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Ziele der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Neo- und Archäophyten, die im Stadtgebiet von Frankfurt am Main im Zeitraum 1700-2006 nachweisbar sind, und die Analyse der Veränderungen während dieses Zeitraumes, andererseits die Untersuchung möglicher Auswirkungen von Neo- und Archäophyten auf die Biodiversität am Beispiel von Brachestandorten. Zur Inventarisierung wurde eine Kombination aus Literatur- und Herbarrecherche im Herbarium Senckenbergianum (FR) mit Feldarbeit in Form einer Rasterkartierung zwischen September 2002 und September 2005 mit Nachträgen aus dem Jahr 2006 durchgeführt. 609 Arten (unter Berücksichtigung von Unterarten/Varietäten 634 Sippen) aus 84 Familien wurden über den Gesamtzeitraum nachgewiesen, wobei mehr als 75 % der Sippen zu 20 Familien gehören. Die erfassten Sippen wurden nach ihrer Einwanderungsgeschichte, Einwanderungsweise und ihrem Einbürgerungsgrad bewertet. 54 % aller Sippen erwiesen sich als Ergasiophygophyten. Aktuell wurden 462 anthropochore Sippen nachgewiesen. Die Familie mit den meisten anthropochoren Vertretern sind sowohl aktuell als auch im Gesamtzeitraum die Asteraceae, die auch auf Brachen eine heruasragende Stellung einnehmen. Der gesamte Untersuchungszeitraum wurde in neun Abschnitte untergliedert. Die Häufigkeit jeder Sippe wurde für die einzelnen Abschnitte in einer sechsstufigen Skala, die sich an die Ergebnisse der Rasterkartierung anlehnt, eingeschätzt. Dadurch wurde es erstmals möglich die starke Zunahme der Neophyten in der Stadtflora sowie den Rückgang von Archäophyten für einen Zeitraum von 300 Jahren quantitativ darzustellen. Untersuchungen zur Diversität erfolgten auf Brachestandorten im Stadtgebiet. Dazu wurden 2003 und 2004 insgesamt 220 Vegetationsaufnahmen nach Braun-Blanquet durchgeführt. Die Probeflächen wurden nach geschätztem Alter in vier Kategorien unterteilt und mit Hilfe von Diversitätsindizes (Evenness, Simpsonund Shannon-Index) verglichen. Es zeigte sich, dass die Diversität auf jungen, d.h. 1-2 Jahre alten Brachen, am höchsten ist und mit zunehmendem Alter abnimmt. Brachen, die erst im Untersuchungsjahr angelegt worden waren, zeigten die größte Variabilität. Auf nährstoffreichen Böden war die Diversität besonders hoch, auf nährstoffarmen Böden extrem niedrig. Brachen, die älter als 5 Jahre waren, zeigten die geringste Diversität und die niedrigsten Zahlen von Archäo- und Neophytenarten. Die höchste Gesamtartenzahl auf 25 m² betrug 58, wobei maximal 16 Archäophyten- und 19 Neophytenarten, im Mittel jedoch nur drei Archäophyten- und vier Neophytenarten, nachgewiesen wurden. Zwischen der Gesamtartenzahl auf Brachen und der Artenzahl von Neo- und Archäophyten ließ sich kein signifikanter Zusammenhang feststellen. Allerdings sind Neophyten auf Brachen aller Altersklassen gleich erfolgreich, während Archäophyten ihren Schwerpunkt auf jungen Brachen haben und mit zunehmendem Brachealter zurückgehen. Die beiden am häufigsten auf Brachen gefundenen Sippen sind die indigenen Hypericum perforatum und Artemisia vulagris. Der Neophyt Fallopia x bohemica und das einheimische Calamagrostis epigejos sind als einzige im Untersuchungsgebiet in der Lage Einart-Bestände zu bilden. Andere, auf den ersten Blick von einer Art (z.B. Solidago canadensis) dominierte Flächen, wiesen bei näherer Untersuchung eine für Brachen durchschnittliche Diversität auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass jungen Brachen bis zum 3. Jahr eine besondere Bedeutung in der Stadtökologie zukommt. Sie bieten z.B. Segetalarten Lebens- und Rückzugsraum. Die Diversität alter Brachen beruht auf ihrem Mosaik verschiedener Lebensräume, die mit dieser Untersuchung nicht erfasst werden konnten.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.
Die Verbreitung westlicher Verhaltens- und Lebensmuster im Rahmen der Globalisierung führt zu einer dramatischen Zunahme des Typ 2 Diabetes. Eine schwerwiegende Komplikation der diabetischen Erkrankung ist die Wundheilungsstörung, deren molekulare Pathophysiologie noch weitgehend unverstanden ist. Voraussetzung für einen koordinierten Wundheilungsprozess ist die ausgewogene Interaktion wundheilungsrelevanter Faktoren, die eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden induzieren und somit zu einem streng kontrollierten Heilungsprozess beitragen. Darüber hinaus scheint auch die Insulinsensitivität der Haut für den Heilungsverlauf eine essentielle Rolle zu spielen. Da die Proteinkinase B/Akt nicht nur ein zentrales Molekül der Insulin-Signaltransduktion ist, sondern als Knotenpunkt vieler Signalkaskaden im Mittelpunkt zellulärer Ereignisse steht, sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der Proteinkinase Akt in der kutanen Wundheilung untersucht werden. Sowohl in der Haut als auch im Wundgewebe konnte Akt1 als dominante Isoform identifiziert werden. Die Verletzung des Hautgewebes induzierte einen Anstieg der Akt1-Expression und -Phosphorylierung in der Epidermis akut heilender Wunden. Insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten waren durch eine starke Expression der Akt1-Kinase gekennzeichnet. Die Phosphorylierung und somit Aktivierung der Akt1-Kinase stieg im Verlauf der Wundheilung stetig an und erreichte ihr Maximum in der Endphase des Heilungsprozesses. Begleitet wurde die Aktivierung dieser Kinase von einer Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und einer starken VEGF-Sekretion. Dagegen konnte in diabetisch chronischem Wundgewebe weder eine Aktivierung der Akt1-Kinase noch eine Phosphorylierung des eIF4E-BP1 nachgewiesen werden, was mit einer deutlich verminderten VEGF-Sekretion einherging. Um nun zu untersuchen, ob im Prozess der Wundheilung die VEGF-Sekretion in einem funktionellen Zusammenhang zur Akt1-Aktivierung steht, wurde in vitro der Einfluss wundheilungsrelevanter Faktoren, wie EGF, einer Kombination proentzündlicher Zytokine oder Insulin auf die Aktivierung der Akt1-Kinase und VEGF-Biosynthese untersucht. Obwohl alle Faktoren sowohl eine Aktivierung der Akt1-Kinase als auch VEGF-Sekretion induzierten, wurde ausschließlich die Insulininduzierte VEGF-Biosynthese über den PI3-Kinase/Akt-Signalweg vermittelt. Die Regulation der Insulin-induzierten VEGF-Biosynthese erfolgte posttranskriptionell aus einem gleichbleibenden Pool an VEGF-mRNA über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Akt1-Mutante und die Verwendung des mTOR-Inhibitors Rapamycin konnte mTOR als Mediator der Akt1-vermittelten Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und somit der VEGF-Biosynthese identifiziert werden. In vitro-Lokalisationsexperimente zeigten, dass eine vollständig phosphorylierte und somit aktive Akt1-Kinase nach Insulinstimulation im Zytoplasma lokalisiert ist - exakt dort, wo die Regulation der Translation stattfindet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Insulin im kutanen Heilungsverlauf die VEGF-Biosynthese posttranskriptionell über eine Akt1-vermittelte Phosphorylierung des eIF4E-BP1 induzieren kann. Eine ausbleibende Akt-Aktivierung in insulinresistenten Keratinozyten könnte somit zu einer verminderten VEGF Sekretion und folglich zu einer verzögerten Angiogenese in chronisch diabetischen Wunden beitragen.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
The rate of species extinctions due to anthropogenic activities has dramatically increased within the past few centuries (Dirzo & Raven, 2003; Novacek & Cleland, 2001). Although the mechanisms and ultimate causes leading to the extinction of species remain largely unclear (Frankham et al., 2002), five threats to global biodiversity have frequently been referred to as the most important: habitat destruction and fragmentation, global climate change, hunting and overuse of food resources, biological invasions and environmental pollution (Dudgeon et al., 2006; Lewis, 2006; Novacek & Cleland, 2001). Different research fields, as conservation biology, ecology and ecotoxicology, investigate the effects of these factors on organisms and found strong evidence for their negative impact on regional and global biodiversity.
In most cases, natural populations will be impacted not only by one threat, but rather a combination of them (Buckley & Roughgarden, 2004; Kappelle et al., 1999). Multiple environmental stress factors can have cumulative negative effects on the survival of populations (Sih et al., 2004). To understand, how natural populations respond to combinations of different stress factors is thus of crucial importance in order to understand our present and future impact on all scales of biodiversity (Warren et al., 2001).
The effects of anthropogenically introduced chemicals on organisms and ecosystems are investigated in the field of ecotoxicology. Research in this area has led to a large body of information concerning the impact of chemical stress on the fitness of model species in the laboratory. In contrast to this, there is an obvious lack of knowledge on the effects of contaminants on natural populations and communities (Bickham et al., 2000; Bourdeau et al., 1990). For instance, ecotoxicologists have just started to investigate the impact of environmental pollution on the genetic variability of natural populations (Bickham et al., 2000; Whitehead et al., 2003). Genetic variation provides the raw material for populations in order to adapt to changing environmental conditions and is thus the substrate for evolution and long-term survival of populations and species (Frankham, 2005). The amount of genetic variation in populations is positively correlated with the effective population size (Frankham, 1996). Habitat destruction and fragmentation has divided the ranges of many species into small and isolated refuges. Without migration from adjacent habitats, isolated populations will decrease in their level of genetic diversity through random loss of alleles (Hedrick, 2000). Frankham (1995) for instance, showed that 32 of the 37 endangered species (which occur in small populations per definition) of different animals and plant taxa display reduced levels of heterozygosity compared to closely related and more frequent species.
In strongly human impacted landscapes, both factors, environmental pollution and habitat destruction, can be expected to occur frequently together. It is thus of crucial importance to investigate the impact of reduced genetic diversity and inbreeding on the response to chemical stress. In addition, chemical exposure has frequently been discussed to have an impact on the extent of genetic variability in exposed populations (Guttman, 1994; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002). However, evidence for this 'genetic erosion hypothesis' remained scarce to date, most likely because of the difficulty to single out the impact of pollution stress from a background of multiple factors which influence patterns of genetic variability in natural populations (Belfiore, 2001; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002).
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
Das Epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes wächst unter anaeroben Bedingungen durch Nitrit-Atmung. Als Elektronendonoren werden Formiat oder Wasserstoff verwendet. Die terminale Reduktase der Elektronentransportkette von Formiat zu Nitrit ist der Cytochrom C-Nitrit-Reduktase-Komplex (NrfHA), welcher die Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Menachinon dient als Redoxmediator. Die katalytische Untereinheit NrfA ist ein Pentahäm Cytochrom c, dessen Struktur bekannt ist. Die Häm c-Gruppe im aktiven Zentrum von NrfA wird über ein ungewöhnliches CXXCK-Motiv kovalent gebunden, während die übrigen vier Häm c-Gruppen über konventionelle CXXCH-Motive gebunden werden. Der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs ist der axiale Ligand des Häm-Eisens der Häm-Gruppe im katalytischen Zentrum. Die Untereinheit NrfH ist ein membranständiges Tetcahäm-Cytochrom C, das den Elektronentransport von Menachinol zu NrfA katalysiert. Im Nitrit-Reduktase-Operon nrfHAIJ wird das Nrfl-Protein kodiert, das ähnlich zu verschiedenen Cytochrom c-Biogenese Proteinen (Ccsl und CcsA) anderer Organismen ist. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von Mutanten, in denen der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs (K134) von NrfA ausgetauscht wurde oder konservierte Aminosäure-Reste am katalytischen des NrfAProteins ausgetauscht wurden. Weiterhin wurden Mutanten konstruiert und charakterisiert, in denen das nrfl-Gen inaktiviert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Es wurde eine Mutante konstruiert (W. succinogenes K134H), in der das CXXCK-Motiv im aktiven Zentrum von NrfA in ein konventionelles CXXCH-Motiv gewandelt wurde. Die spezifische Nitrit-Reduktase-Aktivität, gemessen mit reduziertem Benzylviologen als Elektronendonor, betrug maximal 40% der Aktivität des Wildstammes. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug 6% der Aktivität des Wildstamms. Durch MALDI-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das NrfA-Protein aus dieser Mutante, ebenso wie das Protein aus dem Wildstamm, fünf Häm-Gruppen enthielt. In W. succinogenes Mutanten, in denen der Lysin-Rest 134 gegen Leucin oder Glutamin ausgetauscht wurde, ließ sich das Nrf-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht mehr nachweisen. 2. In W. succinogenes R114L, Y21 8F, H277L wurden konservierte Aminosäure-Reste in NrfA ausgetauscht, die nach dem postulierten Mechanismus der Nitrit-Reduktion an der heterolytischen Spaltung der ersten N-O-Bindung des Nitrits beteiligt sind. Alle diese Mutanten wachsen nicht durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes H277L und R114L besitzen keine Nitrit-Reduktase-Aktivität, obwohl das NrfA-Protein in allen Mutanten nachweisbar war. Die Elektronentransport-Akivität von Formiat zu Nitrit in W. succinogenes Y218F betrug 6% im Vergleich zum Wildstamm und die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug 14% gegenüber dem Wildstamm. Aus der Struktur von W. succinogenes NrfA ist ersichtlich, dass der Glutamin-Rest 276 Teil eines Substrat-Kanals ist, der von der Oberfläche des NrfA-Proteins zur Häm-Gruppe im aktiven Zentrum führt (Einsle et al. 2000). in W. succinogenes Q276E wurde der Glutamin-Rest gegen einen negativ geladenen Glutamat-Rest ausgetauscht. W. succinogenes Q276E wächst nicht durch Nitrit-Atmung. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug in dieser Mutante 6% im Vergleich zum Wildstamm. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität war gegenüber dem Wildstamm um 90% erniedrigt. 3. In der Mutante W. succinogenes stopl wurde das nrfl-Gen durch Einführen von zwei Stop-Codons an den Positionen 47 und 48 inaktiviert. Diese Mutante wächst nicht durch Nitrit-Atmung und besitzt keine Nitrit-Reduktase-Aktivität. Im NrfA-Protein aus W.succinogenes stopl fehlte die über das CXXCK-Motiv ligandierte Häm-Gruppe im aktiven Zentrum, während die übrigen über konventionelle CXXCH-Motive ligandierten Häm-Gruppen vorhanden waren. 4. Die Mutante W. succinogenes Kl34H/stopl, in der das stopl-Gen inaktiviert war und das CXXCK-Motiv in ein fünftes CXXCH-Motiv geändert wurde, entsprach in ihren Eigenschaften dem Stamm W. succinogenes K134H. Daraus ist zu folgern, dass das Nrfl-Protein speziell am Einbau der Häm-Gruppe am CXXCK-Motiv in NrfA beteiligt ist, während Nrfl für den Einbau an CXXCH-Motiven entbehrlich ist. Nrfl ist vermutlich eine spezielle Häm-Lyase, die den Lysin-Rest des CXXCK-Motivs erkennt. 5. Campylobacter jejuni kodiert ein NrfA-Protein, das fünf CXXCH-Motive anstelle von einem CXXCK-Motiv und vier CXXCH-Motiven enthält. In C. jejuni wird die vermutliche Häm-Gruppe des aktiven Zentrums von einem CMNCH-Motiv ligandiert, während in W. succinogenes die Bindung an einem CWTCK-Motiv erfolgt. In den Mutanten W. succinogenes CMNCK und W. succinogenes CMNCH wurde das Häm-Bindemotiv im aktiven Zentrum von NrfA dem von C. jejuni angeglichen. Keine der beiden Mutanten wuchs durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes CMNCK katalysierte den Elektronentransport von Formiat zu Nitrit mit 6% der Aktivität des Wildstamms. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug unter 3% im Vergleich zum Wildstamm. In W. succinogenes CMNCH war das NrfA-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht nachzuweisen. 6. Um die Präparation des NrfA-Proteins und des NrfHA-Komplexes zu erleichtern und um die Präparation der Untereinheit NrfH zu ermögiichen, wurden W, succinogenes Mutanten konstruiert, die einen Hexa-Histidin-Tag an NrfA oder einen Strep-Tag II am N- oder C-terminus von NrfH tragen. Es war aber nicht möglich, den Nitrit-Reduktase-Komplex oder einzelne Untereinheiten durch entsprechende Affinitätschromatographien anzureichern.
Durch die Forschung der letzten Jahre wurde zunehmend deutlich, dass die Tumorumgebung einen starken Einfluss auf Wachstum und Progression eines Tumors ausübt. Ein Schlüsselereignis ist dabei die veränderte Expression von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren im Tumor selbst oder im Tumor-Stroma und somit eine Veränderung in der Interaktion zwischen Tumor- und Stroma-Zellen. Eine solche de novo Expression der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF konnte in der Tumorprogression humaner Plattenepithelkarzinome der Haut ausschließlich im Tumorgewebe hochgradig maligner, schnell und invasiv wachsender und metastasierender Tumore mit einer ausgeprägten Vaskularisierung nachgewiesen werden (Mueller & Fusenig 1999). Um die Wirkung von G-CSF und GM-CSF getrennt analysieren zu können, wurde eine benigne Keratinozyten-Zelllinie, die die Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF exprimiert, nicht jedoch die Faktoren selbst, mit G-CSF oder GM-CSF transfiziert. Die Konsequenz der Faktorexpression wurde in je 2 transfizierten Zelllinien in vitro und in vivo analysiert. Beide Faktoren wirkten autokrin stimulierend auf die Tumorzell-Proliferation und Migration in vitro. Darüber hinaus induzierte GM-CSF die Expression von IL-6 in Tumorzellen, welches dann wiederum die Expression von GM-CSF verstärkte. Untersuchungen der transfizierten Zelllinien in vivo demonstrierten einen deutlichen Beitrag von G-CSF und GM-CSF zur Tumormalignisierung. So ergab die subkutane Injektion der G-CSF exprimierenden Zellen in die Nacktmaus nach einer Latenzzeit von 50 Tagen schnell und invasiv wachsende Tumore mit ausgeprägter Vaskularisierung, während GM-CSF exprimierende Zellen nur ein transientes Tumorwachstum zeigten. Subkutane Injektion von Gemischen der G-CSF mit den GM-CSF transfizierten Zellen demonstrierten eine frühere Häufung der Tumorbildung in Abhängigkeit von der Höhe der GM-CSF Produktion durch die eingesetzte Zelllinie. Die in vivo Progression mittels Rekultivierung von Tumorgewebe der mit G-CSF transfizierten Zellen resultierte in Zellen, die ein sehr schnelles und aggressives Tumorwachstum ohne Latenz zeigten. Diese Progression war assoziiert mit einer de novo Expression von GM-CSF, was auf einen synergistischen Effekt beider Faktoren hinweist. Für die Progressions fördernde Wirkung von G-CSF und GM-CSF spielt neben der autokrinen Stimulation der Tumorzellen vor allem die parakrine Beeinflussung des Tumor-Stromas eine Rolle. Die Analyse der Kinetik der Tumor-Stroma Interaktionen im Oberflächentransplantat ergab eine deutlich schnellere und stärkere, zum Tumor hin gerichtete permanente Angiogenese in den G-CSF exprimierenden Zellen. Diese setzte in den durch in vivo Passage entstandenen, G-CSF und GM-CSF positiven Zellen deutlich früher ein. Die Faktor negativen parentalen Zellen und die mit GM-CSF transfizierten Zellen wiesen dagegen nur eine transiente Angiogenese auf. Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Tumorumgebung war bei allen transfizierten Zelllinien beschleunigt, blieb jedoch bei GM-CSF exprimierenden Zellen wie auch bei den parentalen und Kontroll transfizierten Zellen transient, während G-CSF exprimierende und G-CSF und GM-CSF ko-exprimierende Zellen eine anhaltende Rekrutierung zeigten. Die Analyse der Kinetik der Makrophagen-Rekrutierung ergab eine deutliche Beschleunigung nur in den GM-CSF exprimierenden und den G-CSF und GM-CSF ko-exprimierenden Zellen. Die sehr frühe Gegenwart von Makrophagen in Transplantaten der GM-CSF positiven Zellen ohne die Präsenz von Granulozyten deutet im Zusammenhang mit der sehr unregelmäßigen und blasigen Epithelbildung und dem nur transienten Tumorwachstum dieser Zellen nach subkutaner Injektion auf eine durch Makrophagen ausgeübte frühe Anti-Tumor Immunität hin. Als Schlüsselenzyme der Tumorinvasion und Angiogenese wurde weiterhin die Expression Matrix degradierender Enzyme, der Matrix Metalloproteinasen, in Tumor und Stroma untersucht. Dabei konnte mit zunehmender Tumorprogression eine ansteigende Expression von MMP-2 in Tumoren, von MMP-13 in Tumor und Stroma und von MMP-3 und MMP-9 im Tumor-Stroma in direkter Nähe zum Tumor festgestellt werden, wobei die Proteasen eine der Tumor-Invasion vorangehende Deposition am Rand invasiver Bereiche des Tumors zeigten. Ein Teil der stromalen (murinen) MMP-9 positiven Zellen konnte über Immunfluoreszenz-Färbungen als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ko-Expression von G-CSF, GM-CSF und ihren Rezeptoren in humanen Plattenepithelkarzinomen der Haut einen wesentlichen Beitrag zur Tumorprogression zu einem hochmalignen Tumor-Phänotyp leistet. Dies geschieht zum einen durch eine autokrine Stimulation von Proliferation und Migration der Tumorzellen. Zum anderen stimulieren diese Faktoren parakrin die Induktion einer Tumor fördernden stromalen Umgebung und tragen so zu verstärktem Tumorwachstum und Invasion bei.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
Organismen besitzen die Fähigkeit sich Temperaturerniedrigungen anzupassen, wobei über die molekularen Mechanismen der Kälteadaptation wenig bekannt ist. Für die Untersuchung dieser Mechanismen stellt die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ein ausgezeichnetes Modellsystem aufgrund der einfachen Struktur und der Möglichkeit zur genetischen Manipulation dar. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Antwort von S. cerevisiae auf Kälte mit Hilfe von DNA Chips (6330 ORFs) charakterisiert, wobei Proben von Hefekulturen mit einer Inkubationsdauer von 10 und 30 min, 2, 12 und 60 h bei 10°C verwendet wurden. 634 Gene reagierten mit einer signifikanten Expressionsänderungen auf den Kälteeinfluss, wobei zwei distinkte Phasen, definiert als frühe und späte Kälteantwort, identifiziert wurden. Vergleiche der Kälteantwort mit Expressionsdaten verschiedener Umweltstressbedingungen ergaben differentielle Expressionsmuster. Im Vergleich zu anderen Stressreaktionen zeigten Gene der frühen Kälteantwort entweder ein entgegengesetztes Expressionsmuster (“inverser Hitzeschockeffekt”) oder keine transkriptionelle Reaktion. Dieser Effekt kehrte sich während der späten Kälteantwort in eine allgemeine Stressantwort um. Messungen des Trehalose- und Glykogengehalts sowie Studien mit einer in der Stressinduktion beeinträchtigten Doppelmutante Δmsn2/Δmsn4 bei 10°C zeigten, dass die allgemeine Stressantwort ein Teil der späten Kälteantwort ist. Dagegen deuten die Daten der frühen Kälteantwort auf eine Kälte-spezifische Reaktion hin, wobei Anpassung der Membranfluidität sowie RNA-Modifikation eine essentielle Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Kälteanpassung in S. cerevisiae wurde der ORF YBR255W mit unbekannter Funktion, dessen Deletion einen Kälte-sensitiven Wachstumsdefekt besitzt, auf molekular-biologischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die transkriptionelle Reaktion einer Δybr255w-Mutante bei Kälte (10ºC) wurde mit den Expressionsdaten des Wildtyps verglichen und zeigte starke Veränderungen während der frühen Kälteantwort, wobei nach 2 Stunden der größte Expressionsunterschied zum Wildtyp beobachtet wurde. 65% der Gene der frühen Kälteantwort zeigten YBR255Wabhängige Veränderungen, darunter Gene des Zellzyklus, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Interaktionsstudien auf genetischer und Proteinebene ergaben, dass Ybr255p mit einer Komponente des „Mitotic Exit Network“ und Komponenten des PKC1-Wegs interagiert. Die Überexpression von Ybr225p zeigte drastische Veränderungen der Zellmorphologie, wie sie ebenfalls für Mutanten des „Mitotic Exit Network“ beschrieben sind. Zusammengenommen mit der transkriptionellen Reaktion der Δybr255w-Mutante auf Kälte deuten diese Ergebnisse auf eine essentielle Rolle von Ybr255p im Zellzyklus bei Kälte hin.
The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.