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Institute
EGFL7 regulates adult neural stem cell maintenance and differentiation by inhibition of Notch1
(2010)
In neurobiology the preexisting dogma on the unchangeability of the adult mammalian brain and its inability to give rise to new neurons has been challenged since the early nineties. Generally, it is now accepted that neurogenesis persists in adults. Progress in developmental and stem cell biology in recent years led to an increasing interest in regeneration-based treatment strategies for damaged tissue of the central nervous system. Thus, the enhancement of the endogenous potential of the brain to repair itself is potentially a feasible therapeutic strategy to treat various types of brain damage. Therefore, it is of great interest to understand the molecular mechanism that regulate adult neurogenesis. One of the prominent pathways suggested to be involved here is the Notch signaling cascade. Previously, it has been shown that various components of Notch signaling are expressed in the stem cell niche of the adult subventricular zone (SVZ) in vivo. Interestingly, a recent study demonstrated that the self-renewal potential of adult neural stem cells (NSCs) isolated from the SVZ depend on Notch signaling in vitro.
Recently, we identified a novel non-canonical Notch ligand termed epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7), which was originally described as a protein secreted by endothelial cells and functionally implicated in cellular responses of the vascular system such as cell migration and blood vessel formation. We were able to show that secreted EGFL7 binds to a region in Notch that is involved in ligand-mediated receptor activation, thus acting as an antagonist of Notch signaling.
The present study identifies neurons of the human and murine brain as a novel source of EGFL7, which suggests functions of EGFL7 in the neural system. Expression analyses by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) revealed EGFL7 is down regulated in the adult SVZ, which suggests that endogenous EGFL7 may act as a Notch modulator of NSCs. We assessed the expression of Notch pathway components in adult NSCs isolated from the SVZ of adult mice and demonstrated that inhibition of Notch activity by the γ-secretase inhibitor DAPT reduced the self-renewal potential of NSCs. Accordingly, adenoviral-mediated expression of EGFL7 in vitro decreased Notch-specific signaling and reduced proliferation and self-renewal of NSCs. Conversely, activation of Notch by a constitutive active form of Notch (NICD) rescued the EGFL7-mediated reduction of NSC self-renewal verifying that this effect was directly linked to Notch signaling. Congruent to the reduced proliferation rate measured in vitro, induced expression of EGFL7 in vivo significantly reduced the number of Ki-67 positive cells within the SVZ upon cerebroventricular injection of EGFL7 adenovirus.
Expression analyses in the developing brain showed single EGFL7-positive cells within the marginal zone of the neocortex as measured by in situ hybridization. These cells might be Cajal-Retzius cells, specialized neurons, which specifically express Reelin, which is a protein of the extracellular matrix known to control neuronal migration and differentiation. Interstingly, we could show that Reelin and EGFL7 are expressed in a subtype of neurons of the adult mouse cortex. This implied an interaction of both proteins and was verified by co-immunoprecipitation assays, suggesting an additional role for EGFL7 in neuronal maintenance. QRT-PCR based expression analyses in vitro comparing differentiated and non-differentiated NSCs displayed an increase in EGFL7 expression during the differentiation process, which was paralled by reduced Notch signaling. NSCs differentiated on coverslips coated with EGFL7 differentiated into all three cell types - neurons, oligodendrocytes and astrocytes. EGFL7 favored the formation of neurons as compared to control comparable to the effect of the Notch-inhibitor DAPT. Furthermore, additional oligodendrocytes were formed. These cells displayed a mature morphology with distinct sprouts and branches in contrast to the small and round oligodendrocytes that formed on control coverslips, which resembled us of precursor cells. Neurons and oligodendrocytes were formed at the expense of astrocytes. Congruently to the effect observed in vitro, adenoviral-based expression of EGFL7 in the SVZ yielded a slight induction of neuronal differentiation in vivo. Taken together, these results show for the first time a previously unrecognized role for EGFL7 in the brain by modulation of the Notch pathway in adult NSCs, which changes the proliferation and differentiation potential of adult NSCs in vitro and in vivo.
Protein translocation across the chloroplast membrane is mediated by molecular machinery composed of protein complexes termed the TOC/TIC (the outer/inner envelope chloroplasts translocases). This translocation process is regulated by metabolic energy in form of GTP and ATP and is influenced by the lipid composition of the membrane. The ability to study the function of a single complex “TOC” in vitro using purified protein or purified chloroplast outer envelope vesicles has been instrumental for our understanding of the mechanism underlying this process.
Indeed, the TOC complex has been purified by previously established procedures. However its functional and structural analyses are impaired by the limited yield of purified protein. Therefore, protocols for native TOC complex purification are described here. The complex isolation is achieved by direct biochemical treatment of biological membrane hosting this complex or by tandem affinity purification of modified protein complex components from generated transgenic plants.
Furthermore, in this thesis, radioactive based in vitro import assays are described, namely those that allow monitoring translocation activity across the outer envelope of chloroplast. Based on the analysis of knock-out plants and isolated complexes it was previously suggested that lipid dependence of protein translocation might exist. Thus, the question was raised whether the lipid composition of the membrane has a direct influence on the behavior and functionality of the TOC translocon, or whether additional components of the chloroplast membrane account for the observed effect in vivo. To answer this question, a technique for vesicle fusion was developed. The principal aim was to explore the effect of an exchange of the lipid environment surrounding the complex translocon. This method helped to demonstrate that the SQDG and PI act stimulatory on the translocation across the outer envelope of chloroplast, whereas DGDG exhibits an inhibitory effect on TOC complex functionality.
Sponges are one of the major components of benthic communities and are considered to be a
key role organism in marine ecosystems. In addition to their importance in terms of
biodiversity, sponges are becoming increasingly attractive to the industry, as they themselves
or associated symbionts, produce various kinds of secondary metabolites of pharmaceutical
properties. Some of them have already been clinically applied.
The taxonomic characters of Porifera are limited to only a few morphological and
histological characters. In addition, sponges of the same species often show a wide
morphological variability, whereas the latter depends on different ecological parameters such
as water depth and current conditions. Thus, the taxonomic classification of sponges often
becomes a scientific challenge.
The fauna of the Yellow Sea rates among the least studied worldwide. At the same time,
according to the UN Atlas of the Ocean, the Yellow Sea is one of the most intensively
exploited marine areas in the world. This is not least due to the dense human population living
in the entire catchment area of the Yellow Sea region. In order to compile medium- and longterm
conclusions about the anthropogenic impact on biota of the Yellow Sea, the knowledge
of species and their distribution is of crucial importance, as these data form the baseline for all
future conservation efforts.
Until now the sponge fauna of the Chinese Yellow Sea is insufficiently investigated.
Thus, there is only one publication on sponges from this region that has been released
hitherto. This paper is dealing with only a view species. However, there is no reference
concerning the present location of the voucher material, on which this publication is based on.
Consequently, no scientific collection on Porifera from the Chinese part of the Yellow Sea
exists to date.
In order to compile a documentation of the recent sponge community of the Chinese
Yellow Sea, 12 study sites along the coast of the Liaoning Peninsula, China, Northeast
Yellow Sea, were investigated with focus on sponge distribution. The corresponding habitats
were characterized in regard to their topographical features, abiotic parameters, and common
composition of benthic megafaunal and macroalgal assemblages.
Due to the lack of comparable studies, a comprehensive literature research on sponges of the
shallow Northwest Pacific Ocean was required. As a result the first compilation of
publications is presented, dealing with sponges from shallow depths of the northwestern
Pacific Ocean.
Abstract
2
In the course of this study, 31 sponge species in total were recorded, which are scientifically
processed. With the exception of four all specimens were determined to species- level.
Twelve out of the total number of species are new to science and are described and classified
according to the recent taxonomic system of the phylum Porifera.
The results of this study indicate considerable differences in species composition between
investigated sites. It is shown that physical factors (particularly current regime, sedimentation,
seasonally related variations in temperatures), as well the availability of suitable substrates are
directly related to the diversity and abundance of investigated sponge communities. In this
context possible adaptation strategies of the corresponding sponges were discussed in detail.
Two sponge species, Clathria (Clathria) asodes and Antho (Acarnia) lithophoenix, formerly
known exclusively from the northeastern Pacific Ocean, are now recorded from the Northwest
Pacific Ocean for the first time. Furthermore, Penares hongdoensis, Clathria (Clathria)
hongdoensis and Celtodoryx girardae were synonymized with Penares cortius, Clathria
(Clathria) acanthostyli, and Celtodoryx ciocalyptoides respectively. Moreover, the occurrence
of eight sponge species, which were known from previous records from the Yellow Sea, could
be confirmed.
As a result of this study the Asian origin of a sponge species that is invasive to the French and
Dutch coasts of the Northeast Atlantic Ocean since the 1990s could be established. Moreover,
it is demonstrated that Celtodoryx girardae from the northeastern Atlantic is in fact
conspecific with Cornulum ciocalyptoides described by Burton (1935) from the Posiet Bay,
Sea of Japan. Apart from taxonomic remarks, variations between populations from both
oceans are examined and discussed thoroughly in regard to possible ecological implications.
The community of documented sponges shows overlapping with the one from the Sea of
Japan. According to the results it is assumed that the endemic degree of the sponges from the
Chinese Yellow Sea is rather low to moderate.
The material obtained in the course of this study was integrated in the collection of the
Senckenbergischen Naturforschenden Sammlungen. Therefore, it is the first scientific
collection of sponges from the Chinese Yellow Sea that can be consulted as a basis for all
further studies on sponges of this region.
The present study is the only investigation of sponges from Dalian and adjacent waters before
the spill occurred in the Dalian harbour in July 2010. Therefore, it provides an essential
baseline needed to assess the impact of the oil spill on benthic communities.
Strukturelle Organisation und Mobilisierung des Primaten-spezifischen Non-LTR-Retrotransposons SVA
(2011)
SVA-Elemente repraesentieren die juengste Familie der Non-LTR-Retrotransposons,
welche das humane Genom fortwaehrend modifizieren. SVA-Elemente zeichnen sich
durch ihre Organisation aus zusammengesetzten repetitiven Elementen aus. Um
Rueckschluesse auf den Assemblierungsprozess, der zur gegenwaertigen Organisation der
SVA-Elemente fuehrte, und ueber transkriptionelle Regulation dieser Elemente zu ziehen,
wurden Unterschiede in der Struktur der 116 SVA-Elemente, die auf humanem
Chromosom 19 lokalisiert sind, detailliert untersucht.
SVA-Elemente konnten in sieben unterschiedliche Strukturvarianten eingeteilt werden,
einschliesslich neuer Varianten wie SVA2, 3`-verkuerzte Elemente und Elemente mit 5`-
flankierenden Transduktionen. Ich habe auch eine extrem erfolgreiche human-spezifische
5`-Transduktionsgruppe identifiziert, SVA_F1, die trotz ihres jungen evolutionaeren Alters
ca. 32% aller Mitglieder der SVA-Subfamilie SVA_F umfasst. Die transkriptionelle
Kontrolle einer retrotransponierten und 5`-verkuerzten SVA_F-Kopie durch den Promotor
des MAST2-Gens diente als urspruengliches Source-Element dieser umfangreichen 5`-
Transduktionsgruppe, die mindestens 84 Elemente einschliesst. Die zusaetzlichen 5`-
sowie 3`-Transduktionsereignisse der vollstaendigen Alu-Sequenzen bei Mitgliedern der
SVA_F1-Transduktionsgruppe 4 weisen auf ihre wichtige Rolle in der erfolgreichen
Expansion im humanen Genom hin. Diese nachtraeglich erworbenen Alu-Sequenzen
machen SVA_F1-Familienmitglieder offensichtlich zum besseren Substrat fuer die Trans-
Mobilisierung durch die L1-Proteinmaschinerie. Die unterschiedlichen konsekutiven 5`-
Tansduktionsereignisse der SVA_F1-Familienmitglieder deuten auf transkriptionelle
Kontrolle ihrer Source-Elemente durch eine Vielzahl externer zellulaerer Promotoren hin,
die im Laufe der Evolution in Keimzellen aktiv waren. Ausserdem zeigt die Existenz von
5`-Transduktionen, dass SVA-Elemente sich die 5`-flankierenden Sequenzen aneignen
koennen. Die Daten zeigen auch, dass SVA-vermittelte 5-Tansduktionsereignisse
alternatives RNA-Spleissen an putativen Spleissstellen involvieren. Aus der EST-
Datenbankanalyse ist ersichtlich, dass Mitglieder der SVA_F1-Subfamilie auch
gegenwaertig transkribiert werden.
SVA-Elemente sind hoch aktiv im humanen Genom, aber der Mechanismus ihrer
Retrotransposition wurde bislang nicht aufgeklaert. Vorangehende Analysen genomischer
SVA-Kopien liessen auf eine L1-vermittelte Mobilisierung schliessen; allerdings wurde
der experimentelle Beweis dieser Hypothese bislang nicht geliefert. Mit Hilfe der
Zellkultur-basierten Trans-Mobilisierungsassays wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal
experimentell bewiesen, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-kodierten Proteine
in trans mobilisiert werden. Zu diesem Zweck wurden HeLa-Zellen mit einem
vollstaendigen oder mit einem 5`-verkuerzten SVA-Retrotranspositionsreporterkonstrukt
sowie mit einem L1-Expressionsplasmid bzw. Leervektor kotransfiziert und dann die
jeweiligen Raten der SVA-Retrotransposition anhand Neo-resistenter Kolonien, die
mindestens ein de novo-Retrotranspositionsereignis widerspiegeln, bestimmt. Die
Experimente zeigen, dass die Entstehung der Neo-resistenten Kolonien von der
Koexpression L1-kodierter Proteine abhaengig ist. Ich konnte auch zeigen, dass das
vollstaendige SVA-Testkonstrukt - im Gegensatz zum 5`-verkuerzten SVA-Konstrukt -
mit einer signifikant hoeheren Retrotranspositionsrate als die Kontrollkonstrukte, die zur
Generierung der prozessierten Pseudogenformation eingesetzt wurden, trans-mobilisiert
wird. Die Ergebnisse der Trans-Mobilisierungsassays belegen, dass SVA-Elemente ein
bevorzugtes Substrat fuer die L1-Proteinmaschinerie darstellen, und ihre 5`-Region
einschliesslich der Alu-homologen Sequenz fuer die hohe Retrotranspositionsrate essentiell
ist. Die elf analysierten SVA de novo-Integrationsereignisse weisen Merkmale der L1-
vermittelten Retrotransposition auf, wie Poly(A)-Enden, L1-EN-spezifische Konsensus-
Zielsequenz (NNAUNA), Zielsequenz-Verdoppelungen (TSDs), Mikrohomologien und
zusaetzliche Guanosin-Nukleotide am 5`-UEbergang.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Studien, dass ein signifikanter Teil
der Mitglieder der human-spezifischen SVA-Subfamilie aus transkriptioneller Kontrolle
ihrer Source-Elemente durch externe Promotoren hervorgeht. Durch die in dieser Arbeit
durchgefuehrten in silico-Analysen wurde auch gezeigt, dass SVA-vermittelte 5`-
Transduktionsereignisse zur strukturellen Vielfalt der SVA-Elemente fuehren, und eine
neue Art von genomischen Umstrukturierungen darstellen, die zur Plastizitaet des
humanen Genoms beitragen. Ausserdem bestaetigen die Ergebnisse der Trans-
Mobilisierungsassays die Hypothese, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-
kodierte Proteinmaschinerie trans-mobilisiert werden. Dabei sind Module am 5`-Ende der
SVA-Elemente fuer diesen Prozess hoechst relevant.
Die Ergebnisse der Dualen-Luciferase-Reportergen-Assays unterstuetzen die Hypothese,
dass innerhalb der SINE-R-Sequenz von SVA H19_27 cis-aktive Elemente vorhanden
sind, die auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von
HERV-K reguliert werden.
Ausserdem wurde in dieser Arbeit die Existenz interner reguatorischer Sequenzen
innerhalb der SVA-Sequenz bestaetigt. Mit Hilfe der Dualen-Luciferase-Reportergen-
Assays konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente
enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind. Diese cis-aktiven
Elemente werden auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR
von HERV-K reguliert. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-
Testelements und des L1RP-Promotors in den Teratokarzinom-Zelllinien bekraeftigen die
Annahme, dass haeufige SVA-Mobilisierung in Keimzellen durch die gleichzeitig
hochregulierte SVA- und L1-Transkription bedingt sein koennte.
Es konnte gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die
hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind, und auf aehnliche Weise wie die cis-
aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Die starke
transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-Testelements und des L1RP-Promotors
in Teratokarzinom-Zelllinien bestaetigen die Annahme, dass haeufige SVA-
Retrotransposition in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1-
Transkription bedingt sein koennte.
NOSTRIN belongs to the recently defined F-BAR protein family. F-BAR proteins are
multi-domain proteins, which serve as adaptors between plasma membrane and
cytoskeleton components in processes such as membrane protrusion formation,
endocytosis and migration. NOSTRIN encompasses a F-BAR domain at the N-terminus,
which mediates membrane association, followed by a HR1 motif and an intermediate
domain (ID) domain in the middle, and a SH3 domain at the C-terminus. The domain
architecture and ability to form oligomers enable NOSTRIN to coordinate several
interaction partners namely dynamin, caveolin, N-WASP and endothelial nitric oxide
synthase (eNOS) in the process of eNOS trafficking. In this context NOSTRIN was
originally identified and hence termed eNOS traffick inducer. NOSTRIN is expressed in
vascularized tissues (e.g. liver and lung) and in primary endothelial cells.
Aims of the present work were (1) to investigate if NOSTRIN is involved in other
processes besides eNOS trafficking, (2) to analyse the function of NOSTRIN in vivo
through knockdown of NOSTRIN in developing zebrafish and (3) to study the
consequences of the loss of NOSTRIN on signal transduction in a primary cell culture
model derived from NOSTRIN knockout mice.
To study the possible involvement of NOSTRIN in other processes besides eNOS
trafficking a yeast two-hybrid screen was performed in which fibroblast growth factor
receptor 1 (FGFR1) was identified as a putative novel interaction partner of NOSTRIN. In
a series of yeast two-hybrid, pulldown and co-immunoprecipitation experiments the
interaction between NOSTRIN and FGFR1 was confirmed to occur between
endogenously expressed proteins and determined to be direct and to depend on the ID
domain of NOSTRIN and the 130 C-terminal amino acid residues of FGFR1. FGFR1 is
activated by binding of fibroblast growth factors (FGFs) and induces several different
signal transduction pathways (e.g. MAPK and Akt pathway). Overexpression of
NOSTRIN in HeLa cells specifically enhanced FGF2-dependent MAPK activation.
Accordingly, depletion of NOSTRIN attenuated FGF2-dependent MAPK activation and
did not affect FGF2-induced Akt activation.
In summary, NOSTRIN has been identified as a novel interaction partner of FGFR1
involved in FGF2-dependent signal transduction.
The morpholino oligonucleotide-mediated knockdown of NOSTRIN in developing
zebrafish caused vascular leakage and irregular vascular patterning e.g. a loss of the
proper trajectory of intersegmental vessel and interruptions of the dorsal longitudinal
anastomotic vessel. The vascular phenotype was consistent upon use of two different
morpholinos and could be rescued in a dose dependent manner by the injection of
zebrafish NOSTRIN mRNA. Detailed analysis involving confocal and time lapse
microscopy in zebrafish with endothelial specific expression of EGFP revealed that the
knockdown of NOSTRIN impacts in vivo on the migration and morphology of endothelial
tip cells and leads to a reduction of filopodia number and length.
Additionally a NOSTRIN knockout mouse was generated. The analysis of FGFR1 signal
transduction in primary mouse lung endothelial cells (MLECs) from NOSTRIN knockout
and wild type mice revealed that FGF2-dependent MAPK activation was attenuated in
MLECs isolated from NOSTRIN knockout mice when compared to MLECs isolated from
wild type mice. The effect of NOSTRIN on FGF2-dependent signal transduction seems to
be specific, since VEGF-induced MAPK activation was not affected in NOSTRIN
knockout MLECs. The importance of NOSTRIN for FGF2 signal transduction in vivo is
demonstrated by the greatly impaired angiogenic response to FGF2 in NOSTRIN
knockout mice in matrigel plug assay. In a detailed biochemical analysis it was
discovered that NOSTRIN interacts with the activated small GTPase Rac1 and that
overexpression of NOSTRIN enhances Rac1 activation. Furthermore, the interactions of
NOSTRIN with both Rac1 and its GEF Sos1 are required for NOSTRIN-mediated
activation of Rac1. In accordance, activation of Rac1 was not detected upon FGF2
stimulation in NOSTRIN knockout MLECs.
In conclusion, the present work describes a novel function of the F-BAR protein
NOSTRIN in FGFR1 signal transduction. Data presented in this work demonstrate that
NOSTRIN is required for the assembly of a complex consisting of FGFR1, Sos1 and
Rac1 and subsequently for the FGF2-dependent activation of Rac1 in endothelial cells.
The long sought molecular function of membrane raft-associated flotillin proteins is slowly becoming resolved, partially owing to the increasing knowledge about their interaction partners. Being ubiquitously expressed and evolutionarily highly conserved, flotillins carry out important cellular functions, one of which is the regulation of signal transduction pathways. This study shows that the signaling adaptor protein fibroblast growth factor receptor substrate 2 (FRS2) directly interacts both in vivo and in vitro with flotillin-1 (flot-1). FRS2 is an important docking protein of many receptor tyrosine kinases. It regulates downstream signaling by forming molecular complexes with other adaptor proteins and tyrosine phosphatases, and seems to be a critical mediator of sustained extracellular signal regulated kinase (ERK) activity. Flot-1 has also been implicated in the regulation of ERK activity upon EGF and FGF stimuli. Furthermore, flot-1 forms signalosomes with EGFR and the downstream components of the MAP kinase pathway. The newly discovered interaction between FRS2 and flot-1 was shown to be mediated by the phosphotyrosine binding (PTB) domain and, to a lesser extent, the C-terminus (CT) of FRS2 and by the C-terminus of flot-1. Flot-1 coprecipitated together with FRS2 from murine tissues and cell lysates, demonstrating that this interaction also takes place in vivo. Interestingly, flot-2, which shows a high homology to flot-1 and forms stable oligomeric complexes with it, does not appear to directly interact with FRS2. Novel insights into the functional role of the interaction between flot-1 and FRS2 were provided by the results showing that depletion of flot-1 affects the cellular localization of FRS2. In hepatocytes stably depleted of flot-1, FRS2 appeared to be more soluble. Furthermore, upon pervanadate stimulation of the cells, a small fraction of FRS2 was recruited into detergent resistant membranes, but the recruitment did not take place in the absence of flot-1. Triggered by the same stimulus, a fraction of FRS2 was translocated to the nucleus independently of flot-1. Overexpression of FRS2 has previously been shown to result in increased ERK activation. However, in cells depleted of flot-1, FRS2 was not able to compensate for the compromised ERK activation after EGF or FGF stimulation. This might imply that FRS2 and flot-1 are functionally interconnected and that FRS2 resides upstream of flot-1. Taken together, the results presented here indicate that this complex may be involved in the control of signaling downstream of receptor tyrosine kinases and is important for ensuring a proper signaling response. In the absence of flot-1, increased Tyr phosphorylation of FRS2 was observed. It is known that Tyr and Thr phosphorylation of FRS2 are reciprocally regulated. Since ERK is a known executor of the FRS2 Thr phosphorylation, and ERK activity was shown to be severely diminished upon flot-1 depletion, the increased Tyr phosphorylation of FRS2 was in agreement with this and might be a direct consequence of a decreased ERK activity upon flot-1 depletion. FRS2 owes its name to the major and the first described function of this protein as a substrate for FGFR. PTB domain of FRS2 was published to constitutively bind the juxtamembrane domain of FGFR. In this study, the PTB domain was mapped to be involved in the constitutive interaction with flot-1 and the competition was shown to exist between flot-1 and FGFR1 for binding to FRS2. Another novel interaction partner of FRS2 was discovered in the present study. Cbl-associated protein (CAP) is an adaptor protein with three SH3 domains and it plays a role during insulin signaling by recruiting the signaling complex to lipid rafts. CAP was previously shown to interact with flot-1 via the SoHo domain, and this interaction was found to be crucial for the lipid raft recruitment of other signaling components. Both the PTB domain and CT of FRS2 were found to mediate the interaction with CAP, whereas in CAP, the SoHo domain, together with the third SH3 domain, seems to bind to FRS2. SH3 domains mediate the assembly of specific protein complexes by binding to proline rich sequences, several of which are present in FRS2. Due to overlapping interaction domains, FRS2 and flot-1 competed for the binding to CAP. However, the interaction with neither CAP nor flot-1 was necessary for the observed nuclear translocation of FRS2. Since CAP is expressed as several tissue- and developmental stage-specific isoforms, a further aim of this study was to analyze the expression of its isoforms in mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Many new isoforms were discovered here which have not been described in the literature so far. They all contain the SoHo domain and three SH3 domains, but differ among themselves by the presence and length of a proline-rich region that preceeds the SoHo domain and by a novel 20-amino acid (AA) stretch between the second and the third SH3 domain. The length of the proline-rich region turned out to be an important factor determining the strength of the interaction with FRS2. The interaction was found to be weakened by the increasing length of this region. The new isoforms possessing the 20-AA stretch are specifically expressed in murine muscular tissues, with the highest level in the heart. During adipogenesis, we observed a shift in the abundance of the isoforms, in that only the isoforms without the insertion were shown to be upregulated on mRNA level. However, during myogenesis, preferentially expressed isoforms were those with the insertion. The collected data implicate that isoforms with the 20-AA insertion might be more ubiquitous in nondifferentiated/embryonic cells and that the observed "isoform-switch" might be dependent on the cell fate and differentiation state.
In der vorliegenden Dissertation stand die Aufklärung der Funktion und Regulation von p21 in der Mitose im Mittelpunkt. p21 ist als Cdk-Inhibitor und Schlüsselregulator bekannt, der in viele fundamentale zelluläre Prozesse involviert ist: Zellzyklusregulation, Apoptose, Seneszenz, Zellmigration und Dynamik des Zytoskeletts, Transkription, Differenzierung sowie DNA-Reparatur, aber auch in die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (Besson et al. 2008; Abbas und Dutta 2009; Jung et al. 2010).
Die unkontrollierte Proliferation von Zellen ist mit der Tumorgenese assoziiert und wird unter anderem durch die Fehlregulation von p21, aber auch durch die wichtigen mitotischen Kinasen Cdk1, im Komplex mit ihrer regulatorischen Untereinheit Cyclin B1, sowie Plk1 bedingt. Zudem ist das Fehlen von p21 oder die Fehllokalisation in das Zytoplasma mit einer schlechteren Prognose für den Patienten und Chemotherapie-Resistenz von Tumoren verbunden (Abukhdeir und Park 2008). Aufgrund der zunehmenden Inzidenz und Mortalität von Krebserkrankungen ist es daher von besonderem klinischem Interesse, die molekularen Ursachen für die Entstehung maligner Tumorerkrankungen aufzuklären. Bislang existieren kaum Studien über welche molekularen Mechanismen die Funktionen von p21, dem wichtigsten Cdk-Inhibitor, der zum Beispiel durch die Anwendung niedermolekularer Inhibitoren wie BI 2536, das sich bereits in klinischen Phase II Studien befindet (Strebhardt 2010), beeinflusst wird, während der Mitose reguliert werden.
In der vorliegenden Dissertation wurde daher die physiologische Rolle des Cdk-Inhibitors bzw. Regulators p21 während der Mitose untersucht und mit der Kinaseaktivität von Cdk1/Cyclin B1, wie auch Plk1 korreliert. Es konnte gezeigt werden, dass p21 während der Mitose stark exprimiert wird und dass mitotisches p21 in verschiedenen Krebszelllinien unabhängig von dem p53-Status in einer phosphorylierten Form vorkommt, welche mit der Aktivität von Cdk1 und weniger mit der von Cdk2 assoziiert ist. Durch Untersuchungen der isogenen HCT116-Zelllinien mit und ohne p21 wurde aufgezeigt, wie wichtig p21 für den ordnungsgemäßen Ablauf der Mitose ist. Ohne p21 sind sowohl die Anaphase wie auch die Zytokinese verlängert, die Zellen ordnen die Chromosomen fehlerhaft in der Metaphaseplatte an (congression Fehler), besitzen weitaus mehr lagging Chromosomen und fast 20 % der Zellen weisen im Versuchsverlauf Polyploidie auf. Durch den Verlust des Cdk-Regulators p21 kommt es zur Fehlregulation von Cdk1 und seiner Substrate (wie MCAK) und es treten die oben beschriebenen Probleme auf.
Weiterhin phosphoryliert Cdk1/Cyclin B1 p21 an Ser-130 in vitro und ex vivo in der frühen Phase der Mitose, der Prophase bzw. Prometaphase. Die nicht phosphorylierbare p21 Form S130A befindet sich hauptsächlich im Zellkern und führt zu vermehrtem Auftreten von congression Fehlern, während die S130D-Mutante, die die Phosphorylierung durch Cdk1 vortäuscht, schneller degradiert wird und zudem den Phänotyp der HCT116 p21-/- Zellen verstärkt. Zellen, die S130D exprimieren, benötigen mehr Zeit für das Durchlaufen der Mitose. Hier ist vor allem die Metaphase stark verlängert, aber auch Anaphase und Zytokinese. Dies führt zu congression Fehlern und zu Polyploidie. Diese Ergebnisse bestätigen, wie wichtig die zeitlich korrekte Phosphorylierung von p21 und die dadurch vermittelte Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1 ist.
Darüber hinaus stabilisiert die Suppression von Plk1 das p21 Protein, was darauf hinweist, dass die Degradation von p21 während der Prometaphase von Plk1 kontrolliert wird. Dies wird von der Tatsache unterstützt, dass Ser-114, wie auch Ser116 von Plk1 in vitro phosphoryliert wird. Die Deregulation von p21 durch Plk1, SS114/116AA bzw. SS114/116DD induziert Chromosomenfehler, wodurch die molekularen Mechanismen, warum fehlreguliertes Plk1 die Tumorgenese fördert, hervorgehoben werden.
Nach Abschluss der bisherigen Untersuchungen steht fest, dass man sich von der starren Rolle von p21 als Tumorsuppressor und Akteur während der G1/S-Phase lösen muss. Der Cdk-Inhibitor p21 trägt entscheidend zur mitotischen Progression bei, vor allem bedingt durch die zeitlich ordnungsgemäße Inaktivierung bzw. Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1, der Kinase, die wiederum zahlreiche für die Mitose essentielle Proteine reguliert. In Zukunft muss zum besseren Verständnis der Rolle von p21 in der Mitose die genaue Abfolge der Ereignisse unter Einbeziehung der Degradationsmechanismen eingehender untersucht werden.
Im Zuge des hessischen Wiederansiedlungsprojektes für die Europäische Sumpfschildkröte (Emys orbicularis) konnten in den Jahren 2002-2007 insgesamt 79 juvenile Sumpfschildkröten an vier Standorten (NSG „Hölle von Rockenberg“, NSG „Reinheimer Teich“, NSG „Nachtweid von Dauernheim“ und NSG „Nidderauen von Stockheim“) in Hessen ausgewildert werden. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, hinreichende Kenntnisse zur Biologie, Physiologie und Ökologie der ausgesetzten Jungtiere zu erhalten. Die generellen Erfolgsaussichten eines solchen Langzeitprojektes, das Verhalten der ausgesetzten Jungtiere und deren Gesundheitszustand standen hierbei im Vordergrund der Arbeit. Anhand verschiedener Methoden (direkte Beobachtung, Radiotelemetrie, Fang-Wiederfang) wurde die Ansiedlung über einen Zeitraum von fünf Jahren überwacht. Radiotelemetrische Studien sowie eine direkte Beobachtung erbrachten hierbei Informationen zur Raum- und Habitatnutzung der Jungtiere und den daraus resultierenden Lebensraumansprüchen. Durch dieses Wissen konnten weitere, sowie bereits bestehende, Wiederansiedlungsgebiete in dieser Region durch individuelle Maßnahmen optimiert werden. Des Weiteren konnte mit temperatursensitiven Messmethoden ein Überblick über das tägliche und saisonale Körpertemperaturspektrum der Art in Hessen ermittelt werden. Vor der Wiederansiedlung sowie im weiteren Verlauf der Untersuchung wurden in den jeweiligen Gebieten diverse Biotopsmaßnahmen durchgeführt. So z.B. das Ausbringen von zusätzlichen Sonnenmöglichkeiten in Form von Stämmen, das Anlegen von permanenten und temporären Flachwasserteichen, verschiedenste Biotopspflegemaßnahmen (Entschlammen, Entbuschen) und die Offenhaltung potentieller Eiablageplätze. Diese Maßnahmen zeigten im Laufe der Untersuchung nicht nur einen positiven Effekt für die Zielart Emys orbicularis, sondern auch für weitere, bestandsbedrohte Begleitarten (z.B. die Wechselkröte Bufo viridis). Die ausgesetzten Jungtiere hatten ein mittleres Alter von 3,44 ± 1,29 Jahren (2-6 Jahre) bei einer mittlere Masse von 197,1 ± 110,2 g (66-619 g) und einer mittleren Carapaxlänge von 9,91 ± 1,77 cm (6,71-14,87 cm). Alle Tiere wurden vor dem Aussetzen durch einen Mikrotransponder und eine individuelle Farbmarkierung auf dem Panzer gekennzeichnet.
Mit Hilfe der Radiotelemetrie wurden die Aufenthaltsbereiche sowie das Wanderverhalten der Sumpfschildkröten in den Gebieten NSG „Hölle von Rockenberg“, NSG „Reinheimer Teich“ und NSG „Nachtweid von Dauernheim“ dokumentiert. Zusätzlich zu den herkömmlichen Radiotelemetriesendern konnten temperatursensitive Radiotelemetriesender verwendet werden, die sowohl über den Standort des Tieres als auch seine momentane Körpertemperatur Auskunft gaben. Es wurden hierbei insgesamt 34 Telemetriesender (9 ohne, 25 mit Temperaturfunktion) für eine Besenderung von 27 Individuen verwendet. Das entspricht einer Besenderungsquote von 42,3 %. Die durchschnittliche Masse der Sumpfschildkröten bei der Erstbesenderung betrug 238,6 ± 68,2 g bei einer Carapaxlänge von 10,80 ± 1,07 cm. Um einen Überblick über das Körpertemperaturspektrum der Art in Hessen zu erhalten, wurden temperatursensitive Radiotelemetriesender und ergänzend Temperaturdatenlogger (iButtons®) verwendet. Es zeigten sich sowohl individuelle als auch stark saisonal geprägte Temperaturmuster. Erwartungsgemäß konnten die höchsten Körpertemperaturen im Sommer (bis zu 44 °C) und die niedrigsten im Winter (bis zu -0,8 °C) dokumentiert werden. Der bevorzugte Temperaturbereich von Emys orbicularis wird aufgrund der vorliegenden Daten bei 25-32 °C vermutet. Die Aktivitätsperiode von Emys orbicularis in Hessen lässt sich von Mitte/Ende März bis Mitte Oktober, mit einem Aktivitätsmaximum in den Monaten Mai und Juni, angeben. Eine Erhöhung bzw. Erniedrigung der Körpertemperatur wurde durch Verhaltensweisen, wie Sonnenbaden oder das Aufsuchen von Wasser, erreicht. Sonnenbadende Sumpfschildkröten konnten in der Zeit von 07:15 bis 19:45 Uhr direkt beobachtet werden, die Hauptsonnenaktivität lag zwischen 09:00-15:00 Uhr. Hierbei konnte eine Tagesrhythmik des Sonnenbadens dokumentiert werden, die im Normalfall einen einphasigen Verlauf hatte. Die Schildkröten erschienen im Laufe des Vormittags auf dem Sonnenplatz und verblieben dort, unterbrochen von kurzzeitigem Aufsuchen des Wassers, bis in den Nachmittag hinein. Die bevorzugten Aufenthaltsbereiche und Strukturen unterlagen sowohl saisonalen als auch individuellen Präferenzen. Die Tiere nutzten zu 69,9 % Baumstämme als Sonnenplatz. Es wurden sowohl größere als auch kleinere Gewässer als Aufenthaltsbereich genutzt. Charakteristisch waren hier vor allem ausgedehnte Unterwasser- und Schwimmblatt-Gesellschaften in den Randbereichen, wie z.B. die „Untergetauchte Laichkrautgesellschaft“.
Die Störanfälligkeit der beobachteten Sumpfschildkröten war sehr stark individuell ausgeprägt. Es konnte aber auch beobachtet werden, dass Tiere, die gerade das Wasser verließen, und noch nicht getrocknet waren, schneller auf eine Störung reagierten, als Tiere, die schon vollständig getrocknet waren. Es ist anzunehmen, dass dieses Verhalten mit der Thermoregulation der Tiere in Zusammenhang steht. Die besenderten Tiere verblieben in den Aussetzgebieten und es konnten nur geringe Wanderbewegungen (bis max. 250 m) notiert werden. Der hierbei ermittelte Aktionsraum („home range“) variierte sowohl individuell als auch in den einzelnen Gebieten. So konnte in dem kleineren Gebiet „Hölle von Rockenberg“ (13 ha) eine zehnmal geringere Aktionsraumgröße notiert werden als in dem weitaus größeren Gebiet „Reinheimer Teich“ (75 ha). Sie betrug in Rockenberg 0,21 ± 0,03 ha (0,19 bis 0,32 ha) und in Reinheim 2,00 ± 1,58 ha (0,24 ha bis 4,71 ha). In der Phase der Überwinterung konnte keinerlei Mortalität dokumentiert werden. Als Überwinterungsplatz nutzten die Tiere in der Regel schilfbewachsene Uferbereiche mit einer Wassertiefe von 50 cm. Im Gebiet „Hölle von Rockenberg“ konnten einige Tiere mehrmalig in der Überwinterung beobachtet werden und es zeigten sich hierbei individuelle Standortpräferenzen. Die Überwinterungsplätze wurden zu 50 % wiederholt aufgesucht. In den Wintermonaten Dezember-Februar betrug die mittlere Körpertemperatur 3,09 ± 1,59 °C. Die verwendeten Fangmethoden (Sonnenfalle, Reusenfalle, Handfang) konnten nur im Gebiet „Hölle von Rockenberg“ erfolgreich eingesetzt werden. Im Gebiet „Reinheimer Teich“ konnte nur einmalig eine Schildkröte wiedergefangen werden. Die wiederangesiedelten Tiere nahmen sowohl an Masse als auch an Größe zu. Die durchschnittliche Massenzunahme betrug im Gebiet „Hölle von Rockenberg“ 40,33 ± 7,20 g (29,38-48,40 g) bei einem Wachstum des Carapax von 0,61 ± 0,08 cm (0,52-0,75 cm). Es konnten keinerlei Krankheiten oder Verhaltensauffälligkeiten dokumentiert werden. Im gesamten Untersuchungszeitraum wurde nur einmalig der Verlust eines Tieres detektiert.
Diese Massen- und Größenzunahmen sowie die Überlebensrate sprechen für die verwendeten Aufzuchtsmethoden und die ausgewählten Wiederansiedlungsgebiete. Es zeigt, dass sich die Methode des „headstarting“ bei Emys orbicularis sehr gut eignet und kann somit für solche Wiederansiedlungsprojekte durchaus empfohlen werden. Eine Stützung der Bestände durch das Auswildern „headstarted“ Emys orbicularis (aufgezogenen unter den hier vorgestellten Bedingungen) wird daher für weitere Projekte empfohlen Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lassen sich die Lebensraumansprüche der Art in Hessen benennen. Ausgehend von diesen speziellen Ansprüchen lässt sich ein optimales Emys orbicularis Habitat (für nördliche Vertreter der Art) definieren.
Zusammenfassende Grundlagen eines idealen Emys orbicularis Habitats:
- begleitendes (natürliches) Fließgewässer
- ausreichend Kleingewässer, auch als Trittsteine zum Fließgewässer
- mind. ein großes Hauptgewässer (mind. 2000 m2) mit einer Tiefe von mind. 1,50 m
- flach abfallendes Gewässerprofil mit sich schnell erwärmenden Flachwasserzonen
- ausreichend Wasser-/Unterwasservegetation
- ausreichend, ganztägig besonnte Sonnenplätze in Form von ins Wasser ragenden Stämmen und Ästen
- breiter, südexponierter Schilfgürtel zur Überwinterung
- geringer Fischbesatz zur Sicherung der Nahrungsgrundlage (Konkurrenz)
- möglichst keine fremdländischen Schildkröten (Konkurrenz)
- südexponierte, xerotherme offene Hanglage mit Magerrasencharakter zur Eiablage (im Bedarfsfall sichergestellt durch Beweidung und/oder Mahd) - keinerlei oder nur eingeschränkte freizeitliche Nutzung in Randbereichen - keine Zerschneidung der Gewässer und Wanderwege durch Straßen.
Die vorliegende Arbeit bestätigt den bisher getätigten Bemühungen zum Schutz der Europäischen Sumpfschildkröte gute Erfolgsaussichten für eine weitere Etablierung der Art in Hessen. Da die untersuchten Tiere noch nicht geschlechtsreif waren und somit noch keine Reproduktion im Freiland dokumentiert werden konnte, lässt sich der langfristige Erfolg noch nicht abschließend beurteilen. Aufgrund der bisher getätigten Untersuchungen lässt sich ein Reproduktionserfolg aber in den nächsten Jahren vermuten. Ein wichtiger Schritt zum Schutz der Europäischen Sumpfschildkröte in Hessen ist mit dem hier vorgestellten Projekt und den verwendeten Aufzuchts- und Wiederansiedlungsmethoden getan.
Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces
parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49
und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12).
In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten
mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden.
Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des
jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen
muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese-
Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des
Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces
lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als
Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium
keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei
wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten.
Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit
den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert
zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI
und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen
Elementen erlauben.
Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor
leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der
mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf
R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten
inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung
geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der
gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur
Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur
Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der
blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht
abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin.
Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der
Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des
Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein
isoliert werden konnte.
The NS5B protein of the hepatitis C virus (HCV) is a RNA-dependent RNA polymerase, which is the key enzyme for viral replication. It is recognized as one of the promising targets for antiviral intervention within the new HCV treatment approach of direct-acting antivirals (DAA). However, several of the known non-nucleoside HCV polymerase inhibitors (NNIs) identified by screening approaches show limitations in the coverage of all six major HCV genotypes (GT). Genotypic profiling therefore has to be implemented early in the screening cascade to discover new broadly active NNIs. This implies knowledge of the specific individual biochemical properties of polymerases from all GTs which is to date limited to GT 1 only. The work submitted here gives a comprehensive overview of the biochemical properties of HCV polymerases derived from all major GTs 1 - 6. Biochemical analysis of polymerases from 38 individual sequences revealed that the optima for monovalent cations, pH and temperature were similar between the GTs, whereas significant differences concerning concentration of the preferred cofactor Mg2+ were identified. Implementing the optimal requirements for the polymerases from each individual GT led to significant improvements in their enzymatic activities. However, the specific activity was distributed unequally across the GTs and could be ranked in the following descending order: 1b, 6a > 2a, 3a, 4a, 5a > 1a. Furthermore, the optimized assay conditions for GT profiling were confirmed by testing the inhibitory activity of four known prototype NNIs, each addressing one of the four NNI binding sites. Additionally, a novel NNI chemotype - identified by screening - is described, the substituted N-phenyl-benzenesulphonamides (SPBS). This inhibitor class showed reversible inhibition of NS5B from HCV 1b Con1 with IC50 values up to 39 nM. Based on the decreased inhibitory activity against a recombinant NS5B protein carrying the mutation L419M, it was assumed that the SPBS inhibitors bound to the thumb site II as it has been described for the carboxy thiophene inhibitors. The postulated binding site was consequently confirmed by analysing a provided co-crystal structure of NS5B in complex with a SPBS analogue. Notably, the two SPBS analogues SPBS-1 and SPBS-2 reported here revealed significant differences in addressing the NH-group of the main chain Y477 by hydrogen-bonds, watermediated or directly, which provoked a shift of the carboxyphenyl group of the inhibitors towards the H475 position for the water-mediated binding mode. Interestingly, the differences observed in the binding mode led to a different cross resistance profile at positions M423 and I482. Using the previously optimized biochemical primer-dependent transcription assay, inhibitory activity of the SPBS could be demonstrated against polymerases from HCV GTs 1a and 1b whereas the inhibitor class failed to inhibit any of the non-GT 1 polymerases. Furthermore, initial antiviral activity for SPBS was demonstrated against the subgenomic replicons of HCV GTs 1a and 1b, respectively, and no considerable cytotoxic potential against a panel of ten different cell types. Finally, concerning a possible future treatment without PEG-IFN α or ribavirin, the SPBS analogues were found to display additive to synergistic effects in combination with the benzothiadiazine, the benzofuran and the indole - representative inhibitors for the binding sites palm I, palm II and thumb I, repectively - in the biochemical assay. Within the same binding site as the SPBS, the reference compound hydroxydihydropyranone displayed additive interactions only with the benzothiadiazine (palm I) in the biochemical assay as well as in cell culture. Hence it could be concluded that, having characterized one individual NNI, no universal predication is possible concerning the combinatory behaviour of NNIs binding to the same binding site. As synergistic, antagonistic or additive interactions are inhibitor-dependent (not binding sitedependent) each novel NNI has to be characterized individually in one-to-one combinations.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist eines der Schlüsselenzyme der Leukotrienbiosynthese. Sie katalysiert zunächst die Umsetzung der freigesetzten Arachidonsäure(AA) zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HpETE), in einem zweiten Reaktionsschritt wandelt sie diese in Leukotrien A4 (LTA4) um. Leukotriene sind potente Entzündungsmediatoren und spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen und allergischen Reaktionen. Außerdem wird die Beteiligung an verschiedenen Krebsarten kontrovers diskutiert.
Sie besteht aus 673AS, ist 78 kDa schwer und gliedert sich wie alle bisher bekannten Lipoxygenasen in eine N-terminale C2-ähnliche, regulatorische Domäne(AS 1–114) (C2ld), die für die Membran- und Calciumbindung sowie die Interaktion mit dem Coactosin-like Protein (CLP) verantwortlich ist, und in eine C-terminale, katalytische Domäne (AS 121–673), die das Nicht-Häm-gebundene Eisen im aktiven Zentrum trägt. Ein weiteres Strukturmerkmal sind zwei ATP-Bindungsregionen, eine befindet sich in der C2ld (AS 73–83), die andere auf der katalytischen Domäne (AS 193–209), das molare Verhältnis von 5-LO zu ATP konnte dabei auf 1:1 festgelegt werden [167].
Bereits 1982 wurde in einer Veröffentlichung von Parker et al. beschrieben, dass 5-LO aus Rattenzellen in Gegenwart von Calcium auf einer Gelfiltration dimerisieren kann [204], 2008 schließlich wurde von Aleem et al. publiziert, dass humane 12-LO aus Thrombozyten Dimere bilden kann [219]. Somit konnte es möglich sein, dass auch die humane 5-LO zur Dimerisierung fähig ist.
Zunächst wurde aufgereinigtes Enzym mit nativer Gelelektrophorese und anschließender Coomassiefärbung oder Western Blot untersucht, dabei konnten mehrere Banden pro Bahn detektiert werden. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, wurde im Anschluss eine Gelfiltration etabliert; da die C2ld der 5-LO recht hydrophob ist, war es nötig, 0,5% T20 zum Elutionspuffer PBS/EDTA zuzusetzen, da das Enzym ansonsten unspezifisch mit dem Säulenmaterial interagiert und für seine Größe zu spät eluiert hätte. In Anwesenheit von T20 eluierte 5-LO in zwei getrennten Peaks, die exakt zu den vorher mit Referenzproteinen bestimmten Elutionsvolumina des Monomers und Dimers passten. Weiter wurde getestet, ob niedermolekulare Substanzen einen Einfluss auf das Dimerisierungsverhalten haben, allerdings konnte weder durch Ca2+noch durch ATP eine Verstärkung der Dimerisierung beobachtet werden. Dahingegen konnte, nach Vorinkubation mit GSH und Diamid, das alleinige Monomer auf der Gelfiltration nachgewiesen werden, nach Vorinkubation nur mit Diamid, lag das gesamte Protein ausschließlich als Dimer vor. Durch Gelelektrophorese mit oder ohne Zusatz von ß-Mercaptoethanol und LILBID-MS konnte die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken bestätigt werden. Ein Bindungsassay mit radioaktivem 35S-GSH konnte die kovalente Bindung des GSH an die 5-LO bestätigen. Quantifizierungsstudien mit Ellmans Reagens zeigten, dass mindestens eins der Oberflächencysteine mit GSH modifiziert wurde. Die von der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wurden auf enzymatische Aktivität getestet und in allen 5-LO-haltigen Fraktionen konnte Aktivität gefunden werden. Leider war es nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob das Mono- oder das Dimer aktiver war. Es liegt offenbar in einem Fließgleichgewicht vor, da erneute Injektion des Monomerpeaks im bekannten Elutionsprofil aus zwei Peaks resultierte. Außerdem führt die Anwesenheit von 0,5% T20 während des Aktivitätstests zu einer Hemmung des Enzyms und weniger detektierbaren 5-LO-Produkten; es fiel vor allem auf, dass so gut wie keinerlei trans- und epitrans-LTB4, die nicht-enzymatischen Zerfallprodukte der 5-HpETE, nachzuweisen waren. Betrachtet man die Struktur der 5-LO, so findet man zehn Cysteine an der Oberfläche; die Cysteine 159, 300, 416 und 418 liegen dabei in einem Interface. Mutiert man diese Cysteine zu Serinen, so verschwindet der Dimer-induzierende Effekt des Diamids, wohingegen die Mutante weiterhin glutathionylierbar bleibt. Interessanterweise zeigt diese Mutante auch eine wesentlich weniger ausgeprägte Hemmung durch T20. Um eine Aussage treffen zu können, ob auch 5-LO aus humanen Zellen Dimere bilden kann, wurde 5-LO-haltiger S100 aus polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) untersucht. Dabei konnte mit Western Blot und einem Aktivitätsnachweis gezeigt werden, dass die 5-LO in einem breiten Bereich von der Gelfiltration eluiert. Das deutet darauf hin, dass sie in PMNL ebenfalls dimerisiert vorliegen kann. In Gegenwart von Ca2+kam es zu einer Verschiebung der 5-LO zu höhermolekularen Gewichten, wobei dieses Phänomen nicht bei S100 aus transformierten E.coli auftrat, was auf einen gerichteten Komplex nach Calciuminduktion in PMNL hindeutet.
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit der Bindemodus von Sulindac an die 5-LO mittels Crosslinking untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass konzentrationsabhängig der einfache Komplex aus 5-LO und CLP abnimmt, dafür aber ein hochmolekularer Komplex, der beide Enzyme enthält, entsteht. Weder das Prodrug Sulindac noch der weitere Metabolit Sulindacsulfon oder andere Inhibitoren, die ebenfalls an der C2ld angreifen sollen, zeigten diesen Effekt. Leider konnte nicht weiter geklärt werden, was diesen Effekt verursacht, allerdings liegt die Vermutung nahe, dass es zu einer Aggregation kommt. Weitere Untersuchungen könnten wichtige Hinweise auf das Design von neuen Arzneistoffen bringen, um selektivere und damit nebenwirkungsärmere Inhibitoren zu finden.
Synaptic plasticity is the basis for information storage, learning and memory and is achieved by modulation of the synaptic transmission. The amount of active AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionic acid) receptors at the synapse determines the transmission properties, therefore the regulation of AMPA receptor trafficking affects the synaptic strength. The protein GRIP (glutamate receptor interacting protein) binds to AMPA receptors and is one of the important regulators of AMPA receptor stability at the synapse (Dong et al., 1997; Osten et al., 2000). Previous studies have shown that the ablation of ephrinB2 or ephrinB3 in the nervous system leads to severe defects in hippocampal LTP (long term potentiation) and LTD (long term depression) (Grunwald et al., 2004). We found that ephrinB2 ligands play an important role in the stabilization of AMPA receptors at the cellular membrane (Essmann et al., 2008). Treating cultured hippocampal neurons with AMPA resulted in a robust AMPA receptor internalization, which could be inhibited by simultaneous ephrinB2 activation with soluble EphB4-Fc fusion proteins. Conditional hippocampal ephrinB2 knock-out (KO) neurons showed enhanced constitutive internalization of AMPA receptors. Interaction and interference experiments revealed that ephrinB ligands and AMPA receptors are bridged by GRIP. This interaction is regulated by phosphorylation of a single serine residue in close proximity to the C-terminal PDZ protein target site in ephrinB ligands (Essmann et al., 2008). To investigate the in vivo relevance of this previously undescribed feature of ephrinB reverse signaling, we generated ephrinB2 S-9>A knock-in mice, where the serine at position -9 was replaced by an alanine to prevent phosphorylation. The mutated ephrinB2 of this mouse line was expressed and able to form clusters following stimulation with the preclustered receptor EphB4-Fc. Surface ephrinB2 cluster size and cluster number was slightly smaller in comparison to wild type (WT) mice. Analyzing AMPA receptor internalization, we oserved an increased basal GluR2 endocytosis in cultured hippocampal neurons of ephrinB2 S-9>A mice. Dendrite and spine morphology was similar in pyramidal CA1 neurons of brain slices from adult ephrinB2 S-9>A and WT mice, suggesting a redundancy between the different ephrinB familily members.
Apart from regulating AMPA receptor stability at the synapse, GRIP1 also has an important role in the secretory pathway to deliver cargo proteins along microtubules to dendrites and synapses (Setou et al., 2002). Proteins involved in synaptic transmission and plasticity, as well as lipids required for the outgrowth and remodeling of dendrites and axons have to be transported. We showed in our laboratory with a directed proteomic analysis using the tandem affinity purification-mass spectrometry methodology (Angrand et al., 2006) and with immunoprecipitation assays with brain lysates that the small regulatory protein 14-3-3 interacts with GRIP1. Further immunoprecipitation assays with lysates from HeLa cells transfected with various parts and sequence mutants of GRIP1 revealed that threonine 956 in the linker region L2 between PDZ6 and PDZ7 of GRIP1 is necessary for the interaction with 14-3-3. GRIP1 has been postulated to influence dendritic arborization and maintenance in hippocampal neurons in culture due to defective kinesin-dependent transport along microtubules (Hoogenraad et al 2005). In order to address the role of the association of GRIP1 and 14-3-3 in dendritogenesis, we transfected rat hippocampal neurons with GRIP1-WT and GRIP1 mutants and performed Sholl analysis to evaluate dendritic arborization defects. We could observe striking increased formation and growth of dendrites in developing neurons as well as in mature neurons overexpressing GRIP1-WT. However, overexpression of GRIP1-T956A, where the threonine 956 was replaced by an alanine to prevent phosphorylation, did not show enhanced dendritogenesis, indicating a role for threonine 956 phosphorylation in dendrite branching. To investigate the importance of the interaction between GRIP1 and 14-3-3 in vivo, we generated transgenic mouse lines with a GRIP1-T956A transgene or a GRIP1-WT transgene as control. These mice were crossed with heterozygous GRIP1 mice and by further breedings we obtained some surviver mice carrying either the wild type or the mutated GRIP1 transgene in the usually embryonic lethal GRIP1-KO background (Bladt et al., 2002; Takamiya et al., 2004). In embryonic day (E) 14.5 cultured hippocampal GRIP1-KO neurons we could observe reduced dendritic growth. We also showed reduced GluR2 staining on the dendritic surface in cultured hippocampal neurons from GRIP1-KO and GRIP1-KO neurons containing the GRIP1-T956A transgene. GRIP1-KO neurons containing the GRIP1-WT transgene showed a similar surface GluR2 signal intensity as WT neurons. Reduced surface GluR2 staining in GRIP1-KO neurons and GRIP1-KO neurons with the GRIP1-T956A transgene might be a consequence of defective kinesin-dependent transport of GluR2 to dendrites, indicating an important role of threonine 956 phosphorylation of GRIP1 for GluR2 trafficking.
Conclusion: Proteins containing a Jumonji C (JmjC) domain appear in almost all living organisms and catalyze a variety of oxidation reactions. Therefore, they are important regulators in many biological processes such as proliferation and differentiation. They act either as protein hydroxylases, histone demethylases or by regulate mRNA splicing. Given the fact that some of the JmjC domain-containing proteins are shown to be upregulated in response to hypoxia as well as the dependency of JmjC domain catalytic activity on oxygen led to the assumption of an involvement in angiogenesis. For Jmjd6, a member of the JmjC domain-containing protein family, a regulatory involvement in mRNA splicing has been shown. The Jmjd6-/- mouse dies perinatally due to several severe organ malformations, especially in the heart. Despite the pale appearance, the growth retardation and the cardiac defects, it is unclear whether these mice exhibit defects of cells comprising the vasculature. Therefore, the involvement of Jmjd6 in angiogenesis was examined in vitro using angiogenesis assays as well as in vivo using the Jmjd6+/- mouse. An siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs significantly impaired the formation of capillary-like networks in the tube formation assay as well as sprouting in the spheroid assay. Moreover, after siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs cell migration was significantly reduced. These findings were confirmed in the matrigel plug assay in vivo. Implanted matrigel plugs of Jmjd6+/- mice exhibited significantly less perfused vessels compared to wildtype littermates. Furthermore, cultured lung ECs from Jmjd6+/- mice exhibited impaired network forming activity ex vivo compared to cells isolated from wildtype littermates. To elucidate the mechanisms underlying the requirement of Jmjd6 in angiogenesis, an Affymetrix exon-array was performed, which allows detection of changes in gene expression as well as splicing. The siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 altered the expression of genes known to play a role in vascular biology. The bioinformatic assessment of alternative splice variants revealed that Jmjd6 silencing affects the splicing of the VEGF receptor 1 (Flt1). Differential splicing of Flt1 was shown to generate a short and soluble form of Flt1 (sFlt1), which sequestrates VEGF and PlGF, and thereby inhibits angiogenesis. In particular, a significant increase in sFlt1 expression was observed. Jmjd6 was recently reported to hydroxylate the splicing factor U2AF65. Therefore, we investigated whether U2AF65 might mediate Flt1 splicing and binds to Flt1 mRNA. Indeed, U2AF65 co-immunoprecipitated with Jmjd6 in ECs, while an interaction of U2AF65 with sFlt1 was demonstrated. Moreover, inhibition of Jmjd6 catalytic function by reduced oxygen concentration altered splicing of Flt1 resulted in an increase of the sFlt1 splice variant. Finally, saturating concentrations of VEGF or PlGF or neutralizing antibodies against sFlt1 significantly reduced the inhibition of sprouting caused by Jmjd6 knockdown in vitro.
Collectively, our results indicate that Jmjd6 has an essential role in the oxygen-dependent regulation of angiogenesis by controlling the splicing of Flt1 mRNA, thereby adjusting the generation of the anti-angiogenic short splice variant sFlt1. Several publications demonstrated a major importance for sFlt1 as a biomarker for many severe human diseases such as preeclampsia, sepsis, cancer, myocardial infarction as well as chronic heart failure. Therefore, the identification of the molecular mechanism behind the generation of sFlt1 might enable the development of new or more precise clinical markers for the diagnosis of the corresponding diseases. Furthermore, the discovery of the enzymes involved in the generation of sFlt1 provides further possibilities to modulate sFlt1 levels and thereby may potentially gives rise to the development of new therapies.
Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML) auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2 (NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird.
Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler Vektoren analysiert.
Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische, AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2-Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe Bioverfügbarkeit zu erreichen.
In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet, um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV-Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV-Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen. Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2-Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2-Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war, zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven Zellen auslösen.
The translocation of nuclear-encoded precursor proteins into chloroplasts is a highly ordered process involving the action of several components to regulate this molecular ensemble. Not only GTP hydrolysis and GDP release but also the phosphorylation of TOC GTPases is a widely discussed mechanism to regulate protein import. The receptor component (Toc34) and its isoform of A. thaliana (atToc33) were found to be regulated by phosphorylation. Although the phosphorylation of Toc33 is already known for several years, several questions regarding the molecular components involved in the regulation of the phosphorylation process, precisely what is the protein kinase and where this kinase is initially localized, so far remained unclear.
This thesis aimed at the defining of the phosphorylation status of TOC GTPases in monomeric and/or dimeric states, the identification of the nature of Toc33-PK (protein kinase), and in the same context it aimed at gaining first insights into the physiological significance of Toc33 phosphorylation. To this end, (I) An in vitro and in vivo system for investigating of TOC GTPases Phosphorylation (in monomeric or dimeric state) was developed. Since no information is available about the phosphorylation status of the Toc159 isoforms, the second receptor of the TOC complex, it was interesting to investigate whether these isoforms undergo phosphorylation or not. The results indicated that atToc159 isoforms are able to be phosphorylated by the kinase activity in purified outer envelope membranes (OEMs) of pea, but not atToc132. Moreover, an artificial dimer of psToc34 based on the interaction of a C-terminally fused leucine zipper was not phosphorylated. This result reflected the inability of the OEM kinase to phosphorylate the dimers of TOC GTPases. Also, In vivo labeling of atToc33 was developed and occurred in a dose-dependent manner. Therefore, this results evidenced that in vitro phosphorylation of atToc33 (both endogenous wild type and recombinant expressed proteins) is not artificial labeling but represents a physiological relevance. CD (circular dichroism) measurements revealed that recombinant GTPase domain of atToc33 is preferentially phosphorylated in its folded state. Therefore, it could be suggested that folding of atToc33rec is a prerequisite for its phosphorylation and the phosphorylation event occurs as a posttranslational modification most likely after insertion of Toc33 (Toc34) into the OE of chloroplasts.
Secondly, (II) Isolation and identification of Toc33-PK from OEMs of chloroplasts was performed. Four independent strategies were developed to identify the Toc33-protein kinase: UV-induced and chemically-based crosslinking, different applied chromatographic techniques, identification of PK-Toc33 interaction by means of HDN-PAGE (histidine- and deoxycholate-based native PAGE), and finally mass spectrometric approaches were performed on fractions including the potential kinase activity. UV-induced crosslinking procedure was developed and resulted in covalent bonding of nine proteins to [a-32P] ATP, while chemically-based one was not significant. The applied chromatographic and HDN-PAGE approaches, including mass spectrometry, have revealed the identification of 13 protein kinases. Of these identified kinases, phototropin2 (Phot2, AT5G58140), leucine-rich repeat PK (LRR-PK, AT4G28650.1), and receptor-like transmembrane PK (RLK, AT5G56040.2) were selected as the most promising candidates (ca. kinase type and one transmembrane helix for membrane localization).
(III) The physiological significance of Toc33 phosphoryation was shown to link this process with the environmental changes (especially, the light conditions). Identification of chloroplast OE-located PKs performed by nLC-MALDI-MS/MS resulted in the detection of Phot2. Furthermore, the subcellular localization of Phot2 in OEM of chloroplasts was confirmed by immunoblotting experiments using a-Phot2 antibody. The kinase activity of Phot2 towards TOC GTPases was characterized and revealed that fused GST-KD (kinase domain) protein able to specifically phosphorylate atToc33rec, but not atToc159rec. Also, endogenous atPhot2 was upregulated and heavily detected in the ppi1-S181A plant line (where serine to alanine exchange was performed to abolish the phosphorylation of atToc33). Hence, we suggested that certain signal cascades may directly or indirectly link Toc33 receptor phosphorylation, protein levels of Phot2 (as promising PK candidate), and irradiation conditions (as an inducing signal of the subsequent phosphorylation events). Light-dependent phosphorylation of Toc33 was shown either after de-etiolation conditions or after high light intensities of blue light was performed. Therefore, phosphorylation of Toc33 might be identified as an external regulatory signal to regulate preproteins import into chloroplasts in response to environmental conditions (e.g. light changes) or as a signal of chloroplast biogenesis.
Development of lentiviral vectors for the gene therapy of X-linked chronic granulomatous disease
(2010)
Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf einen einzelnen Gendefekt zurückzuführen sind (monogene Erkrankungen). Darunter befindet sich auch die Gruppe der primären Immundefizienzen (PIDs), von denen aktuell über 150 verschiedene Typen von der Weltgesundheitsorganisation registriert sind. In vielen fällen leiden betroffene Individuen unter einem stark erhöhten Infektionsrisiko durch bakterielle oder virale Pathogene, sowie den damit verbundenen schweren Symptomen - bis hin zum verfrühten Tod der Patienten. Meist können PIDs mit konventionellen Methoden präventiv behandelt werden. Dazu gehören zum Beispiel die regelmässige Gabe von Antibiotika, Antimykotika, Zytokinen oder Immunglobulinen. Der einzige zur Verfügung stehende kurative Behandlungsansatz beruht auf der Transplantation von hämatopoietischen Stammzellen (HSZT) eines gesunden und passenden Spenders. Häufig steht jedoch kein histokompatibler Spender zur Verfügung.
Für diese Patientengruppe hat sich die gentherapeutische Behandlung mit autologen hämatopoietischen Stammzellen als eine gute Option herausgestellt. Der Beweis hierfür wurde eindrucksvoll in klinischen Heilversuchen für zwei Formen des Schweren Kombinierten Immundefekts (X-SCID und ADA-SCID) geführt, einer Erkrankung die durch das vollständige Fehlen bzw. die nicht-Funktionalität der lymphoiden Immunzellen charakterisiert ist. Autologe hämatopoietische Stammzellen der Patienten wurden hier ex vivo mittels eines gamma-retroviralen Vektors mit einer funktionellen Kopie der defekten cDNA genetisch modifiziert und anschliessend zurück infundiert. In der Summe wurde bei über 30 Patienten eine deutliche Verbesserung des Gesundheitszustandes bis hin zur vollständigen Heilung erzielt. Bei einem vergleichbaren Ansatz wurden in Frankfurt, in einem Heilversuch für die septische Granulomatose (X-CGD), erstmals klinisch relevante Erfolge in der Gentherapie für einen Defekt in der myeloischen Linie von Immunzellen erzielt. Ursache der X-chromosomal gekoppelten Form der septischen Granulomatose sind Mutationen in dem Gen für gp91phox (CYBB), einer essentiellen Untereinheit des in Phagozyten benötigten NADPH-Oxidase Komplexes. In der Folge sind die Phagozyten dieser Patienten nicht mehr in der Lage, die für das Abtöten von Krankheitserregern nötigen reaktiven Sauerstoffspezies zu bilden. Ständig wiederkehrende schwere Infektionen mit sonst unproblematischen Erregern sind die Folge.
Neben klaren gesundheitlichen Verbesserungen in der Mehrzahl der Patienten hatte diese Gentherapeutische Behandlungsstrategie in einigen Fällen auch klare Nebenwirkungen. In fünf von 20 Patienten mit X-SCID, sowie in beiden behandelten X-CGD Patienten, kam es infolge der Therapie zu hämatologischen Veränderungen, die in der Ausbildung eines myelodysplastischen Syndroms (bei X-CGD) und Leukämie (bei X-SCID) mündeten. In allen Fällen war die Ursache eine Hochregulierung von Proto-Onkogenen in der Nähe von g-retroviralen Integrationsstellen. Diese Probleme demonstrieren deutlich die unbedingte Notwendigkeit zur Verbesserung der verwendeten therapeutischen Vektoren.
In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren mit myeloid-spezifischen Promotoren entwickelt und auf ihre Eignung für die Gentherapie der X-chromosomal gekoppelten septischen Granulomatose getestet. Lentivirale Vektoren besitzen ein stark verringertes Risiko für Insertionsmutagenese, sowie die exklusive Fähigkeit ruhende Zellen zu transduzieren. Die Verwendung von myeloid-spezifischen Promotoren für die Transgenexpression verringert die Wahrscheinlichkeit der Proto-Onkogen Aktivierung in unreifen Stamm- und Vorläuferzellen – einer Zellpopulation die besonders sensitiv für die in der Leukämieentstehung obligaten Schritte der Immortalisierung und Transformation ist. Gleichzeitig bleibt der volle therapeutische Nutzen erhalten, da das Transgen gp91phox nur in reifen myeloischen Zellen benötigt wird.
Die entwickelten lentiviralen Vektoren exprimieren eine kodonoptimierte gp91phox cDNA unter der Kontrolle des microRNA223-Promoters (223), des MRP8-Promotors (M) oder eines chimären Fusionspromoters bestehend aus den regulatorischen Bereichen des Cathepsin G und des cFes-Promotors (Chim). Zusätzlich wurde ein sogenanntes „ubiquitär aktives Chromatin-öffnendes Element“ (UCOE) in beiden Orientierungen vor den MRP8-Promotor kloniert, um eine erhöhte und stabile Langzeitexpression des Transgens zu erreichen. Ziel der Arbeit war die Selektion eines geeigneten Kandidaten für präklinische Versuchsreihen.
Die für die Evaluierung der Vektoren relevanten Parameter waren die Transgenexpressionslevel, die Spezifität der Expression für myeloische Zellen sowie die vermittelte funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität. Die Fragestellungen der Langzeitexpression, der Anfälligkeit für CpG-Methylierung sowie der Genotoxizität der Vektoren wurden ebenfalls bearbeitet. Die Vektoren wurden in vitro in verschiedenen Zelllinien sowie in in vitro differenzierten primären murinen und humanen Blutstammzellen getestet. Die beiden besten Kandidaten (223 und Chim) wurden in vivo in Maustransplantationsexperimenten (Maus-Maus und humane Stammzellen in NOD/SCID-Mäuse) analysiert.
Die beiden lentiviralen Vektoren 223 und Chim eignen sich beide für eine effiziente Expression in myeloische Zellen, die zur funktionellen Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität in vitro und in vivo führen. Sie sind den bisher in klinischen Anwendungen verwendeten Vektoren in allen Parametern klar überlegen. Daher ist in zukünftigen klinischen Anwendungen ein verbesserter therapeutischer Nutzen für die Patienten sowie eine Verminderung des Risikos von Nebenwirkungen zu erwarten.
Plastids are complex organelles that fulfil numerous essential cellular functions, such as
photosynthesis, amino acid and fatty acid synthesis. he majority of proteins required for
these functions are encoded in the nuclear genome and synthesised on cytosolic ribosomes as
precursors, which are posttranslationally transported to and imported into the organelle by
concerted actions of translocons in the outer and inner chloroplast membrane. For most
preproteins, targeting to the organelle is ensured by a specific import signal, a so called
transit peptide, which is specifically recognised by receptors at the chloroplastês surface. A transit peptide is generally defined as essential and sufficient for precursor targeting to and
translocation into chloroplasts, (however, an analysis of the ability of transit peptides to drive translocation of tightly folded passenger domain revealed that the transit peptide is not
always sufficient for the translocation event. A critical signal length requirement of amino
acids has been determined in vivo and in vitro. In the case of shorter transit peptide, the
succeeding portion of the mature domain provides an extension of an unfolded polypeptide
stretch required for successful translocation. The analysis of the unfolding mode of a folded
model passenger during translocation links the observed transit peptide length requirement
to the action of an energising unit present in the intermembrane space of chloroplasts.
The likely candidate for this energising unit space is putative imsHsp70, previously hypothesised to function in translocation of precursor proteins across the outer membrane. However, as the identity of this protein has up to now remained unknown, its existence has
been a matter of debate. The present study focuses on the isolation and characterisation of
imsHsp70 at the molecular level. Mass spectrometry analyses and in vivo localisation studies
demonstrate that while no specific imsHsp70 exists, multiple cytosolic Hsp70 isoforms are
targeted to the intermembrane space, but not to the stroma of chloroplasts. Thus, a so far unrecognised mode of dual targeting to chloroplasts and cytosol is most likely to ensure the
allocation of (sp s into the intermembrane space.
Clathrin-mediated endocytosis (CME) involves spatially and temporally restricted molecular dynamics.
Although protein kinases and the actin cytoskeleton contribute to the process, whether and how
functions of kinases and actin are integrated remains unknown. Here, we demonstrate that neural
Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) and protein kinase CK2 form a complex and localize on
clathrin-coated vesicles (CCVs). N-WASP binds to and is phosphorylated by CK2, thereby reducing the
kinase activity of CK2. By contrast, N-WASP-promoted actin polymerization is decreased upon both
phosphorylation and binding of CK2. Knockdown of N-WASP and CK2, alone or in combination, results
in impaired endocytosis of epidermal growth factor (EGF) and increased cell-surface levels of EGF
receptor (EGFR). In order to rescue the phenotype of N-WASP-CK2 knockdown cells, both N-WASP and
CK2 activities and abilities to assemble in a complex are required. In summary, this study shows that the
N-WASP-CK2 complex integrates in a single circuit different activities contributing to CME of EGFR and
that the interplay between the two proteins optimizes this process.
The canonical Wnt/β-catenin and the Shh pathway as well as the Notch signaling cascade
are key regulators in stem cell biology and are independently associated with the development
of cancer. Despite the knowledge of a balanced signaling for cellular maintenance, the
fundamental biochemical mechanisms of crosstalk are still poorly understood. This study
demonstrates that the outcome of interaction between Wnt and Shh is cell type specific. A
combined inhibitory mechanism of the Shh and Notch2/Jagged2 pathways on dominant
active β-catenin signaling in the adult tongue epithelium keeps Wnt/β-catenin signaling
restricted to physiological tolerable levels. In the opposite crosstalk the activation of
Wnt/β-catenin signaling in medulloblastoma (MB) of the Shh subtype, in turn inhibits the Hh
pathway.
The inhibitory mechanism of Shh and Notch2/Jagged2 on Wnt/β-catenin signaling is
independent of the degradation complex of β-catenin and takes place inside the nucleus.
Furthermore, the negative feedback on Wnt/β-catenin signaling by the Shh pathway relies
on transcriptional activity of Gli1/2A. Inhibition of Gli1/2A with the specific inhibitor GANT61
abrogated the negative impact of Shh on β-catenin signaling in vitro. Although the negative
feedback loop of Shh is still functional in human SCC25 cells, the inhibitory effect of
Notch2/Jagged2 is lost and contributes to the cancerogenic phenotype of these cells. In the
inverse situation, the activation of β−catenin signaling has a negative feedback on
constantly active Shh signaling and significantly inhibits the Hh pathway. This was shown in
Ptch+/- and Math1-Cre:SmoM2Fl/+ MB tumor spheres in vitro, in which inhibition of sphere
formation and growth was observed and Hh target gene transcription was down-regulated.
This demonstrates for the first time that the activation of canonical Wnt/β-catenin signaling
in primary MB cells with a Hh pathway over-activation has a negative effect on the growth of
these cells in vitro.
In summary the results show that crosstalk of Wnt/β-catenin and Shh signaling has context
specific outcome on pathway activity. Elucidation of the molecular interactions will improve
our understanding of Wnt and Hh associated tumors and contribute to the development of
new therapeutic strategies.
Menschliche Aktivitäten beeinflussen beinahe alle Bereiche des Lebens auf der Erde (MEA 2005a; UNEP 2007). Die Zerstörung und Veränderung natürlicher Lebensräume sind als Hauptursache für den weltweiten Biodiversitätsverlust identifiziert (Harrison and Bruna 1999; Dale et al. 2000; Foley et al. 2005; MEA 2005a). Zusammen mit dem Klimawandel wird die Landnutzungsveränderung daher als einflussreichster Aspekt anthropogen verursachten globalen Wandels betrachtet (MEA 2005a). Landnutzungsveränderung schließt sowohl die Umwandlung natürlicher Habitate in Agrarland oder Siedlungen als auch die Landnutzungsintensivierung in bereits kultivierten Landschaften mit ein. Diese Veränderungen haben weitreichende Konsequenzen für die Artenvielfalt und resultieren häufig in dem Verlust von Arten mit zunehmender Intensität der Landnutzung (Scholes and Biggs 2005).
Biodiversität und Ökosysteme stellen viele verschiedene Funktionen zur Verfügung, wie z. B. die Sauerstoffproduktion, die Reinigung von Wasser und die Bestäubung von Nutzpflanzen.
Einige dieser Funktionen sind hilfreich, andere wichtig und wieder andere notwendig für das menschliche Wohlergehen (MEA 2005b; UNEP 2007). Mittlerweile sind Ökosystemfunktionen und die vielen Nutzen, die sie erbringen, zu einem zentralen Thema der interdisziplinären Forschung von Sozialwissenschaften und Naturwissenschaften geworden (Barkmann et al. 2008 und darin enthaltene Referenzen). Dadurch bedingt ist es zu einiger Verwirrung bezüglich der verwendeten Begriffe der "Ökosystemfunktion" (engl. "ecosystem function") und dem der "Ökosystemdienstleistung" (engl. "ecosystem service") gekommen (deGroot et al. 2002). Da der Fokus meiner Arbeit auf grundlegenden Funktionen von Ökosystemen liegt, verwende ich im Folgenden den Begriff der Ökosystemfunktion.
Für viele Ökosystemfunktionen ist noch sehr unzureichend bekannt, wie diese von externen Störungen beeinflusst werden (Kremen and Ostfeld 2005; Balvanera et al. 2006). Ökosystemfunktionen werden selten von nur einer einzigen Art aufrechterhalten, sondern meist von einer ganzen Reihe unterschiedlicher taxonomischer Gruppen – alle mit ihren ganz eigenen Ansprüchen. Diese Arten, wie auch deren intra- und interspezifischen Interaktionen, können durchaus nterschiedlich auf die gleiche Störungsquelle oder Störungsintensität reagieren. Dies kann Vorhersagen zum Verhalten von Ökosystemfunktionen extrem erschweren. ...
5-lipoxygenase (5-LO) catalyzes the first two steps in leukotriene (LT) biosynthesis. In a two step reaction the enzyme oxygenates arachidonic acid (AA) to form the highly unstable epoxide leukotriene A4 (LTA4) in dehydrating a hydroperoxide intermediate (20). LTA4 can then be further metabolized by two terminal synthases yielding either the potent chemoattractant leukotriene B4 (LTB4) or the cysteinyl leukotrienes (CysLTs). 5-LO enzyme expression is primarily found in mature leukocytes (22) where it can either reside in the cytoplasm or in the nucleus associated with euchromatin (29). Its enzymatic activity is embedded in a complicated network in intact cells regulating LT synthesis by various factors dependent on the cell type and nature of stimulus. Factors such as the amount of free AA released by phospholipase A2 enzymes, levels of enzymes involved, catalytic activity per enzyme molecule and availability of different small molecules influence 5-LO activity (36).
The 5-LO derived LTs are lipid mediators which were shown to primarily mediate inflammatory and allergic reactions and their role in the pathogenesis of asthma is well defined. CysLTs are among the most potent bronchoconstrictors yet studied in man and play an important role in airway remodeling. LTB4 has no bronchoconstrictory effects in healthy and asthmatic humans but displays potent chemoattractant properties on neutrophils and increases leukocyte adhesion to the vessel wall endothelium (22). Therefore, LTB4 enhances the capacity of macrophages and neutrophils to ingest and kill microbes. In concert with LTB4, histamine and prostaglandin E2 (PGE2) CysLTs are thought to maintain the tone of the human airways (82).
Besides their well studied role in asthma, 5-LO derived LTs have also been implicated to play a role in cardiovascular diseases and cancer. In contrast to healthy tissues, LT pathway enzymes and receptors were found to be abundantly expressed in cancer tissues, atherosclerotic lesions in the aorta, heart and carotid artery (86). Pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumour cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway (92, 93). In several studies LTs were found to exhibit cardiovascular actions by promotion of plasma leakage in postcapillary venules, coronary artery vasoconstriction and impaired ventricular contraction leading to reduced coronary blood flow and cardiac output (24). Unfortunately, the precise molecular mechanisms through which LTs influence carcinogenesis and cardiovascular diseases are still incompletely understood.
In contrast, an increasing number of studies questions the correlation between 5-LO and cancer (95-97) since extreme LT concentrations were applied to induce proliferative effects in the majority of the publications. A few studies exist which show susceptibility towards 5-LO products in physiological concentrations or achieve anti-proliferation by applying low concentrations of 5-LO inhibitors (98) ...
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
Die Diatomee C. meneghiniana reagiert sowohl auf Veränderung der Lichtintensität während des Wachstums, als auch auf Veränderungen der Eisenkonzentration im Medium. Die Erhöhung der Lichtintensität respektive die Erniedrigung der Eisenkonzentration im Medium wurden als Stresssituationen für C. meneghiniana definiert. Unter Stressbedingungen findet zunächst eine generelle Erhöhung der Zellzahl statt, wobei das Volumen der einzelnen Zellen unter Eisenmangelbedingungen stark reduziert wird. Aus diesem Grund findet man schließlich unabhängig von der Lichtintensität in den Eisenmangelkulturen niedrigere Werte für die Biovolumina als in den Kulturen mit Eisensättigung.
Es konnten je nach Kulturbedingung kleine Unterschiede in der äußeren Morphologie der Silikatschalen festgestellt werden, die sich jedoch im Rahmen der normalen Variationsbreite bewegen und daher nicht signifikant sind. In allen Kulturen konnten auf Grund der schonenden Präparationsmethode die für C. meneghiniana als typisch beschriebenen Schwebfäden aus Chitin beobachtet werden.
Die Größe der Phäoplasten ist in den Eisenmangelkulturen und in de Starklichtkulturen deutlich geringer, weshalb auch die Anzahl der Thylakoidbänder sinkt. Die für Diatomeen typische Dreifachbänderung der Thylakoide bleibt jedoch immer erhalten. Zudem zeigen die Phäoplasten der LL 12 – und HL 12 – Zellen Ansammlungen eines Stoffs, der zwar nicht näher identifiziert wurde, wobei es sich aber höchstwahrscheinlich weder um Lipid-Globuli noch um das als Speicherstoff bei Diatomeen vorkommende -1,3-Glucan Chrysolaminarin handelt.
Die Färbung der Kulturen zeigt bereits eine Veränderung in der Pigmentierung der Zellen in Abhängigkeit von der Kulturbedingung. Der Chlorophyllgehalt pro Zellen wird vor allem unter Eisenmangel reduziert, während es in Zellen der HL – Kulturen zu einer Verdoppellung des Gehalts an XC – Pigmenten kommt. Die Kombination beider Effekte führt dazu, dass die HL 12 und der LL 1 – Kultur gleichermaßen hellbraun gefärbt sind, die Färbung der HL 1 – Kultur jedoch beinahe gelb ist. Die hellere Färbung der Eisenmangelkulturen ist wahrscheinlich als Chlorose anzusehen und eine klassische Folge von Eisenmangel bei Diatomeen. Die zugehörigen DEORs der ganzen Zellen sind in den HL – Kulturen anfangs sehr hoch und sinken später.
Die Ursache ist vermutlich in der hohen Lichtintensität und der durch Erhöhung der Zellzahl im Verlauf der Anzucht entstehenden gegenseitigen Beschattung der Zellen zu sehen. Hierfür spricht auch die parallel stattfindende Abnahme der XC – Pigmente – Konzentration.
Die Ermittlung der PS I : PS II – Stöchiometrien zeigt, dass sich offenbar auch die innere Architektur der Thylakoidmembran verändert. So liegt das relative, berechnete Verhältnis von PS II zu PS I nur in der LL 12 – und der HL 1 – Kultur bei 2 : 1. Dieses Verhältnis wird üblicherweise für küstennahe unter den den Anzuchtbedingungen vergleichbaren Lichtverhältnissen lebende Spezies angenommen. Die HL 12 - und die LL 1 – Zellen hingegen weisen ein Verhältnis von 1 : 1 auf. Da es nicht möglich ist, die Veränderung in beiden Kulturen entweder mit Eisenmangel oder Starklichtstress zu erklären, muss hier von unterschiedlichen Ursachen ausgegangen werden.
Die Reoxidationskinetiken weisen darauf hin, dass die Übertragung der Energie von QA an QB je nach Kultur unterschiedlich schnellen Kinetiken folgt. Dies ist wiederum durch die Bindungsart des QB, bzw. seine Verfügbarkeit als Akzeptor bedingt.
In den O-J-I-P-Messungen zeigt sich zunächst, dass die F0 – Werte der Eisenmangelkulturen niedriger liegen. Als Ursache hierfür wird eine Verkleinerung der Antenne des PS II, die sich durch den unter Eisenmangel deutlich erniedrigten Chlorophyllgehalt pro Zelle erklären lässt, und die dadurch bedingte Verringerung der Fluoreszenz angenommen. Deutlich ist zudem, dass die Energie in den HL – Kulturen deutlich schlechter von QA an QB weitergegeben wird, weshalb auch die daraus resultierenden Fv/FM – Werte deutlich niedriger sind. Als Erklärung hierfür kommt der unter HL stark erhöhte XC – Pool in Frage, der bekanntermaßen am nichtphotochemischen Quenching beteiligt ist, das wiederum vor allem unter Lichtstress auftritt.
Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm –Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm – Absorption bei, Fraktion II und IV mit der Auswertung der Slotblotsignale für die Photosysteme korreliert.
Die endgültige Aufreinigung der FCPs wurde letztlich mit diskontinuierlichen Saccharosegradienten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass alle FCP – Fraktionen nach der Anionenaustauscherchromatografie einen mehr oder weniger großen Anteil an Verunreinigungen durch Photosysteme enthalten, die auf diese Weise abgetrennt werden konnten.
Die Kulturbedingungen haben zwar keinen Einfluss auf den Oligomerisierungsgrad von FCPa, bzw. FCPb, allerdings konnten Unterschiede in der Stabilität der Komplexe festgestellt werden. FCPa scheint unter LL weniger stabil zu sein, während der FCPb unter Eisenmangelbedingungen einen Teil seiner Stabilität einbüßt. Weiterhin kann in der Gelfiltration des FCPa kann nur eine Schulter beobachtet werden und im FCPb sieht man teilweise sogar zwei Schultern. Da sich die Schulter mit der längeren Retentionszeit auf Höhe der Monomerschulter des FCPa befindet, und die Retentionszeit der anderen Schulter beinahe der des FCPa-Trimers entspricht, könnte dies die Hypothese unterstützen, dass der FCPb ebenfalls aus Trimeren aufgebaut ist. Kleine Verschiebungen in der Retentionszeit wären durch das unterschiedliche Molekulargewicht der Monomere erklärbar.
Die SDS – PAGE zeigt zunächst keine Veränderungen in der Zusammensetzung der FCPs unterschiedlicher Kulturbedingungen. Einzig die beiden HL –FCPb – Proben weisen eine hochmolekulare Bande bei ca. 62 kDa auf, die nicht näher identifiziert werden konnte. Auf Grund der Größe kann jedoch ausgeschlossen werden, dass es sich um Kopurifikation des unter Eisenstress bei Diatomeen häufig als Ersatz für Ferredoxin vorkommenden Flavodoxins oder einen Eisentransporter handelt. Die Inkubation mit spezifischen Antikörpern gegen einzelne fcp – Proteine zeigt, dass die 18 kDa – Bande des FCPa fcp2 enthält und die 19 kDa – Bande fcp6. Die 19 kDa – Bande des FCPb reagiert jedoch nicht mit dem fcp6 – Antikörper. Da aus C. cryptica nur noch zwei weitere fcp – Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 19 kDa bekannt sind und fcp7 auf Aminosäureniveau eine sehr hohe Ähnlichkeit mit dem fcp6 aufweist, kann man vermuten, dass es das entsprechende Protein im FCPb der fcp5 ist.
Membrane proteins (MPs) constitute about 30% of the genome and are essential in many cellular processes. In particular structural characterisation of MPs is challenged by their hydrophobic nature resulting in expression difficulties and structural instability upon extraction from the membrane. Despite these challenges, progress in sample preparation and the techniques to solve MP structures has led to 281 unique MP structures as of January 2011. Through the combination of a cell-free expression system and selective labelling strategies, this thesis aimed to advance the structure determination of α-helical MPs by NMR spectroscopy and resulted in the structure determination of a seven-ransmembrane-helix protein. Results were obtained for the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) and proteorhodopsin (PR). The detergent-based cell-free expression mode proved most efficient for production of both targets, but optimisation of FLAP and PR followed different routes. The presence of a retinal cofactor in PR greatly facilitated the search for an appropriate hydrophobic environment. For structural studies, NMR spectra of FLAP indicated favourable properties of the lysolipid LPPG. In contrast, PR was stable and homogenous in the short-chain lipid diC7PC. As NMR spectra of α-helical MPs are generally characterised by broad lines and signal overlap, selective labelling strategies were essential in the assignment process of both targets. For the backbone assignment of FLAP the transmembrane segment-enhanced (TMS) labelling was developed, employing the six amino acids AFGILV. These residues cluster predominantly in transmembrane helices and form long stretches allowing a large extent of backbone assignment. Besides that, the combinatorial labelling enables identification of unique pairs in the sequence based on a mixture of 15N and 1-13C-labelled amino acids. To find the optimal labelling pattern for a given primary structure, the UPLABEL algorithm has been made available and successfully applied in the backbone assignment of PR. Both selective labelling approaches greatly benefitted from the use of a cell-free expression system to reduce isotope scrambling. Additionally, the de novo structure of PR was determined with an average backbone rmsd of 1.2 Å based on TALOS-derived backbone torsion angles, intrahelical hydrogen bond restraints and distance restraints from the NOE and paramagnetic relaxation enhancement (PRE). A major bottleneck in the NMR structure determination of MPs concerns the number of long-range distances which are often limited. In PR, side chain assignment was enabled by stereo-array isotope labelling as well as selective labelling which provided 33 long-range NOEs. These NOEs stabilised the symmetry of the seven helix bundle. With a total number of 1031, the majority of long-range distances were derived from PREs. The structure of PR reveals differences to its homologues such as the absence of an anti-parallel β-sheet between helices B and C and allows conclusions towards the mechanism of colour tuning.
Prion-Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc verursacht werden. Welche zellulären Mechanismen an dieser Fehlfaltung oder der Pathogenese beteiligt sind, ist bis heute nur teilweise geklärt. Einerseits wird vermutet, dass z.B. eine toxische cytosolische Form des PrPC aufgrund einer Störung des Proteasoms akkumulieren könnte und spontan in PrPSc umgewandelt wird. Andererseits konnte gezeigt werden, dass viele Signalwege, wie die MAPK-Signalwege am Prozess der Neurodegeneration beteiligt sein könnten.
Ziel dieser Arbeit war daher zum einen die Untersuchung der morphologischen Veränderung einer Zelllinie, die cytosolisches PrP exprimiert, und zum anderen die Identifikation weiterer Signalwege, die an der Prionpathogenese beteiligt sein könnten, was mittels Analysen des (Phospho)proteoms Prion-infizierter Zellen und Mäusegehirne durchgeführt werden sollte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden murine Neuroblastoma Zellen charakterisiert, die eine cytosolische Form des Prion Proteins (CyPrP) exprimierten. Diese Zellen zeigten zwar keine cytotoxischen Merkmale, jedoch wiesen sie dramatische morphologische Veränderungen auf. Weiterhin wurde herausgefunden, dass diese Zellen vermutlich eine Isoform des cytosolischen PrP (CyPrPmod) exprimierten, die sowohl glykosyliert als auch auf der Zelloberfläche verankert war und somit Eigenschaften des Volllängen-PrP aufwies. Die Glykosylierung des CyPrPs wurde in Western Blots nachgewiesen, während die Verankerung des CyPrPs in der Plasmamembran anhand der Durchflusszytometrie untersucht wurde. Der vermutete Zusammenhang zwischen der CyPrPmod-Expression und der morphologischen Veränderung der Zellen wurde mittels Herunterregulation von CyPrP untersucht. Jedoch resultierte dies nicht in der erwarteten Reversion der morphologischen Effekte. Die Wiederholung der stabilen Transfektion in den parentalen N2a Zellen und anderen Zelllinien führte außerdem weder zu einer veränderten Morphologie noch zur Expression von CyPrPmod. Somit sind diese Veränderungen auf unspezifische Prozesse während der ersten stabilen Transfektion der N2a Zellen mit CyPrP zurückzuführen.
Um neue Therapien oder Biomarker bei Prion-Erkrankungen zu entwickeln, ist die Untersuchung von Signalwegen, die die Prionpathogenese beeinflussen können, wichtig. Oft werden zelluläre Signalwege über die Phosphorylierung von Proteinen gesteuert, allerdings gab es bisher in der Prionenforschung keine Untersuchungen des Phosphoproteoms von Prion-infizierten Zellen in vivo oder in vitro. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher das Phosphoproteom eines Prionen-replizierenden Zellkultursystems näher untersucht. In einer SILAC-Analyse von nicht infizierten und Prion-infizierten Zellen wurden über 100 Phosphoproteine identifiziert und quantifiziert, von denen drei in Western Blots validiert wurden. Die Phosphorylierung von Stathmin und Cdc2 an spezifischen Phosphorylierungsstellen war in den Prion-infizerten Zellen vermindert, während Cofilin eine erhöhte Phosphorylierung aufwies. Diese Proteine sind an der Regulation des Zellzyklus und des Zytoskeletts beteiligt und könnten eine Rolle in der Prionpathogenese spielen. Außerdem wurde nach 2D-Analysen des Proteoms Prion-infizierter Mäusegehirne eine Hochregulation des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 6 (PRDX6) festgestellt. Auch im Prionen-replizierenden Zellkultursystem konnte dieses Protein in erhöhten Mengen nachgewiesen werden. Experimente zur Unterdrückung bzw. Überexpression von PRDX6 ergaben, dass seine Phospholipase A2-Aktivität Signalkaskaden beeinflussen könnte, die vermutlich die Expression von PrPC und somit die Prion-Replikation regulieren können. Weitere Untersuchungen der PRDX6-abhängigen Signalwege in der Prionpathogenese sowie Inokulationen PRDX6-defizienter Mäuse mit Prionen, könnten erste Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien bei Prion-Erkrankungen sein.
Die noradrenergen Neurone der sympathischen Ganglien und die cholinergen Neurone der parasympathischen Ziliarganglien gehen aus den NLZ hervor. BMP-Signale induzieren die Differenzierung beider Neuronentypen, die mit der Expression von Ascl1 und Phox2a/b beginnt. Im Fall der sympathischen Ganglien werden dann Hand2 und GATA2/3 exprimiert, was wiederum zur Expression der noradrenergen Marker TH und DBH führt, die auch in differenzierten Neuronen weiterhin vorhanden sind. Im Gegensatz dazu werden während der Entwicklung der parasympathischen Ziliarneurone sowohl Hand2 als auch TH/DBH nur transient exprimiert, die differenzierten Neurone besitzen zum Großteil einen cholinergen Phänotyp (Goridis und Rohrer, 2002; Müller und Rohrer, 2002).
Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der Hox-Gene bei der Differenzierung des PNS. 14 der analysierten Hox-Gene werden in den sympathischen Ganglien exprimiert, wobei wir uns bei der näheren Analyse auf das HoxB-Cluster beschränkt haben. HoxB5, HoxB6, HoxB7, HoxB8 und HoxB9 werden zwischen E4 und E7 in den sympathischen und sensorischen Ganglien exprimiert, wobei nur HoxB8 und HoxB9 eine deutliche Expression in den sympathischen Ganglien zeigen. Die HoxB-Gene könnten dem Expressionsmuster nach also eine Rolle bei der frühen Entwicklung und auch bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Phänotyps der sympathischen Ganglien spielen.
Die differenzielle Expression der HoxB-Gene in den sympathischen Neuronen und den Ziliarneuronen und ihre mögliche Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Charakters waren Ausgangspunkt für die ektopische Expression eines Vertreters des HoxB-Clusters, HoxB8, in den Ziliarganglien. In der Normalentwicklung wird die Expression von Hand2, TH und DBH nach E4 in den Ziliarneuronen stark reduziert (Abb. 22A). Wird HoxB8 in den Vorläuferzellen der Ziliarneurone in vivo überexprimiert, wird die Hand2-, TH- und DBH-Expression weit über E4 hinaus, bis mindestens E8 auf einem signifikant höheren Niveau gehalten (Abb. 22B). HoxB8 kann diesen Effekt allerdings nur ausüben, wenn es in den noch undifferenzierten Vorläuferzellen exprimiert wird. Die HoxB8-Überexpression in Primärkulturen von Ziliarneuronen an E5 oder E8 führt nur noch zu einem Anstieg der Hand2-Expression, hat aber keinen Einfluss mehr auf die noradrenerge Genexpression (Abb. 22B).
HoxB8 zeigt zusätzlich im Vergleich mit den anderen analysierten Hox-Genen einen spezifischen Effekt auf die Hand2-, TH- und DBH-Expression, denn sowohl das paraloge Hox-Gen HoxC8 als auch das anterior-exprimierte HoxB-Gen HoxB1 erreichen nur an E5 eine signifikante Expression der drei Gene. Weder HoxC8 noch HoxB1 können die Expression von Hand2 und TH/DBH über E5 hinaus aufrechterhalten (Abb. 22C), während HoxB8 deren Expression auch noch an E8 auf einem hohen Niveau halten kann.
Die HoxB8-vermittelte Aufrechterhaltung der TH- und DBH-Expression in den Ziliarneuronen konnte allerdings nicht in einen direkten Zusammenhang mit der erhöhten Hand2-Expression gebracht werden, da die Überexpression von Hand2 nicht zu einer Aufrechterhaltung von TH und DBH an E5 und E6 führt (Abb. 22C).
Die Effekte von HoxB8 auf die Entwicklung der Ziliarneurone, die durch HoxB8 z.T. noradrenerge, sympathische Eigenschaften annehmen, unterstützen die Vorstellung, dass HoxB8 bei der Differenzierung und Ausbildung des noradrenergen Phänotyps in sympathischen Ganglien eine Rolle spielt. Es konnte also erstmals einem Vertreter der Hox-Gen-Familie eine mögliche Funktion bei der Differenzierung autonomer Neurone zugeordnet werden.
The role of small leucine-rich proteoglycans, biglycan and decorin, in podocytopathy and albuminuria
(2011)
Biglycan is a member of the small leucine-rich proteoglycan (SLRP) family and is involved in the assembly of extracellular matrix components. In macrophages soluble biglycan acts as an endogenous ligand of the innate immunity receptors TLR2 and TLR4. Data addressing the role of biglycan in renal pathology are surprisingly limited. In a normal kidney, biglycan is expressed mainly in the tubulointerstitium; however, in the course of various renal diseases its expression may be altered. The biological role and mechanisms of biglycan action in the pathology of renal diseases, especially those affecting glomeruli, remain poorly understood.
Albuminuria is the first detectable clinical abnormality in diabetic nephropathy. In this study we detected increased biglycan mRNA expression in glomeruli of renal biopsies of patients with incipient diabetic nephropathy, with predominant localization in podocytes. This novel finding raised the question about the role and mechanisms of biglycan action in diabetic podocyte injury and whether the mechanisms of biglycan signaling causing podocyte injury and albuminuria could be extrapolated to other glomerular diseases.
To investigate the role of biglycan in the cause of diabetic podocyte injury and albuminuria we used the murine model of STZ-induced diabetic nephropathy and wild type (Bgn+/0) and biglycan deficient (Bgn-/0) mice. We observed that biglycan was expressed on mRNA and protein levels in podocytes of diabetic Bgn+/0 mice and that diabetic Bgn+/0 mice also had significantly higher albuminuria compared to non-diabetic mice 6 and 12 weeks after disease induction. Biglycan deficiency was shown to be an important factor in albuminuria development. Namely, we observed that diabetic Bgn-/0 mice had significantly lower levels of urinary albumin compared to diabetic Bgn+/0 mice. We showed that less severe podocyte loss in the urine of diabetic Bgn-/0 mice was associated with significantly higher nephrin and podocin glomerular expression compared to diabetic Bgn+/0 mice. Our data suggested that biglycan deficiency was protective against podocyte loss into urine and might be beneficial against development of albuminuria in diabetes.
Biglycan contributed to podocyte actin rearrangement due to increased phosphorylation of Rac1 in vitro. Furthermore, biglycan induced caspase-3 activity and production of reactive oxygen species (ROS), thus enhancing apoptosis in cultured podocytes. Biglycan-induced ROS generation was TLR2/TLR4-dependent. Overexpression of soluble biglycan in wild type mice induced albuminuria under normal conditions and significantly increased albuminuria under pathological conditions (murine model of LPS-induced albuminuria). Inhibition of Rac1 activity in vivo decreased the albuminuria induced by biglycan overexpression. In patients with glomerular diseases, biglycan was detected in urine and was associated with nephrin appearance in the urine of these patients and with increased albuminuria. Collectively, our results elucidate a novel mechanism for biglycan-induced TLR2- and TLR4-dependent, Rac1- and ROS-mediated podocytopathy leading to podocyturia, albuminuria development and progression of glomerular diseases. Interfering with biglycan actions and blocking its signaling via TLR2 and TLR4 might be a potential therapeutic strategy against these diseases. To achieve this goal, the specific mechanisms for binding of biglycan to TLR2 and TLR4 must be elucidated and effective ways of preventing this binding must be developed. Nevertheless, biglycan remains the “danger signal” that activates innate immune receptors in non-immune cells and triggers the deleterious mechanisms leading to aggravation of renal injury.
1. Das Genom von A. woodii konnte sequenziert und annotiert werden. Der Organismus besitzt ein Chromosom von 4050521 Bp und keine Plasmide. Es sind 3495 ORFs kodiert. 2. Die Gene, die die Enzyme des Wood-Ljungdahl-Weges kodieren, konnten identifiziert werden. Sie sind hauptsächlich in drei Clustern organisiert, wobei für Cluster II gezeigt werden konnte, dass es ein Operon bildet und dort ungewöhnlicherweise ein RnfC-ähnliches Protein kodiert ist. 3. Gene für Proteine der Hexose-Verwertung konnten ebenfalls identifiziert werden. A. woodii besitzt sowohl PTS-Systeme als auch einen Na+/Zucker-Symporter zur Aufnahme von Hexosen. Die Enzyme der Glykolyse sind vollständig im Genom vorhanden und liegen im gesamten Genom verstreut vor. 4. Neben den Genen für die bereits charakterisierte Hydrogenase existieren im Genom weitere Gene, die potentielle Hydrogenasen oder Untereinheiten dieser kodieren. 5. Lange wurde für Methyltransferasen in A. woodii vermutet, dass es sich um energiekonservierende Enzyme handelt. Die Genomsequenz zeigte, dass das Genom Gene für 20 Methyltransferasen 1, 10 Methyltransferasen 2 und 22 Corrinoid-Proteine enthält. Die Methyltransferase und das Corrinoid-Protein des Wood-Ljungdahl-Weges konnten identifiziert werden. Allerdings konnte für keines der korrespondierenden Proteine eine Membranständigkeit vorhergesagt werden, was eine Beteiligung der Methyltransferasen an der Energiekonservierung ausschließt. Die Vielzahl der Methyltransferasen passt aber zu der Vielzahl von methylierten Verbindungen, die der Organismus verstoffwechseln kann. 6. Neben den gut charakterisierten etf-Genen aus dem car-Operon, das bei der Caffeat-Reduktion eine wichtige Rolle spielt, gibt es ein weiteres etf-Paar, welches mit den Genen für eine Laktat-Dehydrogenase und eine Laktat-Permease kolokalisiert ist. Welche Rolle die Proteine spielen bleibt noch aufzuklären. 7. Außer den Genen für die gut charakterisierte F1F0-ATP-Synthase finden sich Gene für eine V-Typ ATPase. Diese Gene bilden ein Operon. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit VatA auch produziert wird. Die physiologische Rolle konnte allerdings noch nicht geklärt werden. 8. Basierend auf den genomischen Daten konnte ein Modell des Flagellums erstellt werden. Desweiteren wurde eine Vielzahl von Genen für chemotaktische Proteine identifiziert. Zur Verarbeitung von Umweltsignalen besitzt A. woodii Komponenten des Che-Systems, die zum einen aus E. coli und zum anderen aus B. subtilis bekannt sind. 9. In Proteomanalysen konnte festgestellt werden, dass die Enzyme des Wood- Ljungdahl-Weges beim Wachstum auf H2 + CO2 im Vergleich zum Wachstum auf Fruktose induziert werden, die Enzyme der Glykolyse werden dagegen reprimiert. Desweiteren ist die Hydrogenase (HydAB) auf H2 + CO2 induziert. Das am stärksten induzierte Protein ist eine Alanin-Dehydrogenase, deren Rolle im Stoffwechsel unbekannt ist. 10. Die Untersuchung des genomischen Kontextes der für die Na+-translozierende Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase (Fno/Rnf) kodierenden Gene rnfCDGEAB ergab keine weiteren Gene, die mit Rnf in Verbindung stehen. Experimentelle Befunde zeigen, dass die Gene rnfCDGEAB ein Operon bilden. 11. Nach der Generierung von Antikörpern gegen die Untereinheiten des Rnf-Komplexes, die große lösliche Anteile besitzen, konnte nachgewiesen werden, dass RnfB, C und G in der Membran lokalisiert sind. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass deren Produktion unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Caffeat und den getesteten C-Quellen ist. 12. RnfG konnte in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden, allerdings fehlte der vorhergesagte, kovalent gebundene Flavin-Cofaktor. 13. RnfC konnte ebenfalls in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden. Nach Rekonstitution mit Eisen und Schwefel konnte ein Fe-Gehalt von 8 nmol/ nmol Protein und ein Schwefel-Gehalt von 5 nmol/nmol Protein bestimmt werden. Die im UV/Vis-Spektrum sichtbaren Maxima wiesen auf die Anwesenheit von FeS-Zentren hin. EPR-Analysen deuten darauf hin, dass die FeS-Zentren nur unvollständig assembliert sind. 14. Im Genom von A. woodii ist ein Cluster von Genen, das Proteine zur Umsetzung von 1,2-Propandiol kodiert, zu finden. Elektronenmikroskopisch konnte nachgewiesen werden, dass der Organismus in Gegenwart von 1,2-Propandiol Mikrokompartimente bildet. 15. In Zellsuspensionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass 1,2-Propandiol nicht zu Propionat und Acetat, sondern zu 1-Propanol und Propionat über das Intermediat Propionaldehyd umgesetzt wird. 16. Rohextrakte 1,2-Propandiol-gezogener Zellen katalysierten die Reduktion von NAD+ mit Propionaldehyd als Reduktant. Die Reaktion benötigte CoA, NAD+ (Km 0,35 mM) und Propionaldehyd (Km 1,3 mM). Das Temperaturoptimum betrug 30°C und das pH-Optimum lag zwischen pH 8 und 10. 17. Ein Antikörper gegen die Propionaldehyd-Dehydrogenase (PduP) aus S. enterica reagierte mit einem ca. 50 kDa-Protein 1,2-Propandiol-gezogener Zellen. Dies zeigt, dass PduP aus A. woodii und PduP aus S. enterica immunologisch verwandt sind. Western-Blot-Analysen zeigten, dass PduP nur in 1,2-Propandiol-, 2,3-Butandioloder Ethylenglykol-gezogenen Zellen nachweisbar war, aber nicht in Zellen die auf Fruktose, Ethanol oder H2 + CO2 gezogen waren. 18. Die Aktivität der Propionaldehyd-Dehydrogenase war in Zellen gezogen auf 1,2-Propandiol am höchsten. Nach Wachstum auf Fruktose oder H2 + CO2 war die Aktivität sehr niedrig. Genau gegensätzlich verhielten sich die Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase, einem Enzym des Wood-Ljungdahl-Weges, der ATPHydrolyse und des Rnf-Komplexes. 19. In Gegenwart von Caffeat und 1,2-Propandiol konnte A. woodii nicht wachsen. Das Wachstum auf 2,3-Butandiol oder Ethylenglykol in Gegenwart von Caffeat war möglich.
Zwei flavonoidhaltige Pflanzenextrakte, der neuartige Extrakt WS1261, sowie der standardisierte Ginkgo biloba L.-Extrakt EGb761 wurden auf antidepressive Wirkungsmechanismen untersucht, zusätzlich als chemisch definierte Einzelsubstanz das in beiden enthaltene Flavonoid Isorhamnetin. Methodisch wurden hierzu Effekte auf Transporter und Enzyme des Monoaminstoffwechsels, depressionsrelevante Stresshormone neurotrophe Eigenschaften untersucht.
WS1261 hemmte in höheren Konzentrationen in vitro die (Wieder-) Aufnahmetransportmechanismen von NA und 5-HT. Ex vivo war ein Effekt auf die Aufnahme von NA und 5-HT weder nach 1 h, noch 4 h nach Akutbehandlungen zu sehen, sondern erst nach (14-taegiger) subchronischer Behandlung, und dann auch nur Ufer 5-HT zu messen. Nach subchronischer Behandlung konnte eine ebenfalls in vitro festgestellte Hemmung der MAO-A durch WS1261 ebenfalls ex vivo gezeigt werden.
EGb761 hemmte in vitro die Wiederaufnahme von NA, 5-HT und DA. Ex vivo war dieser Effekt weder 1 h, noch 4 h nach einer Akutgabe, allerdings nach 14-taegiger Dauerbehandlung im Bezug auf eine Hemmung der NA-Aufnahme messbar, ohne dass MAO-A oder MAO-B-Aktivitaet beeinflusst wurden.
WS1261 erhoehte nach 14-taegiger Behandlung konzentrationsabhaengig die Plasma-Corticosteronspiegel. WS1261 war in der Lage, die Ausdifferenzierung von PC12-Zellen konzentrationsabhaengig zu fördern, wodurch auf eine Wirkung ähnlich dem neurotrophen Wachstumsfaktor NGF geschlossen werden kann. Die Konzentration des Wachstumsfaktor BDNF wurde in zwei relevanten Hirnregionen durch WS1261 nicht, in einer jedoch durch Isorhamnetin allein erhoeht.
Zusammengefasst ergaben sich Hinweise darauf, dass eine mögliche antidepressive Wirkung von WS1261 durch eine Wirkung auf eine Beeinflussung des Monoaminstoffwechsels, oder die Erhöhung depressionsrelevanter Stresshormonlevel erklärbar sein koennte, insbesondere nach subchronischer Behandlung. Es ergaben sich ausserdem Hinweise auf wachstumsfaktoraehnliche Wirkungsweisen. Eine Wirkung ueber eine Erhšhung zentraler BDNF-Konzentrationen konnte durch die vorliegende Untersuchung im Beobachtungszeitrum nicht festgestellt werden.
Die literaturbekannte kognitionsverbessernde Wirkung des Ginkgo biloba-Extraktes EGb761 koennte erklärbar sein durch eine nach subchronischer Behandlung feststellbare Hemmung des Noradrenalintransporters NET, da im frontalen Cortex vor allem ueber diesen die synaptische Elimination des hier mit Aufmerksamkeit und Lernprozessen im Zusammenhang stehenden Neurotransmitters Dopamin erfolgt.
Das in beiden Extrakten enthaltene Flavonoid Isorhamnetin kann hšchstens mit einem Teil dieser festgestellten Effekte in Verbindung stehen, da die Extrakte sich in ihrer Wirkungsweise unterschieden, und Isorhamnetin alleine teilweise andere Effekte zeigte, als die isorhamnetinhaltigen Extrakte WS1261 und EGb761. Dies koennte jedoch auch durch die unterschiedlichen in den Extrakten enthaltenen Mengen erklärbar sein.
Blood vessel formation is a well orchestrated process where multiple components including different cells types, growth factors as well as extracellular matrix proteins act in synergistic and highly regulated manner to support the growth of new blood vessels. During embryonic development this process is marked as vasculogenesis and entails the differentiation of mesodermal cells into angioblasts and their subsequent fusion into a primitive vascular plexus. Angiogenesis, in contrast, describes the formation of new vessels from the pre-existing vasculature and it occurs in the embryo during remodeling of the primitive plexus into a mature vascular network. Furthermore, in the adult, angiogenic processes play a role in various physiological and pathological conditions. Angiogenesis is governed by a set of factors and molecular mechanisms whose identification has been a major focus of cardiovascular research for the past several decades. Most recently, Epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7) has been described as a novel molecular player in this context. This secreted protein is produced by endothelial cells and has been implicated in vessel development. Studies performed in zebrafish revealed an important role for EGFL7 in lumen formation during vasculogenesis although the underlying molecular mechanism has not been elucidated yet. In contrast, the investigation of EGFL7’s functions during angiogenic sprouting has faced several challenges and the role of EGFL7 in angiogenesis remained elusive. The purpose of this thesis was to identify the functions of EGFL7 during angiogenic mode of vessel formation in a systematic fashion using numerous in vitro as well as in vivo approaches.
Previously it has been suggested that EGFL7 might associate with the extracellular matrix from where it could exert its effects. Indeed, we could show that EGFL7 accumulates on the outer surface of endothelial cells in vivo by demonstrating its co-localization with collagen IV, a major constituent of the basal lamina. Furthermore, after its secretion to the extracellular matrix (ECM), EGFL7 seemed to interact with some components of the extracellular matrix including fibronectin and vitronectin, but not collagens and laminin.
A major group of receptors that mediate the interaction between the cells and the ECM are integrin receptors. Our co-immunoprecipitation studies revealed that EGFL7 associated with integrin αvβ3 which is highly expressed in endothelial cells and known to be important for vessel growth. Importantly, this EGFL7-αvβ3 integrin interaction was dependent on Arg-Gly-Asp (RGD) motif present within the second EGF-like domain of EGFL7 protein. Adhesion assays performed with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) revealed that EGFL7 promoted endothelial cell adhesion compared to BSA used as a negative control, however, adhesion seemed to be less efficient as compared to bona fide ECM proteins such as fibronectin and vitronectin. In addition, cultivation of endothelial cells on EGFL7 was characterized by the absence of mature focal adhesions and stress fibers, but was paralleled by increased phosphorylation of kinases typical for integrin activation signaling cascade such as FAK, Src and Akt. This led us to the hypothesis that EGFL7 creates an environment that supports a motile phenotype of endothelial cells by serving as a modulator of existing interactions between the cells and the surrounding matrix. Indeed, EGFL7 increased random migration of HUVEC on fibronectin in an αvβ3 integrin dependent manner as shown using a live cell imaging platform. Most importantly, this was paralleled by a decrease in endothelial cell adhesion to fibronectin which is consistent with previous reports on secreted proteins that support a medium strength of adhesion and such promote cellular migration. To assess the overall effect of EGFL7 on the process of blood formation several in vitro and in vivo approaches were employed. First, the addition of EGFL7 to Matrigel injected subcutaneously into mice significantly increased the invasion of endothelial cells into the plugs. Second, a spheroid-based sprouting assay in three-dimensional collagen matrix clearly demonstrated the ability of EGFL7 to support angiogenic sprouting in an integrin dependent manner. This is consistent with the observed effects of EGFL7 on endothelial cell migration. Third, using in vivo assays such as the chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as well as a zebrafish model system we were able to validate the importance of the EGFL7-integrin interaction for the process of angiogenesis in vivo. Taken together, I identified some of the major cellular functions EGFL7 modulates during angiogenesis. In addition, with integrin αvβ3 I unraveled a novel interaction partner of EGFL7 that delivers a mechanistical explanation for EGFL7’s effects on blood vessel formation. Most importantly, data presented in this PhD thesis contribute substantially to the existing literature on EGFL7 unambiguously assigning a role for this protein in the process of angiogenesis.
Since combinatorial chemistry and high throughput screening have become a common technique in the drug discovery phase the number of compounds being considered has increased frequently. These structures are often characterized by high molecular weight, high lipophilicity and low solubility in aqueous and physiological media. Due to the generally poor bioavailability, new in vitro techniques were needed for screening of pharmacokinetic properties. An important parameter for these screening methods is the implementation at an early state of drug discovery phase, to find potential lead structures, before investment costs become significant. The established in vitro methods for the prediction of membrane interaction are not reliable especially for poorly soluble compounds. A new method that is fast and easy to use, requires only small amounts of NCE and which can provide more reliable predictions is needed. In this study, a new screening technique based on surface activity profiling for the prediction of oral drug absorption was evaluated with special emphasis on the predictability of biological membrane interaction of poorly soluble drug compounds. It was demonstrated that drug absorption through a bilayer membrane can be modeled by the orientation of compounds at the air/water interface. Thus amphilicity of a drug is generally related to both oral absorption and blood brain barrier penetration. In turn, amphiphilicity is influenced by the lipophilicity, size and charge distribution of a drug. Surface activity profiling was determined by analysis of surface pressure profiles using the Gibbs adsorption isotherm. The surface activity measurements were carried out using a multichannel tensiometer Delta 8, which was developed by Kibron to be utilized in conjugation high throughput screening in early drug discovery processes. For this study two test sets were analyzed, one for the prediction of gastrointestinal wall interaction and the second for the prediction of the penetration behavior at the blood brain barrier. Both test sets consist of drug compounds with a wide range of absorption properties and consist mainly of compounds with poor water solubility. Since the drugs characteristics varied, they were classified according to water solubility and surface activity and a sample preparation method for each group was established. For the prediction of oral drug absorption, three different methods were established to model the interaction of compound and gastrointestinal wall. For drug compounds with solubility above 1mmol/L the traditional shake-flask method enabled the determination of the amphiphilic properties of drug compounds in pure aqueous media. Compounds with solubility below 1mmol/L tend to not to exhibit any increase in surface activity. Thus surface tension measurements of compounds, which exhibited a limited surface activity due to poor aqueous solubility, were conducted from stock solutions prepared with various organic solvents. Mainly polar organic solvents were used. A mixture of DMSO and DMF resulted in the best combination of properties: the intensive solubility enhancing effect of DMF and the lower intrinsic surface activity of DMSO. The polar solvent ruptured the water clusters, so that highly lipophilic structures had a higher affinity to the solvent and higher concentrations could be obtained. For these compounds higher maximum surface pressure were generated than was possible in pure aqueous media. The surface pressure data were correlated with the fraction absorbed values in vivo. However it was found that poor water solubility is not the only limiting step to exhibiting any surface activity. Some compounds were showed no surface activity in either solvent system. Therefore a micelle vehicle method was established using short chain phospholipids to mimic the gastrointestinal wall. It could be concluded from the results, that non surface active drugs can interact with the phospholipids micelle vehicle in a way analogous to their interaction with the membrane bilayer. The relative critical micelle concentration was correlated with the fraction absorbed of this test set. A sample preparation schema based on the three types of drugs was established. This schema enabled us to predict the absorbance of slightly soluble and poorly soluble drugs with acceptable reliability for early compound screening. For the prediction of blood brain barrier penetration using surface activity profiling as analyzing method, a test set with very poorly soluble characteristics was chosen. The sample preparation method was based on a strictly aqueous approach using the ‘shake flask’ method. The surface tension measurements enabled correlation of the amphiphilic properties of the very poorly soluble drug compounds with BBB uptake. From the aqueous surface pressure profiles and the determination of physicochemical parameters, it was found that blood brain barrier is more likely when a drug provides a small cross-sectional area, As, at the interface. The cross-sectional area is the only parameter which is independent from the maximal concentration in aqueous media and it is particularly suitable for lower solubility compounds. In summary, it was shown that amphilicity is related to biological membrane interaction in the human body and that surface activity profiling with appropriate sample preparation can be used as a reliable screening tool for the prediction of oral drug absorption of poorly soluble drugs. Furthermore an in vitro screening method of blood-brain-barrier penetration was established.
Tumor hypoxia and nutrient starvation are common phenomena in cancerous tissue. Cells that resist this hostile environment are selected for a more aggressive phenotype, usually accompanied by therapy resistance. The hypoxia inducible factors HIF-1a and HIF-2a play a key role in the adaptive homeostatic responses to these challenging conditions inducing a number of target genes that are involved in the regulation of a variety of cellular processes such as angiogenesis, proliferation, metabolism, self-renewal and cell death/cycle arrest. Thus, the HIF pathway encompasses opposing adaptive responses on tumor growthgrowth promoting abilities on the one hand and growth inhibiting on the other. A recent study in our lab uncovered that this switch between cell death and cell survival critically depends on HIF-2a protein levels. Since PHDs (HIF prolyl hydroxylases) are the main regulators of HIF protein abundance and hypoxia drives the malignant phenotype of tumors, we wanted to characterize HIF regulatory functions of PHDs under hypoxic conditions. Our intention was to reveal the importance of PHD contribution to the opposing functions of HIFs under hypoxia. Characterization of PHD1-4 mRNA and protein expression levels under normoxic and hypoxic conditions in glioblastoma cell lines led to the identification of PHD2 and PHD3 as hypoxia inducible PHD isoforms and highlighted their predominant function under hypoxia. Mechanistically, we demonstrated that HIF mediates the hypoxic induction of PHD2 and 3 within a negative feedback loop, promoting its own degradation during prolonged hypoxia. The functional impact of PHD2 and 3 abundance on cell viability under hypoxic conditions was analyzed by disrupting PHD2 and PHD3 function either through a siRNA mediated approach or by application of the PHD inhibitor DMOG. These experiments uncovered that PHD2 and 3 are protective under hypoxic conditions and that PHD inhibition expedites cell death. Combined HIF and PHD suppression under hypoxic conditions abrogated this increased susceptibility to cell death, clearly showing that PHD2 and 3 act in a negative feedback regulatory loop to limit the HIF response under prolonged hypoxia. With respect to possible future therapeutical applications we co-treated cells with a PHD inhibitor and pro-apoptotic agents staurosporine or TRAIL. Co-challenging tumor cells even potentiated the cell death response, indicating a more widespread protective function of PHD. Taken together PHD2 and 3 protect tumor cells from cell death induction, functioning in a negative feedback regulatory loop to constrain the HIF dependent cell death responses under hypoxia. Interestingly, however, when assessing the role of PHD2 and PHD3 in in vivo tumor growth using an intracranial tumor model, we identified an exclusive tumor suppressor function for PHD3. Loss of PHD3 function enhanced tumor growth whereas increased PHD3 expression diminished the tumor burden. The accelerated tumor growth following PHD3 loss could be attributed to a decrease in the induction of apoptosis and an increase in proliferation. Tumor cells are frequently exposed to temporary and spatial depletion of nutrients. Interestingly, PHD3 loss conferred a growth advantage under growth factor deprivation. The growth regulatory function of PHD3 was isoform specific, HIF independent and importantly, did not require the hydroxylase function of PHD3. Previous reports have uncovered a regulatory function of the PHD system in NF-kB signaling. However, our results demonstrated that NF- kB signaling remained unaffected by alteration in the PHD3 status of the cell. Additionally, the PHD3 tumor suppressor function proved to be independent of two putative PHD3 downstream effectors, ATF4 and KIF1Bb. Mechanistically, PHD3 suppression reduced EGFR internalization, enhancing the amount of EGFR expressed on the cell surface. We further showed that the impaired EGFR internalization during PHD3 loss resulted in receptor hyperactivation under stimulated and growth factor deprived conditions. Importantly, PHD3 physcially associated with the EGFR complex as evidenced by co-immunoprecpitation. Consequently, this extended EGFR activation in PHD3 deficient cells resulted in enhanced downstream activation of EGFR signaling and increased proliferation. Consistent with the interpretation that PHD3 loss is beneficial for tumor growth, we found PHD3 promoter methylation in glioblastoma cell lines, hinting at a epigenetic mechanism to finetune PHD3 expression on top of the hypoxic driven gene regulation. Finally, we demonstrated that PHD3 tumor suppressor function is not restricted to glioblastomas since PHD3 suppression in lung adenocarcinoma accelerated subcutaneous tumor growth. With these findings, we expand the knowledge of PHD3 action from its oxygen sensing role to a regulatory function in growth factor signaling. This clearly discriminates PHD3 from the other isoforms and supports the exclusive tumor suppressor function in glioblastoma. Taken together our results identify a complex role of PHD signaling in cancer and delineate HIF dependent and HIF independent functions of the PHD system. We think that the HIF dependent protective effect of PHD2 and 3 and the HIF independent PHD3 tumor suppressor function are not mutually exclusive, but might be activated according to the heterogeneous intra-tumoral conditions. However, PHD3 hydroxylase activity is dispensable for its HIFindependent tumor suppressor function in glioma. This uncouples PHD3 function from co-factor and co-substrate requirements and allows it to act over a broader physiological range, since its influence on cellular processes is not constrained by the availability of rate limiting factors. It might explain, why the enzymatic independent functions of PHD3 predominate in vivo. Thus, therapeutic modulation of the PHD system to inhibit tumor growth has to be based on these contrasting functions of the PHD system. However, their differential dependence on the hydroxylase activity may facilitate a therapeutic strategy to specifically inhibit or promote the protective versus suppressive functions of the PHD system.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht der humane β2-adrenerge Rezeptor, ein intrinsisches Membranprotein und Mitglied der Superfamilie G Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs).
Es wurden im Wesentlichen zwei Themenschwerpunkte bearbeitet. Den ersten Schwerpunkt bildeten die heterologe Produktion des β2-adrenergen Rezeptors in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris sowie dessen chromatographische Reinigung und Charakterisierung. Hierbei konnten in allen wesentlichen Punkten signifikante Verbesserungen im Vergleich zu früheren Arbeiten erzielt werden: Die Ausbeute an heterolog produziertem, funktionellem Rezeptor konnte um das bis zu Fünffache gesteigert werden; Die Gesamtausbeute nach chromatographischer Reinigung wurde um 60% erhöht; Es gelang die Darstellung reiner, monodisperser Rezeptorpräparationen mit einer spezifischen Ligandenbindungsaktivität von 94% und einer Halbwertszeit der Ligandenbindungsaktivität von >50 Tagen bei 4 °C. Eine pharmakologische Charakterisierung des Rezeptors erfolgte sowohl in Membranen als auch in solubilisiert-gereinigter Form. Ferner konnte die in vitro-Interaktion des solubilisiert-gereinigten Rezeptors mit einer konstitutiv aktiven β-Arrestin Variante nachgewiesen werden.
Ziel des zweiten Themenschwerpunkts der vorliegenden Arbeit war die Auffindung und Charakterisierung von rezeptorspezifischen, nicht auf Immunglobulinen basierenden Bindeproteinen, um diese später vorrangig zur Kokristallisation einsetzen zu können. Mit der zellfreien Selektionsmethode des ribosome display ist es hierbei gelungen, aus einer naiven, auf Ubiquitin als Gerüstprotein basierenden Bibliothek hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2-adrenergen Rezeptor zu isolieren. Für Monomere dieser sog. Affiline® wurden Dissoziationskonstanten bis etwa 450 nM gefunden, die durch Homodimerisierung auf etwa 70 nM verringert werden konnten. Zusätzlich wurde mit einer Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen.
Die Superfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und auch diverseste der vier Hauptgruppen membranständiger Rezeptoren. Im Rahmen der Signaltransduktion vermitteln diese die Umwandlung eines extrazellulären Signals in eine spezifische intrazelluläre Reaktion und nehmen so eine Schlüsselposition bei der Kommunikation zwischen Zellen ein. Bei GPCRs erfolgt die Weitergabe der ligandeninduzierten Konformationsänderung vorwiegend über Kopplung an und Aktivierung von Guanin-Nukleotidebindenden Proteinen (G Proteine), die dann ihrerseits mit verschiedenen Effektorsystemen in Wechselwirkung treten. Da ein Großteil aller zurzeit auf dem Markt befindlichen Medikamente ihre Wirkung durch Bindung an einen GPCR entfaltet, ist diese Proteinfamilie von besonders großem pharmakologischem Interesse. Auch der humane β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) zählt zu den kommerziell wichtigen drug targets und ist zudem nach bovinem Rhodopsin der erste GPCR, für dessen Struktur experimentell bestimmte, atomare Modelle vorgelegt werden konnten.
Zur funktionellen Überproduktion des β2AR hatte sich bereits die methylotrophe Hefe Pichia pastoris bewährt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Anwendung hier erarbeiteter, optimierter Bedingungen das Produktionsniveau aller acht für dieses Expressionssystem zur Verfügung stehenden bzw. in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte gegenüber früheren Ergebnissen deutlich gesteigert werden konnte. Hierbei wurde, je nach Konstrukt, eine Verdopplung bis Verfünffachung der Produktion an aktivem, bindungsfähigem Rezeptor erzielt. Bei drei der acht Konstrukte konnte das Produktionsniveau auf ≥ 50 pmol/mg Membranprotein gesteigert werden, was bis zu 1,1 mg aktivem Rezeptor in Membranen pro Liter Schüttelkultur entspricht. Die im Rahmen der Produktionsoptimierung der verschiedenen Konstrukte gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss sowohl von Art als auch Lokalisation eines bestimmten Anhängsels innerhalb der Expressionskassette auf das zu erwartende Produktionsniveau konnten genutzt werden, um bei einem mit bestimmten Eigenschaften neu zu erstellenden Konstrukt – einem Baukastensystem gleich – jene Anhängsel mit den gewünschten (und bekannten) Auswirkungen zu kombinieren. Auf dies Weise konnten auf Anhieb sehr gute Produktionsniveaus für neu erstellte Konstrukte erzielt werden.
Durch Optimierung einer zweischrittigen affinitätschromatographischen Reinigung konnte zum einen die Gesamtausbeute an gereinigtem β2AR um 60% gegenüber früheren Ergebnissen gesteigert werden. Zum anderen gelang es, für derartige, nach SDS-PAGE und analytischer Gelfiltration als homogen und frei von jeglichen Aggregationen befundenen Präparationen, die spezifische Aktivität (Radioligandenbindung) auf 94 ± 4% zu steigern. Die Halbwertszeit der spezifischen Aktivität derartiger Präparationen bei 4 °C lag bei über 50 Tagen. Im Rahmen einer alternativen Reinigungsstrategie konnte der praktische Nutzen proteolytisch abspaltbarer Affinitätsanhängsel in Fällen mit inhomogener posttranslationaler Prozessierung des rekombinanten Proteins durch das Expressionssystem nachgewiesen werden.
Durch Integration einer inversen Affinitätschromatographie in das Reinigungsschema konnte bei bestimmten Konstrukten die Homogenität und Dispersität der Präparation verbessert werden, bei gleichzeitiger vollständiger Entfernung sowohl der abgetrennten Anhängsel als auch der verwendeten Protease.
Die Ligandenbindung des β2AR wurde sowohl in Membranen als auch in solubilisiertgereinigter Form charakterisiert. Die hierbei für den Rezeptor in Membranen mit dem tritiierten Liganden [5,7-3H]-(-)-CGP-12177 erhaltene Dissoziationskonstante (KD) von 4,1 ± 0,2 nM befindet sich in guter Übereinstimmung mit den Literaturwerten für dieses Expressionssystem.
Bei der Charakterisierung der Ligandenbindung des β2AR in solubilisiert-gereinigter Form wurde ein stark modulierender Effekt von Lipiden auf die KD beobachtet: Die Dissoziationskonstante des soubilisiert-gereinigten Rezeptors wurde zu 8 ± 0,6 nM bestimmt, ließ sich jedoch durch gleichzeitige Verwendung von solubilisiertem Phosphatidylcholin und Cholesterinhemisuccinat im Bindungstest auf ein Viertel (2,13 ± 0,2 nM) diese Wertes reduzieren. Der Effekt der Affinitätsmodulation war voll reversibel und die Gesamtmenge (Bmax) an bindungsfähigem Rezeptor blieb praktisch unbeeinflusst.
Des weiteren konnte die spezifische Interaktion des solubilisiert-gereinigten β2AR mit rekombinantem, konstitutiv aktivem β-Arrestin in vitro nachgewiesen werden. Dies ist sowohl für die Etablierung etwaiger funktioneller Assays als auch für Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit einem physiologischen Bindungspartner für von Interesse.
Im Rahmen des zweiten Themenkomplexes wurde die Methode des ribosome display (RD) erfolgreich eingesetzt, um Bindeproteine gegen den β2AR zu selektieren. Ziel war es hier, diese später zur Kokristallisation mit dem Zielprotein einsetzen zu können. Das RD als zellfreie (in vitro) Selektionsmethode findet für lösliche Proteine bereits seit längerem breite Anwendung.
Für Membranproteine wurde es bisher hingegen nur sehr selten erfolgreich verwendet und der Einsatz bei GPCRs ist als neu zu bezeichnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine hochdiverse (theoretische Diversität: 1013, funktionelle Größe 1010 – 1011), naive Bibliothek verwendet, die auf Ubiquitin als Gerüstprotein basiert und von SCIL Proteins, Halle unter der Bezeichnung Affilin® entwickelt wurde. Es handelt sich somit um alternative, d. h. nicht auf Antikörpern oder deren Fragmenten beruhenden Bindeproteine. Zielprotein der in dieser Arbeit durchgeführten Selektionen war solubilisiert-gereinigter β2AR. Sämtliche Arbeiten unter Beteiligung des Zielproteins fanden zur Bewahrung dessen Aktivität in Anwesenheit von Detergenz statt. Die verschiedenen Schritte des RD mussten daher zunächst an die speziellen Erfordernisse des Zielproteins angepasst und geeignete Bedingungen zur Durchführung einer Selektion gefunden werden. Durch entsprechende Vorversuche wurde dann verifiziert, dass der Rezeptor unter den gewählten Selektions- und Immobilisierungsbedingungen seine Ligandenbindugsaktivität beibehält. Es wurden insgesamt sechs RD-Selektionsrunden durchgeführt und der abschließend vorliegende Bindeprotein-Subpool war noch divers (keine Reduktion auf eine Konsensus-Sequenz). Zur Charakterisierung der angereicherten Varianten wurde eine Abfolge von Hochdurchsatzverfahren sowie abschließenden Einzelanalysen eingesetzt. Hierbei gelang es, hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2AR zu isolieren. Die beobachteten Dissoziationskonstanten (KD) der detailliert charakterisierten Affilin-Monomere reichen von etwa 15 μM bis hin zu 450 nM. Nach Homodimerisierung ausgewählter, zuvor charakterisierter Varianten wurde eine Verringerung der Dissoziationskonstanten bis auf etwa 70 nM beobachtet. Damit decken die selektierten Bindeproteine einen Affinitätsbereich ab, der verschiedenartige Anwendungsgebiete eröffnet: Vom Einsatz zur affinitätschromatographischen Reinigung des Zielproteins, über dessen immunologischen Nachweis bzw. dem Einsatz in Assaysystemen bis hin zur Kokristallisation mit dem Zielprotein. Die Spezifität der Bindeproteine wurde gegenüber verschiedenen Negativkontrollen wie etwa dem verwendeten Immobilisierungssystem aber auch gegenüber anderen GPCRs mit homologer Auswahl an Affinitätsanhängseln verifiziert. Durch geeignete Konditionierung (prepanning) der in den eigentlichen Selektionsprozess eingehenden ternären Komplexe war es gelungen, die Anreicherung unerwünschter, gegen das zur Immobilisierung verwendete Biotin/Streptavidin-System gerichteter Varianten wirkungsvoll zu verhindern.
Die selektierten Bindeproteine konnten in verschiedenen Maßstäben (von 1 ml bis 1 l) mit sehr hohen Ausbeuten in E. coli produziert werden. Nach Affinitätschromatographie und präparativer Gelfiltration wurden hochreine, monodisperse Präparationen erhalten. Die Gesamtausbeuten an gereinigtem Bindeprotein lagen bei etwa 15 mg/l Kulturvolumen.
Neben der Affinitätsbestimmung wurde die Bindung einzelner Affilin-Varianten an den β2AR sowohl mittels pull-down Assay als auch analytischer Gelfiltration verifiziert. Parallel zur Homo- und Hetero-Dimerisierung wurde eine Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen. Diese Affinitätsmaturierung der Monomere erfolgte in einem evolutiven Ansatz bestehend aus Zufallsmutagenese zuvor charakterisierter Varianten und anschließender Selektion im Rahmen eines erneuten RD.
Systematische Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit mehreren der aus der Selektion hervorgegangenen alternativen Bindeproteine wurden durchgeführt.
Project I: The progression of rod and cone degeneration in retinally degenerate (rd) mice ultimately results in a complete loss of photoreceptors and blindness. The inner retinal neurons survive and several recent studies using genetically targeted, light activated channels have made these neurons intrinsically light sensitive. We crossbred a transgenic mouse line expressing channelrhodopsin2 (ChR2) under the control of the Thy1 promoter with the Pde6b(rd1) mouse, a model for retinal degeneration (rd1/rd1). Approximately 30-40% of the ganglion cells of the offspring expressed ChR2. Extracellular recordings from ChR2-expressing ganglion cells in degenerated retinas revealed their intrinsic light sensitivity which was approximately 7 log U less sensitive than the scotopic threshold and approximately 2 log U less sensitive than photopic responses of normal mice. All ChR2-expressing ganglion cells were excited at light ON. The visual performance of rd1/rd1 mice and ChR2 rd1/rd1 mice was compared. Behavioral tests showed that both mouse strains had a pupil light reflex and they were able to discriminate light fields from dark fields in the visual water task. Cortical activity maps were recorded with optical imaging. The ChR2rd1/rd1 mice did not show a better visual performance than rd1/rd1 mice. In both strains the residual vision was correlated with the density of cones surviving in the peripheral retina. The expression of ChR2 under the control of the Thy1 promoter in retinal ganglion cells does not rescue vision. Project II: Lentiviral vectors are becoming the vector of choice for transgene delivery into cells due to their ability to infect non- dividing cells and stably integrate the gene into the genome of the host. Two different viral vector systems, namely HIV-1 and SIV and three different viral vectors PLECYT, PHRCMVChR2 of HIV-1 family and PBjChR2 of SIV were used in this study. The efficiency of the vectors was analyzed by applying them onto the retinal explants in culture and checking the transgene expression. The transgene in the PLECYT lentiviral vector was driven by the EF1A promoter. Upon administration of 5.2 X 106 infectious units of PLECYT viral vector suspension onto the retinal explant resulted in the transduction of retinal ganglion cells. Very few other retinal neurons were found transduced. In the case of PHRCMVChR2, approximately 5 X 105 TU/ml of the vector was used and resulted in the transduction of different neuronal subtypes. Many amacrine cells, ganglion cells and Müller cells were found expressing the transgene. For PBjChR2, 5.6 X104 TU/ml was used which resulted in Müller cell- specific transduction. Very few or no other retinal neurons were found transduced. This study demonstrates the transduction efficiency of different viral vectors on the retinal neurons in vitro. An interesting observation on these viral vectors is their altered tropism. The glycoprotein of the virus is critical for determining their tropism and in this study, all the viral vectors generated were pseudotyped with VSVG, which confers a broad non-specific spectrum of infection. However, analyzing the transgene expression, the viral vectors differ from one another and show remarkable difference in their transduction pattern. To list a few factors that might possibly responsible for the drastic transduction difference exerted by the viral vectors include; 1. Promoters used to drive the transgene expression. 2. HIV or SIV component of the vector in combination with the promoter 3. Titre of the vector used and 4. Other factors like pH and serum used in the study. Therefore optimizing the viral vectors and generating high titers would increase the efficiency and cell-type specific expression of the transgene.
Fuer die schlechte Prognose von Glioblastompatienten mit einer ueberlebenszeit von 9-15 Monaten (Norden and Wen, 2006) ist vor allem die hohe Invasivitaet dieser Tumore verantwortlich. Nach operativer Entfernung des Haupttumors entstehen aus den verbleibenden invadierten Zellen sekundaere Tumore, die sich mitunter ueber weite Bereiche des Hirns verteilen. Des Weitern sind die hochinvasiven Tumorzellen oft resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie (Drappatz et al., 2009; Lefranc et al., 2005). In Maustumormodellen und Pateinten konnte zudem gezeigt werden, dass die neuartige antiangiogenetische Therapie zwar das Tumorwachstum verringert, jedoch die Invasivitaet stark erhoeht. (Norden et al., 2008; Ebos et al., 2009; Paez-Ribes et al., 2009). Ueber die Mechanismen die diese hohen Invasivitaet induzieren, ist bislang nur sehr wenig bekannt. Die durch Reduktion von Blutgefaessen steigende Hypoxie des Tumors foerdert die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Dies fuehrt zum Abbau der extrazelluaeren Matrix des umgebenden gesunden Gewebes und beguenstigt dadurch die Tumorzellinvasion (Indelicato et al., 2010; Miyazaki et al., 2008; Shyu et al., 2007). Die Umformung des Aktinzytoskeletts und damit die Mobilitaet von Zellen wird vorwiegend durch ein akkurates Zusammenspeil der Rho GTPasen Rac, Rho und Cdc42, kontrolliert (Ridley et al., 2003). Fuer die Organisation von Axonen im Nervensystem und fuer die Blut- und Lymphgefaessbildung wurde gezeigt, dass die Interaktion der Eph-Rezeptortyrosinkinasen und Ihrer Ephrin-Liganden Signalwege induziert, die in die Regulation dieses Zusammenspiels involviert sind (Egea and Klein, 2007; Makinen et al., 2005; Palmer et al., 2002; Sawamiphak et al., 2010). Des Weiteren zeigt die Analyse der Genloci von Eph-Rezeptoren und Ephrinen in verschieden Hirntumoren eine gehaeufte Deletionen des Ephrin-B2-Gens. Die Quantifizierung von Ephrin-B2 mRNA in diesen Tumoren hat ausserdem ergeben, dass mit zunehmender Malignitaet die Expression von Ephrin-B2 sinkt. Aus diesen Gruenden wurden die Untersuchungen in dieser Arbeit auf die Rolle von Ephrin-B2 anhaengigen Signalwegen in der Glioblastomzellinvasion konzentriert. In einem modifiziertem Boyden-Chamber-Assay konnte gezeigt werden, dass das Ephrin-B2 induzierte EphB4 forward signaling und EphB4 induzierte Ephrin-B2 reverse signaling die Invasivitaet der human Glioblastomzelllinien LN-229, G55 und SNB-19 reduziert. In einem Maustumormodel konnte weiterhin gezeigt werden, dass Ephrin-B2 Knock-Out (KO) Astrozytomzellen, im Vergleich zu Wild-Typ (WT) Zellen, Tumore mit einem groesseren Volumen und einer erhoehten Invasivitaet bilden. Da die Expressionslevel fuer die Ephrin-B2 bindenden Rezeptoren EphA4, EphB1 EphB3 und EphB6 auch im adulten Hirn hoch sind (Hafner et al., 2004), weisen diese in vitro und in vivo Ergebnisse auf eine Tumorsupressorfunktion von Ephrin-B2 hin, die durch repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signaling vermittelte werden koennten. Dies geht mit Erkenntnissen ueber kolorektale Tumore einher (Batlle et al., 2005). Die in einem Sphaeroid-Invasionsassay mit einer EphB-Rezeptoren freien Umgebung beobachtete verminderte Invasion von Ephrin-B2 WT deutet auf eine zusaetzliche invasionsblockierende Rolle der Ephrin-B2-Eph-Rezeptor Interaktion zwischen benachbarten Tumorzellen hin, wie sie auch in Brusttumoren gefunden wurde (Noren et al., 2006). Es scheint als sei Tumorprogression und Invasion erst moeglich, nachdem die Expression von Ephrin-B2 vermindert wurde. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass in hypoxischen Glioblastomzellen die Ephrin-B2 Expression durch die direkte Bindung des den Transkriptionsfaktors ZEB2 an den Ephrin-B2 Promoter reprimiert wird. In einem Weiteren Maustumormodel konnte gezeigt werden, dass die Blockierung der ZEB2 Expression mittels shRNA und die damit einhergehenden Inhibition der hypoxie induzierten Ephrin-B2 Repression das Wachstum und die Invasivitaet von Glioblastomen verringert. Zusaetzlich wurde gezeigt, dass der Verlust von ZEB2 ausreicht, die durch antiangiogenetische Therapie induzierte stark erhoehte Invasivitaet zu vermeiden. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse fuehren zu folgendem Modelmechanismus. In kleinen normoxischen Tumoren koennen repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signalings und EphB forward signalings zwischen Tumorzellen und Zellen des umgebenden Gewebes die Ausbreitung und Invasion des Tumors unterdruecken. Zusaetzlich koennte das Ephrin-B2 induzierte EphB forward signaling zwischen benachbarten Tumorzellen die Mobilitaet der Tumorzellen wie in Brusttumoren inhibieren. Beim Erreichen einer bestimmten Tumorgroesse tritt Hypoxie auf, wodurch HIF-1alpha stabilisiert wird. Dies fuehrt dann zur ZEB2 Expression und leitet die Repression von Ephrin-B2 ein, was wiederum zur erhoehten Tumorzellemobilitaet und im Zusammenspiel mit MMPs zu Invasion fuehren kann. Gleichzeitig werden durch den HIF-induzierten VEGF-Gradienten neue Blutgefaesse rekrutiert. Damit wird der hypoxie-induzierten Invasivitaet entgegengewirkt. Wird mittels antiangiogenetischer Behandlung versucht Tumorprogression entgegenzuwirken, resultiert daraus eine erneut gesteigerte Hypoxie, die dann durch die ZEB2 vermittelte Repression von Ephrin-B2 wieder eine erhoehte Invasivitaet induzieren kann. Das Blockieren der ZEB2 Expression kann dieser durch antiangiogenetischen Behandlung induzierten Invasivitaet entgegenwirken.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.
Die Atmungskette in der inneren Membran der Mitochondrien besteht aus fünf großen Enzymkomplexen. Die NADH-Dehydrogenase (I), Succinat-Dehydrogenase (II, indirekt), Cytochrom c-Reduktase (III) und Cytochrom c-Oxidase (IV) nutzen die Energie aus Elektronentransfers zum Aufbau eines Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran. Dieser wird anschließend von der FOF1-ATP-Synthase (V) als Energiequelle zur Phospho-rylierung von ADP verwendet. Für lange Zeit bestand eine Kontroverse, wie diese Proteine in der Membran organisiert sind. Nach dem „random collision“-Modell diffundieren sie frei als Einzelmoleküle und treffen sich nur zufällig, während sie nach dem „solid state“-Modell größere funktionelle Einheiten bilden. In den letzten Jahren gab es vermehrt Hinweise darauf, dass das letztere Modell das zutreffendere ist, da tatsächlich sogenannte Superkomplexe der Atmungskette in aktiver Form isoliert werden konnten. Schließlich konnte 2007 die erste drei-dimensionale Rekonstruktion eines Superkomplexes, bestehend aus Komplex I, dimerem Komplex III und Komplex IV publiziert werden. Aufgrund der Einschränkungen der verwendeten Negativkontrasttechnik hatte dieses Modell allerdings nur eine niedrige Auflösung und repräsentierte durch die Dehydrierung keinen nativen Zustand. Dadurch ließen sich die Strukturen der einzelnen Komplexe nur ungenau einpassen. Um diese Probleme zu umgehen, sollte eine Struktur unter Kryo-Bedingungen rekonstruiert werden. Um die für Kryo-EM benötigte größere Ausbeute und höhere Konzentration zu erzielen, wurde ein neues Reinigungsprotokoll für die Superkomplexe etabliert. Die wesentlichen Punkte darin sind der Austausch des für die Solubilisierung verwendeten Digitonins durch Amphipol A8-35 mittels ?-Cyclodextrin und eine anschließende Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Im BN-PAGE zeigten die auf diese Art gereinigten Superkomplexe das gleiche Banden- und Aktivitätsmuster wie Proben in Digitonin. Auch bei einer Einzelpartikelanalyse nach Negativ-kontrastfärbung konnten keine Unterschiede festgestellt werden und die Partikel zeigten ähnliche Orientierungen wie in der vorherigen Studie. Einige neue Ansichten ließen sich jedoch nicht zuordnen und stellten eventuell eine Verunreinigung mit größeren Superkomplexen dar. Da auch bei der Reinigung mit Amphipol die Proteinkonzentration letztlich nicht wesentlich erhöht werden konnte und sich die Superkomplexe nicht wie für Kryo-EM erforderlich in einen löchrigen Kohlefilm einlagerten, wurden die Proteine auf einem durchgehenden Kohlefilm in einer dünnen Pufferschicht vitrifiziert. Die dabei zu beobachtenden bevorzugten Orientierungen, sollten auch die Unterscheidung von verschiedenen Populationen von Superkomplexen erleichtern. Eine erste 3D-Rekonstruktion wurde mit Hilfe der „random conical tilt“-Methode errechnet. Dieses Modell wurde durch „projection matching“ bis zu einer Auflösung von 19 Å verfeinert, womit die Auflösung fast doppelt so hoch ist, wie bei der Rekonstruktion aus Negativ-kontrastfärbung (36 Å). Die Struktur repräsentiert einen natürlichen Zustand des Proteins und zeigt Details wie einzelne Domänen, Spalten zwischen Domänen und eine starke Krümmung des Membranarms von Komplex I, die zuvor nicht erkenn-bar waren. Die Amphipole bilden einen Gürtel um den Transmembranbereich. Die Röntgenstrukturen von Komplex I, III2 und IV konnten mit großer Präzision in die Dichtekarte eingepasst werden. Die wenigen kleinen Unterschiede zwischen Röntgenstrukturen und EM-Dichtekarte sind auf leichte Konformations-änderungen zurückzuführen. Die Kryo-EM-Rekonstruktion ist erheblich größer als die Rekonstruktion aus Negativfärbung, wodurch die enthaltenen Komplexe nur noch wenige punktuelle Kontakte haben. In den Zwischenräumen könnte eine spezielle Lipidumgebung die kleinen Elektronenüberträger Ubichinon und Cytochrom c in den Superkomplex integrieren. Ihre Bindestellen sind jeweils zueinander orientiert und die geringen Abstände, die zum ersten Mal bestimmt werden konnten, stützen die Hypothese eines gerichteten Substrattransfers über kurze Entfernungen. Von den möglichen Übertragungswegen scheint der kürzere mit weniger Transferreaktionen bevorzugt zu werden. Während der Entwicklung des neuen Reinigungsprotokolls für die Superkomplexe konnte zusätzlich eine neue Methode zur Rekonstitution von Membranproteinen entwickelt werden. Die solubilisierten Proteine werden dabei in Dichtegradienten mit steigenden Konzentrationen von ansolubilisierten Liposomen und Cyclodextrin zentrifugiert, wodurch ihnen langsam das Detergens entzogen und durch Lipid ersetzt wird. Proteoliposomen werden gleichzeitig von überschüssigem Lipid und Cyclodextrin-Detergens-Komplexen getrennt.
Integrin a2ß1 ist ein Adhäsionsrezeptor, der verschiedene Kollagentypen bindet. Als solcher spielt es eine bedeutende Rolle für Zellfunktionen wie Migration und die Regulation des Zytoskeletts, Zellteilung, Apoptose und Differenzierung. Integrin a2ß1 übernimmt deshalb eine tragende Funktion in Prozessen wie Wundheilung, Angiogenese und der Progression und Metastasierung von Krebs. Rhodocetin ist ein Antagonist des Integrins a2ß1. Es ist ein C-Typ-Lektin-artiges Protein das im Schlangengift der Malaiischen Grubenotter (Calloselasma rhodostoma) entdeckt wurde. Rhodocetin besteht aus vier Untereinheiten a, ß, ? und d, die zwei Dimere formen (aß und ?d), welche wiederum eine kreuzförmige heterotetramere Quartiärstruktur bilden, die bislang nur für Rhodocetin beschrieben wurde. Rhodocetin bindet an die Integrin-a2A-Domäne der a-Untereinheit des Integrins a2ß1. Rhodocetin unterbindet damit die Bindung von Kollagen und die Aktivierung des Integrins. Der genaue Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne ist noch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper gegen Rhodocetin generiert. Es wurden sechs Fusionen von Lymphozyten mit Myelomazellen durchgeführt, für die sowohl Mäuse als auch Ratten mit Rhodocetin immunisiert wurden. Die erzeugten Hybridomaklone wurden zunächst im ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, Rhodocetin zu binden. Positiv getestete Klone wurden selektiert und die monoklonalen Antikörper aus den Zellüberständen aufgereinigt. Es konnten 14 monoklonale Antikörper etabliert werden. Die Antikörper wurden zunächst in ihren Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurden verschiedene ELISAs, Immunblot und Immunpräzipitation genutzt. In der Duchflusszytometrie wurde getestet, ob die Antikörper an Integrin a2ß1 gebundenes Rhodocetin detektieren. Die Antikörper lassen sich hinsichtlich ihr Bindungseigenschaften und der Lage ihrer Bindungsepitope auf den verschiedenen Rhodocetin-Heterodimeren in unterschiedliche Klassen unterteilen. Es wurde nachgewiesen, dass Rhodocetin Konformationsänderungen unterliegt, die durch die Bindung einiger der generierten Antikörper induziert werden. Um den Einfluss divalenter Kationen auf die Konformation von Rhodocetin sowie den Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne zu untersuchen, wurde die analytische Gelfiltrationschromatographie genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung divalenter Kationen die Konformation von Rhodocetin beeinflusst. Um die Interaktionsstudien von Rhodocetin mit der a2A-Domäne auszuwerten wurde ein Sandwich-ELISA etabliert. Dieser ermöglichte es, im Anschluss an die Gelfiltration, die beiden Rhodocetin-Heterodimere unabhängig voneinander im Eluat nachzuweisen und zu quantifizieren. Es wurde nachgewiesen, dass das Rhodocetin-Heterotetramer während der Interaktion mit der Integrin-a2A-Domäne dissoziiert und nur das ?d-Dimer einen stabilen Komplex mit der a2A-Domäne bildet, während das aß-Dimer freigesetzt und unabhängig von diesem Komplex eluiert wird. Die pharmakologischen Eigenschaften von Rhodocetin wurden in einem Tumor-Xenograft-Modell untersucht, für das immundefizienten Mäusen HT1080 Fibrosarkomzellen implantiert wurden. Rhodocetin wurde den Mäusen intravenös appliziert und die Auswirkungen auf die Tumoren sowie der Verbleib von Rhodocetin im Körper analysiert. Die Entwicklung der Serumkonzentration von Rhodocetin wurde mit dem etablierten Sandwich-ELISA untersucht, welches hierzu mit einer Standardreihe kalibriert wurde. Die Elimination von Rhodocetin folgt einer Kinetik erster Ordnung. Die Exkretion von Rhodocetin erfolgt über die Niere. Es zeigte sich, dass etwa zwei Drittel des applizierten Rhodocetins unmittelbar nach Injektion von Integrin a2ß1-exprimierenden Zellen des Blutes gebunden werden. Die immunhistologische Auswertung von Tumoren und Kontrollgeweben ergab, dass Rhodocetin an Endothelzellen innerhalb der Nierenglomeruli sowie der Leber bindet. Rhodocetin konnte auch auf Endothelzellen der Tumorvaskulatur nachgewiesen werden. Innerhalb der Tumoren wurde Rhodocetin auch außerhalb von Blutgefäßen gefunden, wo es an HT1080 Tumorzellen bindet. Die Behandlung mit Rhodocetin beeinträchtigte die Integrität der Blutgefäße innerhalb der Tumoren und führte zu Hämorrhagien. Um die Auswirkungen von Rhodocetin auf die Tumoren genauer zu untersuchen und zu quantifizieren, wurde dynamische Magnetresonanztomographie genutzt. Es zeigte sich, dass Rhodocetin die Durchlässigkeit der Blutgefäße in Tumoren signifikant erhöht.
Wastewater treatment plants (WWTPs) do not eliminate micropollutants completely and are thus important point sources for these substances. In particular, concerns about en-docrine disrupting compounds in WWTP effluents give rise to the implementation of advanced treatment steps for the elimination of trace organic contaminants. The present study investigated ozonation (O3) and activated carbon treatment (AC) at two WWTPs. For an ecotoxicological assessment at WWTP Regensdorf, conventionally treated wastewater, wastewater after ozonation, and ozonated wastewater after sand filtration were evaluated in parallel via the fish early life stage toxicity test (FELST) using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Additionally, a comparative toxicity evalu-ation of ozonated and activated carbon treated effluents was performed at the pilot scale treatment plant in Neuss (WWTP Neuss). For this purpose, four invertebrate tests and one higher plant toxicity test were selected to assess potential biological effects on or-ganisms [Lemna minor growth inhibition test, chironomid toxicity test with Chironomus riparius, Lumbriculus variegatus toxicity test, comet assay with haemolymph of the zebra mussel (Dreissena polymorpha), reproduction test with Potamopyrgus antipo-darum]. All in vivo assays were performed on site at the treatment plants in flow-through test systems. Furthermore, the present study investigated the effects of ozona-tion and activated carbon treatment on endocrine activities [estrogenicity, anti-estrogenicity, androgenicity, anti-androgenicity, aryl-hydrocarbon receptor (AhR) agonistic activity] with yeast based bioassays using solid phase extracted water samples. To evaluate the removal of in vitro non-specific toxicity, a cytotoxicity assay using a rat cell line was applied. The FELST at WWTP Regensdorf revealed a considerable developmental retardation of test organisms exposed to ozonated WW. This was accompanied by a significant decrease in body weight and length compared to reference water, to the conventionally treated WW, and to the ozonated water after sand filtration. Hence sand filtration obvi-ously prevents from adverse ecotoxicological effects of ozonation. An additional test – starting with yolk-sac larvae – resulted in a significant reduction of vitellogenin levels in fish exposed to ozonated wastewater compared to fish reared in conventionally treat-ed wastewater. This demonstrates the effective removal of estrogenic activity by ozonation. At WWTP Neuss, the reproduction test with the mudsnail P. antipodarum exhibited a decreased reproductive output after advanced treatment compared to conventional treatment. This indicates an effective estrogenicity removal by ozonation and activated carbon treatment and is confirmed by results of the yeast estrogen screen with a reduc-tion of in vitro estrogenic activity by > 75%. The L. variegatus test revealed a signifi-cantly enhanced toxicity after ozonation compared to conventional treatment, whereas this effect was reduced following subsequent sand filtration. When ozonation was applied, a significantly increased genotoxicity was observed, detected with the comet assay using haemolymph of the zebra mussel. Again, this effect was removed by subsequent sand filtration to the level of conventional treatment. Activated carbon treatment even resulted in a significant reduction of genotoxicity. At both treatment plants, adverse effects after ozonation may have been a result of the formation of toxic oxidation by-products. However, sand filtration reduced toxication effects, indicating that these oxidation by-products are readily degradable or adsorbable. The results point out that, in any case, ozonation should not be applied without subsequent biologically active post treatment appropriate for oxidation by-products removal (e.g. sand filtration). However, only activated carbon achieved a toxicity reduction compared to the conventional treated wastewater. Thus, it cannot be excluded that po-tential beneficial effects due to ozonation might be masked by residual toxic oxidation by-products passing the sand filter or ozonation is not as effective in toxicity removal as PAC treatment. The yeast based assays with solid phase extracted samples revealed an effective endo-crine activity removal during ozonation and activated carbon filtration (estrogenicity: 77 – 99%, anti-androgenicity: 63 – 96%, AhR agonistic activity: 79 – 82%). The cyto-toxicity assay exhibited a 32% removal of non-specific toxicity after ozonation com-pared to conventional treatment. Ozonation in combination with sand filtration reduced cytotoxic effects by 49%, indicating that sand filtration contributes to the removal of toxicants. Activated carbon treatment was the most effective technology for cytotoxici-ty removal (61%). Sample evaporation reduced cytotoxic effects by 52% (after activated carbon treatment) to 73% (after ozonation), demonstrating that volatile substances contribute considerably to toxic effects, particularly after ozone treatment. These results confirm an effective removal or transformation of toxicants with receptor mediated mode of action and non-specific toxicants during both investigated treatment steps. However, due to the limited extractability, polar ozonation by-products were neglected for toxicity analysis, and hence non-specific toxicity after O3 is underestimated. In the long run, only on-site comparisons at WW receiving water bodies (e.g. communi-ty analysis of fish, macroinvertebrates, plants, microorganisms) – before and after up-grading WWTPs – allow drawing environmentally relevant conclusions regarding bene-fits and risks of advanced WW treatment methods. Conclusively, the benefits and possible negative impacts have to be carefully evaluated to prove that not more environmental impact will be induced than removed by advanced treatment technologies as each additional treatment requires considerable amounts of energy, resources, and infrastructure facilities. Accordingly, comprehensive sustainable approaches for pollution prevention and wastewater treatment (e.g. source control and source separation) are preferable compared to end-of-pipe treatment systems.
Employing NMR spectroscopy, it is not only possible to calculate the three dimensional structures of single proteins, but also to study dynamics and conformational changes of protein-complexes. In fact that is an important aspect, since the protein function depends on dynamics and interactions with other molecules. Therefore the study of protein-protein interactions is of highest importance for a better understanding of biological processes. Based on NMR methods, in this thesis we were able to determine protein-protein interactions within the enterobacterial Rcs signalling complex which is regulated via a phosphorelay. Originally identified as regulator of capsule synthesis, the Rcs phosphorelay is now considered to be implicated in stress response caused by disturbances in the peptidoglycan layer. Beyond that the Rcs system is involved in multiplex transcriptional networks including cell division, motility, biofilm formation and virulence. Because of such global nature and its extraordinary structural organisation involving membrane integrated sensor proteins (RcsC, RcsD), coactivators (RcsF, RcsA) and a transcription factor (RcsB), the Rcs system is one of the most remarkable phosphorelays in the family of enterobacteriacaea. During the complex phosphotransfer the histidine phosphotransferase (HPt) domain of the intermediary RcsD protein mediates the phosphotransfer between RcsC and RcsB, and probably modulates the phosphorylation state of the response regulator RcsB. Therefore the present work has been focused on the interface between RcsD and RcsB in more detail. In the first part of the thesis a new domain within the RcsD protein has been identified and structurally analysed by liquid NMR spectroscopy. RcsD is an inner membrane bound hybrid sensor like-kinase composed of a periplasmic sensor domain and a cytoplasmic portion. The cytoplasmic part contains the histidine like-kinase (HK) domain and the histidine phosphotransferase (HPt) domain. By analysis of the secondary structure in more detail, it was shown here that the two domains are intermitted by an additional 13.3 kDa domain. Corresponding to the position of the ABL (α−β−loop) domain of RcsC, located C-terminal to the RcsC-HK domain, the new identified domain was named RcsD-ABL. The central structural element of RcsD-ABL is a β-sheet composed of six strands with a β1−β2−β3−β4−β6−β5 topology and surrounded by two α-helices α1 and α2. In the second part of the thesis, RcsD-ABL is identified as a binding domain for the response regulator RcsB by NMR titration experiments. Such a binding domain for a response regulator has so far only been described for the histidine kinase CheA. In reportergene assays with β-galactosidase and ONPG as substrate it was shown that overexpression of RcsD-ABL in high amounts inhibited binding of RcsB to its target promoter. The β-galactosidase activity was reduced by 80 % with respect to cells carrying no plasmid encoding RcsD-ABL. The mapping of the binding interface was successfully achieved by chemical shift perturbations, a fast mapping protocol and selective labelling. It was shown that the interaction between RcsD-ABL and RcsB takes place via a binding interface comprising mainly the two α-helices of RcsD-ABL and the α-helices α7, α8 and α10 in the effector domain of RcsB. In the third part of the thesis, the interaction of RcsB with RcsD-ABL was related to that with RcsD-HPt. Using NMR titration experiments and ITC measurements, a comparison of the binding constants (Kd) of RcsB interacting either with the isolated RcsD-ABL (2 PM) or the isolated RcsDHPt domain (40 PM) revealed a higher affinity of RcsD-ABL to RcsB. A conjugate of RcsD-ABL-HPt interacting with RcsB decreased the Kd in the one-site fitting mode to 10 PM. However, the two-site fitting mode applied for RcsD-ABL-HPt/RcsB interaction resulted in a Kd (RcsD-ABL) of 2 PM and a Kd (RcsD-HPt) of 8 PM, indicating that RcsD-ABL enhances the binding of RcsD-HPt to RcsB. In the last part of the thesis, it was partly possible together with the data obtained from NMR titration experiments, PRE measurements and a HADDOCK protocol to develop a geometrical model for the interaction of RcsD with RcsB. In this model the receiver domain of RcsB interacts with the RcsD-HPt domain and the RcsB effector domain interacts with the RcsD-ABL domain. These results lead to surprising insights on the regulation of phosphorelays, since normally the effector domain binds to DNA. Here the effector domain is recognized by the newly identified RcsD-ABL domain. Prospectively, further investigations of phosphorylation affects and mutational studies will be of great interest.
This study comprises a survey on ecology, morphology and taxonomy of parasitic fungi infecting Pteridophytes and Orchidaceae found by the author on several field trips to Western Panama as part of the project plant parasitic micro-fungi of Western Panama (ppMP). In Panama, approximately 9500 species of vascular plants are found. Of these, Orchidaceae are with ca. 1150 (ca. 12%) species by far the most speciose family. The Pteridophytes in Panama comprise ca. 940 species in 31 families. Most fungal pathogens on Orchidaceae in tropical regions were described from plants in culture or from material intercepted at borders by plant quarantine services and not from their natural habitats. Therefore, little is known about distribution and ecology of these pathogens in their natural range. The author determined and classified several hundred Orchidaceae-species and Pteridophytes at the sites selected in the context of the project. This work facilitated the identification of many host plants (at least to genus-level) even in sterile condition in the field. About 65 species of Pucciniales are known to infest Orchidaceae and ca. 38% of them are described from tropical America. All available types of Pucciniales on Orchidaceae in tropical America were studied and compared with 91 specimens of rust fungi on orchids collected by the author in Panama. Several hundred additional specimens housed in the BPI, almost all intercepted from plant quarantine services, were used for comparison. As result of this work, it is suggested to combine Uromyces stenorrhynchi Henn. to Sphenospora and, as this is the oldest epithet, to synonymize S. kevorkianii Linder, S. mera Cumm. and S. saphena Cumm. with it. Further, it could be demonstrated that Uredo aurantiaca Montemartini, U. cyrtopodii Syd. & P. Syd., U. epidendri Henn., U. guacae Mayor, U. gynandrearum Corda, U. lynchii (Berk.) Plowr., U. neopustulata Cumm. (≡U. pustulata Henn.), U. nigropuncta Henn., U. oncidii Henn., U. ornithidii F. Kern., Cif. & Thurst., and presumably U. scabies Cke., are anamorphs of this variable species. U. gynandrearum is the oldest anamorph-name for all these taxa. Therefore, it can be established that this rust infects more than 80 species of Orchidaceae in three subfamilies. In total, the anamorph of this species was collected by the author on 17 different species of Orchidaceae in Panama which, apart from one species, are all new hosts to science. The molecular data obtained by the author confirm this view, although more data, especially from material from the whole range of distribution of U. gynandrearum, are necessary. Puccinia spiranthicola Cumm. was found to be a synonym of P. cinnamomea Diet. & Holw. and was found by the author on three different Orchidaceae in two subfamilies. Uredo pleurothallidis Keissl. is now considered a synonym of U. wittmackiana Henn. and the latter as the anamorph of Puccinia oncidii Cumm. In the anamorph genus Uredo, a new species was found infecting at least five different species of Sobralia and Elleanthus (Sobraliinae) at different localities. Molecular data indicate it to be related to the currently polyphyletic Phakopsoraceae. For the rusts with suprastomatal sori on Orchidaceae, now separated from Hemileia and placed in the genus Desmosorus (nom. inval.), the current concept with only one taxon is rejected and the establishment of three subspecies is suggested. The complicated taxonomy is discussed and makes it necessary to validate the genus-name and make a new combination. Another Hemileia-anamorph species was found by the author and is considered to be new to science. This is the first species of this alliance in America on Orchidaceae. Molecular data obtained by the author confirm the separation of Desmosorus from Hemileia and the position of the new species. For rusts on Pteridophytes, a new species of Milesia, (teleomorph: Milesina) and a new anamorphic species of Uredinopsis was found, both on hosts hitherto not known. In Calidion, the presumable anamorph-genus of Uncol, the species C. cf. cenicafeae Salazar & Buriticá was found on several new hosts. Further, the teleomorph was found. Morphologically, this teleomorph did not agree with the description of Uncol by the author of the genus, although the anamorph characteristics left no doubt that it is Calidion. Apparently, the description of Uncol is inadequate, but cannot be improved, as the type is unavailable. Molecular data obtained by the author show this species to be closest to Desmosorus. For Uredo superficialis Speg., the anamorph of Desmella, nine new hosts in eight different fern families were found by the author and the collaborators of the ppMP-project. Ecological data indicate that this species includes different host specific races, which, however could not be distinguished morphologically. For all these rusts, a thorough discussion of the ecology in their habitats is given. In total, 21 LSU rDNA sequences from 6 different rust species on Orchidaceae and Pteridophytes were obtained and analyzed with the Maximum Parsimony and Minimum Evolution method. Here, the position of several groups could be confirmed, and some anamorphs could be assigned to different teleomorphic relationships. Within the Ascomycota and their anamorphs, several hitherto unknown species and species not known from these hosts or not known from Panama were found and analyzed. On Orchidaceae, the following fungi belonging to the Ascomycota are described, illustrated and discussed: In the Phyllachorales, a hitherto not known Phyllachora sp. was found on Oncidium warszewiczii Rchb. f. and was compared with the other species of this order currently known from Orchidaceae. In the Asterinaceae s. l. Lembosia cf. epidendri Meir. Silva & O. R. Pereia was found on Maxillaria crassifolia (Lindl.) Rchb. f., which is a new host and new host alliance for this fungus hitherto only known from Brazil. The fungus is described and compared with all species of Asterinaceae currently known on Orchidaceae. In the Meliolaceae, Meliola orchidacearum Cif. was found on Camaridium biolleyi (Schltr.) Schltr. and an Epidendrum sp. which are new hosts and new host alliances of this fungus which was hitherto only known from the Caribbean Islands. It is described, illustrated and compared with the type. In the Glomerellaceae, Glomerella cingulata and its anamorph Colletotrichum gloeosporioides were found on several hosts. The species is illustrated, described and compared with data from literature. In the anamorphic Mycosphaerellaceae, Pseudocercospora odontoglossii (Prill. & Delacr.) U. Braun, a species currently only known from culture, was found on the new host Pleurothallis imraei Lindl. It is illustrated, described and compared with data from literature. On ferns, the following other fungi are described, illustrated and discussed: A conspicuous undescribed form of Polycyclus was found by the author on Elaphoglossum ciliatum (C. Presl.) T. Moore (Dryopteridaceae) and Serpocaulon loriceum (L.) A. R. Sm. (Polypodiaceae). A conspectus of Parmulariaceae infecting ferns is given and demonstrated that Polycyclina should be synonymized under Polycyclus. Summing up, it can be assessed, especially for the Pucciniales, that the most speciose plant family in Panama carries remarkable few species of specific parasites, and that many of them seem to be distributed over a wide range of species which often are not closely related. One reason amongst others seems to be that parasites need a minimum density of host plants in a habitat to survive. As orchid species often occur with only few (and often small) individual plants at a given locality, the probability for a specific pathogen to infect a plant gets too low, hence high diversity by low abundance of hosts might be an impediment for specific pathogens. In this case, unspecific parasites, or such which are infecting larger alliances, are in advantage. Other reasons could be specific traits of orchids, like succulence and mycotrophy which might hamper fungal infections.
Die Chemokinrezeptoren CXCR3 und CXCR4 sowie deren spezifische Liganden, CXCL9, -10 und -11 bzw. CXCL12, sind in bedeutender Weise an den pathologischen Prozessen der Th1-/Th17-vermittelten (Typ1- und Typ17-T-Helferzelle) Autoimmunerkrankungen beteiligt. Die dabei auftretenden chronischen Entzündungen sind gekennzeichnet durch eine massive Infiltration von Th1-Gedächtniszellen. Ergebnisse sowohl von tierexperimentellen Studien als auch von in vitro Experimenten weisen deutlich auf eine spezifische Wechselwirkung zwischen den proentzündlichen CXCR3- und dem homöostatischen CXCR4-Liganden hin. Weiterführenden Ergebnisse zu der molekularen Wechselwirkung von CXCR3 und -4 wurden jedoch bislang nicht veröffentlicht. Die Untersuchungen dieser Dissertation konzentrierten sich auf die Kooperation der beiden Chemokinrezeptoren in murinen Th1-Gedächtniszellen. Dabei sollte insbesondere der potentielle Einfluss dieser Interaktion auf die einzelnen Teilprozesse der Extravasation der T-Lymphozyten in vitro analysiert werden. Eingesetzt wurden hierfür statische Chemotaxis- und dynamische Flusskammerexperimente, die zum einen sensitiv genug und zum anderen für einen hohen Probendurchsatz geeignet sein mussten. Die verwendeten Techniken wurden dazu im Rahmen der Dissertation etabliert und validiert. Zunächst musste die Präzision des statischen Migrationssytems mit einer hohen Standardabweichung von durchschnittlich ± 40% deutlich verbessert werden. Ein Wechsel auf ein Kammersystem der Firma Corning verringerte die Abweichung auf ± 25%, und sogar auf ± 9,9% bei einer optimierten Auswertung mittels Durchflusszytometrie. Als weitere Methode wurde ein dynamisches Flusskammersystem mit automatischer Videoanalyse zur Bestimmung der Geschwindigkeit von Zellen etabliert. Zur Validierung der neu entwickelten Analysesoftware Imagoquant® wurden identische Filmaufnahmen von Flusskammerexperimenten hinsichtlich Zellrollen und Zellgeschwindigkeit ausgewertet und mit den Ergebnissen von zwei etablierten Methoden, der Handzählung und einem halbautomatischen Tracking-Programm, verglichen. In der gesamten Validierung stimmten die Berechnungen von Imagoquant® mit Ergebnissen der verschiedenen Auswertemethoden qualitativ überein, wobei die Filme um ein Vielfaches (16- bzw. 20-fach) schneller analysiert werden konnten als mit den bisher verwendeten Methoden. Somit konnte erfolgreich eine computergestützte Analysemethode validiert und etabliert werden, die schnell und benutzerunabhängig arbeitet und folglich objektive Daten im Hochdurchsatz generiert. Die Untersuchungen in den statischen und dynamischen Migrationssystemen ergaben, dass die Stimulation von Th1-Zellen mit CXCL9 zu einer heterologen Desensitivierung verschiedener CXCL12-vermittelter Effekte führt. In statischen Migrationsexperimenten wurde sowohl durch eine synchrone als auch eine sequentielle Stimulation mit CXCL9 eine CXCL12-vermittelte Chemotaxis signifikant vermindert. Der auftretende Effekt war dabei lang anhaltend und konnte noch bei einer Stimulationsdauer von 20 h beobachtet werden, ohne an Intensität zu verlieren. Weitere funktionelle Experimente erfolgten in dynamischen Flusskammerexperimenten, um die desensitivierende Wirkung von CXCL9 auf CXCL12-abhängige Interaktionen der Adhäsionskaskade von Th1-Zellen zu untersuchen. In mit E-Selektin und ICAM-1 Fc-Chimära) beschichteten Flusskammern führte immobilisiertes CXCL12 zu vermehrtem integrinabhängigen Rollen, welches durch eine Vorinkubation der Th1-Zellen mit CXCL9 reduziert wurde. In Flusskammern mit murinen Endothelzellen bewirkte immobilisiertes CXCL12 eine rasche integrinabhängige Adhäsion der Zellen und verkürzte dadurch deren Rollphase signifikant. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 verminderte dagegen die CXCL12-vermittelte Adhäsion und führte damit zu längeren Rollphasen. Deutliche Effekte zeigte CXCL12 bezüglich einer gesteigerten intravasalen und transendothelialen Migrationsrate von T-Lymphozyten, die durch eine Vorstimulation mit CXCL9 aufgehoben wurden. Um die beteiligten Mechanismen dieser Desensitivierung zu entschlüsseln, wurde die Oberflächenexpression von CXCR3 und CXCR4 in dem Th1-Zellklon durchflusszytometrisch analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Stimulation mit CXCL9 neben der ligandenspezifischen Internalisierung von CXCR3 auch eine Kreuzregulation der CXCR4-Oberflächenexpression bewirkte. Im Weiteren wurde die Phosphorylierung bekannter Signalmoleküle der CXCR4-Signalwege analysiert. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 desensitivierte die CXCL12-induzierte Phosphorylierung von Akt signifikant und führte zu einer zeitlichen Modulation des Signals. Ferner verzögerte eine Vorbehandlung der Th1-Zellen mit CXCL9 das CXCL12-induzierte Calciumsignal erheblich, während dabei eine 3,5-fach höhere maximale Ca2+-Konzentration gemessen wurde. Ein abgeleiteter Mechanismus der CXCL9-abhängigen Desensitivierung von CXCR4-Signalwegen beeinflusst insbesondere die Signaltransduktion über den T-Zellrezeptor und dadurch auch die Regulation von Rac1. Des Weiteren führt CXCL9 zur Gi- oder ZAP-70-vermittelten Aktivierung der PKC, welche darauffolgend den CXCR4-Rezeptor phosphoryliert und damit zu dessen Internalisierung führt. Die in vitro beobachtete Desensitivierung verschiedener CXCL12/CXCR4-vermittelter Effekte durch CXCL9 wirkt potentiell in der in vivo Situation von Autoimmunerkrankungen auf unterschiedliche Weise proinflammatorisch. Zum einen wird die Mobilisierung von Th1-Zellen aus CXCL12 exprimierenden peripheren Gewebe gefördert und gleichzeitig verhindert, dass Th1-Zellen in nicht entzündetes peripheres Gewebe rekrutiert werden. Zum anderen wird im Entzündungsgebiet die Affinität der Th1-Zellen zu den CXCL12-exprimierenden Endothelzellen verringert und die Migration in tieferliegende Gebiete der Entzündung begünstigt. Ferner vermindern CXCR3-Liganden auch antiinflammatorische Effekte des CXCL12s, wie z.B. die Polarisierung der Th1-Zellen in regulatorische T-Zellen.
Die Etablierung eines HIV-1 Tiermodells ist ein großes Ziel auf dem Weg zur Entwicklung antiretroviraler Medikamente und Impfstoffe gegen HIV-1. Speziesspezifische Restriktionsfaktoren und fehlende Kofaktoren verhindern jedoch die Replikation von HIV-1 in Tieren. Restriktionsfaktoren sind Bestandteil der intrinsischen Immunität und entwickelten sich im Laufe der Evolution als Abwehrmechanismus gegen diverse Pathogene. Dazu gehören die Proteine der APOBEC3-Familie, TRIM5􀀁 und Tetherin, welche die Virusreplikation von HIV-1 an verschiedenen Punkten seines Lebenszyklus inhibieren. Koevolutionär entwickelten Retroviren Antagonisten, um die restriktive Funktion ihrer Wirtsproteine zu umgehen. Um ein replikationskompetentes, simiantropes HIV zu generieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Sequenzen vifHIV-1 und vpuHIV-1 gegen vifagm.tan aus SIVagm.tan und vpugsn/den aus den Immundefizienzviren SIVgsn und SIVden substituiert, um die Restriktion gegen A3G und Tetherin in Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze zu umgehen. Die TRIM5 vermittelte Restriktion wurde über eine Mutation in der Cyclophilin A Bindedomäne des Kapsids verhindert. Die Analyse der Vifagm.tan Funktion bestätigte den geänderten Tropismus des chimären HIV-1 bezüglich der APOBEC3G vermittelten Restriktion. Denn nach Austausch des vifHIV-1 Gens war das Virus nicht mehr in der Lage, die Aktivität des humanen APOBEC3G zu unterbinden und initiierte stattdessen die Degradation des Analogons aus der Afrikanischen Grünen Meerkatze. Weiterhin konnte die erfolgreiche Klonierung des vpugsn/den Gens in HIV-1 die Aktivität der SHIV-Konstrukte gegen Tetherin der Afrikanischen Grünen Meerkatze und der Rhesusaffen ändern, wohingegen humanes Tetherin nicht mehr abgebaut werden konnte. Trotz der erfolgreichen Aktivität der konstruierten SHIVs gegen die zellulären Restriktionsfaktoren der Afrikanischen Grünen Meerkatze, replizierten die generierten chimären Viren in einer AGM Zelllinie, nicht aber in periphären mononuklearen Blutzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze. Ein Indiz, das für weitere strukturelle Anpassungen der Viren gegenüber ihren Wirten spricht, die zur Bildung der Spezies-Barriere beitragen und Zoonosen erschweren. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die Aktivitäten der Proteine der APOBEC3-Familie und VifHIV-1 auf ihre Regulation durch Phosphorylierung untersucht. Proteinphosphorylierungen gehören zu den wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen, um diverse Funktionen wie die Enzymaktivität, Proteininteraktionen und die zelluläre Lokalisation zu steuern. Dabei konnte die durch Yang et al. postulierte Phosphorylierung von VifHIV-1 nicht bestätigt werden. Analysen der mutmaßlichen VifHIV-1 Phosphomutanten enthüllten, dass die Funktion von VifHIV-1, die Infektiosität von HIV-1 zu gewährleisten, durch Substitution der mutmaßlichen Phosphoaminosäuren nicht beeinträchtigt wird und ebenso sämtliche Phosphomutanten die Degradation von A3G initiierten, wenn auch in unterschiedlichem Maße. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass A3C entweder in einem phosphorylierten Protein-Komplex vorliegt oder ein phosphoryliertes Protein bindet. Zudem konnte ermittelt werden, dass APOBEC3A als einziges Protein der APOBEC3-Familie nach TPA- und cAMP-Stimulation phosphoryliert wird. In vitro Kinase Studien konnten zeigen, dass die Phosphorylierung unter anderem durch ERK2 erfolgt. Es konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen der Phosphorylierung von A3A und dessen zellulärer Lokalisation, Aktivität gegen HIV-1 als auch gegen die Retrotranspositionselemente IAP und LINE-1 hergestellt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die Phosphorylierung die untersuchten Aktivitäten von APOBEC3A nicht beeinflusst oder APOBEC3A eine bisher unbekannte durch Phosphorylierung regulierte Funktion besitzt.
In mitochondrial respiration, the soluble protein cytochrome c accepts an electron from the membrane bound cytochrome bc1. The interaction between cytochrome bc1 and cytochrome c is highly transient in nature, enabling turnover numbers greater than 160 s-1. Yeast cytochrome bc1 has been successfully crystallised with bound cytochrome c with the help of an antibody fragment (Lange and Hunte 2002; Solmaz and Hunte 2008). In all crystal structures of the complex, the homodimeric cytochrome bc1 binds only one cytochrome c, with the binding site located on subunit cytochrome c1. Univalent cytochrome c binding is correlated with conformational changes of the Rieske protein head domain and subunit QCR6p. The interface of the complex is small. The haem moieties are centrally located in a mainly non-polar contact site that includes a cation–! interaction and is surrounded by complementary charged residues. The crystal structure is in agreement with the general architecture of the interfaces of transient redox complexes and also reveals several interesting features unique to the cytochrome bc1. On the basis of the crystal structures, an extensive thermodynamic and kinetic characterisation of the interaction was carried out in this work to challenge the static snapshot of the bound proteins in the crystal structure as the relevant physiological electron transfer. The thermodynamic parameters of the interaction between the redox partners were determined using isothermal titration calorimetry (ITC). The association constant for cytochrome bc1 and cytochrome c in oxidised state under physiological ionic strength of 120 mM at 25 °C, was determined to be 5 " 103 M-1 by direct ITC titration. So, the partners interact with an affinity of 200 #M. In spite of the low affinity the complex has a life time ($ = 1/koff) of 5 #second, sufficiently long to enable the theoretically calculated electron transfer rates of 1.0 " 106 to 2.6 " 107 s%1 with a lifetime ($ = 1/rate) of 1-0.04 μseconds and experimentally determined rate of 7.7 " 104 s%1 with a lifetime of 13 μseconds. The low affinity makes it difficult to ascertain the stoichiometry of binding. The enthalpy of the interaction is endothermic, which is consistent with the nature of an interface where hydrophobic interactions are dominant. The enthalpy and entropy is 3.6 kJmol-1 and 83 kJmol-1K-1, respectively. The importance of key interface residues was also investigated. The role of the interface residue G89 of cytochrome c which might have a role in the dissociation of the complex has been probed by site-directed mutagenesis. The interface contains a cation-! interaction between F230 of cytochrome bc1 and R19 of cytochrome c, which is thought to provide the specificity to the interaction between the otherwise promiscuous partners. To analyse the role of this interaction pair in electron transfer, F230L and F230W mutants were used to measure direct electron transfer rates by flash photolysis and steady state kinetics. The findings indicate that another ! system can work as functional substitution of F230, while deleting the ! system has a deleterious effect on the complex formation. The inability of F230L to achieve the transient and steady state turnover rates as wild type protein indicates a scenario where the variant achieves an altered bound state with inefficient electron transfer pathways and higher edge-to-edge distance. The role of supernumerary subunit QCR6p in complex formation was investigated by steady state kinetics measurements. Subunit QCR6p does not interact directly with cytochrome c but is positioned in such a way that it could electrostatically steer cytochrome c in a reactive ensemble. The highly acidic and disordered N-terminus of QCR6p could interact with a patch of conserved lysine residues on cytochrome c. The role of subunit QCR6p has been assessed using QCR6p deleted cytochrome bc1 and a lysine variant of cytochrome c. The results show that QCR6p not only affects the kinetics of the interaction but is also important for the stability of cytochrome bc1. The kinetic and thermodynamic data obtained during this study provide evidence for the functional importance of non-catalytic cytochrome bc1 subunit QCR6p, show that the entropy driven interaction is indeed of low affinity and highly transient in nature and indicate that the interface is well suited to ensure the high turnover of the electron transfer chain where cytochrome c interacts with multiple partners using overlapping interfaces. The suggested role of the cation-! interaction as a highly specific interaction has been validated.
In der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 ist neben Patientenschulung, Fewichtsreduktion und körperlicher Aktivität die Therapie mit oralen Antidiabetika von besonderer Bedeutung, um langfristig die Blutzuckereinstellung zu verbessern und kardiovaskuläre wie andere Folgeerkrankungen zu minimieren. Allerdings sinkt im Verlauf die Effizienz dieser Therapie, so dass die dauerhafte Gabe von Insulin notwendig wird. Dabei können jedoch auch schwerwiegende Nebenwirkungen, wie z.B. Hypoglykämien und eine wiederrum mit einem erhöhten Risiko an kardiovaskulären Erkrankungen verbundene ausgeprägte Gewichtszunahme auftreten. Demgegenüber führte der GLP-1 Rezeptor-Agonist Exenatide in jüngsten Studien zu einer Verbesserung der Blutzuckereinstellung und Reduktion des Körpergewichts und kann somit als eine neuartige Therapiealternative zum bisher verwendeten Insulin angesehen werden. In der hier vorliegenden prospektiven Studie wurde Exenatide mit Insulin bei Typ 2-Diabetes Patienten mit einer unzureichenden Stoffwechseleinstellung unter Metformin in Bezug auf deren Blutzuckereinstellung und das Hypoglykämie-Risiko verglichen. In dieser 26-wöchigen, multizentrischen, kontrollierten, randomisierten und zweiarmigen Phase IIIb-Studie wurden insgesamt 494 Patienten aus ganz Deutschland untersucht. Die Patienten mit einer unzureichenden Metformin- (Primärkollektiv) oder Kombinationstherapie (exploratives Kollektiv: Metformin plus Sulfonylharnstoff) wurden im Verhältnis 3:1 auf zweimal täglich Exenatide oder zweimal täglich Mischinsulin Aspart 30/70 randomisiert. In einem hierarchischen Modell wurde zunächst die Nichtunterlegenheit von Exenatide gegenüber dem Mischinsulin im Hinblick auf das primäre Endziel der Blutzuckereinstellung (in Form des HbA1c-Wertes) untersucht und anschließend die Überlegenheit von Exenatide in Hinblick auf ein geringeres Hypoglykämie-Risiko. Sekundäre Studienziele waren die Häufigkeit von schweren und von nächtlichen Hypoglykämien, die Veränderung des Körpergewichts sowie des Body Mass Index. Ferner wurden 7-Punkt-Blutzuckertagesprofile und Patientenfragebögen in die Auswertung einbezogen. Bei der insgesamt in acht Visiten unterteilten Studie erfolgte nach zwei Wochen die Randomisierung auf die beiden Therapie-Arme. Während die Dosierung des Mischinsulins im Verlauf der gesamten Studiendauer vom Arzt individuell titriert werden konnte, wurde die Dosis von Exenatide nach vier Wochen von 2 x 5 μg/Tag auf 2 x 10 μg/Tag verdoppelt und bis zum Ende der Studie nicht verändert. Die hier vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die das Hypoglykämie-Risiko unter Exenatide und Mischinsulin als primären Endpunkt prospektiv und konfirmatorisch vergleichend untersucht. Im Primärkollektiv konnte die Nicht-Unterlegenheit von Exenatide zum Mischinsulin in Bezug auf den HbA1c-Wert festgestellt werden. Bei der Vermeidung von Hypoglykämien war Exenatide dem Mischinsulin statistisch signifikant überlegen. Zusätzlich konnte unter der Exenatide-Behandlung ein signifikanter Gewichtsverlust festgestellt werden, wohingegen die Patienten im Mischinsulin-Arm signifikant an Gewicht zunahmen. Die gleichzeitige Erreichung dieser Therapieziele (HbA1c<7,0%, keine Gewichtszunahme und keine Hypoglykämien) wurde als Triple-Endpoint definiert und im Exenatide-Arm signifikant häufiger als unter der Mischinsulin-Therapie beobachtet. In den 7-Punkt-Blutzuckertagesprofilen konnte neben einer allgemeinen Blutzuckersenkung in beiden Therapiearmen eine zusätzliche postprandiale Senkung zu den Zeiten der morgendlichen und abendlichen Exenatide-Injektion beobachtet werden. Demgegenüber waren die präprandialen Blutzuckerwerte im Mischinsulin-Arm niedriger, so dass insgesamt eine vergleichbare Verbesserung des Flächenintegrals in den Blutzuckertageskurven erzielt wurde, was die vergleichbare HbA1c-Verbesserung erklärt. Entsprechend zum Gewicht nahmen auch BMI und Hüftumfang der Patienten unter Exenatide ab und unter Insulin zu. Das Gesamtcholesterin und die Triglyceride sanken unter beiden Therapien leicht ab, HDL-Cholesterin stieg leicht an, wohingegen nur unter Exenatide das LDL-Cholesterin abnahm. Ebenfalls sanken nur im Exenatide-Arm der systolische und diastolische Blutdruck. Die häufigsten unerwünschten Ereignisse unter Exenatide waren Übelkeit, Erbrechen, Verdauungsstörungen, Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen, wobei Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen auch unter Insulin zu beobachten waren. Bei der in den Patientenfragebögen DTSQ und SF-12 dokumentierten subjektiven Empfindung der Nebenwirkungen zeigten sich allerdings eine Kompensation der deutlicheren Nebenwirkungen von Exenatide durch dessen Vorteile, u.a. im Hinblick auf seine einfachere Dosierung und der als angenehm empfundenen Gewichtsreduktion. Insgesamt war in beiden Therapie-Armen eine ausreichende Patientenzufriedenheit festzustellen. Unter denjenigen Patienten, bei denen Antikörper gegen Exenatide festgestellt wurden, nahm die Prävalenz einer Antikörperbildung gegen Exenatide bis zum Ende der Studie ab. Die Ergebnisse der hier vorgelegten Studie lassen die Schlussforderung zu, dass der GLP-1 Agonist Exenatide eine therapeutische Alternative zum Mischinsulin in der Behandlung des Diabetes Mellitus Typ 2 darstellt. Da eine Restfunktion der pankreatischen ß-Zellen eine Voraussetzung für den Therapieerfolg darstellt, sollte Exenatide möglichst früh bei nachlassender Wirkung des oralen Antidiabetikums Metformin eingesetzt werden. Hier wirkt Exenatide durch eine Verbesserung der Blutzuckereinstellung, die zudem mit einem verminderten Hypoglykämie-Risiko und einer Gewichtsreduktion verbunden ist. Die Kombination dieser drei bedeutenden Effekte hat den klinisch relevanten Vorteil, das Risiko an kardiovaskulären Spätfolgen und somit die Morbidität und Mortalität von Typ 2-Diabetikern langfristig zu senken. Dieses sollte in einer prospektiven Langzeitstudie untermauert werden.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
This thesis is based on the following publications (in chronological order): 1. Biegel, E., S. Schmidt & V. Müller (2009) Genetic, immunological and biochemical evidence for a Rnf complex in the acetogen Acetobacterium woodii. Environ. Microbiol. 11: 1438-1443. My contribution: Amplification, sequence determination and analysis of Rnf homologues, enrichment of the Rnf complex 2. Biegel, E. & V. Müller (2010) Bacterial Na+-translocating ferredoxin:NAD+ oxidoreductase. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 107: 18138-18142. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data. 3. Biegel, E., S. Schmidt, J. Gonzáles & V. Müller (2010) Biochemistry, evolution and physiological function of the Rnf complex, a novel ion-motive electron transport complex in prokaryotes. Cell. Mol. Life Sci., in press. DOI: 10.1007/s00018-010-0555-8. My contribution: I was involved in writing all chapters except chapters: „phylogenetic analyses of rnf genes“ and „distribution of rnf genes“. 4. Biegel, E. & V. Müller (2010) A Na+-translocating pyrophosphatase in the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. J. Biol. Chem., in press. DOI: 10.1074/jbc.M110.192823. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data.
Da zwischen der bakteriellen und der archaeellen Selenoprotein-Biosynthese deutliche Unterschiede existieren, sollten in dieser Arbeit trans-aktive Faktoren der Selenoprotein-Biosynthese von M. maripaludis molekulargenetisch analysiert werden um weitere Einblicke in die archaeelle Selenocystein-Biosynthesestrategie zu gewinnen. Die folgenden Ergebnisse wurden durch diese Arbeit erhalten: In Archaeen muss der Selen-Donor wie in Bakterien zu Selenophosphat phosphoryliert werden. Ohne die Aktivierung des Selen-Donors sind Archaeen nicht in der Lage Selenoproteine zu synthetisieren. Das für die Phosphorylierung des Selen-Donors verantwortliche Protein stellt in M. maripaludis interessanterweise selbst ein Selenoprotein dar. M. maripaludis ist nicht zwingend auf die Synthese von Selenocystein in einer Zwei-Schritt-Methode ausgehend von Seryl-tRNAsec, durch die Enzyme PSTK und SepSecS, angewiesen. Das Einbringen des bakteriellen Enzyms Selenocystein-Synthase in M. maripaludis, welches die gleiche Reaktion in einem Schritt durchführt, ohne Bildung des Intermediats O-Phosphoseryl-tRNAsec, ermöglicht es dem Organismus ebenfalls Selenoproteine zu bilden. Dies zeigt, dass das Intermediat O-Phosphoseryl-tRNAsec der archaeellen Selenoprotein-Biosynthese-Strategie für M. maripaludis nicht essentiell ist. Durch die Disruption eines notwendigen Faktors in der Selenoprotein-Biosynthese wird in M. maripaludis eine Veränderung der mRNA-Mengen, der für Selenoproteine und deren Cystein-haltigen Isoformen codierenden Gene ausgelöst. Diese Regulation ist unter bestimmten Bedingungen nicht reversibel. Ein Unterschied hinsichtlich der Essentialität des selenierenden Systems konnte zwischen den Stämmen M. maripaludis JJ und M. maripaludis S2 festgestellt werden. In M. maripaludis S2 ist das selenierende System essentiell. M. maripaludis JJ hingegen ist nicht auf Selenoproteine angewiesen. Weder die physiologische noch die molekulare Grundlage konnten im Rahmen dieser Arbeit aufgeklärt werden, allerdings kann das neu identifizierte HesB-ähnliche Selenoprotein als verursachender Faktor ausgeschlossen werden.
One of the key functions of blood vessels is to transport nutrients and oxygen to distant tissues and organs in the body. When blood supply is insufficient, new vessels form to meet the metabolic tissue demands and to re-establish cellular homeostasis. Expansion of the vascular network through sprouting angiogenesis requires the specification of ECs into leading (sprouting) tip and following (non-sprouting) stalk cells. Attracted by guidance cues tip cells dynamically extend and retract filopodia to navigate the nascent vessel sprout, whereas trailing stalk cells proliferate to form the extending vascular tube. All of these processes are under the control of environmental signals (e.g. hypoxia, metabolism) and numerous cytokines and peptide growth factors. The Dll4/Notch pathway coordinates several critical steps of angiogenic blood vessel growth. Even subtle alterations in Notch activity can profoundly influence endothelial cell behavior and blood vessel formation, yet little is known about the intrinsic regulation and dynamics of Notch signaling in endothelial cells. In addition, it remains an open question, how different growth factor signals impinging on sprouting ECs are coordinated with local environmental cues originating from nutrient-deprived, hypoxic tissue to achieve a balanced endothelial cell response. Acetylation of lysines is a critical posttranslational modification of histones, which acts as an important regulatory mechanism to control chromatin structure and gene transcription. In addition to histones, several non-histone proteins are targeted for acetylation reversible acetylation is emerging as a fundamental regulatory mechanism to control protein function, interaction and stability. Previous studies from our group identified the NAD+-dependent deacetylase SIRT1 as a key regulator of blood vessel growth controlling endothelial angiogenic responses. These studies revealed that SIRT1 is highly expressed in the vascular endothelium during blood vessel development, where it controls the angiogenic activity of endothelial cells. Moreover, in this work SIRT1 has been shown to control the activity of key regulators of cardiovascular homeostasis such as eNOS, Foxo1 and p53. The present study describes that SIRT1 antagonizes Notch signaling by deacetylating the Notch intracellular domain (NICD). We showed that loss of SIRT1 enhances DLL4-induced endothelial Notch responses as assessed by different luciferase responsive elements as well as transcriptional analysis of Notch endogenous target genes activation. Conversely, SIRT1 gain of function by overexpression of pharmacological activation decreases induction of Notch targets in response to DLL4 stimulation. We also showed that the NICD can be directly acetylated by PC AF and p300 and that SIRT1 promotes deacetylation of NICD. We have identified 14 lysines that are targeted for acetylation and their mutation abolishes the effects of SIRT1 of Notch responses. Furthermore, over-expression or activation of SIRT1 significantly reduces the levels of NICD protein. Moreover, SIRT1-mediated NICD degradation can be reversed by blockade of the proteasome suggesting a mechanism resulting from ubiquitin-mediated proteolysis. Indeed, we have shown that SIRT1 knockdown or pharmacological inhibition decreased NICD ubiquitination. We propose a novel molecular mechanism of modulation of the amplitude and duration of Notch responses in which acetylation increases NICD stability and therefore permanence at the promoters, while SIRT1, by inducing NICD degradation through its deacetylation, shortens Notch responses. In order to evaluate the physiological relevance of our findings we used different models in which the Notch functions during blood vessel formation have been extensively characterized. First, retinal angiogenesis in mice lacking SIRT1 activity shows decreased branching and reduced endothelial proliferation, similar to what happens after Notch gain of function mutations. ECs from these mice exhibit increased expression of Notch target genes. Second, these results were reproducible during intersomitic vessel growth in sirt1-deficient zebrafish. In both models, the defects could be partially rescued by inhibition of Notch activation. Third, we used an in vitro model of vessel sprouting from differentiating embryonic bodies in response to VEGF in a collagen matrix. Our results showed that Sirt1-deficient cells shows impaired sprouting which correlated with increased NICD levels. In addition, when in competition with wild-type cells in this assay, Sirt1-deficient cells are more prone to occupy the stalk cell position. Taken together, our study identifies reversible acetylation of NICD as a novel molecular mechanism to adapt the dynamics of Notch signaling and suggest that SIRT1 acts as a rheostat to fine-tune endothelial Notch responses. The NAD+-dependent feature of SIRT1 activity possibly links endothelial Notch responses to environmental cues and metabolic changes during nutrient deprivation in ischemic environments or upon other cellular stresses.
Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Herstellung und Charakterisierung einer neuen Stat5 Reportermaus zur Analyse der transkriptionellen Aktivität von STAT5 in verschiedenen Entwicklungsstadien, Zelltypen und Organen auf Einzelzellebene in vivo. Die Zusammenfassung dieser Promotionsarbeit gibt im Folgenden einen Überblick über den JAK/STAT Signalweg und seine einzelnen Komponenten. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf STAT5, da es eine wichtige Rolle in der zellulären Entwicklung, Differenzierung und Proliferation spielt. Anschließend werden die Klonierung des Stat5 Reportergenkonstruktes und die Herstellung der Reportermaus durch DNA-Mikroinjektion besprochen und die Ergebnisse sowie Schlussfolgerungen der funktionellen in vivo Analyse dieses neuen Reportermausmodells dargestellt. Signal transducer and activator of transcription (STAT) Proteine gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die latent im Zytoplasma vorkommen. Diese Proteinfamilie besteht aus sieben Mitgliedern: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6. Alle STAT Proteine weisen eine konservierte Struktur auf, bestehend aus einer N-terminalen Domäne (NTD), einer Coiled-Coil-Domäne (CCD), einer DNA-Bindedomäne (DBD), einer Linkerdomäne (LD), einer src-homology 2- Domäne (SH2) und einer Transaktivierungsdomäne (TAD). Eine Vielzahl löslicher, extrazellulärer Signalmoleküle wie zum Beispiel Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren binden an ihre spezifischen Oberflächenrezeptoren und Aktivieren so die JAK/STAT Signalkaskade. Dabei führt die Ligandenbindung an den entsprechenden Rezeptor zunächst zur Dimerisierung des Rezeptors und anschließend zur Transphosphorylierung von Janus Kinasen (JAKs). Aktivierte JAKs phosphorylieren dann den Rezeptor an spezifischen Tyrosinresten. An diese können STAT Proteine über ihre SH2 Domäne binden. Die gebundenen STAT Proteine werden anschließend durch JAKs an einem Tyrosinrest (und Serinrest) in der TAD phosphoryliert und dimerisieren im Zytoplasma. Dimerisierte STAT Proteine translozieren anschließend in den Nukleus und binden an spezifische DNA-Sequenzen, die sogenannten GAS (gamma-IFN-aktivierende Seite) Elemente in der Promotorregion ihrer Zielgene. GAS Elemente sind kurze palindromische DNA Regionen mit einer TTTCCNGGAAA Konsensussequenz. Nach Bindung der aktivierten, phosphorylierten STAT Proteine an die GAS Elemente werden weitere Kofaktoren, wie zum Beispiel das CREB Bindeprotein p300/CBP rekrutiert, die gemeinsam als Transkriptionsfaktoren wirken und die Transkription ihrer Zielgene anschalten. Die Identifizierung von STAT5 erfolgte im Rahmen von Promotorstudien am β-Casein Milchgen in der murinen Brustepithelzelllinie HC11 (Schmitt-Ney et al., 1991). Kurz darauf wurde STAT5 auch im Brustgewebe von laktierenden Mäusen, Ratten und Kühen gefunden. Bevor eine Sequenzhomologie zu Proteinen der STAT Genfamilie festgestellt wurde, wurde STAT5 zunächst MGF – „mammary gland factor“ genannt (Schmitt-Ney et al., 1992b; Wakao et al., 1992). Es sind zwei Stat5 Gene bekannt, Stat5a und Stat5b, die eine Sequenzhomologie von 96 % aufweisen und ihren größten Unterschied in der TAD Domäne zeigen. Da keine STAT-ähnlichen Proteine in Hefezellen identifiziert wurden, ist der JAK/STAT Signalweg nur für multizelluläre Organismen von Bedeutung, vermutlich weil diese auf komplexe Zell-Zell Kommunikationen angewiesen sind, um im Zellverband auf Signale in der Umgebung reagieren zu können. STAT5 im Speziellen reguliert neben der Entwicklung des Brustgewebes während der Schwangerschaft, die Produktion von Blutzellen in der fötalen Leber sowie die Zellproliferation während der adulten Hämatopoese. Im Embryo ist die fötale Leber der Ort der Hämatopoese, bevor hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark kolonialisieren und sich die Leber zu einem metabolischen Organ entwickelt. In der Maus gelangen ab dem Embryonaltag E12 hämatopoetische Stammzellen aus der Aorta, den Gonaden und dem Mesonephros (Urniere), der sogenannten AGM Region, sowie aus der Plazenta durch den Blutstrom in die fötale Leber. Die Zellen proliferieren hier und migrieren etwa zwei Tage vor der Geburt (E18) ins Knochenmark, wo die Hämatopoese nach der Geburt erfolgt. Durch die Übermittlung einer Vielzahl von Zytokinsignalen reguliert STAT5 die Differenzierung der pluripotenten Zellen in reife Blutzellen und sorgt zusätzlich für die Generierung von Zellen, die anschließend in der Lage sind, das Knochenmark zu repopulieren. Ein STAT5 Verlust führt aufgrund einer auftretenden Anämie zu einer pränatalen Letalität. Während der adulten Hämatopoese fördert STAT5 hingegen die Zellproliferation und den Zellzyklus sowie die Apoptose in hämatopoetischen Stammzellen. Im Brustgewebe ist STAT5 sowohl in der Mammogenese als auch in der Laktogenese involviert. Die Aktivierung von STAT5 erfolgt hierbei durch eine Vielzahl von Faktoren, wie zum Beispiel Prolaktin und Erythropoietin. Der Phosphorylierungsstatus von STAT5 im virgin Stadium ist hierbei gering, steigt aber während der Schwangerschaft und Laktation stetig an und führt zur Aktivierung von einer Reihe von Zielgenen wie Milchproteinen, aber auch Zellzyklusregulatoren wie CyclinD1 und negativen Regulatoren des JAK/STAT Signalweges, wie zum Beispiel SOCS3. Nach der Laktation nimmt die Phosphorylierung von STAT5 hingegen ab und aufgrund von Apoptose kommt es zu einer Rückbildung des alveolaren Gewebes. Die Regulation der Apoptose erfolgt durch eine erhöhte STAT3 Phosphorylierung. Eine Deregulierung des JAK/STAT Signalweges wird in einer Vielzahl von Tumoren beobachtet. Hier liegt STAT5 typischerweise konstitutiv aktiv vor, führt dadurch zu einer verstärkten Zellproliferation und Angiogenese und verhindert gleichzeitig die Apoptose der mutierten Zellen und eine Immunantwort, was zusammen die Tumorentstehung begünstigt. Konstitutiv aktives STAT5 spielt vor allem bei der Entstehung von soliden Tumoren wie Brustkrebs sowie verschiedenen Leukämieformen wie zum Beispiel akute und chronische myelogene Leukämien eine wichtige Rolle. Neben diesen bereits bekannten STAT5 Funktionen ist die Funktion von aktivem, phosphoryliertem STAT5 im Kontext der Mausentwicklung und in adultem Gewebe noch unklar. Um die Rolle von STAT5 während der Entwicklung näher zu charakterisieren, wurden bereits verschiedene Mausmodelle generiert. Seit dem ersten Gentransfer in Mäuse im Jahre 1980 bieten transgene Tiere eine Möglichkeit, detaillierte Einblicke in zelluläre Prozesse im Rahmen der Entwicklung, des Stoffwechsels und der Entstehung von (Krebs-) Erkrankungen zu erlangen. Transgene Mäuse wurden somit zu einem wichtigen Modellsystem, das in der Lage ist, die Mechanismen, die hinter diesen Prozessen stehen, näher zu beleuchten. STAT5a und STAT5b knock out Mäuse sind überlebensfähig, zeigen jedoch phänotypische Unterschiede. Da eine Signalweiterleitung nach Prolaktininduktion in Brustgewebszellen von STAT5a knock out Mäusen nicht erfolgt, sind diese nicht in der Lage während der Schwangerschaft zu Proliferieren und zu Differenzieren. Die Deletion von STAT5a und STAT5b hingegen ist pränatal letal und die Embryos zeigen schwere Anämien aufgrund einer erhöhten Apoptoserate der erythroiden Zellen in der fötalen Leber. Zusätzlich zu den knock-out und gain-of-function Mäusen wurde die Generierung von Reportermäusen immer wichtiger, um spezifische Signalwege im Kontext des gesamten Organismus zu untersuchen. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war somit die Herstellung und funktionelle Analyse einer neuen Stat5 Reportermaus. Hierfür wurde zunächst ein neues Stat5 Reporterkonstrukt kloniert. Dieses Reporterkonstrukt sollte eine Vielzahl spezifischer Eigenschaften aufweisen, um speziell durch phosphoryliertes STAT5 aktiviert zu werden: (i) ein LacZ Reportergen, (ii) Stat5 Responsive-Elemente und (iii) einen minimalen Promoter. Das LacZ Reportergen wurde hierbei gewählt, um die transktiptionelle Aktivität von STAT5 in Gewebeschnitten direkt durch Blaufärbung der Zellen zeigen zu können. Bei dem gewählten Promoter handelt es sich um einen Minimalpromoter, für die Bindung genereller Transkriptionsfaktoren. Eine Aktivierung des LacZ Reportergens erfolgt jedoch nur nach vorheriger Bindung eines Transaktivators. Damit STAT5 diese Funktion übernimmt wurden zusätzliche Responsive-Elemente aus dem β-Casein Gen in das Konstrukt eingefügt. Nach erfolgreicher Klonierung von insgesamt sieben verschiedenen Stat5 Reporterkonstrukten, wurde ihre spezifische Induzierbarkeit nach STAT5 Phosphorylierung mittels transienter Transfektionsstudien in vitro analysiert und bestätigt. Das p(Stat5RE)4-CMVmin-LacZ Konstrukt wurde anschließend zwischen humane matrix attachment regions (MAR) kloniert, die als sogenannte Insulatoren fungieren. Diese sollen in der transgenen Maus verhindern, dass entfernt bindende Faktoren die Expression der Reportergenkassette positiv (enhancer) oder negativ (silencer) beeinflussen. Zusätzlich zu den sieben hier generierten Stat5 Reporterkonstrukten, wurde das p(Stat5RE)4-CMVmin-LacZ Reportergenkonstrukt im Rahmen einer Diplomarbeit in einen lentiviralen Gentransfervektor kloniert. Dieser erlaubt die stabile Transduktion von Krebszellen und Primärzellen, so dass eine ineffiziente Transfektion dieser Zellen umgangen werden kann (Gäbel, 2009). Zur Herstellung der transgenen Stat5 Reportermaus wurde das linearisierte und aufgereinigte Stat5 Reporterkonstrukt mittels DNA-Mikroinjektion in den Pronukleus von 470 Eizellen von FVB und C57BL/6 Mäusen injiziert. Die Eizellen wurden anschließend in Ammenmäuse transplantiert. Von den 470 Eizellen kamen 57 Mäuse auf die Welt. Die Integration des Transgens wurde anschließend mittels PCR und Southern Blot analysiert und die Integration des kompletten Transgens konnte in zwei der 57 Mäuse festgestellt werden. Bei beiden transgen-positiven Mäusen handelte es sich um C57BL/6 Mäuse, die anschließend mit Wildtyp C57BL/6 Mäusen verpaart wurden. Nachkommen der F2 Generation wurden dann auf die spezifische Induzierbarkeit des Stat5 Reportergenkonstruktes durch phosphoryliertes STAT5 in vivo untersucht. Da der Phosphorylierungsstatus von STAT5 im Brustgewebe bereits eingehend untersucht wurde und bekannt ist, erfolgte zunächst die Analyse der Reportergenaktivität im murinen Brustgewebe. Hierfür wurde das Brustgewebe isoliert, fixiert und über Nacht gefärbt. Anschließend wurden Paraffinschnitte hergestellt und im Detail analysiert. Im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen konnte die Aktivierung des Reportergens im Brustgewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien, vor allem während der späten Schwangerschaft und der Laktation, durch Blaufärbung einzelner Zellen, gezeigt werden. Eine Korrelation der Blaufärbung mit der Phosphorylierung von STAT5 in diesen Zellen wurde anhand von immunhistologischen Färbungen von Paraffinschnitten mit Antikörpern gegen Stat5 und P-Stat5 gezeigt. Zusätzlich zu der hormonell induzierten STAT5 Phosphorylierung bedingt durch eine Schwangerschaft, wurde die Aktivierung des Reportergens durch das Verabreichen von LPS gezeigt. Eine Behandlung der Stat5 Reportermäuse mit LPS führt zu einer Phosphorylierung von STAT5 in Zellen des hämatopoetischen Systems, speziell Granulozyten und Makrophagen, und sollte anschließend das LacZ Reportergen in diesen Zellen aktivieren. Dies konnte durch die Färbung von Blut- und Knochenmarkzellen mit spezifischen Oberflächenmarkern, sowie einer Färbung mit FDG (Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside) mittels FACS Analysen bestätigt werden. Das nicht-fluoreszierende FDG wird hierbei von der exprimierten β-Galaktosidase zunächst zu Fluoreszein-monogalactosid (FMG) und anschließend zum hoch fluoreszierenden Fluoreszein hydrolysiert, was eine messbare Erhöhung der Fluoreszenz nach sich zieht. Zusammenfassend konnte das Stat5-Reportergen sowohl durch endogene Signale als auch durch extern zugeführte Signale induziert werden. Anschließend erfolgte die Analyse der Reportergenaktivierung in anderen Organen der Stat5 Reportermaus. Hierbei konnte die Aktivierung des LacZ Reportergens sowohl in der Leber (Hepatozyten), Milz (Pulpa) und Niere (Mark und Rinde) als auch im Thymus (Lymphozyten und antigen präsentierende Zellen) und im Uterus (endometrisches Epithel) bestätigt werden. Diese Ergebnisse korrelieren mit zuvor durchgeführten Western Blot Analysen, die eine Phosphorylierung von STAT5 in eben diesen Organen gezeigt haben. Zusätzlich wurde phosphoryliertes STAT5 auf Proteinebene im Herz und im Gehirn gefunden, jedoch nicht in Gewebsschnitten der β-Galactosidase gefärbten Organe. Dies deutet darauf hin, dass das Reportergen trotz der Anwesenheit von phosphoryliertem STAT5, nicht immer eingeschaltet wird und somit weitere Faktoren für die transkriptionelle Aktivität von STAT5 notwendig sind. Western Blot Analysen sind somit alleine nicht ausreichend, um eine Aussage über die transkriptionelle Aktivität von phosphoryliertem STAT5 zu treffen, so dass die im Rahmen dieser Arbeit generierte Stat5 Reportermaus einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von aktivem STAT5 bietet. Das generierte Stat5 Reportermausmodel wurde dann im Rahmen dieser Arbeit genutzt, um die Beteiligung von aktivem STAT5 in der Entwicklung von ΔTrkA induzierter akuter myeloischer Leukämie näher zu untersuchen. Hierfür wurden lineage negative Knochenmarkszellen aus den Stat5 Reportermäusen isoliert. Dabei werden sogenannte „Lin“ Antigene (z.B. CD3, CD4, CD8, Gr-1, Ter-119) genutzt, um reife murine Blutzellen zu identifizieren. Zellen, die diese Oberflächenmarker nicht oder nur in sehr geringen Mengen exprimieren, werden als lineage negativ bezeichnet. Ein Mix monoklonaler Antikörper gegen lineage Antigene kann somit zur Isolation lineage negativer Knochenmarkszellen genutzt werden. Diese negative Selektion führt letztendlich zur Anreicherung hämatopoetischer Stammzellen oder früher Progenitorzellen, die diese Marker (noch) nicht exprimieren. Diese Progenitorzellen wurden dann retroviral mit einem ΔTrkA Konstrukt transduziert und anschließend in bestrahlte Rag-1-/- Mäuse transplantiert und repopulierten in diesen das Knochenmark. Durch die ΔTrkA Transduktion wurde in den Rag-1-/- Mäusen myeloische Leukämie induziert. Jedoch konnte im Rahmen dieser Arbeit keine Aktivierung des Stat5 Reportergenkonstruktes beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass STAT5 in ΔTrkA induzierten Leukämien keine Rolle spielt und bestätigt die Annahmen von Meyer et al. Durch die hier vorgestellten Ergebnisse bestätigt sich sowohl die Generierung eines neuen Stat5 Reportermausmodels als auch ihre spezifische Induzierbarkeit sowohl durch endogene hormonelle Prozesse (Schwangerschaft) als auch durch externe Manipulation (LPS Behandlung). Diese neue Stat5 Reportermaus wird in Zukunft als wichtiges und effizientes Modell fungieren, um die Rolle von transkriptionel aktivem STAT5 näher zu beleuchten. Hierbei wird sich der Fokus nicht nur auf die Rolle einzelner Zellen bei der normalen Entwicklung von Organen während verschiedener Entwicklungsstadien beschränken, sondern sich mehr und mehr in Richtung Tumorinitiierung und Tumorentwicklung bewegen. Anhand des hier generierten Stat5 Reportermausmodels können in Zukunft weitere Brustkrebs- und Leukämie-Tumormodelle herangezogen werden, um die Rolle und Funktion von STAT5 in der Tumorentwicklung in vivo detailliert analysieren zu können. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wird dann die Möglichkeit bestehen, dieses neue Stat5 Reportermausmodell als Plattform zu nutzen, um zahlreiche neue Krebsmedikamente zu entwickeln und zu evaluieren.