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Ziel der Arbeit war es, das biotechnologische Potenzial des zellulären Schleimpilzes D. discoideum in Bezug auf die Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren im allgemeinen und von Muskarin-Rezeptoren im besonderen zu untersuchen. Langfristiges Ziel war dabei, mit Hilfe von Dictyostelium discoideum ein leicht zugängliches und kostengünstiges Screeningsystem zur Testung potenzieller muskarinerger Liganden zu entwickeln. Im Rahmen der Arbeit wurden alle humanen Muskarin-Rezeptor-Subtypen M1 bis M5 untersucht. Ausgehend von entsprechenden Expressionsplasmiden für Säugerzellen wurde zunächst mittels PCR die DNA der jeweiligen Rezeptor- Subtypen amplifiziert (Plasmide des Subtyps M2 wurden aus den Arbeiten von Herrn Dr. Guido Voith aus unserer Arbeitsgruppe übernommen). Die DNA wurde dabei zusätzlich mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme versehen, die eine nachfolgende Klonierung in Expressionsplasmide für Dictyostelium discoideum ermöglichten. Zur Klonierung wurden in erster Linie Expressionsplasmide verwendet, die in der Arbeitsgruppe um D. Manstein entwickelt wurden. Diese Plasmide ermöglichen die Expression der klonierten Gene unter der Kontrolle verschiedener Promotoren. Dies sind zum einen der starke, konstitutive Aktin-15 Promotor und zum anderen der schwache und in gewissen Grenzen regulierbare Discoidin-1-Mü Promotor. Außerdem wurde in Expressionsplasmiden der starke und induzierbare Ras-Promotor eingesetzt. Mit den klonierten Plasmiden wurden dann transgene Dictyostelium-discoideum-Stämme erzeugt. Die Stämme wurden zunächst mittels Northern-Blot auf das Vorhandensein und die Transkription der entsprechenden DNA der Muskarin- Rezeptor-Subtypen untersucht. Für alle Muskarin-Rezeptor-Subtypen konnten die jeweiligen Transkripte nachgewiesen werden. Als Nachweis für korrekt in die Zellmembran eingebaute Rezeptormoleküle dienten Bindungsstudien mit dem Radioliganden [3H]-N-Methylscopolamin. Für den humanen Subtyp M5 konnte kein funktionelles Rezeptorprotein nachgewiesen werden, unabhängig von der Art des Expressionsplasmides oder des verwendeten D.-discoideum- Stammes. Die funktionelle Expression der Rezeptoren M1, M3 und M4 konnte bei den beiden axenischen Stämmen AX2 und AX3 nachgewiesen werden. Bei Plasmiden mit Aktin-15-Promotor, welche zusätzlich zum Rezeptorgen eine Dictyostelium discoideum eigene Signalsequenz zwischen Promotor-DNA und Rezeptor-DNA enthielten, wurden etwa 300 Rezeptoren pro Zelle für M1 und M4 gefunden. In Abhängigkeit vom verwendeten Plasmid konnten für M3 etwa 200 bis 7000 Rezeptoren pro Zelle nachgewiesen werden. Parallel zu den Radioliganden-Bindungsstudien wurde mit den Rezeptor-Subtypen M1, M2 und M4 am Aufbau von Assays gearbeitet, mit denen eine mögliche Kopplung zwischen stimuliertem Rezeptor und endogenen G-Proteinen nachgewiesen werden könnte. Zum einen wurde untersucht, ob die Stimulation der Muskarin-Rezeptoren zu einer Polymerisation von Aktin-Filamenten führt, wie dies durch den endogenen Liganden cAMP geschieht. Zum anderen wurde durch mehrfach transformierte D.-discoideum-Stämme, die neben dem Rezeptorgen noch das Beta- Galaktosidasegen als Reportergen, die Alpha-Untereinheit eines humanen G-Proteins und einen endogenen Transkriptionsfaktor exprimierten untersucht, ob durch Stimulation der Muskarin-Rezeptoren eine Expression des Rezeptorgens induziert werden kann. Diese wäre dann in einem automatisierbaren Testsystem über Messung der Beta- Galaktosidaseaktivität leicht nachweisbar. Als Variante dieses Testsystem wurde schließlich der von Joachim Tillner (Tillner, 1997) bereits zur Untersuchung teratogener Stoffeigenschaften verwendete Versuchsaufbau herangezogen. In keinem der verwendeten Assays konnte jedoch eine Kopplung von fremd exprimiertem Rezeptor an endogene GProtein- vermittelte Signaltransduktionswege nachgewiesen werden. Als mögliche Gründe für diese Ergebnisse wurden folgende Punkte diskutiert: Zum einen sind die in unserem Expressionssystem erreichbaren Rezeptorzahlen von 300 bis 7000 heterolog exprimierten Rezeptoren pro Zelle vermutlich zu gering im Vergleich zu den um zwei Zehnerpotenzen höher liegenden endogenen Rezeptoren, zum anderen sind die Säugerzellen evolutionär wahrscheinlich zu weit von D. discoideum entfernt, als dass eine effektive Wechselwirkung des stimulierten Rezeptors mit der Zelle stattfinden kann. Dictyostelium discoideum hat sich daher als kaum geeignetes Testsystem zur Untersuchung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren aus Säugern herausgestellt.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) verhindert mit ihren engen Zell-Zellverbindungen, selektiven Transportern und einem effizienten Abwehrsystem das Eindringen vieler Stoffe in das Gehirn. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Nanopartikel aus humanem Serumalbumin (HSA-NP) zum Arzneistofftransport in das Gehirn entwickelt. Als Ligand zur Überwindung der BHS wurde Apolipoprotein E (ApoE), ein Ligand des LDL-Rezeptors (LDL-R), der sich auf der Membranoberfläche von Hirnendothelzellen befindet, eingesetzt. Kurze ApoE wurde über Avidin/Biotin-Komplexe oder kovalent an die NP-Oberfläche gebunden. Bei der Avidin/Biotin-Methode wurde über einen heterobifunktionalen Crosslinker (Polyethylenglykol (PEG)-Spacer) die Avidinkomponente an die NP Oberfläche gebunden. Nach erfolgter Bindung der Avidinkomponente wurde die Funktionsfähigkeit des gebundenen NeutrAvidin® untersucht. Dabei wurde in der Suspension der NeutrAvidin®-modifizierten NP das Verhältnis von Biotinbindungsstellen zu Avidinkomponente bestimmt. Das ermittelte Verhältnis in der NeutrAvidin®-modifizierten NP?Suspension lag bei 2,6 : 1. Um ApoE an NeutrAvidin®-modifizierte NP zu binden, wurde das ApoE biotinyliert und anschließend an die NeutrAvidin®-NP gekoppelt. Dabei wurden ca. 3800 ApoE-Molekülen pro NP gebunden. Bei der kovalenten Bindung wurden verschiedene Apolipoproteine mittels PEG-Spacer direkt an HSA-NP gebunden. Hierbei wurden 19 µg ApoE/mg NP gebunden. In Untersuchungen am konfokalen Mikroskop (CLSM) zeigte sich eine moderate Anlagerung von ApoE-PEG-NP an LDL-R-exprimierende Hep G2- und ß.End3-Zellen, die auf eine Aufnahme der ApoE-PEG-NP über den LDL-R hindeuten könnte. Loperamid wurde als Modellwirkstoff in Tierversuchen verwendet. Loperamid bindet im Gehirn Opioidrezeptoren und wirkt analgetisch, überwindet jedoch nicht selbstständig die BHS. Der analgetische Effekt von Loperamid-beladenen ApoE-modifizierten NP (7 mg/kg bzw. 4 mg/kg Loperamid) wurde in Mäusen nach i.v.-Applikation mittels Tail-Flick-Test ermittelt. Loperamid-beladene ApoE-NP verursachten konzentrationsabhängig einen analgetischen Effekt bei den untersuchten Mäusen. Die Kontrollzubereitungen (Loperamid-beladene nicht-ApoE-modifizierte NP, Loperamid-Lösung, unbeladene ApoE-NP) zeigten keine analgetische Wirkung. Mit ApoE modifizierte NP die keine Bindung an den LDL-R zeigen, vermittelten keinen analgetischen Effekt im Tierversuch.
Es wurden Antidepressiva verschiedener Klassen bezüglich ihrer Hemmung von Pgp in zwei Zellsystemen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Calcein-AM) untersucht. Die untersuchten Substanzen zeigen alle in höheren Konzentrationen eine Hemmung von Pgp. Da diese Konzentrationen nach Applikation therapeutisch relevanter Dosen in-vivo nicht erreicht werden, lässt sich die These, dass ein Teil der antidepressiven Wirkung dieser Substanzen durch Normalisierung der HPA-Achse zu Stande kommt, durch die Ergebnisse dieser Arbeit nicht bestätigen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Hemmung von Pgp eine Eigenschaft ist, die Antidepressiva von anderen zentral-wirksamen Substanzklassen unterscheidet. Ausgehend von der Annahme, dass die Hemmung von Pgp zur antidepressiven Wirksamkeit beiträgt, wäre die Schlussfolgerung naheliegend, dass andere Gruppen, wie z.B. Antipsychotika diese Eigenschaft nicht aufweisen. Daher wurden drei verschiedene Antipsychotika bezüglich der Modulation der Aktivität von Pgp im Calcein-AM Assay untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Antipsychotika ebenfalls Pgp in höheren Konzentrationen – ähnlich der hemmenden Konzentrationen von Antidepressiva - inhibieren. Von daher ist die Hemmung von Pgp keine substanzklassenabhängige Eigenschaft der Antidepressiva, sondern eher eine unspezifische Eigenschaft, die verschiedene ZNS-wirksame Wirkstoffklassen aufweisen. Des Weiteren wurde die Modulation der Expression von Pgp durch Antidepressiva untersucht. Denn beide Veränderungen, zum einen bezüglich der Aktivität von Pgp und zum anderen bezüglich der Expression von Pgp, können zu klinisch relevanten Arzneimittelinteraktionen führen. Der Hauptuntersuchungsgegenstand dieser Arbeit ist Johanniskrautextrakt, daher wurde in-vitro der Extrakt selbst und die aus dem Calcein-Assay als potenteste Modulatoren anzusehenden Inhaltsstoffe bezüglich der Expression untersucht. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass der Extrakt selbst und auch Hyperforin die Expression von Pgp induzieren. Die Induktion durch Hyperforin entspricht der durch den Gesamtextrakt, so dass man sagen kann, dass Hyperforin der Inhaltsstoff von Johanniskrautextrakt ist, der die Expression von Pgp induziert. Diese Wirkung kommt über eine Aktivierung des PXR zu Stande, der seinerseits die Expression von Pgp moduliert. Hyperforin ist als starker PXR Ligand charakterisiert. Die Induktion konnte ebenfalls im Gehirn von Mäusen nach 14tägiger oraler Applikation von Johanniskrautextrakt gesehen werden. Für die Versuche bezüglich der Expression von Pgp im Gehirn von Mäusen und für das nächste Untersuchungsziel, die Untersuchung der Verteilung von Corticosteron in Mäusen, wurden Behandlungsstudien durchgeführt. Es wurden männliche, 2-3 Monate alte NMRI-Mäuse oral durch Schlundsondierung mit den entsprechenden Substanzen behandelt. Es wurden akute (einmalige Applikation und Tötung der Tiere 1h später) und subchronische (14tägige Applikation, Tötung an Tag 15) Studien durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob Antidepressiva die Verteilung von Glucocorticoiden im Körper (Gehirn/Plasma) modulieren können. Diesbezüglich wurde der Effekt von Johanniskrautextrakt, Mirtazapin, Amitriptylin und Fluoxetin nach akuter Einmalgabe und nach subchronischer 14tägiger oraler Applikation der Substanzen untersucht. Amitriptylin zeigt keinen Effekt auf die Konzentration und/oder Verteilung von Corticosteron, weder nach akuter noch nach subchronischer Gabe. Fluoxetin erhöht die Corticosteronlevel in Gehirn und Plasma sowohl nach Einmalgabe als auch nach subchronischer Applikation signifikant. Mirtazapin erhöht akut ebenfalls Corticosteron in Gehirn und Plasma, nach subchronischer Applikation nivelliert sich dieser Effekt jedoch wieder. Nach 14tägiger Gabe ist kein signifikanter Unterschied mehr zur Kontrolle zu erkennen. Johanniskrautextrakt verhält sich ähnlich wie Fluoxetin. Es erhöht im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Corticosteron in Plasma und Gehirn sowohl nach akuter als auch nach subchronischer Applikation. Keine der untersuchten Substanzen verschiebt die Verteilung von Corticosteron zwischen Gehirn und Plasma im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Konzentration von Corticosteron im Körper wird über 5-HT2 Rezeptoren gesteuert. Indirekte Agonisten wie Fluoxetin und Johanniskrautextrakt erhöhen sie, Antagonisten wie Mirtazapin und Amitriptylin verändern sie nicht. Zusammenfassend kann man bezüglich des Hauptuntersuchungsgegenstandes Johanniskrautextrakt sagen, dass der Extrakt selbst, Hyperforin und Quercetin in der Lage sind, die Transportaktivität von Pgp konzentrationsabhängig zu modulieren. Nach längerer Inkubation induziert der Extrakt durch die Wirkung von Hyperforin als PXR-Aktivator die Expression von Pgp. Darüber hinaus verändert Johanniskrautextrakt die Corticosteronausschüttung bei Mäusen, die oral mit dem Extrakt behandelt wurden, ohne die Verteilung zwischen Gehirn und Plasma zu verändern.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die möglichen positiven Effekte mediterraner Pflanzenextrakte auf oxidative Stress-Parameter im Gehirn zu untersuchen. Die Extrakte wurden im Rahmen eines EU-Projektes durch in vitro-Screenings aus einer Vielzahl, in Italien, Griechenland und Spanien gesammelten nicht-kulivierten Pflanzen, ausgesucht und hinsichtlich ihres Potentials verschiedene antioxidative Faktoren zu beeinflussen in einem in vivo-Mausmodell geprüft. Insgesamt sind 127 Pflanzen, die von der lokalen Bevölkerung mediterraner Länder traditionell verzehrt werden in 12 in vitro-Test untersucht worden. Darunter waren radikal- und Enzym-beeinflussende Tests und Versuchsansätze um antikanzerogene oder DNA-schädigende Eigenschaften zu überprüfen. Nach Auswahl von 12 potentiellen Extrakten für die Fütterungsexperimente, wurden auf Grund von weiteren Screenig-Tests wie z.B. das Potential der Extrakte eine Rigidisierung der Membranen oder Lipidperoxidation zu verhindern, die möglichen Kandidaten für die in vivo-Versuche weiter eingegrenzt. Zur Auswahl der drei Extrakte Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella kam es letztendlich durch die guten Ergebnisse in den Vorversuchen und durch den Ausschluss von ebenfalls positiven Extrakten, die toxische Eigenschaften im MTT-Test gezeigt hatten. Zur in vivo-Untersuchung der drei Extrakte wurden weibliche NMRI-Mäuse für drei Monate mit jeweils einem der Pflanzenextrakte gefüttert. Danach wurden sämtliche Parameter in jungen (6 Monate) und alten (21 Monate) NMRI-Mäusen untersucht, um altersbedingte Unterschiede hinsichtlich der Wirkung der Extrakte festzustellen. Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen an Hirnhomogenaten und dissoziierten Neuronen von NMRI-Mäusen, dass es mit zunehmendem Alter zur Aktivierung verschiedener antioxidativer Abwehrmechanismen kommt. Diese dienen dazu ROS-Level auf einem möglichst unschädlichen Niveau zu halten. Hier spielen vor allem die erhöhten Enzym-Aktivitäten eine wichtige Rolle, die die reaktiven Spezies zu einem relativ frühen Zeitpunkt abfangen und so z.B. eine vermehrte Schädigung der Lipidmoleküle verhindern. Bei den in Fütterungsexperimenten untersuchten Extrakten handelte es sich um die mit Ethanol extrahierten Inhaltsstoffe aus den Pflanzen (Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella). Die drei Extrakte wiesen variierende Polyphenolgehalte und eine unterschiedliche Zusammensetzung ihre Inhaltsstoffe, die Flavonoide betreffend auf. Alle drei Pflanzenextrakte zeigten unterschiedlich starke Effekte auf die gemessenen Parameter und machten deutlich wie wenig eine positive Wirkweise von pflanzlicher Ernährung verallgemeinert werden kann. Die besten Ergebnisse zeigte dabei der Reichardia-Extrakt.
The thesis entitled „Investigations on the significance of nucleo-cytoplasmic transport for the biological function of cellular proteins" aimed to unreveal molecular mechanisms in order to improve our understanding of the impact of nucleo-cytoplasmic transport on cellular functions. Within the scope of this work, it could be shown that regulated nucleo-cytoplasmic transport of a subfamily of homeobox transcription factors controlled their intra- and intercellular transport, and thereby influencing also their transcriptional activity. This study describes a novel regulatory mechanism, which could in general play an important role for the ordered differentiation of complex organisms. Besides cis-active transport Signals, also post-translational modifications can influence the localization and biological activity of proteins in trans. In addition to the known impact of phosphorylation on the transport and activity of STAT1, experimental evidence was provided demonstrating that acetylation affected the interaction of STAT1 with NF-kB p65, and subsequently modulated the expression of apoptosis-inducing NF-kB target genes. The impact of nucleo-cytoplasmic transport on the regulation of apoptosis was underlined by showing that the evolutionary conservation of a NES within the anti-apoptotic protein survivin plays an essential role for its dual function in the inhibition of apoptosis and ordered cell division. Since survivin is considered a bona fide cancer therapy target, these results strongly encourage future work to identify molecular decoys that specifically inhibit the nuclear export of survivin as novel therapeutics. In order to further dissect the regulation of nuclear transport and to efficiently identify transport inhibitors, cell-based assays are urgently required. Therefore, the cellular assay Systems developed in this work may not only serve to identify synthetic nuclear export and Import inhibitors but may also be applied in systematic RNAi-screening approaches to identify novel components of the transport machinery. In addition, the translocation based protease- and protein-interaction biosensors can be applied in various biological Systems, in particular to identify protein-protein interaction inhibitors of cancer relevant proteins. In summary, this work does not only underline the general significance of nucleo-cytoplasmic transport for cell biology, but also demonstrates its potential for the development of novel therapies against diseases like cancer and viral infections.
In der retroviralen Gentherapie von Gliomen ist die effiziente und spezifische Transduktion von Gliomzellen ausschlaggebend für den Therapieerfolg. Als besonders schwierig erwies sich in diesem Zusammenhang [1]: (i) die ausreichende Distribution retroviraler Vektoren im Tumorgewebe (ii) die Transduktion einzelner, infiltrierender Tumorzellen und (iii) die Transduktion von Tumorbereichen mit geringer Zellzeilungsaktivität. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Strategien angewandt, um diese Ziele zu erreichen. Lentivirale Vektoren wurden mit Glykoproteinen des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV-GP) und des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) pseudotypisiert. Lentivirale Vektoren vermitteln anders als gammaretrovirale Vektoren einen effizienten Gentransfer in ruhende Zellen [2]. Auf diese Weise können auch Tumoranteile mit geringer Zellteilungsaktivität transduziert werden. Allerdings sollte dabei die Transduktion des ebenfalls mitotisch inaktiven Hirngewebes vermieden werden. Vergleichende Tropismusstudien mit den oben genannten Pseudotypvektoren zeigten, dass LCMV-GP Pseudotypen einen effizienten und spezifischen Gentransfer in Gliomzellen in vitro und in vivo vermitteln. Auch einzelne, infiltrierende Tumorzellen wurden von LCMV-GP Pseudotypvektoren transduziert. Normale Hirnzellen, insbesondere Neurone, wurden von LCMV-GP Pseudotypen dagegen kaum infiziert. Im Gegensatz dazu transduzierten VSV-G Pseudotypen Neurone in vitro und in vivo mit hoher Effizienz, während Gliomzellen von VSVG Pseudotypen weniger stark transduziert wurden als von LCMV-GP Pseudotypen. Das Suizidgen hsv-tk (Herpes Simplex Virus Thymidinkinase) wurde anschließend durch lentivirale LCMV-GP Pseudotypvektoren in Gliome in vivo eingebracht werden. Diese Suizidgentherapie bewirkte einen starken Antitumoreffekt und führte zu einer kompletten Eliminierung des Tumors bei 90% der behandelten Ratten. Ergebnisse dieser Studien verdeutlichen, dass LCMV-GP-pseudotypisierte lentivirale Vektoren ein hoch effizientes und spezifisches Vektorsystem zum Gentransfer in maligne Gliomzellen darstellen.
Die Rho-Kinase gehört zur Familie der Serin/Threonin Kinasen und wird durch verschiedene vasoaktive Mediatoren, wie Katecholamine, UII, Thromboxan und Serotonin aktiviert. Sie spielt eine Schlüsselrolle in der Gefäßkontraktion des glatten Muskels. Die Rho-Kinase induzierte Kontraktion ist in allen Gefäßbetten der verschiedenen untersuchten Tierspezies (Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein) induzierbar und durch selektive Rho-Kinase Inhibitoren konzentrationsabhängig hemmbar. Die Rho-Kinase Inhibitoren induzieren in vitro eine Gefäßrelaxation und führen in vivo zu einer Blutdrucksenkung. In akuten invasiven Blutdruckmessungen und chronischen telemetrischen Untersuchungen wurde für Rho-Kinase Inhibitoren eine Senkung des peripheren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen. Der vasorelaxierende Effekt von Rho-Kinase Inhibitoren in vitro und in vivo ist gleichermaßen in normotensiven und hypertensiven Tiermodellen messbar und hängt nicht von der Endothelfunktion ab. Es wurden keine Unterschiede in der Sensitivität gegenüber Rho-Kinase Inhibitoren zwischen hypertensiven Tieren und normotensiven Tieren gemessen. In der Proteinexpressionsanalyse zeigte sich eine tendenziell, aber nicht signifikante Erhöhung der Rho-Kinase II-Expression im arteriellen glatten Gefäßmuskel der hypertensiven Tiere. Im Tiermodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie wurde durch chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren die Progredienz der PAH verbessert. Rho-Kinase Inhibitoren normalisierten die Endothelfunktion und die Hyperkontraktilität der pulmonalen Gefäße. Zusätzlich konnten die Rechtsherzhypertrophie und rechtsventrikuläre Druck verbessert werden. In Untersuchungen am isoliert perfundierten Herzen nach Langendorff führte die Perfusion mit Rho-Kinase Inhibitoren zu einer verbesserten Durchblutung der Herzkranzgefäße. Die kardiale Kontraktilität und die Herzfrequenz wurden durch die akute Rho-Kinase Hemmung nicht beeinflusst. Zusätzlich zur Gefäßfunktion reguliert Rho-Kinase auch die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten. Vasoaktive Mediatoren können eine Rho-Kinase induzierte Aktivierung von Thrombozyten bewirken und so die Atherogenese begünstigen. Die Hemmung von Rho- Kinase bewirkt die Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die Aktivierung von Rho- Kinase ist essentiell für zelluläre Transportvorgänge und die Zellmotilität. Dies wird durch Umstrukturierung des Zytoskeletts und mit Hilfe von Stressfaserformierungen realisiert. Rho- Kinase Hemmung verringert die Formierung von Stressfasern und kann somit Transporte von cholesterolsensitiven Transkriptionsfaktoren, z.B. SREBPs, zu ihren Bindungselementen reduzieren. Dadurch wird eine verstärkte Expression SRE-regulierter Gene, wie z.B. Cholesterolsyntheseenzymen, verhindert. Gleichzeitig führt eine Hemmung der Rho-Kinase Aktivität zu einer Senkung der Proliferationsrate von glatten Muskelzellen und Monozyten. Im LDLR defizienten Tiermodell der Atherosklerose wurde durch eine chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren eine signifikante Verbesserung der Endothelfunktion erreicht. Die Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren zeigt allen untersuchten Modellen der Hypertonie blutdrucksenkende Effekte. In Modellen der Atherosklerose wurden durch Langzeitbehandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren therapeutische Effekte auf die Endothelfunktion erzielt. Durch Reduktion der Risikofaktoren Bluthochdruck, Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion senken Rho-Kinase Inhibitioren das kardiovaskuläre Risiko und bieten eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung und Prophylaxe von Herz- Kreislauferkrankungen.
Die Rolle der löslichen Guanylatzyklase in der Signaltransduktion durch Superoxidanionradikale
(2005)
Im kardiovaskulären System ist die lösliche Guanylatzyklase (soluble guanylyl cyclase, sGC) ein Schlüsselenzym der •NO/cGMP-Signaltransduktion. Stickstoffmonoxid (•NO) aktiviert durch direkte Anbindung an das Häm-Eisen die Produktion von zyklischem 3’,5’-Guanosinmonophosphat (cGMP). In glatten Muskelzellen führt ein erhöhter cGMP-Spiegel zur Aktivierung von cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGK) und letztendlich zur Vaso-dilatation. Superoxidanionradikale (•O2-) sind an der Entstehung und Progression von Herz-Kreis¬lauferkrankungen beteiligt. Im vaskulären Gewebe stellt •O2- einen Gegenspieler zum •NO dar. So führt eine vermehrte Produktion von •O2- zu einer eingeschränkten Bioverfügbarkeit von •NO (•O2- + •NO -> ONOO-) (Ohara et al., 1993a). Im Rahmen dieser Arbeit sollte aufgeklärt werden, ob bei einer vaskulären Störung des •NO-Systems die Funktion der sGC durch •O2- auch direkt betroffen ist. Damit könnte dem Superoxid eine weit größere biologische Bedeutung zukommen als bisher angenommen, nämlich die Funktion als Signaltransduktionsmolekül mit der sGC als definiertem Rezeptor und Effektor. Die sGC-Aktivitätsuntersuchungen mit gereinigter sGC zeigten eine konzentrationsab¬hängige Hemmung der basalen und der YC-1- (100 µM) stimulierten (•NO-unabhängigen) sGC-Aktivität durch das •O2--generierende System Xanthinoxidase/Hypoxanthin (XO/HX) (IC50 (basal) = 0,0031 vs. IC50 (YC-1) = 0,022 mU/ml). Die Aufhebung dieser Hemmung durch Superoxiddismutase (SOD, 100 U/ml) deutete auf eine spezifische und schnell-reversible Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- hin. Die in-vitro gezeigte Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- konnte auch in-vivo nach¬gewiesen werden. Die Produktion von •O2- in kultivierten glatten Muskelzellen der Rattenaorta (VSMC) konnte mit Elektronenspinresonanz (ESR) und Lucigenin-abhängiger Chemilumineszenz gezeigt werden. Dabei wurde mit ESR eine ca. 5-fache Steigerung der basalen •O2--Produktion mit dem intrazellulären Redoxcycler Dimethoxynaphtochinon (DMNQ, 10 µM) beobachtet. Auch die Aktivierung membranständiger NADPH-Oxidasen durch die physiologischen Aktivatoren Angiotensin II (Ang II, 100 nM) und platelet-derived growth factor (PDGF, 50 ng/ml) führten zu einer ca. 2-fach gesteigerten •O2--Produktion. Die Hemmung der cGMP-Produktion durch •O2- in kultivierten VSMC konnte in-vivo mittels Enzym-Immuno-Assays (cGMP-EIA) [YC-1 (100µM) = 100 % vs. YC-1 + DMNQ (10 µM) = 21 % vs. YC-1 + PDGF (50 ng/ml) = 76,6 %] nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Auswirkung von •O2- auf die cGMP-abhängige Signaltransduktion mit Immu¬noblotting (Western-Blot) von phosphoryliertem Vasodilator-stimulierten Phosphoprotein (VASP, vasodilator-stimulated phosphoprotein) gezeigt. Intrazelluläre •O2--Produktion durch Redoxcycling (DMNQ, 10 µM) reduzierte die YC-1-stimulierte Phosphorylierung von VASP um 44,4 %. In weiteren Untersuchungen sollte der molekulare Mechanismus der schnell-reversiblen Hemmung der sGC durch •O2- auf Ebene der sGC aufgeklärt werden. Dabei wies die direkte Detektion von Sulfinyl-Radikalen auf eine Oxidation von Proteinthiolen durch •O2- hin. Der spezifische Austausch von Cysteinen der sGC mittels Punktmutation und die Expression der sGC-Mutanten in COS1-Zellen zeigte, dass Thiol-Gruppen der sGC mit •O2- interagieren. Dabei stellte sich heraus, dass die sGC-Mutanten a1/b1C541S und a1C238S/b1 viel sensitiver auf •O2- (XO 3 mU/ml) reagieren als die Wildtyp-sGC (WTa1/WTb1 = -62 % vs. WTa1C238S/WTb1 = -93,7 % vs. WTa1/b1C541S = -90,2 %). Um zu untersuchen, ob das Häm-Eisen der sGC an der Aktivitätshemmung durch •O2- beteiligt ist, wurde einerseits das Häm entfernt (Tween 20), andererseits das Häm-Fe2+ zum Häm-Fe3+ oxidiert (NS2028). Beide Behandlungen führten zu einer weitgehend YC-1-insen¬sitiven sGC. Die mit Protoporphyrin IX (PIX) aktivierte Häm-freie sGC und die mit HMR3448 aktivierte Häm-oxidierte sGC wurden durch XO/HX wesentlich weniger potent gehemmt als die YC-1-sensitive sGC. Dieser Befund deutet auf eine Beteiligung des Häm-Eisens bei der Aktivitätshemmung der sGC durch •O2- hin. Die in dieser Arbeit gezeigte direkte und schnell-reversible Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- weist der löslichen Guanylatzyklase eine neue biologische Funktion zu. Die sGC könnte als Rezeptor- und Effektorenzym die Signaltransduktion des Signalmoleküls •O2- vermitteln.
Die meisten nanopartikulären Ansätze im Bereich der Arzneiformenentwicklung befinden sich am Anfang der klinischen Evaluation, sodass das wirkliche Potenzial nanotechnologischer Produkte sich erst in den kommenden Jahren abzeichnen wird. Die Zusammenführung von „Drug-Targeting“ und „sustained release“ mit nanotechnologischer Entwicklung könnte in Zukunft zu einem Fortschritt in der Medizin beitragen. Auf dem Gebiet der Antisense-Oligonukleotid (ASO)-Therapie stellt der ASOTransfer in Zielzellen eine entscheidende Hürde dar. ASO benötigt, um im Körper an den Wirkort zu gelangen, einen zuverlässigen Träger, der vor dem Abbau in physiologischen Milieu schützt, den Transport über extra- und intrazelluläre Barrieren im Körper gewährleistet und die ASO zielgerichtet an den Wirkort bringt. Der Einbau von ASO in kolloidale Trägersysteme wie Nanopartikel vermittelt eine effiziente Aufnahme in Zellen bei gleichzeitigem Schutz vor abbauenden Enzymen im Körper. Des Weiteren kann eine gezielte Aufnahme in Zielzellen erreicht werden, die normalerweise nicht auftritt. Bisherige Trägersysteme bestanden meist aus Nanopartikeln von synthetischen Materialien, die entweder die ASO an der Oberfläche adsorbiert oder in der Partikelmatrix inkorporiert hatten. Als Trägermaterialien wurden oft Polyalkylcyanoacrylate verwendet. Sie sind aufgrund ihrer negativen Ladung und Hydrophobizität nicht geeignet ohne Zugabe von Hilfsstoffen, welche in höheren Konzentrationen toxisch wirken, anionische hydrophile Substanzen wie ASO zu adsorbieren. Außerdem besteht bei Nanopartikeln mit adsorbierten ASO die Gefahr, dass es bei einer intravenösen Gabe zu einer Desorption der ASO kommt und somit ASO die Zielzellen nicht in verpackter Form erreicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NP auf Basis von humanem Serumalbumin (HSA) als Trägersystem für ASO entwickelt. Durch Oberflächenmodifikation dieser Trägersysteme wurde eine Kopplung von anti-HER2 Antikörper ermöglicht und ein AK-vermitteltes Drug-Targeting erreicht. HSA als natürliches Makromolekül zeichnet sich durch geringe Toxizität und gute Biodegradierbarkeit aus. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass ein Wirkstoff mit vorhandenen Bindungsstellen im HSA-Molekül Wechselwirkungen eingehen kann, was eine erfolgreiche Einbindung gewährleistet. Zusätzlich eignen sich aus HSA hergestellte NP aufgrund funktioneller Gruppen an der Partikeloberfläche für die Kopplung von Antikörpern und ermöglichen somit eine zielgerichtete Arzneistofftherapie. Die entwickelten Trägersysteme wurden hinsichtlich kolloidaler Parameter wie Teilchengröße, Oberflächenladung, ASOBeladungseffizienz, Stabilität in physiologischen Medium und ihrem Vermögen, einen ASO-Effekt zu erzielen, in Zellkultur evaluiert. 4.1 Optimierung der Beladung von NP mit ASO Zunächst wurden HSA-NP hergestellt, bei denen die Beladung durch Inkorporieren des ASO in die Partikelmatrix erfolgte. Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses ergab eine Abhängigkeit der ASO-Beladung vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Eine Mindestmenge eines 1,8-fachen Überschusses an Ethanol ist für die vollständige Desolvatation des HSA und damit für die Einbindung des daran adsorbierten ASO erforderlich. Ebenso beeinflusste die Quervernetzung der Partikel die ASO-Beladungseffizienz. Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto stabiler waren die NP. Nimmt die Menge des Glutaraldehyds von 40% auf 200% zu, löste sich um so weniger ASO während der Waschschritte aus der Partikelmatrix heraus. Jedoch hat das Ausmaß der Quervernetzung einen entscheidenden Einfluss auf die Biodegradierbarkeit des Partikelsystems. Zu stark quervernetzte NP (Quervernetzung von 200%) können von intrazellulären Enzymen nicht mehr abgebaut werden, infolge dessen gelangt das eingebundene ASO nicht zu seinem Wirkort ins Zytoplasma. Im Folgenden wurde versucht über die Einführung einer permanenten kationischen Ladung (EDC/Cholamin-Reaktion) im HSA-Molekül ein Trägerpolymer mit höherer Beladungskapazität im Vergleich zu nativem HSA zu etablieren. Ein geringer Anteil von kationisiertem HSA (cHSA) in der HSA-Partikelmatrix reichte aus, um die ASOBeladungseffizienz um ein 2,5-faches signifikant zu steigern. Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSA-NP war eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Wirkstoffe wie ASO über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der HSA-NP mit EDC und Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials von ca. –20,0 mV in den positiven Bereich (+38,6 mV). Durch die Inkubation mit ASO konnten so große Menge an ASO effizient an die Partikeloberfläche (NP+) gebunden werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse zeigte, dass die Beladung mit ASO in der Reihenfolge von Albumin-NP (HSA-NP) mit einer Beladungseffizienz von 7,6 µg ASO / mg NP zu Nanopartikeln, die in der Partikelmatrix inkorporierten Anteil an kationisiertem Albumin enthielten (cHSA-NP) mit 18,2 µg ASO / mg NP, zu Oberflächen-kationisierten Nanopartikeln (NP+) mit 100 µg ASO / mg NP signifikant zunahm. 4.2 Mit ASO-beladene NP in der Zellkultur HSA-NP wurden von allen verwendeten Brustkrebszell-Linien gut vertragen. Nach Zellaufnahme der HSA-NP wurden bei niedriger Quervernetzung (40%) die Partikel gut intrazellulär abgebaut und das ASO in das Zytoplasma freigesetzt. Es konnte im CLSM gezeigt werden, dass die ASO-Freisetzung innerhalb von 24 h zunahm. Alle Versuche mittels den entwickelten ASO-beladenen Trägersystemen einen Antisense Effekt nachzuweisen schlugen fehl. Da die Beladung der HSA-NP nicht weiter erhöht werden konnte, richtete sich ein neuer Ansatz auf eine verbesserte Aufnahme der NP über einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus. 4.3 Antikörper-vermittelte Anreicherung von NP in Zielzellen Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern mit einer Spezifität gegenüber Tumorzellen ist eine relativ neue und spannende Modalität in der Krebstherapie. Eine der vielversprechenden Zielstrukturen für eine solche Immunotherapie stellt der HER2-Membranrezeptor dar, dessen Überexpression mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. HER2 ist ein Produkt des Proto-Onkogens erbB2, das für einen 185 kDa Transmembrantyrosinkinase Wachstumsfaktorrezeptor kodiert. Dieser Rezeptor ist in normalem Gewebe bei Erwachsenen nur geringfügig exprimiert [Press et al., 1990], aber ist bei ungefähr 30% der Patienten mit humanem Magenkarzinom, Lungen- und Brustkrebs überexprimiert. Gegenwärtig dient HER2 als Tumormarker für die zielgerichtete Behandlung mit dem humanisierten anti-HER2 AK Trastuzumab (Herceptin®) von Patientinnen bei metastasierendem Brustkrebs. Jedoch können bessere Ergebnisse erreicht werden, wenn Trastuzumab in Kombination mit anderen Zytostatika verabreicht wird. Antikörper haben bei alleiniger Gabe eine ausreichende Antitumoraktivität, aber sie können auch konjugiert mit Zytostatika sowie Toxinen und Radionukliden, genutzt werden, um diese zu den Tumoren bringen. Im Prinzip kann die Trägereigenschaft von Antikörpern gesteigert werden, wenn ein Antikörper an ein Arzneistoffreservoir, wie Nanopartikel oder Liposomen geknüpft ist. Der Vorteil dieses innovativen Ansatzes für eine zellspezifische Anreicherung im Vergleich zu herkömmlichen Biokonjugaten ist, dass eine höhere Arzneistoffträgerkapazität mit einer verbesserten Spezifität für eine zielgerichtete Pharmakotherapie kombiniert werden kann. Wegen seiner erhöhten Expression in Tumorzellen, seiner extrazellulären Verfügbarkeit und seiner Fähigkeit nach Antikörperbindung internalisiert zu werden, stellt HER2 eine geeignete Zielstruktur für die Tumortherapie mit zellspezifischen Nanopartikeln dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion Antikörpermodifizierter Protein-basierter Nanopartikel zu untersuchen und eine spezifische Aufnahme in HER2-überexprimierende Zell-Linien zu verbessern. Ein spezifisches Targeting wurde in verschiedenen Krebszell-Linien mit unterschiedlichen HER2- Expressionsleveln durch FACS-Analyse bewiesen. Die Versuche beinhalteten Inhibitionsexperimente durch Vorinkubation mit Trastuzumab, um die Selektivität der Bindungsstellen auf der Zelloberfläche zu unterstreichen. Die zelluläre Aufnahme dieser Nanopartikel, ebenso wie die zelluläre Verteilung, konnte im CLSM beobachtet werden. Diese ermutigenden Ergebnisse heben den potenziellen Wert Antikörper-modifizierter Nanopartikel für eine spezifische Anreicherung in Tumorzellen hervor. Anti-HER2-NP binden effizient an HER2-überexprimierende Zellen (85%) und werden anschließend internalisiert. Im Anschluss wurde die Beladung von ASO in HSA-NP mit den erhaltenen Erkenntnissen Antikörpermodifizierter HSA-NP kombiniert. Zunächst wurde die Freisetzung von farbmarkierten ASO aus AK-modifizierten HSA-NP in SK-Br-3- und MCF7-Zellen untersucht. Durch die spezifische Aufnahme der AK-modifizierten HSA-NP gelangt bereits innerhalb der ersten Stunde deutlich mehr ASO in die Zelle. Die Zellaufnahme und Freisetzung in das Zytosol der Zelle ist abhängig vom HER2- Protein auf der Zelloberfläche und nimmt über 24 h stark zu. SK-Br-3-Zellen reichern das farbmarkierte ASO stärker als die MCF7-Zellen an. Wirksame ASOKonzentrationen können in SK-Br-3-Zellen mit einer sehr geringen Partikelkonzentration von nur 50 µg anti-HER2-NP/ml erzielt werden, während in MCF7- Zellen eine weit aus höhere Partikelkonzentration notwendig ist. Da die HER2- überexprimierenden Zellen, die für einen Antisense-Testung zur Verfügung standen, sich nicht für den Nachweis eines Antisense-Effektes eigneten, konnte die entwickelte Kombination von ASO-beladenen AK-modifizierten Albumin- Nanopartikeln nicht weiter getestet werden. In Kombination mit einem in die Nanopartikel inkorporierten Arzneistoff wird eine wirksame intrazelluläre Arzneistoffabgabe erwartet. Die Anwendung Antikörpermodifizierter Nanopartikel kann Arzneistoff-Trägereigenschaften mit einer zielgerichteten Tumortherapie kombinieren. Diese neue Generation von immunospezifischen Nanopartikeln sollte auf jeden Fall noch weiter im Einzelnen untersucht werden, um die Wirksamkeit dieser Arzneistoffträgersysteme unter in vitro und in vivo Bedingungen zu belegen.
First paragraph (this article has no abstract) Persistent stimulation of nociceptors results in sensitization of nociceptive sensory neurons, which is associated with hyperalgesia and allodynia. The release of NO and subsequent synthesis of cGMP in the spinal cord are involved in this process. cGMP-dependent protein kinase I (PKG-I) has been suggested to act as a downstream target of cGMP, but its exact role in nociception hadn't been characterized yet. To further evaluate the NO/cGMP/PKG-I pathway in nociception we assessed the effects of PKG-I inhibiton and activaton in the rat formalin assay and analyzed the nociceptive behavior of PKG-I-/- mice. Open access article.