. Als Rezeptortyrosinkinase ist ErbB2 direkt an der Tumorpathogenese beteiligt und stellt eine wichtige Zielstruktur für unterschiedliche immuntherapeutische Ansätze dar. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde ein chimäres Tumorvakzin entwickelt, das über die extrazelluläre Domäne des humanen B7-Liganden CTLA-4 die spezifische Beladung von B7-exprimierenden APCs mit einem immunogenen Abschnitt des humanen ErbB2 (HER2/neu) in vivo ermöglicht. Die Immunisierung von naiven Mäusen mit DNA-Vektoren, die für sekretierte CTLA-4-ErbB2 Fusionspoteine kodieren, induzierte in den vorangegangenen Arbeiten eine protektive Immunität gegen anschließend injizierte ErbB2-exprimierende murine Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2). Allerdings war eine therapeutische Vakzinierung mit den DNA-Vektoren gegenüber bereits bestehenden Tumoren nicht mehr wirksam. Zur Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit des CTLA-4-ErbB2 Tumorvakzins wurde in dieser Doktorarbeit eine alternative Behandlungsstrategie entwickelt, bei der das APC-spezifische Fusionsprotein durch ein zelluläres Vakzin in vivo zur Verfügung gestellt wird. Durch stabile Transfektion der aus BALB/c Mäusen stammenden nicht tumorigenen Mammaepithelzelllinie HC11 mit einem CTLA-4-ErbB2 kodierenden DNA-Konstrukt wurde dazu das klonale zelluläre Vakzin HC11/CTLA-4-ErbB2 abgeleitet und funktionell charakterisiert. Von diesem Zellvakzin wurde anhaltend CTLA-4-ErbB2 Fusionsprotein in das umgebende Milieu sezerniert, das in der Lage war, effizient an B7-exprimierende Zellen zu binden. Die dreimalige Immunisierung mit dem zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin im wöchentlichen Intervall löste im immunkompetenten BALB/c Mausmodell eine ErbB2-spezifische Immunantwort aus. Mit Hilfe des bereits zuvor in den prophylaktischen DNA-Vakzinierungsexperimenten eingesetzten BALB/c Renca-lacZ/ErbB2 Tumortransplantationsmodells wurde zunächst untersucht, ob das zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin einen Einfluss auf das Wachstum von etablierten ErbB2-exprimierenden Tumoren hat. Die Inokulation des Vakzins in die Nähe von subkutan wachsenden Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren führte in BALB/c Mäusen zu einer kompletten Tumorregression in der Mehrzahl der behandelten Tiere. Dabei war der antitumorale Effekt von der starken Induktion ErbB2-spezifischer Antikörper und einer mäßigen ErbB2-spezifischen Aktivität systemischer zytotoxischer T-Zellen begleitet. Durch Vakzinierung und Tumorabstoßung wurde ein Langzeitschutz induziert, der die erneute Abstoßung einer zwei Monate nach dem Primärtumor systemisch applizieren letalen Dosis von Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen bewirkte. Die Vakzinierung mit HC11/CTLA-4-ErbB2 hatte keinen Einfluss auf das Wachstum ErbB2-negativer Tumorzellen. Ebenso führte die Behandlung mit HC11 Zellen, die ein irrelevantes CTLA-4 Fusionsprotein sezernieren, nicht zur Abstoßung von RencalacZ/ ErbB2 Tumoren. Diese Resultate bestätigen die antigenspezifische Wirkung des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins. Für die Evaluierung von ErbB2-spezifischen Immuntherapien stehen eine Reihe transgener Mausmodelle zur Verfügung, welche die Untersuchung des Einflusses einer bestehenden immunologischen Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf die therapeutische Aktivität zulassen. Ein gut etabliertes und häufig verwendetes Tiermodell sind dabei transgene WAP-Her-2 Mäuse, für die der humane ErbB2-Rezeptor ein Selbstantigen darstellt. In dieser Arbeit wurden durch Kreuzung mit BALB/c WAP-Her-2 F1 Mäuse mit einem genetischen CB6F1 Hintergrund erzeugt. Diese Tiere wiesen eine ausgeprägte immunologische Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf und eigneten sich somit für die Analyse der Aktivität des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins in einem physiologisch relevanten Kontext. Eine therapeutische Vakzinierung mit dem ursprünglichen HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin führte in diesen WAP-Her-2 F1 Tieren nicht zu einer Abstoßung von Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren. Zur Erhöhung der Effektivität von HC11/CTLA-4-ErbB2 in der Therapie von ErbB2-positiven Tumoren in immunologisch toleranten Mäusen wurde daher ein ähnliches zelluläres Vakzin generiert, das zusätzlich das immunmodulatorische Zytokin IL-15 sezerniert. Im Gegensatz zu HC11/CTLA-4-ErbB2 war das optimierte zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2/IL-15 Vakzin auch in immuntoleranten WAP-Her-2 F1 Mäusen therapeutisch wirksam und verzögerte signifikant das Wachstum von ErbB2-exprimierenden Tumoren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die andauernde Expression und Sekretion des APC-spezifischen CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteins durch peritumoral injizierte Epithelzellen eine wirksame antigenspezifische Immunantwort und antitumorale Aktivität gegen etablierte Tumoren induzieren kann. Es ist wahrscheinlich, dass sich ähnliche Zellvakzine auch in menschlichen Krebspatienten als wirksam und nützlich erweisen können. Eine weitere Entwicklung dieses Ansatzes hin zu einer klinisch anwendbaren Immuntherapie erscheint daher sinnvoll.
LmrA is a member of the ATP Binding Cassette (ABC) transporter family of membrane proteins and a structural and functional homologue of P-glycoprotein1, 2. ABC-transporters share a common architecture of two transmembrane domains and two nucleotide binding domains. The NBDs are highly conserved in this transporter family whereas the TMDs are highly diverse3. The TMDs recognize the substrate and the NBDs bind and hydrolyze ATP and thus contribute the energy for substrate translocation. ABC transporters as a protein family transport a high number of substrates including peptides, nutrients, ions, bile acids, lipids and other lipophilic compounds. LmrA is a multidrug transporter that recognizes a number of hydrophobic substrates including fluorescent dyes and antibiotics1, 4-6. LmrA is a native protein of the gram-positive bacterium Lactococcus lactis. In this thesis, L. lactis was used as a homologous expression host for the preparation of LmrA for a variety of experiments. Wildtype LmrA as well as a number of cysteine mutants were successfully expressed in L. lactis, purified and subsequently characterized by a variety of biochemical assays (Chapter 4). LmrA can be expressed to very high amounts in L. lactis. The purification and reconstitution were optimized for the requirements of solid-state NMR experiments in this thesis. For the first time, an ABC transporter has been reconstituted in synthetic lipids to a ratio of up to 1:150 (mol/mol). LmrA was shown to be active under magic angle spinning conditions with these reconstitution ratios. By taking advantage of the slower ATP hydrolysis by LmrA ΔK388 (lysine deletion in the Walker A motif), a real-time 31P solid-state NMR ATPase assay was established (Chapter 5). This assay allowed, for the first time, the investigation of all phosphor nuclei during the ATP hydrolysis cycle of a membrane protein simultaneously and in real time7. This assay has been successfully adapted to investigate both ATP hydrolysis and substrate phosphorylation of diacylglycerol kinase (together with S. Wollschlag) and ATP hydrolysis at high temperatures of the thermophilic ABC transporter ABC1 from Thermos thermophilus (together with A. Zutz). In the course of this thesis, the gene for LmrA has been cloned into expression vectors suitable for Escherichia coli and the heterologous expression of LmrA was established (Chapter 4). The functionality of the heterologously expressed protein has been investigated and compared to L. lactis LmrA. In these experiments, LmrA was shown to yield a distinct multidrug resistance phenotype in its E. coli host and to show secondary active multidrug transport in the absence of ATP and presence of a proton gradient [Hellmich et al, in prep] (Chapter 4). Previously, it had been shown that LmrA acts as a seconadary active transporter when the NBDs are truncated8. The overexpression in minimal and defined medium and the purification of LmrA from E. coli have been optimized. Isotope labeling for ssNMR has been established and the first multinuclear ssNMR experiments have been carried out on a functional ABC transporter (Chapter 8). ABC transporters couple two cycles: upon ATP binding, the NBDs dimerize, hydrolyze the ATP, subsequently release Pi and ADP and finally dissociate. During this cycle, conformational changes are relayed to the TMDs which utilize the energy from ATP binding and/or hydrolysis to translocate the respective substrate. The prehydrolysis state can be trapped by beryllium fluoride, whereas the post-hydrolysis state of this cycle can be trapped by vanadate9-12. Trapping protocols for these reagents were successfully established for LmrA in this thesis (Chapter 4). This allowed for the investigation of different catalytic states by both ssNMR and EPR. A general 19F labeling protocol for membrane proteins has been established in the course of this thesis and successfully applied to proteorhodopsin (together with N. Pfleger)13 and LmrA (chapter 6). Single cysteine mutants of LmrA that line out the dimer interface have been labeled with a fluorine label for ssNMR. In the apo state, the 19F labeling indicates highly flexible transmembrane domains, a finding that is supported by 13C ssNMR and EPR measurements. The addition of drugs has a different effect on different positions within the LmrA dimer, therefore indicating that different drugs are recognized at a different position within the protein. For P-glycoprotein and LmrA it has been previously shown by biochemical methods that different drug binding sites co-exist. For a 19F label attached at position 314 (LmrA E314C), the spectra showed two distinct peaks with similar populations. This could hint towards a structural asymmetry within the LmrA dimer that might also be reflected in the alternating ATP hydrolysis at the NBDs. E314 has been specifically implicated with drug transport. Thus, structural asymmetry at this position might be functionally relevant for guiding a substrate through the transporter. Structural asymmetry within a homodimeric ABC transporter has also been shown for BtuCD, the E. coli vitamin B12 importer14. In addition, the conserved glutamates in EmrE, a small multidrug resistance protein, were shown to be asymmetric in the drug bound state15. Both, uniformly 13C/15N labeled as well as selectively amino acid type labeled LmrA has been investigated in different conformational states. Interestingly, significant dynamic changes in the b-sheet regions of LmrA (confined to the NBDs) were observed in the pre-hydrolysis (beryllium fluoride) and transition state (vanadate trapped) state. These were interpreted as the transition from a domain in fast conformational exchange in the apo state to one of intermediate exchange in the nucleotide bound state. A significant change in NBD mobility upon nucleotide binding was previously also shown with 2H ssNMR on LmrA16. By EPR it was shown that LmrA in both the vanadate and BeFx trapped states displays a significantly higher rigidity and therefore defined distances, whereas the apo state resembled a “floppy” protein with no preferred distance distribution. This concurs with data obtained from 19F ssNMR with fluorine labeled single-cysteine mutants. Here, in agreement with the EPR data, a higher label (and possibly) protein mobility was observed in the apo state displaying rather broad line widths. Upon trapping with vanadate, the line widths of the majority of fluorine-labeled mutants decreased due to an enhanced protein rigidity and a more homogenous environment of the fluorine labels. A similar observation was made when increasing the temperature that can be explained due to higher protein flexibility at increased temperatures. Solution NMR was employed to investigate the isolated soluble NBD of LmrA (Chapter 9). First 2D and 3D spectra were successfully obtained and could be utilized for a preliminary assignment of a significant fraction of residues. Additionally, binding of ATP and ADP in absence and presence of magnesium was investigated. Finally, the effects of peptides emulating the coupling helices of the full-length transporter on the soluble NBD were investigated. Strikingly, binding of one of these peptides only occurred in the presence of nucleotides (whereas the other showed no binding at all) hinting towards a tightly coupled regulation of the NBD and TMD during the substrate translocation/ATP hydrolysis cycle based on nucleotide binding.
Dynamische Proteininteraktionen sind die Grundlage biologischer Prozesse, ihr korrekter Ablauf ist essentiell für die intakte Physiologie aller Organismen. Die Aufklärung der Struktur und Funktion von Proteinen inklusive ihrer komplexen Interaktionen, ist entscheidend für das Verständnis biologischer Prozesse. Methoden zur Untersuchung von Protein-Interaktionen sind in der Regel auf die Modifikation von Proteinen angewiesen. Zum Einen ist die selektive Markierung von Proteinen mit spektroskopischen Sonden – insbesondere mit Fluorophoren – ein wichtiger Ansatz zur in vivo und in vitro Interaktionsanalyse. Zum Anderen gewinnen festphasenbasierte Analysemethoden zunehmend an Bedeutung. Multivalente Chelatoren (MCH) bieten vielseitige Möglichkeiten, rekombinante Proteine reversibel an spektroskopische Sonden oder Oberflächen anzubinden und haben dadurch ein enormes Potential für Anwendungen zur funktionalen Charakterisierung von Proteinen. Ziel dieser Arbeit war es, die Energetik und Dynamik der Interaktion von MCH mit Oligohistidinen zu charakterisieren, um diese insbesondere zur Organisation von Proteinen in Mikro- und Nanostrukturen einzusetzen. Die Interaktion der MCH mit Histidin-Tags unterschiedlicher Länge und Sequenz wurde in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Es zeigte sich, dass die zunehmende Länge und die Redundanz auf Seiten des Histidin-Tags in einer erhöhten Affinität resultierten. Das Einführen einzelner Spacer-Aminosäuren resultierte hingegen in einer drastischen Reduktion der Komplexstabilität. Ein Alanin-Scanning zeigte, dass vor allem die zentralen Histidine besonders wichtig für eine stabile Bindung sind. Dieser Effekt lässt sich dadurch erklären, dass es sich bei der MCH-Oligohistidin-Interaktion um einen äußerst dynamischen Prozess handelt, bei dem die Metallkoordinationsstellen mit ständig wechselnden Histidinen interagieren. Diese Permutation erhöht die Entropie des Komplexes, und ist somit Grund für die erhöhte Affinität mit steigender Redundanz des Histidin-Tags. Anhand von Chelator-Dichte-Arrays konnte gezeigt werden, dass die Stabilität der Bindung von Histidin-getagten Proteinen nicht nur mit der Multivalenz der Chelatoren, sondern auch mit der MCH-Dichte ansteigt. In Kompetitionsexperimenten mit Hexa- und Dekahistidinen auf den MCH-Dichte-Arrays wurden veränderte Stabilitäten beobachtet. Die Stabilität von H6 ver5. veringert sich in Anwesenheit von H10, wobei sich die scheinbare Affinität von H10 in Anwesenheit von H6 erhöht. Dies wird auf die gleichzeitige Interaktion mit verschiedenen MCH-Molekülen auf der Oberfläche, die Oberflächenmultivalenz, zurückgeführt. Um diesen Effekt anhand von MCHMolekülen mit definiertem Abstand zu untersuchen, wurde ein Tris-NTABiotin-Konjugat (BTTris-NTA) hergestellt und auf Streptavidin-Oberflächen bzw. fluoreszenzmarkiertem Streptavidin eingesetzt. Echtzeit TIRFS-RIf-Kompetitionsexperimente zeigten eine veränderte Bindungskinetik für H6 in Anwesenheit von H10, welche darauf zurückzuführen ist, dass H6 aktiv durch H10 verdrängt wird. Dieser Effekt ist offenbar auf die dynamische Interaktion des Oligohistidins mit multiplen Chelatoren auf der Oberfläche zurückzuführen, welche den aktiven Austausch von H6 gegen H10 ermöglicht. Sowohl auf Oberflächen als auch in Lösung wurden für die Interaktion von Streptavidin-gebundenem BTTris-NTA mit Oligohistidinen um Faktor 3-5 erhöhte Affinitäten, im Vergleich zu freiem Tris-NTA, festgestellt. Interaktionsanalysen in Lösung zeigten maximale Komplex-Stöchiometrien von 1:2 für die Interaktion von Streptavidin-BTTris-NTA mit Oligohistidinen. Diese Stöchiometrien sowie die erhöhte Affinität lassen sich durch die gleichzeitige Interaktion von zwei benachbarten an Streptavidin gebundenen BTTris-NTA-Molekülen mit einem Oligohistidin erklären. Die räumliche Nähe der Tris-NTA-Moleküle erhöht die Redundanz auf Seiten des Chelators, was sich wiederum positiv auf die Entropie auswirkt und damit zu einer erhöhten Affinität führt. Diese Ergebnisse bestätigen den postulierten Effekt der Oberflächenmultivalenz. Es wurde gezeigt, dass BTTris-NTA die reversible Biotinylierung Histidingetagter Proteine ermöglicht, und damit eine Brücke zwischen den zwei am meisten eingesetzten Werkzeugen der Biochemie, dem Histidin-Tag und dem Biotin-(Strept)Avidin-System, schlägt. BTTris-NTA findet in verschiedenen Bereichen Anwendung: zur Umwandlung kommerzieller (Strept)Avidin-Oberflächen in Tris-NTA-Oberflächen, in Phage-Display-Screenings und Western Blot Analysen sowie zur Markierung von Rezeptoren auf Zelloberflächen. Die Biotinylierung über BTTris-NTA ermöglicht es zudem, auch Proteine geringer Konzentrationen (<10 nM) effizient auf Streptavidinoberflächen zu immobilisieren. Diese Selbstassemblierung Histidin-getagter Proteine wurde zur Organisation von Proteinen auf Oberflächen in Mikro- bis Nanometer-Dimensionen genutzt.
Kollagen des marinen Schwammes Chondrosia reniformis Nardo: Optimierte großtechnische Herstellung, Analytik und neue pharmazeutisch-technologische Anwendungsmöglichkeiten Großtechnische Isolierung und Untersuchung von Chondrosia-Kollagen Schwämme spielen eine wichtige Rolle im Ökosystem des Meeres und ihr Vorkommen ist begrenzt. Zur schonenden und nachhaltigen Nutzung als Rohstoffquelle müssen im Hinblick auf eine industrielle Nutzung alternative Wege zur Gewinnung von marinem Schwammkollagen entwickelt werden. Ein Beispiel hierfür sind die sogenannten „Marikulturen“ direkt im Meer, aus denen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Schwämme stammten. Im Gegensatz zu den früher eingesetzten Methoden zur Isolierung des Chondrosia-Kollagens, die Laborcharakter trugen, konnte in der vorliegenden Dissertationsarbeit ein stark vereinfachtes, für die großtechnische Produktion geeignetes Verfahren mit einer hohen Ausbeute (ca. 35%) beschrieben werden. Das Schwammausgangsmaterial wurde über ca. 4 Tage mit Hilfe von Natriumsulfit reduktiv behandelt und die Kollagenfasern (nach einem Filtrationsschritt) in saurem Medium gewonnen. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen des isolierten Materials zeigten die kollagentypische Fibrillenquerstreifung, die Unlöslichkeit der Faserbündel in saurem Milieu sowie deren Abbau in die einzelnen Fibrillen in neutraler Pufferlösung. Die von tierischen Kollagenen abgeleitete Bestimmung des Proteingehaltes ergab einen im Vergleich zum kalkulierten Kollagenanteil höheren Gesamtproteingehalt. Dies ist ein Hinweis auf mögliche nichtkollagene Proteinanteile, die an Kollagen assoziiert vorliegen können. Untersuchungen zur Aminosäurenzusammensetzung des isolierten Materials ergaben im Vergleich zu den von Swatschek et al. (2002a) publizierten Ergebnissen einen deutlich höheren Glycin- und einen mehr als doppelt so hohen Hydroxyprolingehalt. Dies kann dahingehend gedeutet werden, dass die neue Isolierungsmethode die bekannten Verunreinigungen des Kollagens mit Glykoproteinen reduziert und zu einem deutlich reineren Kollagenmaterial führt. Mit Hilfe einer neu entwickelten Methode konnten erstmalig Partikel aus Chondrosia-Kollagen hergestellt werden, deren Größe im Nanometerbereich lag. Hierbei handelte es sich um eine kontrollierte alkalische Hydrolyse des isolierten, gefriergetrockneten Kollagens in 1,5 M NaOH. Es konnte eine Partikelausbeute in Höhe von ca. 10% erzielt werden. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten gleichförmige, sphärische Partikel. Die Partikelgrößenuntersuchungen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (nach Resuspension der gefriergetrockneten Schwammkollagennanopartikel (SKNP)) ergaben eine Größe von 168 ± 9,1 nm. Somit sind diese Partikel im Gegensatz zu den bisher aus Chondrosia-Kollagen gewonnenen Mikropartikeln auch für intravenöse Anwendungen geeignet und haben eine größere Trägerkapazität. Die hergestellten Nanopartikel wurden adsorptiv mit dem Wirkstoff 17?-Estradiol-Hemihydrat beladen. In Abhängigkeit von der eingesetzten Stoffkonzentration (1,25 bis 5,0 mg/ml) konnten Beladungsraten von bis zu 13,1% erzielt werden. Die Stabilitätsprüfung von wässrigen Partikelsuspensionen ergab nach 180 Tagen Einlagerung eine auf 7 bis 8% reduzierte Beladungsrate. Nach Inkorporation der beladenen Partikel in eine Hydrogelgrundlage wurde die transdermale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs im Rahmen der Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen untersucht. SKNP-Gele mit einer Estradiolkonzentration in Höhe von 0,06% wurden mit gleichkonzentrierten partikelfreien Gelen verglichen. In den Speichelproben der Patientinnen konnten nach täglicher einmaliger Applikation des Nanopartikelgels nach 28 Tagen signifikant höhere Estradiolkonzentrationen gemessen werden. Die ermittelten Flächen unter den Konzentrations-Zeit-Kurven (AUC) über 24 h nach der einmaligen topischen Applikation von 0,75 mg Estradiol waren um das 2,3 bis 3,4-fache höher als die entsprechenden AUC-Werte des Vergleichsgels. 24 h nach Auftragen des Gels lagen die Estradiolspiegel des Vergleichsgels in etwa wieder auf Höhe der Basalwerte, wohingegen die Estradiolwerte nach Applikation des SKNP-Gels zum gleichen Messzeitpunkt mindestens doppelt so hoch waren. Somit konnten bei Anwendung der SKNP-Zubereitung eine deutlich erhöhte transdermale Estradiolabsorption und eine verlängerte Arzneistoffwirkung beobachtet werden. Das nanopartikuläre Trägersystem aus Chondrosia-Kollagen stellt damit eine vielversprechende Möglichkeit zur Erhöhung der transdermalen Bioverfügbarkeit von lipophilen, schlecht resorbierbaren Wirkstoffen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Formulierung für einen magensaftresistenten Überzug mit Chondrosia-Kollagen als Filmbildner entwickelt. Die Sprühsuspension bestand aus 15% gefriergetrocknetem Kollagen, dem Weichmacher Triethylcitrat (1,5%), dem Trennmittel Talkum (7,5%) und Wasser. Der Coating-Prozess wurde in einem Dragierkessel mit Placebotabletten durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurden Tabletten-Stichproben entnommen, um die erforderliche Kollagenschichtdicke für eine Magensaftresistenz zu bestimmen. Tabletten mit einer Kollagenauftragsmenge von 12,9 mg/cm2 entsprachen der Prüfung auf Magensaftresistenz gemäß Europäischem Arzneibuch. Die Widerstandsdauer in 0,1 M Salzsäure betrug mehr als 2 h und der Zerfall in Phosphatpufferlösung pH 6,8 höchstens 10 min. Rasterelektronenmikrosko-pische Aufnahmen bei unterschiedlichen Vergrößerungen zeigten eine gleichmäßige und glatte beschichtete Oberfläche. Das Auftragsverfahren im Dragierkessel erwies sich als reproduzierbar. Die mechanischen Eigenschaften der überzogenen Tabletten waren zufriedenstellend und die Magensaftresistenz wurde durch eine 6-monatige Lagerung nicht beeinträchtigt. Als Naturprodukt eignet sich Schwammkollagen als Überzugsmaterial für Nichtarzneimittel. Der schnelle Zerfall des Kollagenüberzugs in neutraler Pufferlösung stellt einen Vorteil gegenüber den häufig verwendeten Schellacküberzügen dar, die sich im Darmtrakt zu langsam auflösen und daher nicht selten mit synthetischen Polymeren kombiniert werden.
Top-down and bottom-up approaches are the general methods used to analyse proteomic samples today, however, the bottom-up approach has been dominant in the last decade. Establishing a bottom-up method involves not only the choice of adequate instruments and the optimisation of the experimental parameters, but also choosing the right experimental conditions and sample preparation steps. LC-ESI MS/MS has widely been used in this field due to its advanced automation. The primary objective of the present study was to establish a sensitive high-throughput nLC-MALDI MS/MS method for the identification and characterisation of proteins in biological samples. The method establishment included optimisation and validation of parameters such as the capillaries in the HPLC systems, gradient slopes, column temperature, spotting frequencies or the MS and MS/MS acquisition methods. The optimisation was performed using two HPLC-systems (Agilent 1100 series and Proxeon Easy nLC system), three spotters and the 4800 MALDI-TOF/TOF analyzer. Furthermore, samples preparation protocols were modified to fit to the established nLCMALDI- TOF/TOF-platform. The potentials of this method was demonstrated by the successful analysis of complex protein samples isolated from lipid particles, pre-adipocytes/adipocytes tissues, membrane proteins and proteins pulled-down from protein-proteins interaction studies. Despite the small amount of proteins in the lipid particles or oil bodies, and the challenges encountered in studying such proteins, 41(6 novel + 14 mammal specific + 21 visceral specific) proteins were added to the already existing proteins of the secretome of human subcutaneous (pre)adipocytes and 6 novel proteins localised in the yeast lipid particles. Protein-protein interaction studies present another area of application. Here the analytical challenges are mostly due to the loss of binding partner upon sample clean-up and to differentiate from non-specific background. Novel interaction partners for AF4•MLL and AF4 protein complex were identified. Furthermore, a novel sample protocol for the analysis of membrane proteins, based on the less specific protease, elastase, was established. Compared to trypsin, a higher sequence coverage and higher coverage of the transmembrane domains were achieved. The use of this enzyme in proteomics has been limited because of its non specific cleavage. However, from the results obtained in these studies, elastase was found to cleave preferentially at the C-terminal site of the amino acids AVLIST. The advantage of the established protocol over conventional protocols is that the same enzyme can be used for shaving of the soluble dormains of intact proteins in membranes and the digestion of the hydrophobic domain after solubilisation. Furthermore, the solvents used are compatible with the nLC-MALDI method setup. In addition, it was also shown that for less specific enzymes, a higher mass accuracy is required to reduce the rate of false positive identifications, since current search engines are not perfectly adapted for these types of enzymes. A brief statistical analysis of the MS/MS data obtained from the LC-MALDI TOF/TOF system showed that for less specific enzymes, under high-energy collision conditions, approximately 43 % of the fragment ions could not be matched to the known y- b type ions and their resultant internal fragments. This limitation greatly influenced the search results. However, this limitation can be overcome by modifying the N-terminal amino acids with basic moieties such as TMT. The use of elastase as a digestion enzyme in proteomic workflow further increased the complexity of the sample. Therefore, orthogonal multidimensional separation was necessary. Offgel-IEF was used as the separation technique for the first dimension. Here peptides are separated according to the pI. However, the acquired samples could not be loaded to the nLC due to the high viscosity of the concentrated samples when using the standard protocol. In order to achieve compatibility of the Offgel-IEF to the nLC-MALDI-TOF/TOF-platform, the separation protocol of the Offgel-IEF was modified by omitting the glycerol, which was the cause of the viscous solution. The novel glycerol free protocol is advantageous over the conventional method because the samples could directly be picked-up and loaded onto the pre-column without resulting in an increase in back pressure or a subsequent pre-column clogging. The glycerol free protocol was then assessed using purple membrane and membrane fraction of C. glutamicum. The results obtained were comparable to those applied in published reports. Therefore, the absence of glycerol did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In addition the applicability of elastase and the glycerol free Offgel-IEF for quantitation of membrane proteins was assessed. Most of the unique peptides identified were in the acidic region and 85 % were focused only into one fraction and approximately 95 % in only two fractions. These results are in accordance with previously published results (Lengqvist et al., 2007). When compared with theoretical digests of the proteins identified in this study, it can be concluded that basic moiety (TMT) on the peptide backbone, did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In an applied study, changes in the protein content of yeast strain grown in two different media were relatively quantified. For example, prominent proteins, such as the hexose tranporter proteins responsible for transporting glucose accross the membrane, were successfully quantified. Last but not least, the nLC-MALDI-TOF/TOF platform also served as a basis for the development of a high-throughput method for the identification of protein phosphorylation. The establishment of such a method using MALDI has been challenging due to the lack of sensitive matrices, such as CHCA for non-modified peptides, which exhibit a homogenous crystallisation and thus yield stable signal intensity over a long period of time in an automated setup. The first step of this method was the establishment of a matrix/matrix mixture with better crystal morphology and higher analyte signal intensity than the matrix of choice, i.e. DHB. From MS and MS/MS measurements of standard phosphopeptides, a combination of FCCA and CHAC in a 3:1 ratio and 3 mM NH4H2PO4 facilitated high analyte signal intensities and good fragmentation behaviour. Combining a custom-packed biphasic column for the enrichment of phosphopeptides, the applicability of the matrix mixture was assessed in anautomated phosphopeptide analysis using standard phosphopeptides spiked to a 20-fold excess BSA digest. These analyses showed that this method is reproducibile and both flow throughs can be analysed. Applying the method to the analysis of 2 standard phosphoproteins, alpha/beta-casein, and a leukemia related protein, ENL, 13 phosphopeptides from both alpha/beta-Casein and 13 phosphopeptides with 6 phosphorylation sites from the ENL were identified. As a general conclusion, it can be stated that the nLC-MALDI-TOF/TOF method established here in various modifications for different analytical purposes is a robust platform for proteomic analyses.
Etablierung eines universellen Testsystems zur funktionellen Analyse neuer MLL-Fusionspartner
(2010)
Leukämische Erkrankungen entstehen häufig aufgrund genetischer Aberrationen. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen um reziproke chromosomale Transloka-tionen, die an der Entstehung chimärer Fusionsgene mit intaktem Leserahmen betei-ligt sind und letztendlich zur Expression neuartiger Fusionsproteine führen. Das auf Chromosom 11 Bande q23 lokalisierte MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) spielt bei einigen dieser chromosomalen Aberrationen eine wichtige Rolle. Es entstehen Fusi-onsproteine, die phänotypisch sowohl mit akuten myeloischen Leukämien (AML) als auch mit akuten lymphatischen Leukämien (ALL) assoziiert sind. Diese hämatopoie-tischen Erkrankungen werden aufgrund ihrer ungünstigen Prognose und schlechter Heilungschance als Hochrisiko-Leukämien klassifiziert. Neben Translokationen des MLL-Gens sind für die Leukämogenese noch weitere genetische Aberrationen von Bedeutung. Ebenso spielen, allerdings in geringerem Maße, Deletionen, Inversionen sowie Insertionen eine Rolle. Allen chromosomalen Translokationen sowie den übrigen chromosomalen Veränderungen geht mindestens ein DNA-Doppelstrangbruch voraus. Dieser findet sowohl beim MLL als auch beim Partnergen in sogenannten Bruchpunktsregionen statt. Inzwischen sind 104 verschiedene Veränderungen des MLL-Gens bekannt, von de-nen 64 auf molekularer Ebene charakterisiert wurden. Allein über 20 Partnergene wurden in den letzten fünf Jahren im Diagnostikzentrum DCAL (Diagnostic Center of Acute Leukemia) des Universitätsklinikums Frankfurt identifiziert. Allerdings sind bis heute noch keine universellen Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells zur Unter-suchung neuer Partnergene bekannt. Somit ist es von großem Interesse möglichst schnell und zuverlässig dieses Ziel zu erreichen, um weitere Informationen über das onkogene Potential der beteiligten MLL-Partner zu erhalten. Als neue Kandidaten wurden im Rahmen dieser Arbeit DCPS, MAML2 sowie NRIP3 untersucht, die auf die Positivkontrolle ENL und auf die Negativkontrolle LASP1 bezogen wurden. Zunächst wurde ein universelles retrovirales Vektorsystem entwickelt, welches den MLL-N-Terminus (Exon 1 - Exon 9) trägt. Das zu untersuchende Partnergen kann durch Einklonieren der entsprechenden DNA-Sequenz in diesen Vektor eingefügt werden. Um ein authentisches Fusionsprodukt mit durchgehendem Leserahmen zu erhalten, sind die beiden Gene durch eine intronische Sequenz voneinander separiert. Die korrekte Fusion konnte auf Transkriptebene via RT-PCR nachgewiesen werden. In Vorversuchen wurden die Konstrukte MLL•DCPS, MLL•ENL (Positivkontrolle), MLL•LASP1 (Negativkontrolle), MLL•MAML2 sowie MLL•NRIP3 in murine hämato-poietische Progenitorzellen (Ba/F3 und 32D) transduziert. Die erfolgreiche Infektion konnte sowohl fluoreszenzmikroskopisch als auch auf Transkriptebene nachgewie-sen werden. Des Weiteren zeigten die Konstrukte unterschiedliche Einflüsse auf die Hox-Genexpression der Hox-Gene a5, a7, a9, a10, b3 und b4. Zur Untersuchung wachstumstransformierender und proliferierender Eigenschaften der Fusionsproteine folgten nach Abschluss der Vorversuche erste Transduktionsex-perimente mit murinen Lin-/Sca1+-hämatopoietischen Zellen. Mittels eines Methylcel-lulose-Assays sollten die transformierenden Eigenschaften der MLL-Fusionen über-prüft werden. Lediglich die Positivkontrolle wies wachstumstransformierende Eigen-schaften auf. Somit legen die bisherigen Ergebnisse die Vermutung nahe, dass noch weitere Faktoren für die Leukämogenese relevant sein müssen. Um Aussagen über das Verhalten der zu untersuchenden MLL-Fusionen in vivo tref-fen zu können, wurden retroviral infizierte, Lin-/Sca1+-aufgereinigte hämatopoietische Stammzellen in Empfängermäuse transplantiert. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnten bei den Mäusen noch keinerlei Symptome einer leukämischen Erkrankung diagnosti-ziert werden. Es ist abzuwarten, ob die transplantierten Mäuse in den nächsten Wo-chen leukämische Verhaltensauffälligkeiten aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erfolgreich ein Testsystem etabliert werden, das es ermöglicht, neue Partnergene in kürzester Zeit funktionell zu analysieren. So können in Zukunft hoffentlich neue Erkenntnisse zur Leukämogenese gewonnen werden, die eventuell neue Therapieansätze ermöglichen.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
Mit der Identifizierung des Histamin-H3-Rezeptorsubtyps im Jahr 1983 begann eine umfangreiche Erforschung seiner Bedeutung und die Suche nach spezifischen Liganden. Die genaue Sequenzaufklärung und Klonierung des humanen Histamin-H3-Rezeptors (hH3R) erst 16 Jahre später ermöglichte eine detaillierte Aufklärung molekularer Vorgänge, deren Auswirkungen auf physiologische und pathophysiologische Prozesse sowie die Entwicklung selektiver hH3R-Liganden. Es zeigte sich, dass der Rezeptor nicht nur die zentrale und periphere Histaminkonzentration im Körper reguliert, sondern auch die Ausschüttung weiterer Neurotransmitter moduliert und damit Einfluss auf zahlreiche neurologische Prozesse nimmt. Diese Erkenntnis macht ihn zu einer wichtigen Zielstruktur bei der Erforschung neuer Therapieansätze verschiedener Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Demenz, Schizophrenie, Narkolepsie, Epilepsie, Adipositas oder neuropatischer Schmerz. Obwohl bereits mehrere Liganden bekannt sind, die diesen Rezeptor adressieren, stellt die Entdeckung alternativer Leitstrukturen und neuer Strukturklassen ein wichtiges Ziel für die Entwicklung potentieller Wirkstoffe dar. Auch das Defizit an bildgebenden Liganden und deren stetig wachsende Nachfrage für eine effiziente Wirkstoffentwicklung und eine detaillierte Rezeptoraufklärung machen den Bedarf an neuen hochselektiven hH3R-Liganden deutlich. Ausgehend von der im eigenen Arbeitskreis etablierten antagonistisch/invers agonistisch selektiv wirkenden 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-hH3R-Leitstruktur wurden zunächst rechtsseitige Strukturerweiterungen in para-Position des zentralen Phenylringes durchgeführt (Abb. 4.1). Hauptbestandteile dieser Substituenten waren basische Strukturelemente oder Heterozyklen mit starker Wasserstoffbrücken-Akzeptorfunktion...
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des HIV-Protease-Inhibitors Saquinavir und seines Derivates Saquinavir-NO auf die ABC-Transporter vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Saquinavir-NO zeigte in drei verschiedenen Tumorentitäten stärkere zytotoxische Wirkung als Saquinavir. Weder die Expression der ABC-Transporter MDR1 oder BCRP1 noch der zelluläre p53-Status hatten einen Einfluss auf die Zellsensitivität. MDR1-exprimierende chemoresistente Tumorzellen wurden durch Saquinavir-NO stärker gegen ausgewählte Zytostatika resensitiviert als durch Saquinavir. An chemosensitiven MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Des Weiteren wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensiti-vität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Saquinavir-NO stärker erhöht als durch Saquinavir. Am Durchflusszytometer wurde der Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf die intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123 untersucht. In MDR1-exprimierenden Zelllinien führte Saquinavir-NO zu einer deutlich stärkeren Akkumulation von Rhodamin 123 als Saquinavir. In MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Mit Hilfe des MDR1-ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Saquinavir und Saquinavir-NO als Substrate oder als allosterische Inhibitoren für MDR1 fungieren. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass sowohl Saquinavir als auch Saquinavir-NO jeweils ein Substrat für MDR1 darstellen. Um den Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf den ABC-Transporter BCRP1 zu untersuchen, wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für BCRP1 transduziert. Die BCRP1-transduzierten Zellen wurden durch Saquinavir und Saquinavir-NO in vergleichbarem Ausmaß zu dem BCRP1-Substrat Mitoxantron sensibilisiert. Saquinavir-NO ist somit im Vergleich zu Saquinavir der deutlich potentere MDR1-Inhibitor, während beide Substanzen gleichermaßen BCRP1 beeinflussten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des MDM2-Inhibitors Nutlin-3 auf die ABC-Transporter-vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Nutlin-3 zeigte aufgrund seiner Funktion als MDM2-Inhibitor an Zellen mit Wildtyp-p53 stark zytotoxische Effekte. An Zellen mit einer p53-Mutation oder an Zellen, die p53-negativ sind, waren diese Effekte nicht zu beobachten. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte in p53-Wildtypzellen zur Induktion diverser p53-Zielgene (p21, MDM2, GADD). In Zellen mit mutiertem p53 blieb diese Induktion nach Nutlin-3-Behandlung aus. Chemoresistente MDR1-exprimierende Tumorzellen wurden durch Nutlin-3 stark gegen ausgesuchte Zytostatika resensitiviert. Des Weiteren wurde die chemosensitive, p53-mutierte (Nutlin-3-insensitive) und MDR1-negative Rhabdomyosarkomzelllinie RH30 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensitivität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Nutlin-3 stark erhöht. Am Durchflusszytomter zeigte sich in MDR1-exprimierenden Zellen durch Behandlung mit Nutlin-3 eine signifikant erhöhte intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123. In MDR1-negativen Zellen wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Mit Hilfe des ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Nutlin-3 als Substrat oder als allosterischer Inhibitor für MDR1 fungiert. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass Nutlin-3 ein Substrat für MDR1 darstellt. Nutlin-3 ist ein Racemat und wurde in allen Versuchen als solches verwendet. Das Enantiomer Nutlin-3a hemmt die MDM2-p53-Interaktion als aktives Enantiomer ca. 150-fach stärker als Nutlin-3b. Im letzten Schritt der vorliegenden Arbeit wurde Nutlin-3 in seine Enantiomere Nutlin-3a und Nutlin-3b aufgetrennt und beide Enantiomere wurden im Hinblick auf ihre Wirkung auf MDR1 untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Enantiomeren festgestellt. Nutlin-3a und Nutlin-3b interferieren demnach zu gleichen Teilen mit MDR1. Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den ABC-Transporter MRP1 zu untersuchen, wurde mit zwei verschiedenen Zellmodellen gearbeitet. In beiden Zellmodellen zeigte sich, dass Nutlin-3 auch den MRP1-vermittelten Efflux der fluoreszierenden Substrate Rhodamin 123 und Calcein-AM inhibiert. Der Befund, dass Nutlin-3 mit der MDR1- und MRP1 vermittelten Chemoresistenz interferiert, ist neu und eine wichtige Information für die Bewertung der beginnenden klinischen Studien zur Untersuchung von Nutlin-3 als antitumorale Substanz.