610 Medizin und Gesundheit
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In der vorliegenden Arbeit wurden die pharmakologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften des Kaliumkanals KCNQ1 und des KCNQ1/MinK (IKs) untersucht. Hierzu wurden die Kanäle in Xenopus-laevis-Oozyten und der KCNQ1/MinK (IKs) in CHO-Zellen exprimiert und in Voltage-Clamp-Experimenten untersucht. Die Blockwirkung des Chromanol-293B-Razemates und die der beiden Enantiomere wurden am KCNQ1- und KCNQ1/MinK-Kanal untersucht. Eine Enantiomerenselektivität der Chromanol 293B-Enantiomere wurde nachgewiesen. Beide Enantiomere wirken abhängig vom Zustand der KCNQ1- und IKs-Kanäle. Das 3S,4R-293B blockierte nur geschlossene Kanäle, während das andere Enantiomer 3R,4S-293B auf geschlossene und auf geöffnete Kanäle wirkte. Als Grundlage dieser Aussagen wurden kinetische Analysen der Kanalkinetiken ohne Blocker und bei partieller Blockade der Kanäle durchgeführt. Die Inhibiton des IKs
Das hemmende Umfeld von Ganglienzellen in der Netzhaut des Auges Der Bereich auf der Netzhaut, aus dem Ganglienzellen Lichtsignale erhalten, wird rezeptives Feld genannt. Er umfaßt einen erregenden, zentralen Teil, das rezeptive Feldzentrum, und einen hemmenden, peripheren Teil, das Umfeld. Die antagonistische Organisation (erregendes Zentrum/hemmendes Umfeld) des rezeptiven Feldes verbessert die Signalverarbeitung, indem Kontraste verstärkt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen der Umfeldhemmung an der isolierten, intakten Kaninchennetzhaut zu untersuchen. Das rezeptive Feldzentrum wird durch den erregenden Kontakt zwischen Photorezeptor Þ Bipolarzelle Þ Ganglienzelle erzeugt. Visuelle Stimulation des rezeptiven Feldzentrums erhöht die Entladungsrate (Anzahl der Aktionspotentiale pro Zeiteinheit) der Ganglienzelle. Die Erhöhung der Entladungsrate wird durch die Freisetzung des erregenden Transmitters Glutamat aus präsynaptischen Bipolarzellen bewirkt. Eine Belichtung des Umfeldes hat den entgegengesetzten Effekt: die Entladungsrate der Ganglienzelle wird verringert. Die Umfeldantwort der Ganglienzelle wird durch die laterale Hemmung in der OPL (äußere Synpsenschicht) und der IPL (innere Synapsenschicht) erzeugt. In der OPL wird die Signalübertragung von GABAergen Horizontalzellen moduliert, indem sie Photorezeptoren und/oder Bipolarzellen hemmen. In der IPL modulieren Amakrinzellen, die entweder GABAerg oder glyzinerg sein können, die Signalübertragung, indem sie Bipolarzellen und/oder Ganglienzellen hemmen. Die Entladungsrate von retinalen Ganglienzellen wird bei Belichtung des Umfeldes somit auf zwei Arten verringert: entweder werden präsynaptische Zellen (Photorezeptoren, Bipolarzellen) gehemmt oder die Ganglienzelle wird direkt durch Amakrinzellen gehemmt. Im ersten Fall schütten Bipolarzellen weniger Glutamat aus (indirekte laterale Hemmung), im zweiten Fall wird durch hemmende Neurotransmitter (GABA oder Glyzin) ein Einstrom von Chloridionen in die Dendriten der Ganglienzellen hervorgerufen (direkte laterale Hemmung). Es ist bisher noch unklar, zu welchem Anteil direkte und indirekte laterale Hemmung an der Umfeldantwort beteiligt sind. Weiterhin ist nicht bekannt, welche Neurotransmitterrezeptoren bei der Erzeugung des hemmenden Umfeldes eine Rolle spielen. Um dies zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit lichtinduzierte, synaptische Ströme von retinalen Ganglienzellen an der isolierten, intakten Kaninchenetzhaut gemessen. Dabei wurde die Netzhaut von vorher eingeschläferten Kaninchen freipräpariert und anschließend in einer mit Sauerstoff angereicherten Extrazellulärlösung aufbewahrt. An diesem isolierten, intakten NetzhautPräparat (in vitro Retina) konnten bis zu acht Stunden Lichtantworten gemessen werden. Die lichtinduzierten Ströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der PatchClampTechnik in der Spannungsklemme gemessen. Die Meßkammer mit der flach ausgebreiteten Netzhaut befand sich auf einem Mikroskoptisch. Das Mikroskop war mit einer InfrarotDifferentialinterferenzOptik (NomarskiOptik) ausgestattet und die Mikroelektroden konnten unter Sichtkontrolle mit Hilfe eines Mikromanipulators an die Zellkörper herangefahren werden. Kreisförmige und ringförmige Lichtmuster mit verschiedenen Durchmessern, wurden auf einem Computerbildschirm erzeugt und durch den Mikrsokopkondenser auf den Boden der Meßkammer projiziert. Erregende Ströme retinaler Ganglienzellen konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für Chloridionen eingestellt wurde. Die erregenden Ströme wurden durch Belichtung des Umfeldes stark verringert. Dies wird durch die verminderte Freisetzung von Glutamat durch Bipolarzellen verursacht und ist ein Hinweise auf eine indirekte, laterale Hemmung der Ganglienzelle. Durch die Zugabe des GABARezeptorblockers Picrotoxinin in die Nährlösung (Badapplikation) konnte die Umfeldhemmung der meisten Ganglienzellen nahezu vollständig aufgehoben werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß präsynaptische GABA A und GABA C Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Umfeldhemmung spielen. Direkte hemmende Chloridionenströme konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für erregende Ströme eingestellt wurde. Durch Beleuchtung des Umfeldes wurden Chloridionenströme in Ganglienzellen ausgelöst. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte, laterale Hemmung der Ganglienzelle durch Amakrinzellen, die zusätzlich zur indirekten Hemmung erfolgt. Bei Anwendung der Stromklemme der PatchClampTechnik konnte nachgewiesen werden, daß Chloridionenströme die Entladungsrate der Zelle beeinflussen. Durch die Badapplikation von Picrotoxinin und durch die Überströmung mit dem GABA A Rezeptorhemmer Bicucullin wurden die Chloridionenströme deutlich verringert. Durch den Glyzinrezeptorblocker Strychnin konnten die hemmenden Ströme nur bei wenigen Zellen verringert werden. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte Hemmung der Ganglienzelle über GABA A Rezeptoren. In den meisten Ganglienzellen konnten direkte und indirekte Hemmung durch die Badapplikation von Tetrodotoxin verringert werden. Tetrodotoxin hemmt das Entstehen von Aktionspotentialen und das Ergebnis zeigt, daß 'widefield Amakrinzellen, die über Aktionspotentiale kommunizieren zur Umfeldhemmung beitragen. Bisherige Modelle gingen davon aus, daß Interaktionen zwischen Horizontalzellen, Photorezeptoren und Bipolarzellen in der OPL die Hauptursache für die Umfeldhemmung sind. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, daß Interaktionen zwischen Amakrinzellen, Bipolarzellen und Ganglienzellen wesentlich zur Umfeldhemmung beitragen. In der Netzhaut gibt es zwischen 12 und 15 Ganglienzelltypen, die auf unterschiedliche Mustermerkmale wie z. B. Farbe, Kontrast oder Bewegung reagieren. Alle bisher untersuchten Ganglienzelltypen verringern bei einer Reizung des Umfeldes ihre Entladungsrate. Ist bei allen Ganglienzelltypen der Beitrag von Horizontal und Amakrinzellen zur Umfeldhemmung sowie der Anteil von direkter und indirekter lateralen Hemmung gleich? Oder gibt es für jeden Ganglienzelltyp aufgrund seiner physiologischen und morphologischen Ausprägung verschiedene Mechanismen der lateralen Hemmung? Diese Fragen könnten durch die Entwicklung von Pharmaka, welche selektiv Horizontalzellen bzw. Amakrinzellen hemmen, untersucht werden. Die Anwendung dieser Substanzen könnte den Beitrag dieser Zellen zur Umfeldhemmung eines bestimmten Ganglienzelltyps nachweisen. Gleichzeitig könnte die indirekte Hemmung von retinalen Ganglienzellen durch intrazelluläre Applikation von Chloridionenkanalblockern viel genauer als bisher gemessen werden, da auf diese Weise erregende synaptische Ströme besser isoliert werden können. Durch die Kombination dieser beiden Methoden könnte für jeden Ganglienzelltyp der Netzhaut die zellulären und synaptischen Mechanismen der Umfeldhemmung detailliert beschrieben werden.
In den vergangenen Jahren wurden in der AntisenseTechnologie grundlegende Hürden genommen, die eine Arzneimittelentwicklung auf Nukleinsäurebasis ermöglichen. Hierzu zählt vor allem die Gewährleistung einer ausreichenden metabolischen Stabilität und die Synthese im technischen Maßstab. In zahlreichen klinischen Studien wurde der Wirksamkeitsnachweis am Menschen erbracht. Als sequenzspezifische Therapeutika zeichnen sich Antisense Oligonukleotide im Vergleich zu vielen anderen Wirkstoffen dadurch aus, daß sie spezifisch mit einer RNAZielsequenz hybridisieren, ohne dabei wichtige zelluläre Funktionen zu beeinträchtigen. Neben krankheitsauslösenden Genen können Antisense Oligonukleotide auch virale Gene blockieren und nach Aktivierung der Ribonuklease H hydrolysieren. Das erste Präparat auf Oligonukleotidbasis wurde 1998 zugelassen und hemmt erfolgreich die Vermehrung des Cytomegalievirus. Hepatitis C ist eine Virusinfektion, die momentan nur unzureichend therapiert werden kann. Seit Mitte der neunziger Jahre wird nach geeigneten Antisense Oligonukleotiden und Ribozymen gesucht, um die Heilungschancen bei einer chronischen HCVInfektion zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch experimentelles Screening eine potente Zielsequenz (tS13) im Bereich der internen ribosomalen Angriffsstelle (IRES) und des Startcodons für die Proteinbiosynthese des HCV gefunden (Nukleotide 326342 des HCV Genoms). Hierzu wurde die Sequenz eines bereits bekannten 23mer Antisense Oligonukleotids durch systematisches Verkürzen auf 17 Nukleotide reduziert, ohne in vitro an Inhibitionspotential einzubüßen. Erst weitere Verkürzungen führten zu einer deutlichen Abnahme der Antisense Wirkung. Eine Schwierigkeit bei der therapeutischen Anwendung von polyanionischen Antisense Oligonukleotiden ist deren begrenzte zelluläre Aufnahme. Wie in Kapitel 3 dargelegt, wurden bislang zahlreiche Methoden zur Verbesserung der Membrangängigkeit dieser Wirkstoffklasse entwickelt. Zur Evaluierung eines leberselektiven Transports (engl.: drug targeting) und zur Steigerung der hepatozellulären Aufnahme (engl.: cell uptake) wurde das antiviral wirkende 17mer Antisense Oligonukleotid tS13 mit Biomolekülen wie den Gallensäuren, die im enterohepatischen Kreislauf das Zielorgan Leber passieren, kovalent verknüpft. Die Kupplung erfolgte dabei über die für die zelluläre Aufnahme nicht essentielle 3aHydroxylgruppe der Cholsäure und Taurocholsäure. Die Gallensäuren wurden entsprechend geschützt, in die Phosphoramidite 22a/b und 27a/b überführt und im letzten Kupplungsschritt der Festphasensynthese an das 5
1. Die Arbeit soll den Beitrag von Ionenleitfähigkeiten an der Funktionsweise der Vogelhaarzelle weiter aufklären. 2. Dazu werden zwei Ionenkanalmodulatoren sowohl in die Scala media, wie auch in Scala tympani appliziert. Amilorid ist ein Blocker v.a. von Natriumabhängigen Ionleitfähigkeiten; Diazoxid ist ein Öffner ATPabhängiger Kaliumleitfähigkeiten. 3. Amilorid hat bei Applikation in die Scala media keinen Effekt auf das endocochleäre Potential. Diazoxid senkt das endocochleäre Potential nach Applikation in die Scala media signifikant um 2,42mV ± 2,31. Da Diazoxid auf die Aktivität auditorischer Neurone keinerlei Einfluß hat, muß davon ausgegangen werden, daß Diazoxid das EP durch Beeinflussung anderer Ionkanäle unabhängig von der Haarzelle absenkt. Mögliche Kandidaten sind Ionkanäle im Bereich des Tegmentum vasculosum, das für die Generation des EP mit verantwortlich ist. 4. Eine endolymphatische AmiloridApplikation erhöht frequenzabhängig und dosisabhängig die CAPSchwelle, wobei die Schwellenanhebung mit Anstieg der Frequenz steigt (gemessener Bereich 1252000Hz). Bis zu einer Frequenz von 400Hz hat Amilorid kaum einen Effekt auf das CAP, oberhalb 400Hz steigt die Schwelle mit einem Gradienten von 11 dB/Okt an. 5. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf das CAP. 6. Die endolymphatische Applikation von Amilorid erniedrigt die akustisch evozierte Entladungsrate und erhöht die spontane Entladungsrate afferenter Neurone aus dem Ganglion cochleare. Diese Veränderungen sind abhängig von der charakteristischen Frequenz und der applizierten Menge, wobei der Frequenzbereich der charakteristischen Frequenz der nicht reagierenden Einzelfaserableitungen. zwischen 126632 Hz lag, der der reagierenden zwischen 704 und 1200 Hz. 7. Bei den afferenten Neuronen, bei der die akustisch evozierte Aktivität nach endolymphatischer Applikation von Amilorid ansteigt, kommt es auch zu einer Veränderung der von der evozierten Aktivität abhängigen Parameter Q10dB, Tief und Hochfrequenzflanke und charakteristischer Frequenz. Die endolymphatische AmiloridKonzentration bei diesen Einzelfaserableitungen lag zwischen 91µM und 269 µM. 8. Die charakteristische Frequenz wird durch Amilorid erniedrigt, allerdings kommt dies durch eine stärkere Abnahme der evozierten Rate oberhalb der charakteristischen Frequenz zustande. 9. Die Gruppeneinteilung ist bis auf ein Neuron bei Veränderungen spontaner und akustisch evozierter Entladungsrate gleich. Bei einem kam es zu einem Anstieg der spontanen Entladungsrate, aber nicht zu einer Abnahme der akustisch evozierten Entladungsrate. Dies legt nahe, daß 1. die Veränderungen auf Beeinflussung unterschiedlicher Ionleitfähigkeiten beruht , und 2. die Ionleitfähigkeit, welche für die Veränderung der spontanen Entladungsrate verantwortlich ist, etwas sensibler für Amilorid ist, als jene, welche für die Veränderung der evozierten Entladungsrate verantwortlich ist. 10. Der Anstieg der evozierten Rate steht in guten Einklang mit den Ergebnissen von Jørgensen und Ohmori (1988), die zeigen konnten, daß Amilorid den mechanoelektrischen Transduktionskanal von Vogelhaarzellen mit einem IC 50 von 50µM blockiert. Der Anstieg der spontanen Entladungsrate kann mit einem Block des Transduktionskanals nicht erklärt werden. Es muß also noch eine andere Leitfähigkeit in dem Innenohr der Taube durch Amilorid blockiert werden. 11. Zusammen mit den Ergebnissen anderer Studien legen die Ergebnisse nahe, daß es sich hierbei um eine Ionleitfähigkeit im Bereich der apikalen Membran handeln muß. Mögliche Kandidaten wären Ca 2 Kanäle, welche an Ca 2 abhängigen Prozessen zur Regulierung der Ciliensteifigkeit bzw. Cilienmotilität beteiligt sind. 12. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf die Aktivität auditorischer Neurone. 13. Bei Applikation in die Scala tympani hat weder Amilorid noch Diazoxid Einfluß auf das CAP.
28 Kinder mit Pierre-Robin-Sequenz, die erstmals im Humangenetischen Institut der Universitätsklink in Frankfurt am Main im Alter von drei Monaten bis acht Jahre untersucht wurden, wurden im Alter von acht bis 16 Jahren nachuntersucht. Die Kinder wurden unterteilt in eine Gruppe mit isolierter und eine Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Sie wurden hinsichtlich ihrer physischen, psychomotorischen, audiologischen und sprachlichen Entwicklung untersucht. Die Gruppen unterschieden sich bezüglich des körperlichen Wachstums, der Häufigkeit von mentaler und sprachlicher Retardierung. Die Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz waren durchschnittlich kleiner und leichter bei Geburt und im Verlauf. 19 % der Kinder mit syndromatischer Form waren kleinwüchsig. Eine mentale Retardierung fand sich nur in der Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz, in der 31 % betroffen waren. 8,3 % der Kinder mit isolierter Pierre-Robin-Sequenz waren in ihrer sprachlichen Entwicklung retardiert, während dies bei 38 % der Kinder mit syndromatischer Form der Fall war. Schwere Artikulationsstörungen, die zu einer sehr undeutlichen Aussprache führten, fanden sich bei 17 % der Kinder mit isolierter und bei 29 % der Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Zwei Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz hatten überhaupt keine Expressivsprache entwickelt. Es konnte ein Zusammenhang dieser Unterschiede in der Entwicklung mit der Schwere der respiratorischen und ernährungsbezogenen Probleme in den ersten beiden Lebensjahren gesehen werden. Respiratorische Probleme traten etwas häufiger in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-Robin-Sequenz auf. Gemessen an der Häufigkeit und Dauer der Nahrungssondierung waren die Ernährungsprobleme ebenfalls deutlich ausgeprägter in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-RobinSequenz. Eine Schallleitungsschwerhörigkeit fand sich insgesamt bei 39 % der 28 Probanden ohne wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Eine Schallempfindungsschwerhörigkeit trat nur in der Gruppe der Patienten mit syndromatischer PierreRobinSequenz auf. Diese Ergebnisse waren vereinbar mit den Resultaten früherer Untersuchungen, die darauf hin deuteten, dass Kinder mit isolierter PierreRobinSequenz bei optimaler Therapie im Neugeborenen und Säuglingsalter eine gute Prognose bezüglich ihrer physischen und mentalen Entwicklung haben, während bei Vorliegen eines übergeordneten Syndroms häufiger mit Wachstumsdefiziten und mentaler Retardierung zu rechnen ist. Bezüglich der genetischen Beratung läßt sich feststellen, dass das Wiederholungsrisiko bei isolierter Pierre-Robin-Sequenz klein ist.
Im Rahmen einer klinische Studie wurden bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf/Halsbereich LymphozytenSubpopulationen phänotypisch und funktionell charakteri- siert sowie deren Aktivierungszustand anhand der Bestimmung des Interleukin2Titers und der Konzentration von löslichem Interleukin2Rezeptor a (sIL2Ra) im Plasma gemessen. Hierbei interessierte der Einfluß des Tumors bzw. der Therapieformen wie Operation, Che mo, Bestrahlungstherapie und kombinierte RadioChemotherapie auf diese immunologischen Parameter. Die Zusammensetzung der Populationen peripherer Blutlymphozyten wird durch die Größe und Malignität des Primärtumors sowie durch Lymphknotenmetastasen beeinflußt. In der An fangsphase, bei einer Tumormalignität G1, ist eine starke Reduzierung der LAKZellaktivität zu sehen, was mit suppressiven Faktoren, wie zum Beipiel ProstaglandinE2, abgesondert von Monozyten, in Verbindung gebracht werden könnte. Der Anteil CD3positiver Zellen ist im G3Stadium sehr stark erniedrigt und deutet auf eine Herunterregulierung der zu dem CD3 Komplex gehörenden eKette hin. Weiterhin war bei den HNOTumorpatienten der Anteil der CD4Lymphozyten auffällig erniedrigt, während die Zahl der doppeltpositiven CD4 CD8 Zellen sowie die HLADRWerte erhöht war. Einen Monat nach einem operativen Eingriff ließ sich eine starke Zunahme der CD25 Expression, besonders auf TLymphozyten erkennen. Die Chemotherapie mit Cisplatin, Fo linsäure, 5FU, Fortecortin eine sogenannte Polychemotherapie bewirkte eine starke Erhö hung der NKZellpopulation und eine höhere Expression des CD25Markers auf NKZellen sowie eine Zunahme der LAKZellfunktion. Die Veränderung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf den Einsatz von Cisplatin und 5FU zurückzuführen. Die Bestrahlungsthe rapie bewirkte eine signifikante Abnahme der TLymphozyten, besonders der CD4T Helferzellen, bei gleichzeitiger Zunahme der CD4 CD8 positiven Zellen. BZellen sind gStrahlen sensitiv, so daß unter Bestrahlung ihr Anteil vermindert wird. Die Erhöhung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf eine Radioresistenz dieser Lymphozytensubpopula tion zurückzuführen. Die RadioChemotherapie beinhaltet drei Zyklen mit einem Zytostatika gemisch: Cisplatin, 5FU, Folinsäure, Dexametason, Rescuvolin und Fortecortin und an schließender Behandlung mit gStrahlen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen deutlich, daß es unter dieser RadioChemotherapie zu einem signifikanten Abfall der CD3 und CD2positiven Zellen, besonders der zytotoxi schen TZellpopulation, sowie zu einer Erhöhung der CD25exprimierenden Zellen kommt. Die Beziehungen der Zellen untereinander sind unter Operation, Betrahlung und Radio Chemotherapie nicht verändert, die Chemotherapie verursacht jedoch vermutlich ein Un gleichgewicht zwischen THelferzellen und Makrophagen bezüglich der Vermehrung von NKZellen. Bei Patienten ohne Therapie kam es zu einer Abnahme der CD3positiven Zellen. Dies unterstützt die Hypothese der Herunterregulierung der eKette des CD3Komplexes unter Tumoreinwirkung. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die alleinige Bestimmung des Interleukin2 Proteins keine Auskunft über die Wirkung des Tumors auf die Sezernierung dieses Peptids bei einer Tumorlokalisation im Gaumen und Zungenbereich gibt. Erst im Verlauf der Erkrankung können Änderungen durch virale Infektionen und der Einfluß verschiedener Therapiemodali täten beobachtet werden. Die Konzentration von sIL2Ra verhielt sich proportional zur Tumorgröße. Dies unterstützt die Hypothese, daß dieser Rezeptor eher vom Tumor abstammt und nicht von den infiltrierten Lymphozyten. Die Konzentration von sIL2Ra im Plasma war abhängig von der Therapieart. Sie erreichte wesentlich höhere Werte bei Tumorpatienten im Vergleich zu den Probanden. Der niedrigste Spiegel bei Patienten fand sich bei Bestrahlungstherapie (Median = 840 U/ml), die höchsten Werte bei Patienten mit Chemotherapie (Median = 1400 U/ml). Infiltrierende CD3 Lymphozyten im Primärtumor, identifiziert mit einen Antikörper gegen die eKetten, sind im Vergleich zu metastasierten Lymphknoten signifikant erniedrigt. Unter suchungen der peripheren Blutlymphozyten bei Patienten mit Primärtumor ergaben eine signi fikante Erhöhung der CD3Populationen bei gleichzeitiger Erniedrigung des Anteils CD45 positiver Zellen. Es bestand für CD45positive Zellen ein signifikanter Zusammenhang zwi schen peripheren Blutlymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten.
Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Vektor für die Gentherapie zu optimieren. Zunächst wurde dazu die HTLV1Integrase im Austausch gegen die HSRV Integrase in HSRV eingebracht. Dieses rekombinante Plasmid war jedoch replikationsdefizient und hatte nach der Transfektion in eukaryonte Zellen keinen Virustiter. Dies führte zu der Überlegung, auch die für die Erkennung des Virus durch die Integrase wichtigen ersten 15 Nukleotide der LTREnden von HSRV an die Sequenz von HTLV1 anzugleichen. Da auch der daraus resultierende Klon keine Infektiösität aufwies, konnte die Replikationsdefizienz eventuell weitreichendere Gründe haben als eine reine Integrationsdefizienz. Ein cisElement am CTerminus der HSRVIntegrase welches zur Stabilisierung und Verpackung der RNA in Partikel wichtige Funktionen hat, wurde daher in dem Klon mit der HTLV1Integrase regeneriert. Dazu wurde eine chimäre Integrase bestehend aus dem Nterminalen und dem Mittelteil der HTLV1Integrase mit dem Cterminalen Teil der HSRV Integrase fusioniert und in das HSRV Provirus mit und ohne die HTLV1LTREnden eingebracht. Da diese Klone ebenfalls nichtinfektiös waren, sollte Expressionsanalyse der rekombinanten Plasmide zur Klärung der Ursache ihrer Replikationsdefizienz beitragen. Als Kontrollen dienten dabei ein HSRVKlon ohne Integrase, ein HSRVKlon mit wiedereingeführter HSRVIntegrase und ein Konstrukt mit den HTLV1LTREnden aber mit der HSRVIntegrase. Die Untersuchung der chimären Klone ergab, daß virale genomische RNA zumindest kurze Zeit nach der Transfektion in den Zellen vorhanden war, aber eventuell nicht in Viruspartikel verpackt wurde, da vor der HTLV1Integrase ein weiteres ca. 114 Nt langes cisElement fehlte. Dieses fehlende cisElement war möglicherweise auch die Ursache für eine gestörte GagProzessierung der Klone in 293TZellen. Da Gag Prozessierung für den Zusammenbau intakter Viruspartikel essentiell ist, konnte hier ein Grund für die Replikationsdefizienz der chimären Klone liegen. Alle weiteren viralen Proteine wurden von den chimären Klonen exprimiert und normal prozessiert. Die virale Protease war also enzymatisch aktiv. Weiterhin wurde die korrekte Aktivität der reversen Transkriptase nachgewiesen. Durch eine Kotransfektion der chimären Plasmide mit dem HTLV1GagProtein sollte das im Preintegrationskompex vorkommende GagProtein für die øTLV1 Integrase ersetzt werden. Auch dieser Versuchsansatz erwies sich als ungeeignet, die Integration bzw. Replikation der chimären Klone zu verbessern. Durch die Einklonierung eines Resistenzgens in die viralen Klone sollten Zellen mit integrierter viraler DNA gezielt selektioniert werden. Das Resistenzgen wurde in drei der viralen Konstrukte eingebracht, in wtpHSRV13, in den Klon mit den HTLV1 LTREnden und der HTLV1Integrase sowie in das virale Plasmid mit den HTLV1 LTREnden und der chimären Integrase. Nach der Einzelzellselektion der mit wt Zeocin transfizierten BHKZellen hatte von sechs Klonen nur einer einen geringen Virustiter, dieser exprimierte als einziger virale Gene. Durch Southernblotanalyse dieser Einzelzellklone konnte die Anzahl der Integrate auf fünf bis acht pro Einzelzellklon ermittelt werden. Die Einzelzellklone aus der Transfektion mit den rekombinanten Klonen besaßen keine Infektiösität. Die Expression der viralen Gene war bei den Einzelzellklonen aus der Transfektion des Klons mit den HTLV1LTR Enden und der HTLV1Integrase nachweisbar.
Das Chromanol 293B stellt die Leitsubstanz einer möglicherweise neuen Kategorie von KlasseIIIAntiarrhythmika dar. Im Herzen inhibiert es potent und spezifisch den Kaliumkanal I Ks , der an der Repolarisation der Membran bei Ablauf eines Aktionspotentials beteiligt ist. Er ist aus der AlphaUntereinheit KCNQ1 und der BetaUntereinheit MinK aufgebaut. Es bestehen deutliche biophysikalische Unterschiede zwischen den Strömen homomerer KCNQ1 und heteromerer I Ks (KCNQ1/MinK)Kanäle. Die Koexpression mit MinK verändert aber auch die Pharmakologie von KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit trugen zwei unabhängige Lösungsansätze dazu bei, die Interaktion der beiden Untereinheiten molekular besser zu verstehen. Dabei wurden als Methoden die zielgerichtete Mutagenese, die Expression der WildTypProteine und der Mutanten in XenopusOozyten und deren elektrophysiologische Analyse angewendet. Im ersten Teil wurde die Bindungsstelle des I Ks Inhibitors 293B molekular identifiziert, während im zweiten Teil der Mechanismus der Inaktivierung der AlphaUntereinheit KCNQ1 untersucht wurde. In den beiden Ansätzen wurde ausgenutzt, dass die zu KCNQ1 eng verwandten KCNQ2 Kanäle weder sensitiv gegenüber 293B waren noch eine Inaktivierung zeigten. Die Expression von MinKMutanten, die alle veränderbaren Regionen des Proteins abdeckten, ergab, dass keine dieser Mutationen die Affinität des I Ks Kanals gegenüber 293B wesentlich beeinflusste. Das war erstaunlich, da homomere KCNQ1Kanäle durch das Chromanol 293B um den Faktor 45 schwächer zu blockieren sind als I Ks Kanäle und da zusätzlich gezeigt wurde, dass sich auch das Ausmaß der Stereoselektivität von 293B und anderer verwandter I Ks Inhibitoren in Bezug auf KCNQ1 und I Ks stark unterscheidet. Es konnte aus den Ergebnissen indirekt vermutet werden, dass MinK offensichtlich auf allosterische Art die Affinität des Inhibitors erhöht. Um einen Hinweis auf die I Ks Spezifität des Blocks durch 293B auch innerhalb der KCNQ Familie zu erhalten, wurde zunächst die Inhibition der verwandten KCNQ2 und KCNQ3Kanäle getestet, die sich als kaum signifikant erwies. In diesem Zusammenhang wurde auch ein neues Mitglied der KCNQFamilie kloniert, KCNQ5, das schwach sensitiv gegen 293B war, nicht im Herzen vorkommt aber wahrscheinlich zusammen mit KCNQ2/KCNQ3 zum neurona len MStrom beiträgt. Dies ergab Hinweise darauf, dass von anderen KCNQKanälen differente Proteinsequenzen die hohe Sensitivität des KCNQ1Kanals gegenüber 293B determinieren. Die Bindungsstelle an der AlphaUntereinheit KCNQ1 wurde anschließend durch KCNQ1/KCNQ2 Chimären auf die innere Porenregion eingegrenzt. Durch detaillierte Untersuchung mithilfe von Punktmutationen identifizierten wir Aminosäuren in der Transmembranregion S6 (I337) und der Porenschleife H5(V307), deren Austausch gegen die entsprechenden KCNQ2 Aminosäuren die Affinität von 293B zu KCNQ1 sowie zu I Ks Kanälen um den Faktor 420 herabsetzten. Durch Analogiemodellierung mithilfe der bekannten Kristallstruktur des KcsA Kaliumkanals konnte ein 3DModell der KCNQ1Porenregion erstellt werden, aus dem sich ergab, dass die Seitenketten der Aminosäure Isoleucin 337 in das Lumen der inneren Pore gerichtet sind. Aus dem Modell konnte weiterhin das Phenylalanin 340 als in das Lumen gerichtet identifiziert werden. Dieses Ergebnis konnte durch weitere MutageneseExperimente evaluiert werden, aus denen hervorging, dass Veränderungen an dieser und benachbarten Positionen die Sensitivität sowohl von KCNQ1 als auch von I Ks Kanälen gegenüber 293B um den Faktor 10100 verminderten. Das 293BMolekül konnte so in das Modell integriert werden, dass sich attraktive Interaktionen mit diesen beiden Resten (F340 und I337) ausbilden. Die innere Porenregion stellt auch für viele Inhibitoren anderer Kaliumkanäle eine wichtige Determinante für hohe Affinität dar. Die in H5 gelegene Aminosäure V307 schien nach dem Modell nicht an einer 293BInteraktion direkt beteiligt zu sein. Es fiel aber bei der Charakterisierung auf, dass das veränderte Protein nicht mehr inaktivierte. Daher sollte ein Zusammenhang zwischen dem 293B Wirkmechanismus und der intrinsischen KCNQ1Inaktivierung untersucht werden. Es wurden wiederum durch einen Chimärenansatz zunächst die Regionen identifiziert, die für eine KCNQ1Inaktivierung notwendig sind. Anschließend wurde nach punktuellem Austausch von KCNQ1Aminosäuren gegen analoge KCNQ2Reste für eine weitere Position im Transmembransegment S5 (G272) ein Verlust der Inaktivierung festgestellt. Die zweite nicht inaktivierende Mutante G272C war WildTypgleich 293Bempfindlich, woraus sich vermuten ließ, dass die schwache Empfindlichkeit gegenüber 293B und der Verlust der Inaktivierung der KCNQ1Mutante V307L nicht in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse machten aber molekular den Unterschied der KCNQ1Inaktivierung zu den beiden klassischen Inaktivierungsarten von Kaliumkanälen, N und CTyp, deutlich. Zuvor war dies nur anhand unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften gezeigt worden. Das zuvor erstellte KCNQ1 Modell unterstützte die Resultate, da sich in ihm die beiden Regionen S5 und die Porenhelix H5 etwa auf Höhe der beiden Aminosäuren V307 und G272 kreuzen, was eine Interaktion dieser Regionen suggeriert. Zudem ist bei der ein LongQTSyndrom verursachenden KCNQ1Mutation L273F die mutierte Stelle unmittelbar neben dem Valinrest 307 lokalisiert. Diese besonders stark inaktivierende LQT1Mutante erhielt auch unter der Einwirkung von MinK eine nachweisbare Inaktivierung aufrecht. Da die KCNQ1Inaktivierung durch MinKKoexpression normalerweise aufgehoben wird, spricht dies für eine pathophysiologische Relevanz der KCNQ1Inaktivierung.
Die Hämatopoese stellt den blutbildenden Prozeß dar, der den Menschen ein Leben lang mit Blutzellen versorgt und deren Ausgangspunkt eine kleine Zahl hämatopoetischer Stammzellen ist. Diese Stammzellen besitzen einerseits die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind andererseits in der Lage, durch Proliferation und terminale Differenzierung Zellen verschiedener Linien hervorzubringen. Das biologische Hauptmerkmal der Stammzelle ist die Fähigkeit die Hämatopoese zu rekonstituieren, was klinisch bei der Stammzelltransplantation genutzt wird. Überwiegend werden dabei Knochenmark und peripheres Blut als Quelle für Stammzellen genutzt, die abhängig von der Zahl der transplantierten Zellen zur völligen Rekonstitution der Blutbildung führen. Für Patienten ohne passende Spender wurde das Nabelschnurblut als Alternative in Betracht gezogen. Trotz verschiedener Vorteile der Stammzellen aus Nabelschnurblut besteht der Hauptnachteil in der sehr limitierten Zahl der Zellen mit dem erhöhten Risiko eines Transplantatversagens. Aus diesem Grund wird die ex vivo Vermehrung dieser Stammzellen derzeit zunehmend untersucht. Erforderlich sind Bedingungen zur ausreichenden Vermehrung der Zellen unter Erhalt der Stammzelleigen schaften, die die klinische Anwendung möglich machen. Diese Bedingungen waren bisher nicht erfüllt. Hauptziel dieser Arbeit war es demnach Kulturbedingungen für die Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren, die den klinischen Anforderungen einer Transplantation genügen. Dafür wurden sowohl die determinierten Vorläuferzellen untersucht, als auch die Fähigkeit der Stammzelle in vitro Langzeithämatopoese aufrecht zu erhalten und zur Repopulierung der NOD/SCIDMaus. Die Repopulierung ist ein spezifischer Prozeß (Homing), bei dem die Migration der Zellen aus der Blutbahn durch die Endothelzellschicht der Gefäße in die spezialisierten Nischen des Knochenmarks erfolgt. Da für die Amplifikation äußere Stimuli erforderlich sind, welche die biologischen Eigenschaften der Zellen modulieren, wurden die Eigenschaften der expandierten Zellen in verschiedenen in vitro Assays wie CFU und LTCIC untersucht, die derzeit als die besten Verfahren gelten, die hämatopoetische Stammzelle zu detektieren. Zur Untersuchung der Repopulierungsfähigkeit wurde das NOD/SCIDMausmodell etabliert, in dem der Aufbau einer humanen Hämatopoese im murinen Knochenmark gemessen wird, sowie ein neues in vitro Modell entwickelt, das Stromazellsphäroid, mit dessen Hilfe die Migrationsfähigkeit untersucht wurde. Mit der Kombination der auf primitive Stammzellen wirkenden Zytokine SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine gute und ausreichende Vermehrung der ontogenetisch unreifen und der determinierten Progenitorzellen nach Kultivierung der Zellen über 7 Tage. Das beim Einsatz in der ex vivo Expansion umstrittene Zytokin IL3 führte hierbei nicht zum befürchteten Verlust der Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen. Es sorgte vielmehr durch eine starke Vermehrung der Zellen für ein Engraftment der NOD/SCIDMaus, das dem durch frische unmanipulierte Nabelschnurblutzellen vergleichbar war. Von den getesteten Kultursystemen erwies sich die statische Kultivierung im Teflonbeutel als geeignet zur Vermehrung der primitiven Progenitoren, ohne die Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen zu vermindern. Durch die Wahl eines serumfreien, klinisch anwendbaren Mediums gelang somit die Etablierung eines Kultursystems zur optimierten ex vivo Expansion früher Progenitor und Stammzellen aus Nabelschnurblut ohne Verlust der Repopulierungsfähigkeit für die klinische Anwendung. Das Homing in das Knochenmark ist ein selektiver aus mehreren Einzelschritten bestehender Prozeß unter Interaktion der Zellen mit Endothelzellen und dem Knochenmarkstroma, der durch eine Vielzahl verschiedener zusammenwirkender Adhäsionsmoleküle reguliert wird. Weitere Faktoren, die das Homing beeinflussen sind Zytokine oder Chemokine. Diese Stimuli wirken über verschiedene intrazelluläre Signalwege, von denen die RhoProteinfamilie der kleinen GTPasen eine bestimmende Rolle in der Migration zugedacht wird, sowie andere Bestandteile der intrazellulären Signaltransduktion, wie Kinasen und GProteine. Die Migration in das Sphäroidmodell ist ebenso ein selektiver und gerichteter Prozeß, bei dem neben den primären CD34 Zellen aus Nabelschnurblut auch andere humane hämatopoetische Zelllinien eine gerichtete Einwanderung zeigen. Durch Zugabe eines Inhibitors von G Proteinen, Pertussis Toxin (PT), und Hemmung der kleinen GTPasen durch spezifische Toxine aus Clostridien konnte eine reproduzierbare und deutliche Verringerung der Migration in das Sphäroid erreicht werden. Die Migration hämatopoetischer Zellen in das Sphäroid erfolgt also unter Beteiligung der kleinen GTPasen, sowie PT sensitiver GProteine. Blockierungsversuche zeigten unerwarteterweise keine funktionelle Beteiligung des ChemokinRezeptorpaares SDF1/CXCR4 und des Adhäsionsmoleküls VLA4 bei der Migra- tion in das Sphäroid. Welche weiteren Mechanismen für diese Migration bedingend sind erfordert weitergehende Untersuchungen. Durch die Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut mit den Zytokinen SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine ausreichende Vermehrung von frühen und determinierten Progenitorzellen unter Erhalt ihrer Stammzellfähigkeiten, so daß ein klinischer Einsatz möglich wird. Dabei ergab sich durch Untersuchung der Migrationsfähigkeit im Sphäroidmodell, daß beim Homing der Zellen die Aktivierung der kleinen GTPasen und eines Pertussis Toxinsensitiven GProteins beteiligt sind.
Schon kurz nach Änderung der Verordnung über das Leichenwesen und der Einführung des neuen Leichenschauscheines in Hessen am 15.4.1996 traten Schwierigkeiten auf, die zunächst auf die Umstellung zurückgeführt wurden. Nachdem auch einige Monate später die Klagen von vielfältiger Seite (Ärzte, Sanitäter, Bestatter, Kriminalpolizei) nicht nachließen, sollte untersucht werden, ob, warum und in welchem Umfang die Handhabung des neuen Leichenschauscheines solche Schwierigkeiten bereitet. Die Untersuchung basierte zum einen auf der Auswertung der Leichenschauscheinen der Verstorbenen, die im Zentrum der Rechtsmedizin in der Zeit von 1.1.31.3.1997 zur Verfügung standen (264 vertrauliche, 161 nichtvertrauliche Teile der Leichenschauscheine) zum anderen auf Interviews mit dem Standesamt, Gesundheitsamt, Kriminalpolizei, Verwaltung der Universitätsklinik und einem Bestatter. Als Gesamtergebnis kristallisierte sich heraus, dass der Leichenschauschein formale Mängel aufweist. Insbesondere die Angabe des Totauffindens ist mit dem Personenstandsgesetz nicht vereinbar, nach dem grundsätzlich die Todeszeit, bzw. der Todeszeitraum angegeben werden muss. Zum anderen war das Fehlen der Rubrik ''Natürlicher Tod'' einer der wesentlichen Mängel, weil häufig von Ärzten auch bei nichtnatürlichem Tod vergessen wurde, die entsprechende Rubrik zu signieren, so dass ohne Vorliegen des vertraulichen Teils der Standesbeamte von einem natürlichen Tod ausgehen musste. In einem Fall ist erst bei der zweiten Leichenschau im Krematorium der wirkliche Sachverhalt aufgeklärt worden, mit entsprechender Störung des Beerdigungsablaufes. Weiterhin ist der Leichenschauschein sehr unübersichtlich angelegt, indem gleiche Angaben sich an verschiedenen Stellen befinden, was dazu führt, dass sie häufig nicht, unvollständig oder falsch ausgefüllt werden. Auch die praktische Handhabung mit verschiedenen Briefumschlägen ohne eindeutige Kennzeichnung führte dazu, dass z.B. der nichtvertrauliche Teil mit in den für den vertraulichen Teil vorgesehenen Umschlag kurvertiert wurde und damit wiederum ein weiteres Herantreten an die Angehörigen notwendig war. Einer der größten Mängel ist darin zu sehen, dass darauf verzichtet wurde eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie es in anderen Bundesländern üblich ist, einzuführen. Das bedeutet, dass der Notarzt nach dem Einstellen der Wiederbelebungsmaßnahmen solange warten muss, bis sichere Todeszeichen aufgetreten sind. Dieses ist nicht nur unökonomisch, sondern häufig wegen eines neuen Einsatzes auch nicht durchführbar. Als Mangel ist auch das Fehlen der Warnhinweise (''Schrittmacher'') im vertraulichen Teil zu werten. Dadurch liegen wichtige Informationen dem die zweite Leichenschau bei Feuerbestattung durchführenden Arzt nicht vor. Bei dieser Sachlage scheint es unabdingbar eine Änderung des Leichenschauscheines und des Procedere herbeizuführen. Vorstellbar wäre ein einheitliches Formular der vertreibenden Verlage mit Schwärzungen an den Stellen, die von datenschutzrechtlichem Belang sind. Ferner sollten für sämtliche Formularblätter entsprechend gekennzeichnete Briefumschläge zur Verfügung stehen, so dass grundsätzlich bei jeder Leichenöffnung alle Formulare in einen gesonderten Umschlag kommen. Außerdem sollte noch einmal von gesetzgeberischer Seite überdacht werden, ob eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie sie sich in anderen Bundesländern bewährt hat, einzuführen. Letztlich wird auch darüber nachzudenken sein, wie die Qualität der ärztlichen Leichenschau zu verbessern ist. In erster Linie wird es eine Frage bei der Ausbildung der Medizinstudenten sein, die aber zu dieser Zeit die ''Ernsthaftigkeit'' dieser Tätigkeit noch nicht richtig einzuschätzen wissen. Außerdem wird es durch die Reduzierung der Leichenöffnungen und z.T. sehr emotional geführte Rechtsdiskussionen immer schwieriger den Arzt ''in praxi'' auszubilden. Zweifellos ist die Bereitschaft zur Fortbildung bei Ärzten, die die Leichenschau durchführen, später größer, aber hier ist kaum noch eine institutionalisierte, zeitaufwendige Fortbildung möglich. Letztlich muß auch darüber nachgedacht werden, inwieweit nicht vermeidbare Mängel bei der Leichenschau und bei dem Ausfüllen des Leichenschauscheines durch Verhängung von Bußgeldern sanktioniert werden sollte. Schließlich entstehen nicht nur anderen Institutionen (Standes, Gesundheitsamt, statistische Behörden) und Angehörigen durch Mängel bei der Leichenschau erhebliche Beschwernisse und Unkosten. Es kann auch einem Täter bei Verkennung einer Tötung Anlaß zu weiteren entsprechenden Taten geben.
TEIL I Die Bauentwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes in Frankfurt am Main von 1960 bis zur Fertigstellung des Erweiterungsbaus im Jahr 1973 ( bearbeitet von: Thomas Kick ) Die vorliegende Arbeit reiht sich ein in die Gesamtdarstellung der Geschichte des Zahnärztlichen Universitäts- Institutes in Frankfurt am Main. In der Dissertation von Bald-Duch wird ein geschichtlicher Überblick von der Gründung der Heilanstalt Carolinum im Jahre 1890 bis zum Tode von Otto Loos am 1. April 1936 gegeben, die Arbeit von Roeloffs-Nuthmann umfasst die Darstellung des historischen Werdegangs des Zahnärztlichen Institutes in Frankfurt am Main während der nationalsozialistischen Herrschaft und der Nachkriegsjahre bis hin zum Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Carolinum. Diese Dissertation vervollständigt die Dokumentation der Entwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes Carolinum für die Jahre 1960 bis 1986, wobei der Schwerpunkt der Darstellung auf die Bauentwicklung und dabei insbesondere auf die Planung und Errichtung des Neubaus des Zentrums der Zahn-, Mund- und Kiefer- heilkunde Carolinum gelegt wurde. Zu Beginn der sechziger Jahre wurden Verhandlungen zur Übernahme der Städtischen Universitätskliniken und der angeschlossenen Institute in Frankfurt am Main durch das Land Hessen aufgenommen. Davon betroffen war auch das Zahnärztliche Universitäts-Institut Carolinum, das in die Verwaltung der Universität übergehen sollte. Professor Flesch-Thebesius als Vorsitzender des Vorstandes der Freiherr Carl von Rothschild
Bislang ist unklar, warum Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM, Chlorocebus), die in ihrem natürlichen Habitat bis zu 50% mit SIVagm infiziert sind, zeitlebens keine Symptome einer Immundefizienz zeigen, d.h. eine Resistenz gegen AIDSähnliche Symptome besitzen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in einer Studie die Immunantwort SIVagminfizierter AGM nach Immunstimulation mittels Tetanustoxoid untersucht. Ziel dieses Projekts war die Klärung der Frage, ob die Virusreplikation durch Stimulation des Immunsystem und damit einhergehend einer Vermehrung der Zielzellen von SIV, eine Änderung erfährt oder ob diese durch immunologische Kontrollmechanismen konstant bleibt. Untersucht wurde dazu eine Gruppe von vier natürlich SIVagminfizierten AGM, die zwei Jahre nach Basisimmunisierung mit Tetanustoxoid im Abstand von vier Wochen i.m. immunisiert wurden. Der Zeitpunkt der SIVInfektion lag vor der Basisimmunisierung. Wöchentlich fanden Blutentnahmen statt und es wurden immunologische und virologische Parameter bestimmt. Die gemessenen Lymphozytenwerte, die FACSDaten und die Lymphozytenproliferationskapazität ließen nach Tetanustoxoidgabe keine Änderung erkennen. Die Daten gaben keinen Hinweis darauf, daß die exogene Antigenspezifische Stimulation zu einer Proliferation der Gedächtniszellen geführt hätte. Es ist davon auszugehen, daß es während der Basisimmunisierung zu einer Proliferation von CD4 TZellen kam und diese nachfolgend infiziert bzw. eliminiert wurden. Somit waren keine Tetanusspezifischen Gedächtniszellen zum Zeitpunkt der Immunstimulation mehr existent. Um dieses Problem auszuschließen, müssten SIVagmnegative AGM eine Basisimmunisierung erhalten und erst anschließend dürfte eine Infektion mit SIVagm stattfinden. Aufgrund des Versuchsaufbaus kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Immunstimulation auf die Höhe der Virusbelastung Einfluß nimmt. Für das apathogene SIV/Primatensystem konnte im Vergleich mit AIDSsuszeptiblen SIV/PrimatenSystemen zwar keine deutlich stärkere humorale oder zelluläre Immunantwort gefunden werden, jedoch gibt es signifikante Unterschiede. AGM zeigen nur eine geringe Virusbelastung in den Lymphknoten und es konnte bislang in keinem natürlichen Wirt von SIV sog. ''VirusTrapping", daß heißt die Anheftung von Viruspartikeln auf der Oberfläche von Follikulär Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Es wurde auch nie, trotz chronischer Infektion, eine Strukturänderung des lymphatischen Gewebes gefunden. Ein weiterer kurioser Unterschied ist das Fehlen einer Immunantwort gegen natives GagProtein, obwohl es zu einer starken Immunantwort gegen das EnvProtein kommt. In der zweiten durchgeführten Studie im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte, unter der Annahme, daß die obengenannten Phänomene miteinander assoziiert sind, folgende Hypothese untersucht werden: Aufgrund des Fehlens der GagAntikörper kommt es bei AGM nicht wie bei einer HIVInfektion zur Bildung von Immunkomplexen. Dementsprechend können keine Viruspartikel via Fc Rezeptor auf FDC gebunden werden. Nachfolgend findet deshalb auch keine verstärkte Apoptose der FDC bzw. Lyse der germinalen Zentren statt, und die Lymphknotenarchitektur bzw.struktur bleibt intakt. Zunächst sollte deshalb im folgenden Projekt eine humorale Immunantwort gegen das Kernprotein von SIV induziert werden. Nach mehrfacher Immunisierung mit affinitätschromatographisch gereinigtem GagProtein entwickelten alle untersuchten Tiere (Gruppe A) hohe AntikörperTiter. Nachfolgend wurden die Gagimmunisierte Gruppe und eine Kontrollgruppe (Gruppe B) experimentell infiziert. Die Negativkontrollgruppe (Gruppe C) blieb unbehandelt. In regelmäßigen Abständen erfolgten Blutbzw. Lymphknotenentnahmen. Ein wichtiger Teil dieses Projekts war die Etablierung einer quantitativen RTPCR zum Nachweis von SIVagmRNA. Bislang war es nicht möglich, die virale RNA zu quantifizieren und bei der chronischen, benignen SIVagmInfektion von AGM lag lange der Verdacht nahe, daß es aufgrund einer niedrigen Viruslast nicht zum Krankheitsausbruch kommt. Es konnte eine quantitative TaqmanRTPCR etabliert werden, mit der der spezifische Nachweis mit einer Sensitivität von 100 RNAKopien pro ml möglich ist. Die Tiere zeigten Plasmaund Proviruslasten in einer Höhe, die durchaus vergleichbar ist mit der Viruslast HIVinfizierter Menschen bzw. SIVmacinfizierter Rhesusaffen. Es kann somit ausgeschlossen werden, daß eine niedrige Viruslast der Grund für die Apathogenität ist. Die Viruslast in den Lymphknoten wurde immunhistochemisch untersucht. Die zuvor Gag immunisierten Tiere zeigten mehr infizierte Zellen, insbesondere im Bereich der Follikel, als Gruppe B. Diese Daten stimmten mit den Ergebnissen der InsituHybridisierung überein. Auch hier konnte mehr virale RNA in den Follikeln der GruppeA detektiert werden. Zwei der Tiere zeigten Anzeichen von VirusTrapping in den Keimzentren der Lymphknoten. Die histologischen Daten könnten darauf schließen lassen, daß die Existenz von GagAntikörpern auf die Viruslast in lymphatischem Gewebe Einfluß nimmt.
In der vorliegenden Arbeit werden Verfahren der Mathematik und Informatik entwickelt und eingesetzt, um Struktur, Dynamik und biologische Aktivität aus NMR spektroskopischen und empirischen Parametern zu bestimmen. Dolastatin 10 und Epothilon A sind potentielle Wirkstoffe gegen Krebs, da sie durch Wechselwirkung mit Tubulin die Zellteilung unterbinden. Die 3D Struktur beider Wirkstoffe in Lösung und die Struktur von an Tubulin gebundenem Epothilon A wird aus NMR spektroskopischen Parametern bestimmt. Dolastatin 10 liegt in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis -- und trans -- Konformation in der ungewöhnlichen Aminosäure DAP vor. Beide Konformationen des flexiblen Pentapeptids können bestimmt werden mit RMSD = 1.423 Å für das cis -- Konformer und RMSD = 1.488 Å für das trans -- Konformer. Während das trans -- Konformer gestreckt vorliegt, faltet das cis -- Konformer am DAP zurück. Epothilone A ist durch einen Makrozyklus weniger flexibel und sowohl die an Tubulin gebundene Struktur (RMSD = 0.537 Å) als auch freie Form (RMSD = 0.497 Å) kann mit geringen RMSD -- Werten bestimmt werden. Die Struktur der freien Form, welche in Lösung hauptsächlich vorliegt, ist mit der Röntgenstruktur weitgehend identisch. In der an Tubulin gebundenen Form wird eine essentielle Umorientierung der Seitenkette beobachtet, die für die Wechselwirkung mit Tubulin entscheidend ist. Dipolare Kopplungen eines Proteins sind geeignet, eine 3D Homologiesuche in der PDB durchzuführen, da die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen und Domänen durch sie beschrieben wird 85 . Die frühe Erkennung 3D homologer Proteinfaltungen eröffnet die Möglichkeit, die Bestimmung von Proteinstrukturen zu beschleunigen. Eine Homolgiesuche unter Nutzung dipolarer Kopplungen ist in der Lage, Proteine oder zumindest Fragmente mit ähnlicher 3D Struktur zu finden, auch wenn die Primärsequenzhomologie gering ist. Darüber hinaus wird eine Transformation für experimentelle dipolare Kopplungen entwickelt, die die indirekte Orientierungsinformation eines Vektors relativ zu einem externen Tensor in den möglichen Bereich für den Projektionswinkel zwischen zwei Vektoren und somit in eine intramolekulare Strukturinformation übersetzt. Diese Einschränkungen können in der Strukturbestimmung von Proteinen mittels Molekulardynamik genutzt werden 92 . Im Gegensatz zu allen existierenden Implementierungen wird die Konvergenz der Rechnung durch die auf diese Weise eingeführten dipolare Kopplungsinformation kaum beeinflusst. Die dipolaren Kopplungen werden trotzdem von den errechneten Strukturen erfüllt. Auch ohne die Nutzung bereits bekannter Protein oder Fragmentstrukturen kann so ein erheblicher Teil der NOE -- Information substituiert werden. Die Dynamik des Vektors, der die beiden wechselwirkenden Dipole verbindet, beeinflusst den Messwert der dipolaren Kopplung. Dadurch wird Information über die Dynamik von Molekülen auf der µsZeitskala zugänglich, die bisher nur schwer untersucht werden konnte. Die Messung dipolarer Kopplungen für einen Vektor in verschiedenen Orientierungen erlaubt die Analyse seiner Bewegung 89 . Im besonderen ist die Ableitung eines modellfreien Ordnungsparameters 2 S möglich. Weiterhin lassen sich ebenso modellfrei eine mittlere Orientierung des Vektors, axialsymmetrische Anteile und nichtaxialsymmetrische Anteile der Dynamik ableiten und auswerten. Die Anwendung der so entwickelten Protokolle auf experimentelle Daten 90 lässt Proteine deutlich dynamischer erscheinen als auf der Zeitskala der Relaxationsexperimente zu erkennen ist. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 auf 0.6. Dies entspricht einer Erhöhung des Öffnungswinkels der Bewegung von ca. 22 ° auf ca. 33°. Die Bewegungen weichen teilweise bis zu 40% und im Mittel 15% von der Axialsymmetrie ab. Neuronale Netze erlauben eine schnelle (ca. 5000 chemische Verschiebungen pro Sekunde) und exakte (mittleren Abweichung von 1.6 ppm) Berechnung der 13 C NMR chemischen Verschiebung 115 . Dabei kombinieren sie die Vorteile bisher bekannter Datenbankabschätzungen (hohe Genauigkeit) und Inkrementverfahren (hohe Geschwindigkeit). Das 13 C NMR Spektrum einer organischen Verbindung stellt eine detaillierte Beschreibung seiner Struktur dar. Resultate des Strukturgenerators COCON können durch den Vergleich des experimentellen mit den berechneten 13 C NMR Spektren auf ca. 1 o/oo der vorgeschlagenen Strukturen eingeschränkt werden, die eine geringe Abweichung zum experimentellen Spektrum haben 122 . Die Kombination mit einer Substrukturanalyse erlaubt weiterhin die Erkennung wahrscheinlicher, geschlossener Ringsysteme und gibt einen Überblick über die Struktur des generierten Konstitutionssubraumes. Genetische Algorithmen können die Struktur organischer Moleküle ausgehend von derer Summenformel auf eine Übereinstimmung mit dem experimentellen 13 C NMR Spektrum optimieren. Die Konstitution von Molekülen wird dafür durch einen Vektor der Bindungszustände zwischen allen Atom -- Atom Paaren beschrieben. Selbige Vektoren sind geeignet, in einem genetischen Algorithmus als genetischer Code von Konstitutionen betrachtet zu werden. Diese Methode erlaubt die automatisierte Bestimmung der Konstitution von Molekülen mit 10 bis 20 Nichtwasserstoffatomen 123 . Symmetrische neuronale Netze können fünf bzw. sieben dimensionale, heterogene Parameterrepräsentationen der 20 proteinogenen Aminosäuren unter Erhalt der wesentlichen Information in den dreidimensionalen Raum projizieren 134 . Die niederdimensionalen Projektionen ermöglichen eine Visualisierung der Beziehungen der Aminosäuren untereinander. Die reduzierten Parameterrepräsentationen sind geeignet, als Eingabe für ein neuronales Netz zu dienen, welches die Sekundärstruktur eines Proteins mit einer Genauigkeit von 66 % im Q 3 -- Wert berechnet. Neuronale Netzte sind aufgrund ihrer flexiblen Struktur besonders geeignet, quantitative Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität zu beschreiben, da hier hochgradig nichtlineare, komplexe Zusammenhänge vorliegen. Eine numerische Codierung der über 200 in der Literatur beschriebenen Epothilonderivate erlaubt es, Modelle zur Berechnung der Induktion der Tubulin Polymerisation (R = 0.73) und der Inhibierung des Krebszellenwachstums (R = 0.94) zu erstellen 136 . Die trainierten neuronalen Netze können in einer Sensitivitätsanalyse genutzt werden, um die Bindungsstellen des Moleküls zu identifizieren. Aus der Berechnung der Aktivität für alle Moleküle des durch die Parameter definierten Strukturraums ergeben sich Vorschläge für Epothilonderivate, die bis zu 1 000 mal aktiver als die bisher synthetisierten sein könnten.
Molekulare Charakterisierung und immunologischer Nachweis von porcinen endogenen Retroviren (PERV)
(2001)
GProteingekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine der größten in der Natur vorkommenden Proteinfamilien dar (Watson and Arkinstall, 1994). GPCRs sind plasmamembranständige Proteine, die mit heterotrimären GProteinen interagieren und eine Vielzahl an Signaltransduktionswegen aktivieren. Trotz der strukturellen Vielfalt der an GPCRs angreifenden Liganden stimulieren die meisten GPCRs nur eine begrenzte Anzahl strukturell sehr ähnlicher GProteine (Hedin et al., 1993; Conklin and Bourne, 1993). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dieser Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität zugrunde liegen, ist von fundamentaler Wichtigkeit für das Verständnis zellulärer Signaltransduktion. Ausführliche StrukturFunktionsanalysen verschiedener Neurotransmitter rezeptoren, einschließlich der Muskarinrezeptoren (Wess, 1996) und adrenergen Rezeptoren (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994), haben einen beträchtlichen Beitrag zur Identifizierung der strukturellen Elemente, die für die GProteinKopplungsselektivität dieser Rezeptorgruppe verantwortlich sind, geleistet. Im Gegensatz dazu ist bisher noch weitgehend ungeklärt, welche molekularen Mechanismen der Kopplungsselektivität von GPCRs, die durch Peptidliganden aktiviert werden, zugrunde liegen. Das Ziel dieser Arbeit war daher, molekulare Grundlagen der GProtein Kopplungsselektivität von PeptidGPCRs näher zu untersuchen und aufzuklären. Die Vasopressinrezeptorfamilie unterscheidet sich von nahezu allen anderen PeptidGPCRs darin, daß die einzelnen Rezeptorsubtypen deutlich unterschiedliche GProtein Kopplungspräferenzen aufweisen. Die V1a und V1bVasopressinrezeptoren stimulieren selektiv GProteine der Gq/11 Familie, was zur Aktivierung von PhospholipaseCbeta-Isomeren führt. Im Gegensatz dazu koppelt der V2Vasopressinrezeptor vornehmlich an das GProtein G s , was in einem Anstieg an intrazellulärem cAMP resultiert. Daher stellen die Vasopressinrezeptorsubtypen ein attraktives Modellsystem zum Studium der Peptid GPCRRezeptordomänen, die für die selektive GProteinAktivierung verantwortlich sind, dar. Als Modellsystem für diese Arbeit diente primär der V2Vasopressinrezeptor. Molekulare Faktoren, die die Gs Kopplungsselektivität des V2 Vasopressinrezeptors bestimmen. Eine frühere Studie zeigte, daß die Gegenwart der V1aRezeptorsequenz in der zweiten intrazellulären (i2) Schleife notwendig war, um den Wildtyp V1a und V1a/V2 Rezeptorchimären effizient an Gq/11 Proteine zu koppeln (Liu and Wess, 1996). Effiziente Interaktionen zwischen Wildtyp V2 oder V1a/V2Rezeptorchimären und dem GProtein G s waren hingegen hauptsächlich von V2Rezeptorsequenzen in der dritten intrazellulären (i3) Schleife abhängig. Um die molekularen Grundlagen der Gs Kopplungsselektivität des V2Rezeptors näher zu untersuchen, wurden zunächst klassische Mutagenesetechniken (zielgerichtete Mutagenese'') angewandt. Definierte V2Rezeptorsegmente (oder einzelne Aminosäuren) wurden in den V1aRezeptor transferiert, und die resultierenden HybridVasopressinrezeptoren wurden anschließend in funktionellen Studien auf ihre Fähigkeit, hormonabhängig intrazelluläre cAMP Konzentrationen zu steigern (G s vermittelt), getestet. Diese Strategie schien besonders geeignet, da die Aktivierung des V1aWildtyprezeptors nahezu keine Auswirkungen auf intrazelluläre cAMPSpiegel hat. Wie bereits erwähnt, ist die effiziente Kopplung des V2Rezeptors an das Gs Protein vornehmlich von V2Rezeptorsequenzen in der i3Schleife abhängig (Liu and Wess, 1996). Eine V1aRezeptormutante, deren i3Schleife durch die homologe V2 Rezeptorsequenz ersetzt worden war, war in der Lage, effizient mit Gs zu interagieren. Die Fähigkeit dieser Rezeptormutante, Gs zu aktivieren, war jedoch im Vergleich zum V2Wildtyprezeptor vermindert. Diese Beobachtung ließ die Vermutung zu, daß noch andere intrazelluläre V2Rezeptordomänen zur optimalen Gs Kopplung notwendig sind. Daher wurde zunächst eine Reihe von V1a/V2Rezeptorchimären erzeugt, die den Beitrag der zweiten (i2) und vierten intrazellulären (i4) Rezeptordomäne zur V2 Rezeptor/G s Kopplungsselektivität klären sollten. Funktionelle Untersuchungen der resultierenden HybridRezeptormutanten in Säugetierzellen (COS7) zeigten, daß ein kurzes Segment im Nterminalen Abschnitt der i4Domäne einen deutlichen Beitrag zur V2Rezeptor/G s Kopplungsselektivität leistet. Eine V1aRezeptormutante, welche in der i3Schleife und dem Nterminalen Segment der i4Domäne (Ni4) homologe V2 Rezeptorsequenzen enthielt, zeigte ein funktionelles Profil (EC 50 und E max ), welches mit dem V2Wildtyprezeptor nahezu deckungsgleich war. Anschließend wurden strukturelle Elemente innerhalb der i3Schleife näher untersucht. Funktionelle Analysen zeigten, daß der Nterminale Abschnitt der i3Schleife weitgehend das GProteinKopplungsprofil des V2Rezeptors bestimmt. Eine Reihe von V1aRezeptormutanten wurde erzeugt, in denen kurze Segmente des Nterminalen Bereichs der i3Schleife mit der entsprechenden V2Rezeptorsequenz ausgetauscht wurden. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß ein Aminosäurepaar (Gln225, Val226) und triplet (Phe229, Arg 230, Glu231) am Beginn der i3Schleife des V2 Rezeptors für die effiziente Aktivierung von Gs von entscheidender Bedeutung sind. Durch Punktmutationen in diesem Bereich wurden zwei polare Aminosäuren, Gln225 und Glu231, identifiziert, die für die effiziente V2Rezeptor/G s Interaktion essentiell sind. Untersuchungen mit anderen GPCRKlassen (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994; Wess, 1996) haben ebenfalls gezeigt, daß dem N Terminus der i3Schleife eine besondere Rolle im Rezeptor/GProteinKopplungsprozeß zukommt. In diesen Studien wird berichtet, daß vornehmlich hydrophobe und ungeladene Aminosäuren Schlüsselrollen in der rezeptorvermittelten GProteinAktivierung einnehmen. Die hier beschriebenen Untersuchungen hingegen ergaben, daß zwei polare/geladene Aminosäuren, Gln225 und Glu231, für die V2Rezeptor/G s Kopplung von besonderer Wichtigkeit sind und zeigen daher, daß die Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität nicht auf ausschließlich hydrophoben Wechselwirkungen beruht. Desweiteren konnte beobachtet werden, daß die Länge der i3Schleife die Effizienz, mit der der V2Rezeptor GProteine der Gs Klasse zu aktivieren vermag, beeinflußen kann. Die V1a und V2Rezeptoren weisen unterschiedlich lange i3 Schleifen auf (die i3Schleife des V2Rezeptors ist 13 Aminosäuren kürzer als die des V1aRezeptors). Eine V1aRezeptormutante, deren Nterminaler Abschnitt der i3 Schleife durch homologe V2Rezeptorsequenz ersetzt wurde, konnte deutlich effizienter mit Gs interagieren, wenn der mittlere Abschnitt der i3Schleife um elf Aminosäuren verkürzt wurde. Gleichermaßen konnte die effiziente Kopplung bestimmter V1a/V2Hybridrezeptoren an Gs durch Einfügen von elf Aminosäuren in den zentralen Bereich der i3Schleife deutlich gehemmt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der zentrale Bereich der i3Schleife die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität beeinflussen kann, obgleich diese Rezeptordomäne vermutlich nicht direkt mit dem GProtein interagiert. Es ist denkbar, daß die Länge der i3Schleife den Zugang des GProteins zu funktionell wichtigen Rezeptordomänen, z.B. Aminosäuren im Bereich der fünften Transmembrandomäne (TM V) und der i3Schleife, reguliert. Identifizierung einzelner Aminosäuresubstitutionen und Aminosäuredeletionen, die die GProteinKopplungsselektivität des V2Rezeptors beeinflussen: Einsatz von Hefeexpressionstechnologie und zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Hefe(Saccharomyces cerevisiae) Expressionstechnologien angewandt, um StrukturFunktionsanalysen des V2Rezeptors zu erleichtern und Beschränkungen klassischer Mutagenesetechniken zu überwinden. Der V2Wildtyprezeptor und verschiedene GProteinchimären aus Hefe und SäugetierGalpha Untereinheiten wurden in genetisch modifizierten Hefelinien, deren Zellwachstum von effizienter Rezeptor/GProteinKopplung abhängig war, coexprimiert. In diesem System aktiviert produktive Rezeptor/GProteinKopplung den HefeMAPKinase/Pheromon Signaltransduktionsweg. Dies führt zur Transkription des FUS1HIS3Reportergens und somit zur Expression von His3Protein, was den Histidinauxotrophen (his3) Hefelinien ermöglicht, in histidinfreiem Medium zu wachsen (Pausch et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, daß heterolog exprimierte V2Rezeptoren weder mit der HefeGProtein alphaUntereinheit (Gpa1p) noch mit einem mutierten Gpa1Protein, in dem die Cterminalen fünf Aminosäuren gegen homologe Galpha q Sequenz ausgetauscht worden waren (Gq5), effizient interagierten. Im Gegensatz dazu erwies sich die Interaktion zwischen dem V2 Rezeptor und einem mutierten Gpa1Protein, dessen Cterminale fünf Aminosäuren die homologe Galpha s Sequenz enthielten (Gs5), als hocheffizient. Diese Beobachtungen zeigten, daß der V2Rezeptor im Hefesystem sein physiologisches Kopplungsprofil beibehielt. Zur weiteren Validierung des Hefeexpressionssystems wurden die G q/11 gekoppelten M 1 , M 3 und M 5 Muskarinrezeptoren und verschiedene mutierte Vasopressin und M 3 Muskarinrezeptoren mit veränderten funktionellen Eigenschaften heterolog in Hefe exprimiert. Funktionelle Analysen zeigten, daß die Wildtyprezeptoren und die verschiedenen Rezeptormutanten in Hefe und Säugetierzellen ähnliche Phänotypen aufwiesen. Um zu untersuchen, weshalb der V2Rezeptor nicht effizient an GProteine der Gq/11 Familie koppelt, sollte der in Hefe exprimierte V2Rezeptor zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') unterzogen und Mutanten mit veränderten G ProteinKopplungeigenschaften isoliert werden. Im speziellen wurde die i2Schleife untersucht, da eine frühere Studie gezeigt hatte, daß vornehmlich die i2Schleife des V1a Rezeptors für die V1aRezeptor/G q/11 Kopplungsselektivität verantwortlich ist (Liu and Wess, 1996). Mittels zufallsgerichteter Mutagenesetechnik wurde in Hefe eine Bibliothek von V2Rezeptormutanten erzeugt, deren i2Schleife Mutationen mit einer Mutageneserate von ungefähr 10% (auf der Nukleotidebene) enthielt. Anschließend wurden in einem Selektionsverfahren (screen'') 30 000 V2Rezeptormutanten auf ihre Fähigkeit, mit Gq5 zu interagieren, überprüft. Es konnten vier V2Rezeptormutanten isoliert werden, welche effizient an Gq5 (jedoch nicht an HefeGpa1p) koppelten. Funktionelle Untersuchungen mit diesen und anderen mittels zielgerichteter Mutagenese erzeugter V2Rezeptormutanten zeigten, daß die Substitution einer einzigen Aminosäure (Met145) im zentralen Bereich der i2Schleife beträchtliche Auswirkungen auf die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität hatte. Die Fähigkeit des V2Rezeptors, produktiv mit Gq5 zu interagieren, war von der Anwesenheit relativ großer, hydrophober Aminosäuren wie Leucin und Tryptophan abhängig. Austausch von Met145 mit kleinen Aminosäuren wie Glycin oder Alanin erlaubte dem V2Rezeptor nicht, Gq5 zu aktivieren. Interessanterweise interagierten alle V2Rezeptormutanten, die eine Met145 Punktmutation aufwiesen, mit Gs5 ähnlich effizient wie der V2Wildtyprezeptor. Die Unfähigkeit der V2(Met145Gly) und V2(Met145Ala)Rezeptoren, Gq5 zu aktivieren, beruht daher nicht auf einem Faltungsdefizit. Gleichermaßen basierte die Fähigkeit der V2(Met145Trp) und V2(Met145Leu)Rezeptoren, produktiv an Gq5 zu koppeln, nicht auf der Überexpression von Rezeptorprotein. Diese Ergebnisse zeigen, daß die chemische Eigenschaft der Aminosäure an Position 145 die V2Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität reguliert. Interessanterweise befindet sich in allen anderen Subtypen der Vasopressin/OxytocinRezeptorfamilie (V1a, V1b, und Oxytocin Rezeptoren), welche selektiv an GProteine der G q/11 Klasse gekoppelt sind, ein Leucin an der Stelle, die zu Met145 (V2Rezeptorsequenz) homolog ist. Eine der vier ursprünglich isolierten V2Rezeptormutanten enthielt neben verschiedenen Punktmutationen eine Deletion in Position Met145. In detaillierteren zielgerichteten MutageneseStudien wurden zwei V2Rezeptormutanten erzeugt, die alle drei GProteine (Gq5, Gs5 und Gpa1p) aktivieren konnten. Um zu untersuchen, ob ein generelles Verkürzen der i2Schleife um eine Aminosäure der Grund für die beobachtete Rezeptor/GProteinPromiskuität ist, wurden verschiedene V2Rezeptormutanten erzeugt, in denen einzelne Aminosäuren unmittelbar N und Cterminal von Met145 deletiert worden waren. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß die Deletion einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 (Ile141delta, Cys142delta, Arg143delta oder Pro144delta) in V2Rezeptormutanten resultierte, die nicht mit GProteinen interagieren konnten. RadioligandBindungsstudien zeigten, daß diese V2Rezeptormutanten keine V2Liganden binden konnten, was darauf schließen läßt, daß Deletionen einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 zu mißgefalteten Rezeptoren führen. Die Aminosäuren Ile141Pro144 befinden sich am Beginn der i2Schleife, unmittelbar neben der alphahelikalen zytoplasmatischen Verlängerung der dritten Transmembrandomäne (TM III) in der Nähe des hochkonservierten DRY(H)Motivs. Es ist denkbar, daß Aminosäuren innerhalb des Ile141Pro144Segments mit den zytoplasmatischen Abschnitten von TM III und/oder TM V interagieren und diese Wechselwirkungen die Rezeptorstruktur stabilisieren. Im Gegensatz dazu hatten Deletionen unmittelbar C terminal von Met145 (Leu146delta, Ala147delta, Tyr148delta oder Arg149delta) keinerlei Auswirkungen auf die Funktion des V2Rezeptors. Diese Aminosäuren befinden sich im zentralen Bereich der i2Schleife, der nicht mit den transmembranären Domänen des Rezeptorproteins interagieren kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Apolipoproteine des Liquors untersucht, um bestehende Zusammenhänge nachzuweisen, die eventuell später bei der Diagnose von Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das ApoE aller Proben wurde phänotypisiert. Die Konzentrationen des ApoJ und Apo(a) wurden mit Hilfe selbst- bzw. in der Arbeitsgruppe entwickelter ELISAs bestimmt. Durch Kombination der existierenden ELISAs konnte der von Borghini et al. 1995 beschriebene LpE-Partikel und ein bisher nicht bekannter Apolipoprotein-Partikel aus Apo(a) und ApoE nachgewiesen werden. Die relative Konzentration dieses Apo(a)/E- und des ApoJ/E-Partikels wurde bestimmt. Mit Hilfe der Kreuzimmunelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die Apolipoproteine Bestandteil eines Partikels sind. Aufgrund der gefundenen Informationen wurde die These postuliert, daß es sich bei diesen Partikeln um einen gemeinsamen Partikel aus ApoE, ApoJ und Apo(a) handelt. Detaillierte Daten über den Aufbau und die Zusammensetzung des Partikels konnten bisher nicht gewonnen werden. Im Liquor wurden die Konzentrationen von ApoE, Apo(a) und ApoJ gemessen. Diese Konzentrationen wurden in Zusammenhang zu dem ApoE-Phänotyp der entsprechenden Probe gesetzt. Wo möglich wurde ApoE und Apo(a) auch im Serum der entsprechenden Patienten bestimmt. Auch diese Konzentrationen wurden in Beziehung zu ihrem ApoE-Phänotyp gesetzt. Zuletzt wurden für die Apolipoproteine E und (a) die Liquor- und Serumkonzentration in Beziehung zueinander gesetzt. Außer für das ApoE und den ApoJ/E-Partikel konnte für keines der untersuchten Apolipoproteine weder im Liquor noch im Serum ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration des Apolipoproteins und dem ApoE-Phänotyp gefunden werden. Zusätzlich zu den Apolipoproteinen des Liquors wurde in Zusammenarbeit mit der Universität Dresden das Tau-Protein gemessen. Die Ergebnisse bestätigen die diagnostische Wertigkeit der Bestimmung von Protein Tau bei degenerativen Erkrankungen des ZNS. Eine Differenzierung zwischen verschiedenen degenerativen Erkrankungen des ZNS ist jedoch nicht möglich. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersuchte die Rolle des ApoE im Gehirn. Dabei zeigte sich, daß die Synthese des ApoE durch die Astrozyten ein sehr komplexer Vorgang sein muß. Eine weitere Untersuchung des ApoE wies die stärkere Glykolisierung im Liquor im Vergleich zum Serum nach.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Die vorliegende Arbeit gliederte sich in 3 Teilbereiche. Der erste Teilbereich beschäftigte sich mit der antiviralen in vitro Wirkung von EDDS (Ethylendiamindinbernsteinsäure), sowie mit der Wirkung von EDDS, DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) und DFO (Desferrioxamin) im Tiermodell. EDDS zeigte in vitro eine vielversprechende Wirkung gegenüber verschiedenen HCMV Stämmen. Hierunter befanden sich GCV und HPMPCresistente Stämme. Dies ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, da die Therapie von HCMVbedingten Erkrankungen mit hohen Nebenwirkungen verbunden ist und zudem durch vermehrtes Auftreten von Resistenzen gegenüber den etablierten Therapeutika GCV, HPMPC und Foscarnet erschwert wird. Die invitroDaten legen einen ähnlichen antiviralen Wirkmechanismus des EDDS verglichen mit DTPA nahe. Diese Ähnlichkeit wird durch die enge strukturelle Verwandschaft der Stoffe noch unterstrichen. Im Mausmodell zeigte jedoch keiner der 3 untersuchten Chelatoren eine erfolgversprechende protektive Wirkung gegenüber MCMVInfektionen. Damit wurden vorangegangene Untersuchungen im Rattenmodell bestätigt. Trotz vielversprechender anderslautender Ergebnisse, die auf eine invivoWirkung von DFO gegenüber CMVInfektionen hinwiesen, scheint damit der Einsatz der Chelatoren aufgrund ihrer sehr kurzen Halbwertszeit im Körper stark limitiert. Der zweite Teil der Dissertation befaßt sich mit der Entwicklung und Untersuchung von peptidischen Wirkstoffträgersystemen für DTPA. Hierbei ließen sich reproduzierbar lösliche HSADTPA und GelBDTPAKonjugate, sowie HSADTPA und GelBDTPANP herstellen. Die antivirale und die antitumorale Wirkung dieser Konjugate wurde in vitro untersucht. Da für die antitumorale Wirkung von DTPA bisher keine Daten vorlagen, wurde zunächst die Cytotoxizität in einer NBZellinie und in 3 BrustkrebsZellinien bestimmt. Als Vergleich dienten HFF. Es zeigte sich, daß DTPA in unterschiedlichen Konzentrationen gegenüber den untersuchten Zellinien cytotoxisch war, eine Tumorspezifität konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die Cytotoxizität und die antivirale Wirkung des DTPA wurden in vitro durch Bindung an die unterschiedlichen peptidischen Trägersysteme deutlich erhöht. Dies führte jedoch nicht zu einer Erhöhung der therapeutischen Breite, da HFF in gleichem Maße stärker geschädigt wurden. Trotzdem bieten die Trägersystem Zubereitungen im Hinblick auf eine invivoAnwendung einige Vorteile. Es könnten geringere Mengen DTPA eingesetzt werden, was eine verringerte Ausschwemmung von Metallionen zur Folge hätte. Neben einer verlängerten Zirkulationszeit im Organismus könnte die veränderte Körperverteilung zu Verbesserungen führen. Im Falle der antitumoralen Anwendung wäre dies eine Anreicherung im Tumor aufgrund des EPREffektes. Für die antivirale Anwendung wären die Anreicherung in entzündeten Geweben, sowie die Anreicherung in Monozyten und Makrophagen von großem Interesse, da diesen Zellen ein entscheidender Anteil an dem durch CMV verursachten Multiorganbefall zugerechnet wird. Trotzdem bedarf der invivoEinsatz einer eingehenden Evaluierung und erscheint aufgrund der geringen therapeutische Breite insbesondere im Hinblick auf die Therapie von Tumoren stark eingeschränkt. Bezüglich des cytotoxischen Mechanismus weist die Wirkung der DTPAKonjugate darauf hin, daß DTPA den Zellzyklus und die Virusreplikation durch Wechselwirkung mit der Zellmembran und dadurch Veränderung der Signaltransduktion beeinflußt. Da eine geringere DTPAMenge größere Effekte verursacht, erscheint es unwahrscheinlich, daß die Komplexierung von Metallionen für die Wirkungen verantwortlich war. Im dritten Teil dieser Dissertation wurde eine PLANPTrägersystem für das antitumoral wirksame Enzym BSRNase entwickelt. BSRNase zeigte in vitro und bei intratumoraler Applikation sehr vielversprechende, selektive antitumorale Effekte gegenüber proliferierenden und ruhenden Tumorzellen. Die systemische Applikation war jedoch nicht erfolgreich. Dieses Scheitern wurde auf hohe Antigenität, kurze Halbwertszeit der Substanz im Körper und auf eine ungenügende Körperverteilung zurückgeführt. NP sind geeignet die Zirkulation im Körper zu verlängern und reichern sich in Tumoren aufgrund des EPREffektes an. PLANP wurden ausgewählt, da sie BSRNase in ausreichendem Maß binden und da PLA ein bioabbaubares und bioverträgliches Material ist. In vitro unterschied sich die nanopartikuläre Zubereitung bei der Wirkung gegenüber normalen, Lymphom und Leukämiezellen nicht. Beide BSRNaseZubereitungen induzierten Apoptose in parentalen und chemoresistenten Krebszellen. Normale Zellen wurden nicht in ihrer Viabilität beeinträchtigt. Die aspermatogenen und antiembryonalen Wirkungen von BSRNaseZubereitungen weisen auf ihre antitumoralen Eigenschaften hin. In diesen beiden Testsystemen übertraf die nanopartikuläre Zubereitung die Wirkung der BSRNaseLösung. InvivoVersuche müssen nun den tatsächlichen Stellenwert der BSRNasePLANP zeigen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Porcinen Endogenen Retroviren (PERV) erstmals ausführlich biochemisch und biologisch charakterisiert sowie ihr Wirtsspektrum und ihre Expression in vitro näher analysiert. Es wurden sensitive immunologische Nachweismethoden entwickelt, die in experimentellen, präklinischen und ersten klinischen Studien zur Xenotransplantation angewandt wurden. Die Charakterisierung der Viren ergab, daß es sich um TypCRetroviren handelt, wobei ein Teil der Partikel nicht gereift ist. In hoch gereinigten Viruspräparationen aus Überständen produzierender porciner und PERVinfizierter, humaner Zellen konnten alle Strukturproteine identifiziert werden. Dazu wurden neben Elektrophoresen Western BlotAnalysen eingesetzt, wobei kreuzreaktive Antiseren gegen verwandte Viren und neu entwickelte, erstmals gegen PERVProteine gerichtete Antiseren benutzt wurden. Bei der Untersuchung der biologischen Eigenschaften wurde gezeigt, daß PERV in vitro ein mit anderen Retroviren vergleichbares immunsuppressives Potential besitzt. Mit diesen neuen Antiseren und den hoch gereinigten Viruspräparationen wurden sehr sensitive Western BlotVerfahren sowie ELISAs auf der Basis synthetischer Peptide als Nachweissysteme etabliert und validiert. Zuerst wurden Seren gesunder Blutspender mit diesen Tests untersucht. Dann wurden Seren von Schlachtern und von Patienten nach Xenotransplantationen getestet. Erstmals wurden auch Seren von Pavianen, denen u.a. auch ganze Schweineorganen transplantiert wurden und die eine profunde, für zukünftige Anwendungen typische, pharmakologische Immunsuppression erhielten, auf Antikörper gegen PERV untersucht. Bei Seren einiger Patienten und gesunder Blutspendern wurden zwar Kreuzreaktionen mit viralen Proteinen gefunden, es lagen aber keinerlei Anzeichen für eine PERVInfektion vor. Um das Wirtspektrum von PERV zu analysieren, wurden Zellinien und erstmals auch primäre Zellen verschiedener Spezies einschließlich Ratte und Maus mit PERV inokuliert. Dabei wurden erstmals Hinweise auf die Suszeptibilität von humanen Blutzellen erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mitogenstimulierte porcine PBMC PERV freisetzen können, wobei alle drei Subtypen der Hüllproteine nachgewiesen wurden. Eine nähere Analyse ergab daß verschiedene Schweinerassen aber auch einzelne Individuen der gleichen Rasse unterschiedliche Mengen an Virus freisetzen. Unter bestimmten Stimulationsbedingungen wurde PERV von adhärenten Zellen produziert, die nicht näher charakterisiert werden konnten. Eine endgültige Beurteilung des Infektionsrisikos bei Xenotransplantationen ist nach Abschluß dieser Studie noch nicht möglich. Mit der Charakterisierung von PERV und den immunologischen Nachweismethoden wurden die Voraussetzung für die Analyse weiterer experimenteller und klinischer Xenotransplantationen gelegt.
Short tandem repeat (STR) Loci sind ideale Marker für gerichtliche und abstammungs genetische DNAUntersuchungen. Sie bestehen aus sich wiederholenden 26 bp langen Einheiten und sind über das gesamte menschliche Genom verteilt. Aufgrund ihrer geringen Allellängen (100600 bp) lassen sich STRs leicht mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizieren. In der vorliegenden Arbeit sind fünf STRPolymorphismen der Loci D11S488, D18S51, D19S246, HUMFIBRA (FGA) und HUMVWFA31/A auf ihre Populationsgenetik und Sequenzstruktur hin untersucht worden. Die Daten wurden anhand genomischer DNA von 100 gesunden, unverwandten kaukasischen Blutspendern aus der Region Hessen gewonnen. Über ein 6 %iges denaturierendes Polyacrylamidgel wurden die PCRProdukte aufgetrennt und unter Gebrauch fluoreszenzmarkierter Primer mit einem 373A DNASequenzer analysiert. Der Locus D11S488 ist durch eine zusammengesetzte Repeatregion (compound repeat) von AAAG und GAAG Blöcken gekennzeichnet. Mit einer Variationsmöglichkeit an vier unter schiedlichen Positionen kam es zum Auftreten von Mikroheterogenitäten in Allelen gleicher Länge. 29 verschiedene Allele wurden gefunden, die basierend auf ihrer Gesamtrepeatanzahl (YAAG) 2641 (242 bp302 bp), in 15 Allelklassen gruppiert wurden. Bei D19S246 (TGTA und TCTA) liegt ebenfalls ein compound repeat vor. Mikroheterogenitäten führten in 11 Allelgruppen (182230 bp) zu 17 unterschiedlichen Allelen. Der Locus D18S51 (AGAA) ist ein STRPolymorphismus mit einer einfachen Repeatstruktur (simple repeat). 12 unter schiedliche Allele wurden beobachtet, die alle einen regelmäßigen Tetranukleotidrepeat aufwiesen. Die Allelspanne reichte von Allel 11 mit 278 bp bis Allel 22 mit 322 bp. Ebenfalls ein einfacher Repeat bestimmt das HUMFIBRA System (TCTT). Eines der beobachteten 10 Allele differierte allerdings um nur 2 bp. Zusammen mit dem compound repeat HUMVWFA31/A (8 Allele) sind alle untersuchten Marker multiplexfähig. Ein ausgeprägter Polymorphismus der individuellen Loci, die dem HardyWeinberg Equilibrium folgen, sowie eine Übereinstimmungswahrscheinlichkeit (pM) der Merkmale zwischen unverwandten Personen von 3 x 10 7 machen eine Analyse dieser fünf TetranukleotidMarker zu einer sinnvollen Ergänzung in der Bearbeitung abstammungs genetischer Fragestellungen.
Die doppelblinde Pilotstudie ''Wirksamkeit und Verträglichkeit einer Enzym oder Vitamin ATherapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf/Halsbereich" wurde in Zusammenarbeit mit der HNOKlinik in dem Zeitraum von Oktober 1994 bis Juni 1996 mit 25 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen und 15 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Den Patienten wurde neben der konventionellen Therapie entweder VitaminA (Retinolpalmitat, 150,000 IE/d), die Enzympräparation (proteolytische Gesamtaktivität 20,880 F.I.P.E/d) oder Placebo zugeteilt. In regelmäßigen Abständen wurde das Allgemeinbefinden/ Nebenwirkungen protokolliert, Blutbild und Leberwerte bestimmt, die peripheren Lymphozyten phänotypisiert und die NK LAK, bzw. LAKZellAktivität gemessen. Zur Auswertung gelangten 16 Patienten. Statistisch signifikant war eine Erhöhung der CD2 und CD3Werte der EnzymGruppe (41 Messungen) gegenüber den Patienten der Gruppen VitaminA (18 Messungen), Placebo (12 Messungen) und den Ausgangswerten der Patienten (25 Messungen). Auch im Verlauf konnte die Erhöhung der CD3Werte bei der Enzymgruppe gegenüber den anderen Patientengruppen bestätigt werden. Der Anteil der TZellen im peripheren Blut lag im Bereich der gesunden Kontrollen. Um die Wirkungen der Prüfmedikationen auf Leukozyten (PBL, PMNL, Monozyten) in vitro zu untersuchen, wurde ein Panel durchflußzytometrischer Tests entwickelt, bzw. etabliert, die die Messung der Funktionen NKZellaktivität, LAKAktivität, ADCC, Phagozytose und Sauerstoffradikalbildung ermöglichten bzw. vereinfachten. Die untersuchte Enzympräparation enthielt Papain, Trypsin und Chymotrypsin im Verhältnis 2,5:1:1. In vitroVersuche ergaben eine dosisabhängige Stimulierung der NK, NKLAK, CTL bzw. LAKAktivität und der ADCC durch NKZellen durch die Enzympräparation. Es war möglich, die Lymphozyten mehrfach zu stimulieren, eine Enzymdauergabe, bzw. hohe Enzymdosen führten zu einem Aktivitätsrückgang. Die Enzymmischung verbesserte die Phagozytose und den oxidativen Burst bei PMNL und erhöhte die CD18 und CD54 bzw. erniedrigte die CD16Expression auf PMNL. Mit alltransRetinsäure bzw. Retinol konnten die Lymphozytenaktivitäten in vitro mit den gewählten Versuchsbedingungen kaum beeinflußt werden, Änderungen konnten meist 48h bis 72h nach Zugabe beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Beobachtungen zu VitaminAWirkungen auf PMNL waren nicht möglich, da diese nur maximal 24h kultiviert werden konnten.
Einen vielversprechenden Ansatz auf dem Gebiet der Entwicklung kolloidaler Arzneiträgersysteme stellen die proteinbasierten Nanopartikel dar, da sie biodegradierbar und nicht toxisch sind und eine Reihe möglicher Angriffspunkte zur kovalenten Bindung von Arzneistoffen und zur Oberflächenmodifikation aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Herstellungsprozeß von HSANanopartikeln und sein Einfluß auf die physikochemischen Eigenschaften des resultierenden Partikelsystems evaluiert. Durch Oberflächenmodifikation wurde eine Kopplung von Proteinen mittels bifunktionaler Crosslinker ermöglicht und die zelladhäsiven Eigenschaften des Trägersystems vermindert. Durch Kopplung funktioneller Proteine wurden die ersten Schritte in Richtung eines ligandenvermittelten DrugTargetings unternommen. Evaluierung des Herstellungsprozesses und Charakterisierung des resultierenden partikulären Systems Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses von HSANanopartikeln ergab eine Abhängigkeit der Partikelgröße und der Partikelanzahl vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Die Quervernetzung des resultierenden Systems beeinflußte die Anzahl der freien Aminogruppen an der Partikeloberfläche: Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto weniger Aminogruppen waren nachweisbar. Die Härtung der Partikel durch Einwirkung hoher Temperaturen führte ebenfalls zu stabilen Partikeln. Die Anzahl der verfügbaren Aminogruppen lag im Vergleich zu den Glutaraldeydquervernetzten höher. Die Art und das Ausmaß der Quervernetzung hatten keinerlei Einfluß auf die mittlere Partikelgröße. Das Zetapotential dagegen zeigte eine Tendenz, mit steigender Quervernetzung negativer zu werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Aminogruppen an der Oberfläche von GelatineA und BNanopartikeln verdeutlichte, daß HSANanopartikel signifikant mehr freie Aminogruppen an der Partikeloberfläche, und damit mehr Angriffspunkte zur kovalenten Kopplung und Oberflächenmodifikation aufweisen, als GelatineNanopartikel, wobei Gelatine ANanopartikel mehr als doppelt so viele Aminogruppen an der Oberfläche besitzen als Gelatine BPartikel. Die höchsten Aminogruppenzahlen zeigten die hitzedenaturierten HSANanopartikel. Einführung von Sulfhydrylgruppen an die Partikeloberfläche Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs Methoden zur Einführung von Thiolgruppen auf die Oberfläche von HSANanopartikeln evaluiert. Die effektivste Methode ergab sich aus der Kopplung von Cystamin mit dem Kopplungsreagenz EDC, gefolgt von einer reduktiven Spaltung der Cystamindisulfidbindungen und der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Bedauerlicherweise zeigte diese Partikelpräparation die höchste Toxizität der untersuchten Zubereitungen in der Zellkultur. Die Kopplung von LCystein mit EDC war aufgrund unerwünschter Nebenreaktionen wesentlich weniger effektiv. Die einfachste Art, Thiolgruppen einzuführen, war die reduktive Spaltung der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Doch Bindungsexperimente zeigten, daß diese Thiolgruppen zwar mit Ellmans Reagenz nachweisbar waren, aber zu Bindungszwecken wahrscheinlich aus sterischen Gründen nur in untergeordnetem Maße zur Verfügung standen. Die Verwendung von 2Iminothiolan (Trauts Reagenz) war eine im Vergleich zur Cystamin/EDCMethode einfache und leicht zu handhabende Methode zur Einführung von SHGruppen, allerdings mit relativ geringer Effizienz. Das Quenchen freier Glutaraldehydreste an der Partikeloberfläche mit Cystamin führte zu einem sehr niedrigen SHGruppengehalt, mit LCystein waren so gut wie keine Thiolgruppen nach der Umsetzung nachweisbar. Die SHGruppen wurden bei einer Lagerung bei 4°C mit einer Halbwertszeit von 28,2 Tagen abgebaut, unabhängig von der Art der SHGruppeneinführung. Die Reaktivität der SHGruppen dagegen nahm wesentlich schneller ab als ihre Nachweisbarkeit: Bereits am dritten Tag nach der SHGruppeneinführung lag die Bindungsrate von mit SHreaktiven Crosslinkern aktivierten Proteinen um 2030 % niedriger, verglichen mit dem ersten Tag. Durch Veränderung der Reaktionsparameter konnte bei allen Methoden die Anzahl der eingeführten Thiolgruppen kontrolliert werden. Durch die Einführung der SHGruppen zeigten die Nanopartikel eine deutlich höhere Mukoadhäsion. Oberflächenmodifikationen Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSANanopartikel war zum einen eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Arzneistoffe wie DNA über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der Partikel mit EDC allein oder mit EDC und Cystamin bzw. Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials in den positiven Bereich. Durch Veränderung der Cholamin bzw. Cystaminkonzentration war die Verschiebung des Zetapotentials steuerbar. Gleiches galt für die Umsetzung der Gelatine APartikel, allerdings waren hier deutlich geringere Konzentrationen zur Erlangung der gleichen positiven Zetapotentiale notwendig. Zum anderen sollte durch die Modifikation der Partikeloberfläche ein verändertes Verhalten hinsichtlich der Zelladhäsion der Partikel erzielt werden. Es zeigte sich eine verstärkte Zelladhäsion nach der Einführung weiterer Aminogruppen und nach der Einführung lipophiler Gruppen. Eine verminderte Zelladhäsion wurde durch eine Maskierung der Aminogruppen erreicht. Die besten Ergebnisse erbrachte hierbei die Umsetzung der HSANanopartikel mit Jodessigsäure. Bindung funktioneller Proteine Um zu überprüfen, ob funktionelle Proteine an das evaluierte Trägersystem unter Erhalt der Funktionalität gebunden werden können, wurden zunächst Enzyme über den bifunktionalen Crosslinker SulfoMBS kovalent gekoppelt. Analysen der Bindungsrate und der tatsächlichen enzymatischen Aktivität differierten zwar, doch ist dies wohl auf eine noch nicht hinreichend optimierte Analytik zurückzuführen. Eine enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase und der bGalaktosidase war nach der Bindung an das Trägersystem eindeutig nachweisbar. Als weiteres funktionelles Protein wurde das Avidinderivat NeutrAvidin(TM) gewählt und mit SulfoMBS an Gelatine ANanopartikel gekoppelt. Durch die Bindung biotinylierter Antikörper konnte der Erhalt der Funktionalität des gebunden NeutrAvidins(TM) gezeigt werden. Die Konjugation eines biotinylierten, humanen CD3 Antikörpers an das NeutrAvidin(TM)konjugierte Partikelsystem führte zu einer selektiven Bindung des Trägersystems an primäre humane Lymphozyten. Auch eine Aufnahme des Trägersystems in die Zellen konnte gezeigt werden. Die Experimente zum Antikörpervermittelten Targeting konnten mit HSANanopartikeln nicht reproduziert werden, da HSAPartikel eine so starke Zelladhäsion zeigten, daß ein Targeting aufgrund des Antikörpers nicht mehr ersichtlich war. Erste Versuche mit oberflächenmodifizierten HSAPräparationen, wie beispielsweise einer Jodessigsäure Umsetzung, führten zu einer deutlich verminderten Zelladhäsion. Weitergehende Experimente zur Evaluierung dieses Effektes sind für die Weiterentwicklung dieses Trägersystems entscheidend.
Bedingt durch den demographischen Wandel in der Bevölkerung erlangen gerontologische Themen immer zentralere Bedeutung. Die Thematik des Dekubitus in der häuslichen Pflege ist durch ihren Bevölkerungsbezug und die Multidisziplinarität der Problemstellung dabei ein wichtiges Praxisfeld. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in drei Teile: 1. Zur Anleitung häuslich Pflegender ist ein Ratgeber für pflegende Angehörige entstanden und wird im Schlüter Verlag, Hannover veröffentlicht. 2. Durch die Befragung möglichst repräsentativer Stichproben von niedergelassenen Allgemeinärzten und praktischen Ärzten werden Maßnahmen zu Prävention, Diagnostik und Therapie des Dekubitus in der allgemeinärztlichen Versorgung erfaßt. Alle vertragsärztlich tätigen Allgemeinmediziner und Praktischen Ärzte der Modellregion Stadt und Landkreis Offenbach (mittelgroße Stadt in Hessen, die die hessische Grundgesamtheit widerspiegelt) werden 1993 (N=165) (Dissertation Silke Nowack) und 1998 (N=196) in ein schriftliches postalisches Interview mit 21 überwiegend offenen Fragen in 2 Wellen einbezogen. Die Antworterquote von jeweils 35% (n=58/69) ist im Vergleich zu anderen Studien in dieser schwierigen Befragtengruppe zufriedenstellend, aber vermutlich zugunsten der am Thema Interessierten verzerrt. Der Vergleich der Datenprofile 1993 und 1998 läßt auf eine weitgehend gleiche Antwortergruppe schließen. Die Ergebnisse können allerdings nur zu Tendenzaussagen herangezogen werden. Von den Allgemeinmedizinern und praktischen Ärzten werden 1993 und 1998 durchschnittlich 4 bis 5 Patienten mit Dekubitus jeweils in Alten und Pflegeheimen und zu Hause betreut (Median = 3). Der Altersgipfel der Patienten liegt bei 71 bis über 80 Jahren. Als Grunderkrankung spielen allgemeine Schwäche und Kachexie sowie der cerebrale Insult, als Begleiterkrankung der Diabetes mellitus die führende Rolle. Während 1993 in erster Linie Felle als Antidekubitushilfsmittel genannt werden, treten diese in der Befragung 1998 in den Hintergrund. Antidekubitusmatratzen werden 1998 am häufigsten genannt (1993: 29 von 58 Ärzten; 1998: 42 von 69 Ärzten, Unterschiede nicht signifikant). Zur Prävention und Behandlung von Druckgeschwüren gibt es zahlreiche Literatur. Ein durchgehend positiver Effekt von Publikationen, Fortbildungen oder den beiden deutschsprachigen Leitlinien auf die tatsächliche Versorgung von Patienten mit Dekubitus im allgemeinärztlichen Bereich im Vergleich von 1993 zu 1998 wird in den vorliegenden Daten allerdings nicht sichtbar. So ist z.B. die Auswahl der von den Hausärzten eingesetzten Lokaltherapeutika und lokalen Maßnahmen polypragmatisch, manchmal konfus und aktionistisch und nicht an den wenigen vorhandenen, in ihrem Nutzen belegten Konzepten orientiert. Im Verordnungsbereich der Dermatika ist ein großes Einsparpotential vorhanden, das zugunsten moderner feuchter Wundverbände zu mobilisieren wäre, wie das Verordnungsverhalten der Vertragsärzte zeigt. Von 1992 zu 1997 weisen die Daten des GKVArzneimittelindex zwar einen Rücklauf der Verordnung von Lokalantibiotika auf, er spiegelt sich aber nicht im Antwortverhalten der hier Befragten wider. Zu beobachten ist weiterhin ein deutlicher Anstieg von allgemeinärztlichen Nennungen bei diagnostischen Maßnahmen im Jahre 1998, von denen einige keinen Stellenwert im Umgang mit Dekubituspatienten haben. 3. Von Mai bis August 1998 werden offene, themenzentrierte, leitfadengestützte, mündliche Interviews mit durch Zufallsstichprobe ermittelten 10 pflegenden Angehörigen (9 Frauen, 1 Mann) von Dekubituspatienten aus Stadt und Landkreis Darmstadt geführt und anhand von Tonbandprotokollen in einem Mehrstufenverfahren ausgewertet. Die Interviews finden im häuslichen Umfeld der pflegenden Angehörigen, in Abwesenheit der Patienten, statt. Die Befragung der pflegenden Angehörigen ergibt als durchschnittliches Lebensalter der Pflegebedürftigen 75 Jahre (Median 79 Jahre), Pflegebedürftigkeit besteht seit durchschnittlich 6 Jahren (Median 3,5 Jahre). Die Dauer der Dekubituserkrankung beträgt durchschnittlich 3 Jahre (Median 2 Jahre). Auch in dieser Befragtengruppe unterstreichen polypragmatische und obsolete Behandlungsmethoden die Forderung nach klaren und einheitlichen Konzepten in der Dekubitusprävention und --therapie. Die Pflegenden sind in der Mehrzahl Töchter/Schwiegertöchter. Soziale und emotionale Belastungssituationen werden thematisiert. Aggressive Verhaltensweisen legen 8 von 10 Befragten dar. Selbsthilfegruppen, Gesprächskreise für pflegende Angehörige oder psychologische Betreuung werden von den pflegenden Angehörigen nicht als Entlastungsmöglichkeit geschätzt und genutzt. Gründe für das Pflegeengagement sind gesellschaftliche Normierung, rollenimmanentes Verhalten, der Generationenvertrag sowie der Gedanke, das Leben des Betroffenen durch die häusliche Pflege erleichtern und verlängern zu können. Mit Einführung der Pflegeversicherung wurde die finanzielle Unterstützung häuslich Pflegender verbessert, die Pflegekompetenz bleibt allerdings weiterhin bei allen befragten Angehörigen autodidaktisch erworben. Häusliche Krankenpflegekurse der Krankenkassen werden nicht besucht, so daß von Seiten der Pflegeversicherung eine Attraktivitätssteigerung der Kurse oder eine eventuelle Einführung einer Teilnahmepflicht wünschenswert ist. Zur systematischen Verhütung und Behandlung eines Dekubitus im hausärztlichen Bereich ist die Entwicklung und Verbreitung einer Leitlinie, entsprechend der amerikanischen Guideline der Agency for Health Care Policy and Research anzustreben. Dem Hausarzt als zentraler Koordinationsstelle zwischen Patient und Pflegenden obliegt ferner die Aufgabe auch auf die Gesundheit der Pflegeperson zu achten, um Überlastungssituationen rechtzeitig diagnostizieren und therapieren zu können.
Osteoarthrose ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die in einem schleichenden Prozeß zur Zerstörung des Knorpels in den gewichttragenden Gelenken insbesondere der Hüfte und des Knies führt. Chronische Behinderungen sind die Folge. Die hohe Prävalenz in der vorwiegend älteren Bevölkerung hat zur Bezeichnung als Volkskrankheit geführt. Die genauen Ursachen der Osteoarthrose sind weitgehend unbekannt, jedoch wird davon ausgegangen, daß eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen anabolen und katabolen Prozessen, die am normalen Knorpelmetabolismus beteiligt sind, zugunsten des Katabolismus stattfindet. Ein Charakteristikum der Krankheit ist die verstärkte Degradation des Proteoglykans Aggrekan, einem der Hauptbestandteile der Knorpelmatrix. Dafür verantwortlich ist besonders im frühen Krankheitsstadium die Enzymaktivität ''Aggrekanase", in späteren Phasen sind auch verschiedene MatrixMetalloproteasen (MMPs) beteiligt. Die Enzymaktivität Aggrekanase blieb lange Zeit unentdeckt und wurde unter den Mitgliedern der MMPFamilie vermutet. Jedoch weisen MMPs und Aggrekanase eine unterschiedliche Spezifität für Aggrekan auf, da MMPs die interglobuläre Domäne des Aggrekans bevorzugt zwischen N 341 und F 342 spalten (MMPSchnittstelle), Aggrekanase dagegen nur zwischen E 373 und A 374 (Aggrekanase Schnittstelle). Daß es sich bei MMPs und Aggrekanase um distinkte Aktivitäten handelt, zeigt die jüngste Klonierung zweier Aggrekanasen, die der Familie der ADAMTSProteasen angehören. Trotz der Identifikation dieser zwei Aggrekanasen, die über eine Metalloprotease, Disintegrin und ThrombospondinDomäne verfügen, sind viele EnzymCharakteristika noch ungeklärt, und auch die Frage, welches dieser beiden Enzyme oder welches noch unentdeckte Enzym in der Pathophysiologie der Osteoarthrose die bedeutendste Rolle spielt, ist noch offen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung der noch weitgehend ungeklärten Substratspezifität der Aggrekanase. Besonderes Interesse bestand in der Frage, welche minimalen Anforderungen ein Substrat erfüllen muß, um von Aggrekanase als solches akzeptiert zu werden, da Hinweise existieren, daß kurze Peptide, die die Schnittstelle in nativem Aggrekan repräsentieren, nicht als AggrekanaseSubstrat erkannt und gespalten werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß tatsächlich Sequenzbereiche des Aggrekans distal zur AggrekanaseSchnittstelle für eine effiziente Spaltung durch Aggrekanase notwendig sind. Durch Mutations und Deletionsstudien mit einem funktionalen rekombinanten Substrat, das die gesamte interglobuläre Domäne des Aggrekans mit der AggrekanaseSchnittstelle beinhaltet, wird gezeigt, daß die Substratregion der MMPSchnittstelle, insbesondere deren N terminale Hälfte, wichtig ist für eine effiziente Spaltung an der AggrekanaseSchnittstelle 32 Aminosäuren weiter Cterminal. Dieses Ergebnis weist auf die Möglichkeit hin, Aggrekanase trete über eine zweite, von der eigentlichen Schnittstelle distinkten Interaktionsstelle mit dem Substrat in Wechselwirkung. Diese Substratspezifität ist in verschiedenen zellulären und nicht zellulären sowie rekombinanten AggrekanaseSystemen reproduzierbar und somit für Aggrekanase charakteristisch. Die membrangebundene MMP14, die unter bestimmten Bedingungen in der Lage ist, eine Proteolyse der AggrekanaseSchnittstelle zu erzeugen, teilt diese Eigenschaft nicht und ist deshalb als Kandidat für die pathologische Aggrekanase Aktivität unwahrscheinlich. Desweiteren wurde die Rolle der Substratglykosylierung für die Degradation durch Aggrekanase untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß die N und OGlykosylierungen des rekombinanten Substrats dessen Spaltung durch Aggrekanase negativ beeinflussen. Einen zusätzlichen Aspekt der AggrekanaseCharakterisierung stellt die Inhibition der Enzymaktivität durch das Mukopolysaccharid Heparin dar. Heparin bindet vermutlich an Enzymdomänen außerhalb der katalytischen Domäne und hemmt so die für eine effiziente Spaltung nötigen Interaktionen zwischen diesen Domänen und dem Substrat. Die Charakterisierung der Enzymaktivität Aggrekanase, die in dieser Arbeit beschrieben ist, führt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Aggrekan Degradation und kann zur Entwicklung neuer Ansätze zur Inhibition des Enzyms im Zuge der Osteoarthrosebekämpfung beitragen.
1. Die Membran des SR besitzt mehrere unterscheidbare Transportsysteme für organische und anorganische Anionen. Diese Transportsysteme lassen sich durch Anionenfluxmessungen mit der FilterassayMethode und durch Einzelkanalmessungen mit der Planarmembrantechnik charakterisieren. Der Vergleich der mit beiden Methoden ermittelten Daten ergibt, dass der 35 SO 4 2 Flux unter Standardbedingungen durch den als BCl (Big Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanal bewerkstelligt wird und eine Steigerung der Effluxrate im Vesikelfluxexperiment auf die zusätzliche Aktivierung des als SCl (Small Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanals zurückzuführen ist. 2. Neben Chlorid und Sulfat werden auch andere organische und anorganische Anionen wie Jodid, Pyrophosphat, Oxalat und Nukleotide transportiert. 3. Der stärkste Hemmstoff von 35 SO 4 2 und NukleotidTransport ist der PurinozeptorAntagonist Suramin mit einer I 50 von 0.91.16 µM. 4. Eine Stimulation des 35 SO 4 2 Transports kann durch die Kationen Calcium, Magnesium und Cholin erreicht werden. Ebenso wirken Hemmstoffe des RyR wie Ryanodin und Atractylosid stimulierend bzw. aktivierend. 5. 35 SO 4 2 Influx und Efflux werden durch Nukleotide unterschiedlich beeinflusst. Der Efflux wird in Abhängigkeit von Nukleotidbase, Anzahl der Phosphatreste und der Ladung gehemmt. Unter Magnesiumeinwirkung ist der Hemmeffekt verstärkt und auch das als nicht hydrolysierbar geltende ATP Analogon AMPPNP wirkt inhibierend. Der maximale 35 SO 4 2 Influx hingegen ist in Anwesenheit von ATP erhöht. Die ATPAnaloga AMPPNP und AMP PCP zeigen diesen stimulierenden Effekt nicht. 6. ATP und GTP werden in Anwesenheit von SRProtein schnell ab und umgebaut. Dieser Umbau lässt sich durch Magnesium und verschiedene Hemmstoffe des Anionenfluxes beeinflussen. 7. Der Eintransport von Nukleotiden in das Lumen des SR lässt sich durch Hemmstoffe des Anionenfluxes inhibieren. Die zusätzliche Hemmbarkeit durch Atractylosid, einen Inhibitor des mitochondrialen ATP/ADP Translokators (AAT), impliziert die Möglichkeit einer Beteiligung dieses Transportproteins am Nukleotidtransport. 8. Inhibitoren der Ca 2 ATPase hemmen auch den Anionenflux. Die Vermittlung des Anionentransports durch die Ca 2 ATPase selbst sowie die Hemmung des Ca 2 Eintransports aufgrund der Inhibition der Anionenkanäle sind ausgeschlossen. Vesikel mit rekonstituierter Ca 2 ATPase weisen keinen Anionen transport auf, obwohl der Ca 2 Eintransport durch Anionenkanalhemmstoffe wie Suramin, DIDS und PPANS inhibiert werden kann. 9. Beim Anionenflux eingesetzt zeigen Aktivatoren und Inhibitoren des Ca 2 ReleaseKanals gegenläufige Effekte. Der Ca 2 ReleaseKanal ist nicht der Vermittler des Anionentransports. Anionentransporter sind im RyRfreien longitudinalen SR ebenso häufig wie in den RyRreichen terminalen SR Zisternen.
g/d TLymphozyten stellen beim Menschen ca. 15% der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten. Die physiologische Funktion der g/d TZellpopulation ist ungeklärt. Auf grund ihrer Akkumulation in mukosalen Oberflächen scheinen sie eine Komponente der ''ersten Verteidigungslinie" zu bilden. Das d TZell Rezeptor (TCR) Repertoire gesunder Erwachsener ist oligoklonal, streng individuenspezifisch und zeitlich stabil. Zudem besteht eine charakteristische Kompartimentierung, d.h. im Intestinum liegt ein anderes d TCRRepertoire vor als im peripheren Blut. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das intestinale d TCRRepertoire einer entwicklungsabhängi gen Dynamik unterliegt. Hierzu wurde die Diversität der antigenbindenden (CDR3) Domäne intestinaler dKettentranskripte von Feten, Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen mittels denaturierender PAGE und DNASequenzierung molekular biologisch analysiert. Unsere Studien dokumentieren, daß im Verlauf der Reifung vom Fetus zum adulten Individuum gravierende Veränderungen stattfinden. Das fetale d TCRRepertoire ist stark eingeschränkt und zeichnet sich durch niedrige Komplexität der dKettentrans kripte aus was darauf beruht, daß innerhalb der CDR3Domänen kaum matrizen unabhängige ''N"Nukleotide existieren und zudem homologieabhängige Rekombina tionsereignisse stattfinden. Die Tatsache, daß verschiedene Feten teilweise identi sche dKettentranskripte exprimieren kann jedoch nicht allein auf obige Mechanis men zurückgeführt werden. Somit bleibt unklar, ob das fetale d TCRRepertoire vorprogrammiert ist oder Selektionsprozessen unterliegt. Im Gegensatz zu Feten ist das d TCRRepertoire Neugeborener polyklonal. Wie bei Erwachsenen weisen die CDR3Domänen ihrer dKettentranskripte zahlreiche ''N"Nukleotide auf. Da das d TCRRepertoire bereits im Alter von 14 17 Jahren starke Einschränkungen seiner Diversität zeigt und mit demjenigen siebzigjähriger Personen vergleichbar ist wird angenommen, daß die klonalen Expansionen eine Folge kontinuierlicher Selektions prozesse darstellen, die z.B. durch HSP verwandte Eigenantigene vermittelt werden. Vergleichbar dem Intestinaltrakt bildet auch die Haut eine bedeutende Grenzfläche des Organismus zu seiner Umgebung. Möglicherweise spielen kutane g/d TZellen ebenfalls eine Rolle im Rahmen einer ''ersten Verteidigungslinie". Wir wiesen anhand gesunder Erwachsener nach, daß das kutane d TCRRepertoire analog zum Intesti num oligoklonal ist und sich signifikant vom peripheren d TCRRepertoire unter scheidet. Da in multiplen Hautbiopsien identische dKettentranskripte gefunden wer den, sind dominante g/d TZellklone offenbar weiträumig in der Haut verteilt. Weiterhin wurde untersucht, ob spezifisch aktivierte g/d TLymphozyten an der Patho genese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt sind. Im Fall der ange nommenen antigenvermittelten Aktivierung müßten klonale Expansionen einzelner g/d TZellpopulationen zu charakteristischen Verschiebungen des d TCRRepertoires innerhalb entzündlich veränderter Darmareale führen. Vergleichende Analysen der läsionalen und nichtläsionalen Darmabschnitte von M.CrohnPatienten lassen jedoch keine krankheitsassoziierten Repertoireverschiebungen erkennen. Vielmehr weisen entzündliche und nichtentzündliche Areale nahezu identische d TCRRepertoires auf. Da dies auch im Fall der bakteriell verursachten Divertikulitis gilt, werden g/d TLym phozyten vermutlich generell indirekt oder über TCRunabhängige Mechanismen (z.B. Zytokine) aktiviert. Alternativ wird eine Erkennung streßinduzierbarer Eigenanti gene durch intestinale g/d TZellen diskutiert. Beide Vorgänge würden zu keiner Beeinflussung des d TCRRepertoires führen und in Einklang mit den nachgewiese nen Expansionen einzelner weniger Rezeptorspezifitäten stehen. Da vermutlich auch die BLymphozyten der intestinalen Lamina propria an der ''ers ten Verteidigungslinie" beteiligt sind nahmen wir an, daß die Ig H Transkripte IgA bzw. IgM exprimierender BZellen ebenfalls Einschränkungen ihres Rezeptor Repertoires aufweisen. Wir fanden, daß die kleinen V H 5, V H 6 und V H 7Familien intestinaler B Zellen oligoklonale Expansionen zeigen, während das Repertoire der dominierenden V H Familien deutlich diverser ausfällt. Durch Subklonierung lassen sich jedoch bei sämtlichen VH Familien klonal verwandte IgATranskripte in weit voneinander ent fernten Darmabschnitten identifizieren. Zudem stellen ~ 75% aller Basensubstitutio nen stille Mutationen dar oder führen zum Ersatz durch Aminosäuren vergleichbarer Eigenschaften, was auf einen starken Selektionsdruck schließen läßt. Da kaum Hin weise auf Isotypwechsel vorliegen, stellen intestinale IgM und IgAImmunozyten ver mutlich divergente Zellinien dar. Das V H Repertoire peripherer BZellen ist stark limitiert, wobei kaum Überlappungen mit intestinalen IgVH Repertoires bestehen. Aufgrund der partiellen Einschränkung des V H Repertoires ist anzunehmen, daß Teile der humoralen Immunabwehr konservierte Antigene erkennen, wobei es sich im Gegensatz zu TZellen wahrscheinlich nicht um Eigenantigene, sondern um Oberflächenstrukturen symbiontischer Mikroorganismen handelt. Unsere Resultate zeigen, daß die Begrenzung des Rezeptor Repertoires ein Charak teristikum von B und TLymphozyten darstellt. Übereinstimmend hiermit wurden von anderen Arbeitsgruppen klonale Expansionen auch bei a/b TZellen nachgewiesen. Vermutlich wird die Expansion einzelner Zellklone durch permanente Wechselwirkun gen mit ''Schlüsselantigenen" induziert, wobei es sich um invariante Fremdantigene oder konservierte Eigenantigene handeln dürfte.
Das TumorSuppressorGen wt1 (Wilms Tumor Gen) kodiert ein ZinkFinger DNA bindendes Protein mit vorwiegend Transkriptionshemmenden Eigenschaften. Da wt1 Expression auch in leukämischen Blasten von Patienten mit akuten Leukämien nachgewiesen werden konnte, war das Ziel der Arbeit, das Expressionsmuster von wt1 mRNA in Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) mittels der PolymeraseKettenreaktion (PCR) zu untersuchen. Dabei war die Expressionsstärke visuell in negativ (), schwach positiv ( ), mittelgradig positiv ( ) und stark positiv ( ) zu unterteilen. Die Ergebnisse, in ausgesuchten Fällen durch eine kompetitive PCR validiert, sollten mit FABKlassifikation, Karyotyp, OberflächenmarkerExpression, Alter, Geschlecht und klinischem Verlauf verglichen werden, um eine Aussage über die Bedeutung der wt1 Expression für Prognose, Verlaufskontrolle und das Erkennen von Minimal Residual Disease (MRD) zu treffen. Es wurden insgesamt mehr als 500 Proben von Patienten (mononukleäre Zellen (MC) aus Knochenmark (KM) und peripherem Blut (PB)) untersucht. Davon wurden insgesamt 129 Patienten bei Erstdiagnose und 32 Patienten bei 1. Rezidiv untersucht. Bei 77 Patienten konnte die wt1 Expression im Verlauf untersucht werden. wt1 mRNA fand sich bei 124 von 161 (77%) der Patienten bei Erstdiagnose und 1.Rezidiv. Die wt1 Expression war unabhängig vom Alter, vorhergehendem myelodysplastischem Syndrom (MDS), Geschlecht und FABSubtyp mit Ausnahme einer signifikant niedrigeren wt1 Expressionshäufigkeit in FAB M5 Leukämien von nur 40% (P=0,0025). Es fand sich keine Korrelation zwischen wt1 mRNA Expressionsstärke und den durch den Karyotyp definierten prognostischen Gruppen. Die Ansprechrate auf Therapie war zwar umso höher, je niedriger die wt1 Expression lag; es fand sich jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den ExpressionsGruppen. Patienten mit hoher wt1 mRNA Expression ( , ) zeigten eine deutlich schlechtere Gesamt Überlebenswahrscheinlichkeit (OS) als solche mit niedriger Expression (, ). Das 3Jahres OS für alle neu diagnostizierten AMLPatienten lag bei 13% bei starker und 38% bei schwacher wt1 Expression (P=0,038); bei Patienten mit de novo AML bei 12% und 43% (P=0,014). Der Unterschied war bei der Patientengruppe unter 60 Jahren noch stärker ausgeprägt. Im Verlauf ließ sich bei allen Patienten, die eine komplette Remission (CR) erreichten, keine wt1 Transkripte mehr nachweisen. Bei Rezidiv trat in den meisten Fällen erneut erhöhte wt1 Expression auf. In einigen Fällen ging dies dem klinischen Befund eines Rezidivs voraus. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß wt1 von der Mehrzahl der AMLPatienten exprimiert wird und mittels PCR nachgewiesen werden kann, ein von Karyotyp und Alter unabhängiger prognostischer Faktor ist und sich mit Einschränkung zur Verlaufskontrolle und Detektion von MRD anbietet.
Das Applikationssystem Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein innovatives System für die Applikation von Pharmaka während elektrophysiologischer Experimente entwickelt und getestet. Das AchtkanalApplikationssystem eignet sich hervorragend für Experimente an Hirnschnitten und kann durch folgende Eigenschaften charakterisiert werden: - Das System ist durch die Verwendung von DruckluftVentilen nahezu frei von elektromagnetischen Störfeldern. - Aufgrund der geringen Dimensionen der Applikationspipette (Spitzendurchmesser = 250 µM) können gezielt unterschiedliche Regionen einer Zellkultur oder eines Hirnschnittes beeinflusst werden. - Die geringen Dimensionen des Systems ermöglichen einen kostengünstigen Betrieb, da nur kleine Mengen an Pharmaka benötigt werden. - Das System schaltet exakt und zuverlässig. Alle 8 Kanäle schalten in guter Übereinstimmung, und zwischen den einzelnen Kanälen kann dank eines zentralen Spülkanals akkurat und sicher gewechselt werden. - Mit dem System können Substanzen auf zwei Arten appliziert werden. Es besteht zum einen die Möglichkeit der sogenannten SpitzenApplikation. Die SpitzenApplikation eignet sich besonders für Experimente an Zellkulturen, isolierten Zellen oder Membranstücken, und zeichnet sich bei dieser Art der Anwendung durch einen schnellen Konzentrationsaufbau (< 1 s) aus. Weiterhin können Substanzen mittels der sogenannten PulsApplikation appliziert werden. Die PulsApplikation bietet einerseits den Vorteil einer kontinuierlichen Applikation ohne Druckschwankungen, und ermöglicht andererseits die schnell aufeinanderfolgende Applikation mehrerer Substanzen. Demgemäß eignet sich die PulsApplikation hervorragend für Experimente an Hirnschnitten. Ionotrope GlutamatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war eine tiefergehende Beschreibung der ionotropen, nonNMDARezeptoren bei Neuronen der LSO des auditorischen Hirnstammes der Ratte. Im Vergleich hierzu wurden entsprechende Untersuchungen auch an MNTBNeuronen durchgeführt. Von besonderem Interesse war dabei der Nachweis funktioneller Kainat Rezeptoren. Im Gegensatz zu RNA oder ProteinNachweisen einzelner Rezeptor Untereinheiten wurden funktionelle Rezeptoren elektrophysiologisch, mit Hilfe der Patch ClampTechnik, charakterisiert. Mit Hilfe von spezifischen Agonisten, Antagonisten und Modulatoren konnten folgende Sachverhalte nachgewiesen werden: - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle AMPARezeptoren. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR2 ist Bestandteil von AMPARezeptoren bei LSONeuronen. - Funktionelle AMPARezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Abschnitt der Entwicklung ist die Größe der AMPA Rezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere. - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle KainatRezeptoren. - Im Hinblick auf die KainatRezeptoren gibt es jeweils zwei Klassen von LSO bzw. MNTBNeuronen. LSONeurone lassen sich in eine Klasse, die sich durch schnelle KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, und eine Klasse, die sich durch langsame KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, unterteilen. Den beiden Klassen liegen sehr wahrscheinlich unterschiedliche Rezeptordichten und / oder Unterschiede in der Untereinheitenzusammensetzung zugrunde. MNTBNeurone lassen sich in Zellen, die KainatRezeptoren besitzen, und Zellen, die diesen Typ von Rezeptor nicht besitzen, unterscheiden. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR5 ist Bestandteil von KainatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen. - Funktionelle KainatRezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Zeitraum ist die Größe der KainatRezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere.
Das Apolipoprotein (Apo) B100 ist der wesentliche Proteinbestandteil der Low Density Li poproteine (LDL). Es spielt als Ligand bei der rezeptorvermittelten Aufnahme der LDL aus dem zirkulierenden Blut in die Leber und andere periphere Gewebe eine wichtige Rolle. Erhöhte Plasmakonzentrationen der LDL gelten als unabhängiger Risikofaktor in der Genese der Koronaren Herzkrankheit (KHK). Eine gestörte Interaktion des LDLRezeptors mit seinem Liganden Apo B100 vermindert die Endozytose der im Blut befindlichen LDL und kann damit eine primäre Hyperlipoproteinämie (HLP) des Typ IIa verursachen. Die Rezeptorbindungsregion des Apo B100, dessen Primärstruktur 4536 Aminosäuren um fasst, ist im carboxyterminalen Bereich des Moleküls lokalisiert. Im Gegensatz zu einer Viel zahl bekannter LDLRezeptormutationen wurden lediglich drei Mutationen am Apo B100 bekannt, die als Auslöser der Typ IIa HLP in Frage kommen. Diese werden in der Literatur als Familiär Defektes Apo B100 (FDB) beschrieben. Bei allen drei FDBVarianten (FDB 3500Q , FDB 3500W , FDB 3531C ) liegen Punktmutationen innerhalb des Exons 26 des Apo B100 Gens vor. In der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, weitere, bisher unbekannte Punktmutationen am Apo B100, die als Ursache bindungsdefekter LDL in Frage kommen, zu finden und zu charakterisieren. Die zunächst durchgeführte Sequenzierung der genomischen DNA einer Pa tientin mit bindungsdefekten LDL, die negativ für FDB war, zeigte keine Abweichungen von der WildtypDNASequenz im Bereich der Rezeptorbindungsregion. Es wurde daraufhin eine genetische ScreeningStrategie für bindungsdefekte Apo B100 entwickelt, die für die Analyse größerer Probenmengen geeignet erschien. Hierzu wurden zunächst parallel zwei Verfahren, der singlestrand conformation polymorphism (SSCP) und die Temperatur Gradienten Gel E lektrophorese (TGGE) getestet. Letztere erwies sich als geeignete Methode. Ein Kollektiv von 297 Typ IIa HLPPatienten, deren LDLCholesterin > 1,55 g/L und Trigly zeridKonzentrationen <2,0 g/l waren, wurde zusammengestellt. Die Blutproben stammten von nicht miteinander verwandten, im Rhein/MainGebiet ansässigen Personen kaukasischer Abstammung. Ein DNA Bereich von 2,8 Kilobasenpaaren korrespondierend zu den Aminosäureresten 3131 3837 und 42694498 des Apo B100 wurde in einzelnen Abschnitten amplifiziert und mit He teroduplexTGGE analysiert. Es wurden neun Substitutionen identifiziert. Diese waren: FDB 3500Q , FDB 3500W , L3350L, Q3405E, R3611Q, I4287V, N4311S, A4454T, und T4457M. Bei 21 Personen (7,1%) wurde FDB 3500Q nachgewiesen. Dies entspricht nach Extrapolation auf die Gesamtbevölkerung einer Mutationshäufigkeit von 1,4% in unserer Region. Es konnte festgestellt werden, dass bei allen Merkmalsträgern die R3500Q Mutation mit einem einheitli chen Haplotypen kosegregiert, so dass eine stammesgeschichtliche Verwandtschaft der Muta tionsträger belegt ist. FDB 3500W wurde bei zwei HLPPatienten diagnostiziert. Dies war insofern überraschend, da diese Mutation zuvor lediglich bei einer Person kaukasischer Abstammung in Großbritannien gefunden worden war. Beide R3500W Mutationen waren mit unterschiedlichen, bisher unbe kannten Haplotypen assoziiert. LDL der beiden heterozygoten Merkmalsträger für FDB 3500W zeigten in einem an normalen humanen Fibroblasten durchgeführten Bindungsassay eine deut lich verminderte Rezeptorbindungsaffinität, jedoch lag diese etwas höher als die der LDL ei ner FDB 3500Q heterozygoten Person. Es ist daher anzunehmen, dass der Austausch eines Argi nins durch Tryptophan an Position 3500 einen geringeren Bindungsverlust der LDL bewirkt als der Austausch von Arginin zu Glutamin. Zwei der in der TGGE identifizierten Punktmutationen stellten bekannte Apo B100 Poly morphismen (MspI 3611 und N4311S) dar, eine weitere stille Mutation an Kodon L3350L wur de bei drei Personen festgestellt. Daneben fand sich ein Merkmalsträger mit einer Punktmuta tion an Kodon 4457 (T4457M). Zwei zuvor beschriebene Substitutionen, Q3405E und A4454T, traten mit einer Prävalenz von 1,3%, bzw. 6,4% im untersuchten Kollektiv auf. LDL eines heterozygoten Merkmalträgers für Q3405E hatten normale Bindungsaffinität an LDL Rezeptoren, zeigten jedoch eine signifikant erniedrigte Internalisation und Degradation im in vitroBindungstest. Schliesslich wurde eine bisher unbekannte Mutation des Apo B100 am Aminosäurerest I4287V, die mit einer Allelfrequenz von 1% im untersuchten Kollektiv auf trat, funktionell überprüft. Dabei zeigte sich sowohl im Fibroblasten Bindungsassay als auch in einem zweiten in vitroTestverfahren, dem U937 Zellen Wachstumsassay keine Assoziati on der I4287V Mutation mit bindungsdefekten LDL in der Familie einer heterozygoten Merkmalsträgerin. Eine funktionelle Relevanz dieses Aminosäureaustausches ist daher un wahrscheinlich. An einem Tryptophanrest an Position 4369 des Apo B100, der bei der Formation der dreidi mensionalen Struktur des Proteins mit Arginin 3500 interagiert, wurden Nukleotidveränderun gen zunächst durch gezielte Mutagenese des Kodon 4369 erzeugt, um sicherzustellen, dass diese Mutationen durch TGGE nachweisbar sind. Nachfolgend wurde bei den Typ IIa HLP Patienten nach Mutationen an dieser Position gesucht. Es konnte festgestellt werden, dass im untersuchten Kollektiv keine Punktmutationen am Aminosäurerest 4369 existierten. Die Vermutung, dass weitere klinisch relevante Apo B100 Mutationen mit einem dem FDB konformen Merkmalsbild bei Typ IIa HLPPatienten vorhanden sind, konnte nicht bestätigt werden. Andererseits wurde eine überraschend hohe Prävalenz (1:72) des FDB 3500Q im Rhein/Main Gebiet festgestellt. Aufgrund der gemeinsamen Abstammung aller Merkmalsträ ger und der hohen Mutationsfrequenz in dieser Region ist es denkbar, dass sich die vermutlich vor ca. 6000 Jahren datierte FounderMutation in diesem Teil Deutschlands ereignete. Da es offensichtlich auch, zwar seltener auftretende, Fälle des FDB 3500W in der hier untersuch ten Region gibt, sind AnalyseMethoden, wie etwa die TGGE, die sich als ein hochsensibles Nachweisverfahren multipler Punktmutationen erwies, bei der differentialdiagnostischen Ab klärung von Fettstoffwechselstörungen solchen Methoden vorzuziehen, die nur auf die Substi tution FDB 3500Q testen.
Die Atherosklerose ist eine chronischentzündliche Erkrankung der Blutgefäße, die nach der "responsetoinjury"Hypothese durch die Verletzung des Endothels initiiert wird. Dabei führt die Aktivierung von Endothelzellen durch verschiedene proatherosklerotische Faktoren, wie z.B. das Komplementsystem oder das CD40 System, zur "Endotheldysfunktion". In den betroffenen Bereichen des Gefäßes entstehen frühe atherosklerotische Läsionen, die durch veränderte Adhäsivität und Permeabilität des Endothels zur Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Entzündungszellen und somit zum Fortschreiten der inflammatorischen Reaktion und zur Progression der Atherosklerose führen. Die laminare Schubspannung des fließenden Blutes (Shear Stress) ist einer der wichtigsten endogenen atheroprotektiven Faktoren im kardiovaskulären System. Dagegen sind Störungen der lokalen Hämodynamik im Blutgefäß mit endothelialer Dysfunktion und dem Auftreten von atherosklerotischen Läsionen assoziiert. Zur Identifizierung atheroprotektiver Mechanismen wurde die Shear Stressregulierte Genexpression in Endothelzellen mittels ''Atlas cDNA Expression Array" im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Von den 55 Shear Stressinduzierten Genen, wurde die Expression der potentiell antiinflammatorischen Proteine Clusterin und TRAF3 und der möglichen Mechanotransduktoren Integrin alpha5 und Integrin ß1 analysiert und die Bedeutung für die Funktion von Endothelzellen untersucht. Shear StressExposition erhöhte spezifisch die Expression des KomplementInhibitors Clusterin. Zusätzlich inhibierte Shear Stress, über die erhöhte Clusterin Expression, die Komplementinduzierte Expression der proinflammatorischen Chemokine MCP1 (''Monocyte chemoattractant protein1") und Interleukin8, die Monozyten und Leukozyten anlocken und die Entzündungsreaktion der Endothelzellen vorantreiben. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß Shear Stress die Expression des inhibitorischen Proteins TRAF3 (''tumor necrosis factor receptorassociated factor 3"), das an der CD40Signalkaskade beteiligt ist, erhöht. Im Gegensatz dazu, wurden weder die homologen Proteine TRAF2 und TRAF5, noch der CD40 Rezeptor oder CD40 Ligand durch Shear Stress reguliert. Sowohl Shear Stress als auch TRAF3 hemmen die CD40induzierte Expression des proinflammatorischen Proteins MCP1 und des prothrombotischen Proteins "Tissue Factor". Entgegen den Erwartungen lokalisierte TRAF3, das urprünglich als Rezeptorassoziiertes Adapterprotein identifiziert wurde, hauptsächlich im Zellkern. Demzufolge könnte TRAF3 eine inhibitorische Funktion im Zellkern ausüben, indem es beispielsweise die Translokation von MAPKinasen oder die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA beeinflußt. Die Umsetzung von mechanischen Kräften in biochemische Signale im Zytoplasma ist Voraussetzung für den protektiven Effekt von Shear Stress auf Endothelzellen. Als Mechanotransduktoren sind Integrine von zentraler Bedeutung, da sie eine Verbindung zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix herstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß Shear Stress die Expression der IntegrinUntereinheiten alpha5 und ß1, die zusammen den FibronektinRezeptor bilden, erhöht. Dabei konnte die Beteiligung von Stickstoffmonoxid (NO) und Wachstumsfaktoren, die durch Shear StressExposition freigesetzt werden und die Expression von Integrinen stimulieren, ausgeschlossen werden. Andere Integrine, wie z.B. der LamininRezeptor alpha6ß4, wurden durch Shear Stress nicht reguliert. Als physiologische Relevanz der Shear Stressinduzierten Integrin Expression wurde die Adhäsion von Endothelzellen erhöht. Weiterhin induzierte die Präexposition von Endothelzellen mit Shear Stress die Adhäsionsinduzierte Aktivierung der MAPKinase ERK1/2, die wichtige Überlebenssignale in Endothelzellen vermittelt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Shear Stress die Expression der antiinflammatorischen Proteine Clusterin und TRAF3 sowie der Mechanotransduktoren Integrin alpha5 und ß1 erhöht. Die Hemmung der Komplement und CD40induzierten Aktivierung von Endothelzellen durch Shear Stress ist von Bedeutung, um sowohl der Initiation als auch der Progression der Atherosklerose entgegen zu wirken. Die Shear Stressinduzierte Adhäsion, die über die Stimulation der Expression des FibronektinRezeptors alpha5ß1 vermittelt wird, ist eine wichtige Voraussetzung für die Mechanotransduktion von Shear Stress und das Überleben von Endothelzellen. Die Identifizierung und Aufklärung atheroprotektiver Mechanismen, die durch die laminare Schubspannung des Blutes aktiviert werden, könnten dazu beitragen, die Integrität des Endothels und die Funktionalität der Blutgefäße im Rahmen der Atherosklerose zu schützen.
In dieser Arbeit konnten die initialen Befunde bezüglich der potenten Serotoninaufnahmehemmung durch Johanniskrautextrakt mittels Radiorezeptorassay Methoden bestätigt werden. Es wurde gezeigt, daß die Phloroglucinole Hyperforin und Adhyperforin größtenteils für die Inhibierung der Serotoninaufnahme in Maushirn Synaptosomen verantwortlich sind. Die halbmaximalen Hemmkonstanten sind für beide Inhaltsstoffe identisch und liegen bei ca. 400 nM. Dagegen konnte nur bei einer weiteren relevanten Inhaltsstoffgruppe aus Hypericum perforatum, nämlich den OPCs, eine Hemmung der Serotoninaufnahme in Synaptosomen festgestellt werden. Wichtige Befunde konnten durch Ermittlung der Serotoninaufnahme in humanen Thrombozyten gewonnen werden. Vergleichende Untersuchungen von verschiedenen klassischen Antidepressiva und von Hyperforin an der Serotoninaufnahme in Thrombozyten und Synaptosomen zeigten jeweils identische halbmaximale Hemmkonstanten in beiden Systemen. Zum einen wurde durch diese Experimente erstmals eine Beeinflussung der Serotoninaufnahme durch Hyperforin in humanen Zellen nachgewiesen, und zum anderen konnte dadurch bestätigt werden, daß Thrombozyten als ein peripheres Modell der Serotoninaufnahme verwendet werden können. Eine nähere Charakterisierung des molekularen Wirkungsmechanismus der Serotoninaufnahmehemmung durch Hyperforin in Synaptosomen lieferte Hinweise darauf, daß Hyperforin einen von den klassischen Antidepressiva unterschiedlichen Mechanismus aufweist. Im Gegensatz zu den bekannten Antidepressiva zeigt Hyperforin nichtkompetitive Eigenschaften am Transportermolekül. Unterstützt wird diese Vermutung durch weitergehende Untersuchungen, bei denen die direkte Interaktion von Johanniskrautextrakt und Hyperforin mit SERT1 durch Ermittlung der Paroxetinbindung an Maushirnmembranen bestimmt wurde. Auch hier zeigt Hyperforin einen andersartigen Einfluß. Sämtliche klassischen Antidepressiva weisen eine sehr gute Korrelation zwischen der Hemmung der Paroxetinbindung und der Inhibition der Serotoninaufnahme mit nahezu identischen IC 50 Werten auf. Dagegen hat weder Johanniskrautextrakt noch Hyperforin einen erwähnenswerten Einfluß auf die Paroxetinbindung, was darauf schließen läßt, daß beide Substanzen nicht durch eine direkte Bindung an die Substratbindungsstelle des Serotonintransporters die Inhibition der Serotoninaufnahme induzieren. Ausgehend von diesen Befunden wurden weitere Parameter untersucht, welche für die Regulation der Serotoninaufnahme verantwortlich sind. Die wichtigste treibende Kraft für die Aktivierung und Aufrechterhaltung des Serotonintransportes ist der an der Plasmamembran bestehende Natriumgradient, so daß sich die weiteren Untersuchungen vor allem mit der Ermittlung der intrazellulären Natriumkonzentration nach Hyperforinzugabe befaßten. Während der SSRI Citalopram keinen Einfluß auf die intrazelluläre Natriumkonzentration in Thrombozyten ausübt, führt Hyperforin in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise zu einer Erhöhung der intrazellulären Natriumkonzentration. Aufgrund dieser hyperforininduzierten Beeinflussung von [Na ] i und der daraus resultierenden Erniedrigung des Natriumgradienten an der Plasmamembran, läßt sich nicht nur die Hemmung der Serotoninaufnahme, sondern auch die Inhibierung der Aufnahme von Noradrenalin, Dopamin, GABA und LGlutamat erklären. Um die Ursache des Natriuminfluxes in das Thrombozytenzytosol zu ermitteln, wurden Vergleichssubstanzen herangezogen, die bekanntermaßen ebenfalls zu einer Erhöhung von [Na ] i führen. Da durch diese Vergleichssubstanzen auch andere intrazelluläre Ionenkonzentrationen beeinflußt werden, wurden die Effekte von Hyperforin mittels Fluoreszenzspektroskopie auf diese Ionenkonzentrationen zusätzlich untersucht. Hyperforin verursacht in höheren Konzentrationen (10 µM) eine gravierende Erhöhung von [Ca 2 ] i und eine biphasische Beeinflussung des zytosolischen pHWertes mit initialer Ansäuerung und sekundärer Alkalisie rung des Zytosols. Es handelt sich hierbei größtenteils um einen Kalziuminflux aus dem Außenmedium und in geringerem Maße um eine Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern. Niedrigere Hyperforinkonzentrationen von 0,33 µM führen zu einer konstanten intrazellulären Acidifizierung und einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Eine Beteiligung des NHE kann weitgehend ausgeschlossen werden, da der pHEffekt nicht natriumabhängig ist. Die sekundäre Alkalisierung , die nach Zugabe von höheren Hyperforinkonzentrationen (10 µM) beobachtet wird, deutet auf die Aktivierung eines Mechanismus hin, der für die Aufrechterhaltung des intrazellulären pHWertes verantwortlich ist. Ein potentieller Kandidat könnte der natriumunabhängige Cl/HCO 3 Exchanger sein. Die Beeinflussung der [Na ] i und des pH i scheinen voneinander unabhängige Prozesse zu sein. Der Einstrom von Natrium und Kalziumionen läßt sich vermutlich über nichtselektive Kationenkanäle erklären, da beide hyperforininduzierten Effekte durch SK
Charakterisierung intrazellulärer Bindepartner von metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe III
(2001)
Die Aminosäure Glutamat ist der maßgebliche exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem, und glutamaterge Synapsen sind weit über das ganze Hirn ver breitet. Neben den Ionenkanalgekoppelten (ionotropen) Glutamatrezeptoren (iGluRs) aktiviert Glutamat auch prä und postsynaptische metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs), die über trimere GProteine und nachgeschalteten Signalkaskaden Einfluss auf die Signalverarbeitung in der Synapse nehmen können (Pin und Duvoisin, 1995). Diesen Rezeptoren werden Aufgaben bei verschiedenen Formen neuronaler Plastizität und Neurotoxizität zugeschrieben (Pizzi et al., 1993; Pin und Duvoisin, 1995; Pekh letski et al., 1996; Pizzi et al., 1996a; Bushell et al., 1997; Maiese et al., 2000; Sabel haus et al., 2000). Zur Zeit sind acht verschiedene mGluRs zuzüglich ihrer Spleißvarian ten bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, Struktur und pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden (Nakanishi, 1992; Pin et al., 1993). Mitglieder der Gruppe III mGluRs sind spezifisch an der aktiven Zone der Präsy napse lokalisiert und dort an der Regulation der Neurotransmission beteiligt (Shigemoto et al., 1996; Ottersen und Landsend, 1997). Die Mechanismen, die zur spezifischen Lo kalisation führen, konnten bislang noch nicht aufgezeigt werden. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Ca 2 abhängige Interaktion von Calmodulin (CaM) mit mGluR7a durch Kopräzipitationsstudien gezeigt. Die CaMBindung ist dabei von phy siologischer Relevanz für die Aktivierung des Rezeptors (O'Connor et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde nach neuen Interaktionspartnern für die Gruppe III mGluRs gesucht, um so weitere Aufschlüsse über die präsynaptische Verankerung und Regulati on dieser Rezeptorgruppe zu gewinnen. In einem ZweiHybridScreen konnten dabei die Proteine PxF und SGT, beides Genprodukte unbekannter Funktion, als zwei mögliche Interaktionspartner für mGluR4b identifiziert werden. Die Natur dieser Interaktionen konnte im Verlauf dieser Arbeit nicht genauer bestimmt werden und bleibt somit Gegenstand weiterer Untersuchungen. In einem parallelem Ansatz wurde die Interaktion von mGluR7a mit CaM näher untersucht. Dabei konnte ein hochkonservierter Bereich in allen Gruppe III mGluRs mit Ausnahme von mGluR4b und mGluR6 identifiziert werden, der eine Konsensussequenz zur CaMBindung (1510Motiv) enthält. Neben der CaMBindung konnte für diesen Bereich in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Michael Freissmuth auch eine Interaktion mit Gbetagamma nachgewiesen werden. Die GbetagammaBindung an den Rezeptor wird durch Ca 2 abhängige Aktivierung von CaM gehemmt. Es wird daher ein Modell zur dualen Aktivierung von Gruppe III mGluRs vorgeschlagen, welches mögliche Mecha nismen zur negativen Rückkopplung der Glutamatfreisetzung aufzeigt. Zusätzlich wurde eine mögliche Regulation der Gruppe III mGluRs durch PKC Phosphorylierung untersucht. Dabei konnte die in vitroPhosphorylierung eines einzel nen Restes (S862) im intrazellulären CTerminus von mGluR7a nachgewiesen werden, welche zur Hemmung der CaMBindung führte. Aufgrund dieser Daten wird ein erwei tertes Modell formuliert, in dem die Hemmung der Ca 2 /CaMabhängigen Aktivierung der GProteinsignalkaskade durch Phosphorylierung von mGluR7a eine übergeordnete Regulation des Rezeptors darstellt. Da die Gruppe III mGluRs bei Aktivierung zu einer Selbsthemmung der Neuro transmission führen (Pin und Duvoisin, 1995; Takahashi et al., 1996), stellt deren Ca 2 /CaMregulierte Aktivierung und die zusätzliche Regulation durch Phosphorylie rung eine Möglichkeit der Regulation von Lernprozessen dar.
Die Vesikel des sarcoplasmatischen Reticulums (SR) der Skelettmuskulatur von Kaninchen enthalten neben Kanälen hoher (big chloride channel') und geringer (small chloride channel') Leitfähigkeit auch der äußeren Mitochondrienmembran bekannten voltagedependent anionselective channel' (VDAC). Der Kanal konnte mittels Immunodetektion Vesikeln heavy' und light' nachgewiesen, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt nach der Spaltung Bromcyan teilsequenziert werden. Die Partialsequenzen beiden erhaltenen Fragmente stimmen Isoform 1 VDAC dem CorneaEndothel Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) sowie aus dem Mitochondrium überein. Jedoch weist Kanal unterschiedliche Eigenschaften auf. zeigt Gegensatz dem mitochondrialen VDAC keine Affinität dem AnionenkanalInhibitor SITS bildet SRMembran keine Komplexe anderen Proteinen Bekannte Effektoren mitochondrialen VDAC wie NADH, DCCD antiVDAC Antikörper zeigen SulfatEffluxExperimenten entweder keine oder eine gegensätzliche Wirkung, was einen weiteren Hinweis unterschiedliche Regulationsfaktoren gibt. Die fehlenden Transporteigenschaften des rekonstituierten Kanals unter SulfatEfflux Bedingungen machen seine Beteiligung Sulfattransport und somit Transport SR sehr unwahrscheinlich. Vielmehr scheint den Transport von Nucleotiden, besonders ATP, SRLumen vermitteln. Allerdings weist auch hohe Affinitäten einem speziell synthetisierten GTPAnalogon auf könnte deshalb dem bekannten Eintransport von GTP in SRVesikel beteiligt sein. Nucleotide werden SRLumen Phos phorylierung verschiedener Proteine Sarcalumenin, HCP (histidinerich protein') und Calsequestrin benötigt, neben ihrer Funktion Speicher auch der Regulation Release beteiligt sind. den Vesikeln sarcoplasmatischen Reticulums existieren mindestens zwei Proteine, durch Immunodetektion Affinitätsmarkierung mit einem radioaktiv markierten GTPAnalogon nachgewiesen wurden. greifen regulierend in den Anionentransport SR ein, Antikörper gegen G Untereinheit dieser Proteine den Sulfattransport hemmen. Diese Wirkung scheint allerdings direkt erfolgen nicht über second messenger'. Einen weiteren Hinweis GProteinvermittelte Regulation Anionentransports stellt sehr effiziente Hemmung des SulfatEfflux SRVesikeln durch Suramin verschiedene Arbeitskreis synthetisierte Suraminderivate Ein Analogon, spezifisch GProteingekoppelten Ionenkanälen (P2Y Purinoceptoren) Wechselwirkung und bindet eine alpha Untereinheit der SRVesikel. Ein weiteres Derivat, SB 22, zeigt ebenfalls Affinität zu dieser G alpha Untereinheit sowie zu einem anderen Protein (40 kDa) und der Ca ATPase. ATPase keine Transport eigenschaften für Sulfat aufweist, muß die hemmende Wirkung auf den Anionentransport entweder durch Modifikation einer Galpha Untereinheit oder Zeit noch nicht näher charakterisierten Proteins erfolgen. Der VDAC zeigt Suraminderivaten gegenüber inert und kommt deshalb nicht Sulfattransporter des sarcoplasmatischen Reticulums Frage.
Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter Der plasmamembranständige Serotonintransporter SERT terminiert die Neurotransmission an serotonergen Synapsen durch den schnellen Rücktransport des Neurotransmitters Serotonin (5HT) in die Präsynapse. Neben seinem präsynaptischen Vorkommen wird der SERT auch axonal in Varikositäten immundetektiert. Der Substrattransport selbst unterliegt der Kontrolle des Ca 2 /CaM, des Stickoxid (NO) und des Proteinkinase C (PKC) Signaltransduktionsweges. Letzterer bestimmt die Oberflächenverfügbarkeit des SERT durch dessen Sequestrierung. Die Regulation der Lokalisation und des Substrattransports des SERT sollte durch assoziierte Proteine erzielt werden. Da bislang jedoch keine interagierenden Proteine des SERT bekannt waren, sollten in dieser Arbeit mit Hilfe des HefeZweiHybridSystems zytoplasmatische Interaktionspartner des SERT identifiziert werden. Erste Untersuchungen an heterolog exprimierten Deletionsmutanten der Termini des SERT ergaben, daß diese zytoplasmatischen Domänen für die Funktion des Proteins unabdingbar sind. Im folgenden wurde daher mit dem Carboxyterminus des SERT eine hirnspezifische cDNABibliothek der neugeborenen Ratte durchsucht. Es wurden vier cDNAKlone isoliert, die für putative Interaktionspartner des SERT kodierten. Die Relevanz dieser genetisch nachgewiesenen Interaktionen wurde biochemisch mittels affinitätschromatographischer Studien untersucht, während immunzytochemische Analysen die Interaktionen durch die Umverteilung oder durch die Colokalisation der coexprimierten Proteine in vivo validierte. Pharmakologische Untersuchungen sollten darüberhinaus Aufschluß über den regulatorischen Einfluß der Interaktion auf die Transportfunktion des SERT geben. Nach diesen Aspekten wurden zwei der putativen Interaktionspartner näher untersucht. Der erste untersuchte cDNAKlon kodierte für die ßUntereinheit der intrazellulären Acetylhydrolase des "plateletactivating factor" (ßPAFAH). Affinitätschromatographisch wurde die Interaktion durch die Präzipitation der eukaryotisch überexprimierten ß Untereinheit an einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein des SERTCT bestätigt. Die immunzytochemische Analyse zeigte nach der Coexpression der ßPAFAH und dem SERT eine Umlokalisierung des zytoplasmatischen Proteins an Bereiche plasmamembranständiger SERTImmunreaktivität. Durch Wiederaufnahmestudien wurde kein Effekt der ßPAFAH auf die Transportfunktion des SERT ermittelt, weshalb die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion vorerst unklar bleibt. Der zweite Klon kodierte für das Rattenspezifische Homolog des myristoylierten Alanin reichen Proteinkinase CSubstrats (MacMARCKS). Der biochemische Nachweis einer Interaktion konnte hier nicht erbracht werden. Dagegen zeigte die immunzytochemische Analyse eine Colokalisation von MacMARCKS und SERT in diskreten Bereichen der Plasmamembran. Hinweise auf die physiologische Bedeutung konnten durch die pharmakologische Analyse gewonnen werden. So induzierte die Coexpression von MacMARCKS und SERT eine Abnahme der maximalen Transportrate (Vmax) um 29,6 ± 18,6 % (n = 3) im Vergleich zu GFPexprimierenden Kontrollzellen. Die Stimulierung der PKC erzielte dagegen kaum eine weitere Reduktion der Vmax im Gegensatz zu den Kontrollzellen, während die Behandlung der Zellen mit einem PKCInhibitor zum Angleich der Vmax der Konrollzellen und der MacMARCKSexprimierenden Zellen führte. Daraus wurde gefolgert, daß MacMARCKS an der Regulation der Transportfunktion des SERT durch dessen Sequestrierung beteiligt ist. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Interaktionspartner des SERTCT identifiziert, deren mögliche Funktionen in der Regulation der intrazellulären 5HT Konzentration einerseits bzw. der Regulation der Transportfunktion des SERT andererseits liegen könnten.
Zur adäquaten Bestrahlung maligner Tumoren ist eine gute Reproduzierbarkeit der angestrebten Bestrahlungsposition bei jeder Therapiefraktion von entscheidender Bedeutung. Bei der freien Lagerung von Patienten muß die Bestrahlungsposition anhand von Hautmarkierungen sicher nachvollziehbar sein. Häufiges Nachzeichnen schränkt die Identifizierbarkeit dieser Einstellhilfen durch ein zunehmendes Maß an Ungenauigkeit ein. Im ersten Teil der Studie wurden drei verschiedene Markierungsverfahren in bezug auf ihre Eignung in der Bestrahlungsroutine verglichen. Es handelte sich um zwei Verfahren zur Konservierung der Haumarkierungen mit Hilfe von Wundverbänden und um die Hautmarkierung mit einem speziellen Hautmarkierungsstift. Zur Bewertung dienten die Kriterien Haltbarkeitsdauer und Identifizierbarkeit, sowie Hautverträglichkeit. Es zeigte sich, daß ausschließlich der Viomedex ® Hautmarkierungsstift für den Einsatz bei der Bestrahlung geeignet war. Im zweiten Teil der Studie wurde prospektiv untersucht, ob verglichen mit der bisher geübten Praxis mit Viomedex ® eine Verlängerung der Haltbarkeit der Hautmarkierungen und eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Patientenlagerung erreicht werden kann. Haltbarkeit und Reproduzierbarkeit wurden in Abhängigkeit von den Hautmerkmalen Nachtschweiß, Schweißneigung, Behaarungsgrad und Hauttyp sowie dem Zeitpunkt der Einzeichnung ermittelt. Die durchschnittliche Haltbarkeit, betrug 11,02 Tage. Sie stand in keinem signifikanten Zusammenhang zu bestimmten Hautparametern. Einzeichnungen, die zu einem späteren Zeitpunkt im Verlauf der Strahlenbehandlung erfolgten, wiesen eine etwas längere Haltbarkeit auf, der Unterschied war statistisch nicht signifikant. Durch Identifizierung anatomischer Bildpunkte wurden die Verifikationsaufnahmen mit der jeweiligen Simulationsaufnahme verglichen und die mittlere Gesamtabweichung aller untersuchten Einstellungen als Maß für die Reproduzierbarkeit der Bestrahlung berechnet. Ein signifikanter Zusammenhang mit dem Zeitpunkt der Einzeichnung oder mit bestimmten Hautparametern trat nicht auf. Gegenüber früheren Untersuchungen unseres Institutes ergab sich eine stark verbesserte Reproduzierbarkeit. So verringerte sich der Wert der Gesamtabweichung bei der Bestrahlung der weiblichen Brust von 0,605 cm auf 0,490 cm. Bei Betrachtung der übrigen Patienten, die ohne Fixationshilfen bestrahlt wurden, konnte die Gesamtabweichung von 1,082 cm auf 0,655 cm gesenkt werden. Auch der Prozentsatz sehr großer Einstellfehler (>1 cm) ist im internen Vergleich bei der Bestrahlung aller Körperregionen von 47,7 % auf 20,4 % zurückgegangen. Es wurde gezeigt, daß durch langhaftende, sorgfältig eingezeichnete Hautmarkierungen, die Reproduzierbarkeit der Einstellungen bei frei gelagerten Patienten verbessert werden kann. Eine ProblemPatientengruppe, die aufgrund ihrer Hauteigenschaften einer gesonderten Markierungsmethode bedarf, wurde nicht ermittelt. Es konnten feste Regeln zum Anbringen und Überwachen der Hautmarkierungen formuliert werden, die in die Bestrahlungsroutine der Klinik für Strahlentherapie der J. W. GoetheUniversität aufgenommen wurden.
Zusammen mit anderen b 2 Sympathomimetika wird Terbutalin schon seit langem in der Behandlung chronisch obstruktiver Lungenerkrankungen (COLE) eingesetzt. Dabei wurde mehrfach von schweren unerwünschten kardialen Wirkungen nach der Anwendung von Terbutalin berichtet. Die Tatsache, daß die COLE in der Regel mit chronisch hypoxiegeschädigten Herzen assoziiert sind, gab Anlaß, die Auswirkungen von Terbutalin auf hypoxiebelastete isolierte Rattenherzen und deren Mitochondrien zu untersuchen. Dafür wurde das zunächst für 20 Minuten normoxisch arbeitende Rattenherz (working rat heart) einer fünfzigminütigen Hypoxiephase ausgesetzt, während der es mit Terbutalin in Konzentrationen zwischen 1,1 und 225,3 ng/ml perfundiert wurde (0,5, 1, 5, 10 und 100 nmol Terbutalin auf 100 ml Perfusionspuffer). Die Perfusionsgeschwindigkeit betrug 2 ml/min. Der Hypoxiephase folgte eine siebzigminütige Reoxygenierungsphase, in der in zehnminütigen Abständen das Herzminutenvolumen (HMV), die Herzfrequenz und der Koronarfluß dokumentiert wurden. Nach Abschluß der Reoxygenierungsphase wurden die myokardialen Mitochondrien isoliert, um die ATP Synthese und ATPaseAktivitäten sowie die Membranfluidität zu messen. Zusätzlich wurden zwei Versuchsreihen ohne Hypoxiephase durchgeführt (mit 1 und 100 nmol Terbutalin), um die alleinige Wirkung von Terbutalin auf die Rattenherzen zu untersuchen. Die Aortenflußmessung während der Reoxygenierung ergab eine generelle Reduzierung der Herzleistung im Vergleich zu den Kontrollherzen (ohne Terbutalinzugabe). Lediglich im 1 nmolVersuch (2,3 ng/ml) war zu Beginn der Reoxygenierungsphase eine signifikante Steigerung des HMV festzustellen. Jedoch hielt auch diese Steigerung nur für etwa zwanzig Minuten an. Alle anderen Versuchsreihen (mit 0,5, 5, 10 und 100 nmol Terbutalin) ergaben eine deutliche Verschlechterung der Herzleistung. Das HMV der Kontrollherzen betrug während der Reoxygenierung durchschnittlich etwa 75% des HMV vor der Hypoxiephase. Die Terbutalinherzen erreichten abgesehen vom 1 nmolVersuch, wo ein HMVMaximum von etwa 80% erreicht wurde, Aortenflußwerte, die zwischen 30% und 70% der Ausgangswerte lagen. Eine Besonderheit ergab sich beim 0,5 nmolVersuch. Hier fand sich eine Steigerung des Aortenflusses über den gesamten Verlauf der Reoxygenierung von etwa 48% auf 68%. Das Herz schien sich von einer anfangs starken Reduzierung des HMV wieder zu erholen. Bezüglich der Herzfrequenzen war eine weitgehende Korrelation zu den Herzminutenvolumina festzustellen, so daß eine Steigerung des HMV vermutlich Folge einer Herzfrequenzsteigerung ist und umgekehrt. Die Koronarflußmessungen ergaben eine Steigerung der Koronarperfusion, also eine Vasodilatation, ab einer Dosis von zwischen 1 nmol und 5 nmol Terbutalin. In höheren Dosen (10 nmol und 100 nmol) kam es zu einer deutlichen Reduzierung des Koronarflusses, was vermutlich auf die kardiotoxischen Wirkeigenschaften von Terbutalin zurückzuführen ist. Es zeigte sich also ein optimaler Wirkungsbereich, der zwischen 1 nmol und 5 nmol liegt. Die mitochondrialen Messungen ergaben eine generelle Reduzierung der ATPSyntheseAktivitäten (0,0150,03 µmol ATP/mg/min) und eine generelle Steigerung der ATPaseAktivitäten (0,71,65 µmol ADP/mg/min) im Vergleich zur Kontrolle (0,04 µmol ATP/mg/min bzw. 0,6 µmol ADP/mg/min). Dabei trat das ATPSynthese Aktivitätsmaximum bzw. das ATPaseAktivitätsminimum im 10 nmolVersuch auf. Die kleinste ATPSynthese Aktivität (0,015 µmol ATP/mg/min) wurde beim 1 nmolVersuch, wobei gleichzeitig das HMVMaximum erreicht wurde, gemessen. Es kann also von einem erhöhten Energiebedarf, der nicht durch eine gesteigerte ATPSyntheseAktivität gedeckt wird, ausgegangen werden. Vermutlich wird die ATPSynthese durch eine aufgrund hoher intramitochondrialer Kalziumspiegel gesteigerte Aktivität von ebenfalls H Gradienten abhängigen Kalziumcarriern kompetitiv' gehemmt. Die hohen intramitochondrialen Kalziumspiegel sind dabei eine Folge hypoxie bzw. reoxygenierungsbedingter Membrandefekte. Die Messungen der Membranfluidität ergaben keine nennenswerten Abweichungen von der Kontrolle. Dies ist ein Hinweis darauf, daß die kardiodepressiven Effekte nicht hauptsächlich auf hypoxiebedingte Mitochondrienmembrandefekte zurückzuführen sind, sondern viel wahrscheinlicher auf Terbutalinbedingte toxische Effekte. Die Experimente ohne Hypoxiephase ergaben mit 1 nmol Terbutalin (2,3 ng/ml) eine diskrete Steigerung des HMV, mit 10 nmol Terbutalin (22,5 ng/ml) eine deutliche Reduzierung. Dies läßt den Schluß zu, daß die kardiodepressive Potenz von Terbutalin durch zusätzliche Hypoxiebelastung verstärkt wird. Drei mögliche Mechanismen können für die kardiodepressiven Eigenschaften von Terbutalin verantwortlich gemacht werden. Zum einen führt eine hypoxiebedingte relative Überstimulation von bRezeptoren zur Entstehung von Sauerstoffradikalverbindungen, die zum Teil irreversible Zellschädigungen verursachen können. Die Entstehung von Sauerstoffradikalen wird durch die Reoxygenierung (oxidativer Streß) nach der Hypoxiephase noch verstärkt. Zum zweiten handelt es sich bei Terbutalin um einen partiellen Agonisten am bRezeptor. Vor allem in Verbindung mit oxidativem Streß, der durch die Reoxygenierung gegeben ist, wird die maximale Wirksamkeit partieller Agonisten reduziert, was sich auch auf die positiv inotropen Eigenschaften von Terbutalin auswirkt. Zum dritten kann von nicht über bRezeptoren vermittelten kardiotoxischen Effekten ausgegangen werden. Vermutlich ist eine dosisabhängige Kombination aller drei Mechanismen die Ursache für die Kardiotoxizität von Terbutalin. Es muß also von einer rezeptorvermittelten bmimetischen und von einer primär kardiotoxischen Wirkkomponente ausgegangen werden. In niedriger Dosierung (0,5 nmol) überwiegt die kardiotoxische Wirkkomponente, von deren Auswirkungen sich die Rattenherzen jedoch erholen konnten. Im 1 nmolVersuch war dann eine optimale Dosierung erreicht (1 nmol/100ml » 2,3 ng/ml), die gleichzeitig auch der effektiven Plasmakonzentration (beim Menschen) von Terbutalin entspricht. Hier überwiegt die bmimetische Wirkkomponente. In höherer Dosierung (10 nmol und 100 nmol) kommt es dann zur relativen Überstimulation von bRezeptoren, was zu den oben beschriebenen teils irreversiblen Myokardschäden führt.
Das orale Antidiabetikum Glibenclamid ist ein potenter Inhibitor des K ATP Kanals. Die Funktion dieses Kanals ist entscheidend für die Ischämische Präkonditionierung, die Myokardschäden unter Sauerstoffmangel vermindern kann. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Sulfonylharnstoffe Glimepirid und Glibenclamid in Kombination mit Rilmakalim auf die Kontraktilität isolierter Kardiomyozyten des Meerschweinchens mittels digitaler Bildanalyse untersucht. Weiterhin wurde der Einfluß dieser Substanzen auf die Vitalität isolierter Kardiomyozyten des Meerschweinchens unter elektrischer Stimulation durch LDHBestimmungen bestimmt. Rilmakalim verminderte die Kontraktilität der isolierten Kardiomyozyten konzentrations abhängig. Die Sulfonylharnstoffe Glimepirid und Glibenclamid zeigten in den untersuchten Konzentrationen keinen Einfluß auf die kardiomyozytäre Kontraktilität. In Kombination mit Rilmakalim konnte gezeigt werden, daß Glimepirid in den untersuchten Konzentrationen (0,03 µmol -- 9 µmol) den kontraktilitätsmindernden Effekt von Rilmakalim geringer hemmt als Glibenclamid. Ein Einfluß auf die Vitalität der Kardiomyozyten unter elektrischer Stimulation konnte bei keiner Substanz in den untersuchten Konzentration nachgewiesen werden. Die durchgeführten Untersuchungen legen den Schluß nahe, daß der Einfluß der Sulfonylharnstoffe auf kardiale K ATP Kanäle unterschiedlich ausgeprägt ist. Glimepirid scheint im Vergleich zu Glibenclamid in geringerem Ausmaß den sarkolemmalen K ATP Kanal zu blockieren. Dies läßt vermuten, daß auch kardiovaskuläre Nebenwirkungen, die über den Einflußt auf den K ATP Kanal vermittelt werden, unter einer Glimepiridtherapie geringer ausgeprägt sind. Inwieweit diese Annahme zutrifft, muß durch Untersuchungen an humanen Kardiomyozyten und in weiteren klinischen Studien verifiziert werden. Neuere Erkenntnisse über unterschiedliche K ATP Kanaltypen innerhalb des Kardiomyozyten machen es erforderlich, die Wirkung der Sulfonylharnstoffe auf diese Kanalsubtypen näher zu untersuchen.
Seit Ende der 80er Jahre kommt die medikamentöse Behandlung mit PG F2 a bei ausgewählten Extrauteringraviditäten (EUG) zur Anwendung. Über diese Therapien existieren zahlreiche klinische Studien, aber nur wenige in vitro Untersuchungen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die PG F2 a Wirkung auf Langzeitkulturen menschlichen Trophoblastgewebes. Dabei wurde in einem bereits etablierten, standardisierten Kultursystem Trophoblastgewebe intrauteriner und extrauteriner Schwangerschaften untersucht. Den Zellkulturen wurde für jeweils 48 Stunden PG F2 a in drei verschiedenen Konzentrationen zugegeben (0,01, 0,1 und 1,0 mg/ml). Die Zugabe erfolgte entweder beim Kulturansatz oder am 6. Tag danach. Für jede Kultur wurden in 2tägigem Abstand die jeweiligen HCGKonzentrationen bestimmt und HCGVerlaufskurven erstellt. Die Auswertung erfolgte anhand der arithmetischen Mittelwerte sowie mittels FriedmannRangvarianzanalyse und Wilcoxon/WilcoxTest. Die morphologischen Veränderungen der Trophoblastzellen während des Kulturverlaufes wurden fotografisch dokumentiert. Trotz der bei extrauterinen Schwangerschaften häufig begrenzten Gewebemenge gelang es mit dem gewählten Kultursystem, Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen intrauterinem und extrauterinem Trophoblastgewebe bezüglich der Behandlung mit PG F2 a klar herauszuarbeiten. Sowohl bei intrauterinem wie extrauterinem Trophoblastgewebe kam es in den Kulturen mit der höchsten und teilweise auch der zweithöchsten PG F2 a Konzentration zur einer signifikanten Erniedrigung der HCGWerte gegenüber der Kontrolle. Die beobachtete Erniedrigung der HCGWerte war bei intrauterinem erheblich deutlicher ausgeprägt als bei extrauterinem Gewebe. Sie war bei Behandlung bei Kulturansatz meist schon am zweiten Tag nach Behandlung, bei PG F2 a Zugabe am Tag 6 erst 46 Tage danach zu beobachten. Weder bezüglich der Zellmorphologie noch der Wachstumsrate ließen sich Unterschiede zwischen den verschiedenen Prostaglandinkonzentrationen oder zwischen behandelten und nicht behandelten Kulturen erkennen. Die Ergebnisse weisen auf einen direkten Einfluß von PG F2 a auf die HCG Sekretion intrauterinen wie extrauterinen Trophoblastgewebes hin. Aufgrund der Beobachtungen bezüglich Zellmorphologie und Wachstum der Zellen dürfte ein stoffwechselmodulierender Effekt als Ursache wesentlich wahrscheinlicher als ein zytotoxischer Einfluß sein. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Geweben unterschiedlicher Herkunft zeigen, daß an Kulturen intrauterinen Trophoblastgewebes gewonnene Erkenntnisse nicht prinzipiell auf extrauterines Trophoblastgewebe übertragen werden können.
Das Endstadium der chronischen Abstoßungsreaktion ist die sogenannte Transplantatarteriosklerose. Zu den hierzu beitragenden Mechanismen zählen die Aktivierung des HLASystems und die unkontrollierte Induktion und Freisetzung von Zytokinen wie TNFa, IL1ß, IL2 etc. (Cerami 1992). Dieser permanente Entzündungsreiz unterliegt nach Monaten oder Jahren einer gewissen Autonomie (Tracey et al. 1988; Yin et al. 1993). Die Freisetzung von Zytokinen aus TLymphozyten wird jedoch durch CSA, ein anerkanntes Immunsuppressivum, nur zeitweise unterdrückt (GranelliPiperno, Inaba und Steinmann 1984). Gleichzeitig wird durch eine Sensibilisierung sowohl der glatten Muskelzellen der Gefäßmedia als auch der Endothelzellen der Intima eine Aufregulierung der Zytokinrezeptoren induziert und somit der CSAWirkung entgegengewirkt (Russel et al. 1995). Die Rolle der glatten Muskelzellen sowie der Einfluß des Endothels im pathophysiologischen Geschehen der chronischen Transplantatabstoßung ist in vivo schwer faßbar und sollte in einem in vitro Ansatz näher charakterisiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden humane glatte Muskelzellen aus der menschlichen Nabelschnur isoliert und die Kulturbedingungen für diesen Zelltyp zunächst optimiert. Durch immunzytochemische Markierungen wurden die Zellen identifiziert. Die glatten Muskelzellen wachsen zu einem konfluenten Monolayer und zeigten bei regelmäßiger Subkultivierung eine exponentielle Wachstumsphase. In anschließenden Experimenten wurden diese Zellen verschiedenen Entzündungsmediatoren ausgesetzt und die Proliferationsrate mit Hilfe des [ 3 H] Thymidineinbaues bestimmt. Zur Anwendung kamen Endothelin1, Interleukine und Tumornekrosefaktor a. Die stärksten Wachstumsstimulatoren waren TNFa (2,5 ng/ml), IL1ß (50 U/ml) und Eth (0,1 µg/ml). Die Wachstumsraten wurden um ca. 2535 % gegenüber der Kontrolle gesteigert. Mit TNFa und IL1ß in den gleichen Konzentrationen wurden auch additive Effekte gefunden. Zur Beschreibung der intrazellulären Signalwege, die durch die Einwirkung der verschiedenen Substanzen aktiviert werden, wurden in einem weiteren Ansatz die Proteinkinase C (PKC) durch Staurosporin sowie die Tyrosinkinase (TK) durch Genistein inhibiert. Es konnte nachgewiesen werden, daß vorwiegend die PKC für die Induktion der Proliferation durch TNFa oder IL1 verantwortlich ist. Der Einfluß von Cyclosporin A (CSA) unter den Stimulationsbedingungen war nun von besonderem Interesse. Es zeigte sich keine deutliche Hemmung der zytokin induzierten Proliferation durch CSA im Vergleich zur Kontrolle. Da die Zellen im natürlichen Gewebeverband einer gegenseitigen Wachstums kontrolle unterliegen, wurde in einem zusätzlichen Ansatz Kulturüberstand von Endothelzellen, die ebenfalls aus der Nabelschnur isoliert wurden, mit den glatten Muskelzellen inkubiert. Dieser Überstand wurde nach 3 Tagen von den Endothel zellen gewonnen und hemmte in Konzentrationen von 1% und 10% das Wachstum der glatten Muskelzellen. Wurden die Endothelzellen mit TNFa stimuliert (vorinkubierter Überstand), so hatte dieser Überstand eine ähnliche Wirkung auf glatte Muskelzellen. Am deutlichsten konnte in dieser Versuchsserie gezeigt werden, daß die glatten Muskelzellen für eine zusätzliche TNFaStimulation (2,5 ng/ml) sensibilisiert werden, wenn sie mit dem TNFa vorinkubierten Endothelzellüberstand versetzt wurden. Die zelluläre Aktivierung durch Zytokine wird über die Proteinkinase C vermittelt. Cyclosporin A hat keine protektive Wirkung auf die zytokinvermittelte Zellaktivierung bei den untersuchten humanen glatten Muskelzellen.
In diesen kurz bis mittelfristig erhobenen Daten hatte sich das LCS Kniegelenkssystem als Kniegelenkersatz bewährt. Die Indikation war breit zu stellen. Achsenabweichungen in der Frontalebene bis 30° und Instabilitäten des Seitenbandapparates bis 15° konnten mit dieser Endoprothese korrigiert werden. Die chronische Polyarthritis, auch mit kompletten Befall des Bewegungssystems, mit den Folgen von Muskelschwäche, Bänderdestruktion und Osteoporose wurde erfolgreich mit diesem Implantat versorgt. Gelenknahe Destruktionen mit Schwächung des implantattragenden Knochens durch starke Osteoporose oder zystische Defekte, ließen sich unter Auffüllung mit autologer Spongiosa und Verankerung des Implantates mit Zement operativ beherrschen. Die Verwendung der zementfrei zu implantierenden Version mit poröser Oberfläche zeigte radiologisch enge Knochenimplantatverbindung. Die Ergebnisse unterschieden sich kumulativ von den zementierten Fällen kaum. Die knochenresektionssparende Implantationstechnik bot bei einem notwendig werdenden Ausbau breiten Rückzug auf andere Modelle. Bei den implantatkritischen Komponenten, Tibiaplateau und Retropatellarersatz, wurde zur Verankerung der tibialen Komponente ein zentraler Fixationsstem verwendet. Nach dem Prinzip der low friction sind Plateau und rotierende Patella "metalbacked". Allerdings wurde wegen des Verdachts eines KnochenMetall Kontaktes bei der rotierenden Patellaversion zuletzt die Versorgung mit einem einfachen retropatellaren Knopf favorisiert. In den fünf Fällen bikompartimenteller Versorgung zeigte sich ein ausgezeichnetes Ergebnis hinsichtlich Schmerzreduktion und Fähigkeit zum Treppensteigen. Die radiologische Auswertung zeigte keine Korrelation zwischen Saumbildung und klinischem Resultat. Eine durchgehende Saumbildung mit Positionsänderung der Prothese, also radiologische Lockerung, fand sich nicht. Ebenso zeigte sich keine Dislokation der Polyäthylenlager an Patella und Tibia. Die Rate revisionsbedürftiger Fälle lag bei 10%. Darunter fielen drei TEPWechsel und drei Fälle operativer Lysen bei fibröser Steife. Bei der klinischen Untersuchung des Patientengutes war in keinem Fall eine massive dorsale Subluxation in 90° Beugung bzw. diesbezüglich eine Beschwerdeangabe durch den Patienten zu erheben. Ebenso zeigte sich keine massive Aufklappbarkeit bei Valgus oder Varusstreß. Die Achsenverhältnisse konnten in fast allen Fällen befriedigend wiederhergestellt werden.
In dieser Arbeit wurde das Hauptkapsidprotein VP1 des murinen Polyomavirus zum Transfer von DNA in eukaryontische Zellen eingesetzt. Das murine Polyomavirus wird der Familie der Papovaviridae zugeordnet. Die Viren dieser Familie sind durch nichtumhüllte, ikosaedrische Kapside gekennzeichnet. Die äußere Hülle wird aus 72 VP1Pentameren gebildet, an die sich intern je ein VP2 bzw. VP3Molekül anlagert. Das Strukturprotein VP1 ist aufgrund folgender Eigenschaften für eine DNABeladung und Transfektion in eukaryontische Zellen prädestiniert: 1. Es wurde am NTerminus von VP1 eine DNABindungsdomäne identifiziert. 2. Es konnte am NTerminus von VP1 eine Kernlokalisationssequenz nachgewiesen werden. 3. Es wurde die exakte Rezeptorerkennungssequenz innerhalb der VP1Struktur bestimmt. 4. VP1 ist in der Lage, nach einer rekombinanten prokaryontischen Expression unter Hochsalzbedingungen zu Kapsoiden zu assemblieren. In dieser Arbeit wurde ein rekombinantes, in E. coli exprimiertes VP1Protein verwendet und hinsichtlich seiner DNABindung und der Fähigkeit zum DNATransfer in eukaryontische Zellen charakterisiert: 1. Das vorhandene Aufreinigungsprotokoll konnte optimiert werden. Die Proteinausbeute aus 1 l Bakteriensuspension wurde von 1,8 mg auf 3 mg gesteigert. Gleichzeitig wurde die Kontamination mit Fremdprotein deutlich reduziert. Es konnten die Ergebnisse hinsichtlich der Kapsoidassemblierung unter Hochsalzbedingungen reproduziert werden. 2. Cytotoxizitätstests in NIH 3T3Zellen belegten, daß die getesteten VP1Kapsoid Konzentrationen (ca. 25 µg/ml) keine signifikanten Anzeichen einer toxischen Reaktion zeigten. 3. Der Vergleich zwischen dem Kapsoid ohne HisTag und mit HisTag (Nterminale Klonierung eines 6xHisAffinitätsTags) zeigte, daß durch den HisTag die Bindung von einzelsträngiger DNA an das Kapsoid von 37% auf 55% erhöht werden konnte. Es wurde aber auch eine konzentrationsabhängige Aggregation des VP1Proteins mit HisTag beobachtet. In späteren Arbeiten wurde aus diesem Grund bevorzugt das VP1Protein ohne HisTag eingesetzt. 4. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine Transfektion von eukaryontischen Zellen, in diesem Fall den NIH 3T3Zellen, mit rekombinanten VP1Kapsoiden nachgewiesen werden. Nach Beladung von VP1Kapsoiden mit fluoreszenzmarkierter einzelsträngiger DNA konnte eine eindeutige intrazelluläre Fluoreszenz in den NIH 3T3Zellen beobachtet werden. Diese Fluoreszenz war diffus im Cytoplasma und distinkt im Nukleus lokalisiert. 5. Die biologische Aktivität der über VP1 in die Zelle transportierten einzelsträngigen DNASequenzen wurde mit einer Reduktion der bcl2Expression in MOLT4 Zellen überprüft. Die VP1Kapsoide zeigten im Vergleich zu DOTAP als Transfersystem und Aufnahme freier einzelsträngiger DNA die höchste Antisense Wirkung. Die verwendeten modifizierten Oligodesoxynukleotide zeigten jedoch eine nichtsequenzspezifische Reduktion des Proteinlevels. 6. Nach Beladung von VP1Kapsoiden mit PlasmidDNA unter Hochsalzbedingungen konnte in Transfektionsversuchen der erfolgreiche Transport der verwendeten PlasmidDNA in den Nukleus der Zielzelle über die Expression des Markergens (EGFP) nachgewiesen werden. 7. Im Hinblick auf eine Verbesserung der Transfektionseffizienz wurde die Beladung von VP1 mit DNAKondensaten getestet. Nach Einsatz von Histonen für eine DNAKomplexierung wurden Partikel detektiert, die vor allem aufgrund ihrer Größe nicht für eine Beladung mit VP1 geeignet waren. Als ein zweites Kondensationsagenz wurden polykationische Polyamidoamine, auch Dendrimere genannt, untersucht. Nach Einsatz von kondensierter, fluoreszenzmarkierter doppelsträngiger DNA konnte zusammen mit VP1Pentameren eine wesentlich stärkere Fluoreszenz innerhalb des Cytoplasmas der transfizierten Zellen im Vergleich zur Transfektion von DendrimerDNAKondensaten ohne VP1 nachgewiesen werden. Es konnte jedoch in keinem getesteten Kondensationsansatz in Anwesenheit von VP1 ein Transport der eingesetzten PlasmidDNA zum Nukleus der eukaryontischen Zellen beobachtet werden.
Typ 1 Diabetes mellitus ist ein durch Insulinmangel bedingter Defekt der Glukoseverwertung, der durch eine autoimmune Zerstörung der pankreatischen betaZellen verursacht wird. Als häufigste Autoimmunerkrankung Jugendlicher und junger Erwachsener in den Industrienationen stellt sie durch ihre stetig steigende Inzidenz eine bedeutende medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Etwa 50% des Risikos, an Typ 1 Diabetes mellitus zu erkranken, wird exogenen Faktoren zugeschrieben, für die anderen 50% macht man genetische Faktoren verantwortlich. Etwa die Hälfte des genetischen Risikos wird durch die HLARegion vermittelt. Neben seiner "klassischen" Rolle im Rahmen der Calcium und Phosphat-Homeostase wirkt Vitamin D auch antiproliferativ und immunmodulierend. 1,25(OH) 2 D 3 inhibiert die Aktivierung von Lymphozyten, die Expression von HLA Klasse II-Molekülen und interagiert mit der Produktion von Zytokinen und Antikörpern. Tierexperimentell eignet sich Vitamin D zur Prävention von AutoimmunDiabetes, Thyreoiditis und Enzephalitis. Wichtige Komponenten des Vitamin D Endokriniums stellen die (monomorphen) ana und katabolen Enzyme des Vitamin D Stoffwechsels sowie der nukleäre Vitamin D Rezeptor (VDR; Chromosom 12q12q14) und das Vitamin D bindende Protein (DBP; Chromosom 4q11q13) dar. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische Polymorphismen von VDR [FokI, BsmI, ApaI, TaqI] und DBP [(TAAA) n Repeat, StyI, HaeIII] im Rahmen einer Familienanalyse auf eine Assoziation mit Typ 1 Diabetes mellitus untersucht. Die Haplotypen der am 3'Ende des VDRGens gelegenen Polymorphismen BsmI, ApaI und TaqI waren mit Typ 1 Diabetes in der hier untersuchten, kaukasischen Population assoziiert. Das Bestehen einer Assoziation derselben 3'VDRPolymorphismen mit Typ 1 Diabetes bei Asiaten bestätigt die Ergebnisse dieser Arbeit. Während die Vererbungsmuster der Konditionierun gen hinsichtlich des Alters der Patienten, maternaler bzw. paternaler Transmission und CTLA Exon 1Genotypen nicht von den erwarteten Häufigkeiten abwichen, bestand ein deutlicher Unterschied für die Konditionierung entsprechend der HLADR/DQHaplotypen und eine grenzwertige Differenz für das Geschlecht der Patienten. Kein Abweichen von den erwarteten Vererbungshäufigkeiten wurde hingegen für die DBPPolymorphismen beobachtet. Auch hier ergab sich für die Konditionieungen entsprechend des Alters und des Geschlechts der Patienten sowie bezüglich maternaler bzw. paternaler Transmission und CTLA Exon 1Genotypen kein Unterschied zwischen den jeweiligen Subgruppen. Die Konditionierung nach HLADR/DQHaplotypen ergab ein grenzwertig signifikantes Abwei chen von den erwarteten Werten. Eine Assoziation von genetischen Polymorphismen des nukleären Vitamin D Rezeptors mit Typ 1 Diabetes mellitus legt funktionelle Unterschiede der VDRHaplotypen bei der Vermittlung der immunmodulatorischen Vitamin DWirkung nahe. Positive Assoziationsstudien von VDRPolymorphismen mit Osteoporose, diversen Malignomen und Psoriasis stützen diese Hy pothese indirekt. Da teilweise ''gegenteilige" Haplotypen ein erhöhtes DiabetesRisiko bei Asiaten und Kaukasiern vermitteln, scheinen die hier betrachteten Polymorphismen lediglich Marker einer mit ihnen im Linkage Disequilibrium stehenden, kausalen genetischen Variante zu sein. Die Unterschiede in der Vererbung der VDRHaplotypen an weibliche und männliche Patienten sowie die differentielle Transmission der VDRAllele entsprechend der HLADR/DQHaplotypen unterstreicht die genetische Heterogenität von Typ 1 Diabetes mellitus in der hier untersuchten kaukasischen Population. Vor dem Hintergrund des vielfältigen Einflusses von Vitamin D auf Faktoren, die am Entstehen von Typ 1 Diabetes und Autoimmunität beteiligt sind, erscheint ein für die VDRAs soziation kausaler Polymorphismus innerhalb dieses Rezeptorgens wahrscheinlicher als ein kausaler Polymorphismus außerhalb desselben. Seine herausragende Bedeutung bei der Vermittlung der immunmodulatorischen Eigenschaften von Vitamin D macht den nukleären Vitamin D Rezeptor zum potentiell interessanten ''Hebel" für eine medikamentöse Prävention und Therapie von Typ 1 Diabetes mellitus und anderen Autoimmunerkrankungen.
Hintergrund: Einer der wichtigsten Gründe für das Therapieversagen von Zytostatika ist die MDR von malignen Zellen. Deren Modulation mit sogenannten Chemosen sitizern scheint ein erfolgversprechender Therapieansatz zu sein, so daß zahlreiche in vitro Studien initiiert wurden. Jedoch beachten diese Studien nur selten den Effekt der Proteinbindung auf die zelluläre Aufnahme von Zytostatika und der Wirkung von Chemosensitizern. Der Vorhersagewert der in vitro Tests für die in vivo Effektivität steht somit zur Diskussion. Die Ziele dieser Untersuchung waren es deshalb a) die Bindungscharakteristiken des Anthrazyklins IDA in HS und Zellkulturlösungen zu bestimmen, b) den Effekt der Proteinbindung, sowie des Chemosensitizers RVRP und des AkutPhaseProteins AGP, auf die Aufnahme und Retention von IDA in eine humane HL60 Leukämiezellinie zu untersuchen und c) die Bedeutung der Proteinbin dung für die in vivoAktivität von Zytostatika und Chemosensitizern zu analysieren. Methoden: Die Proteinbindung von IDA wurde mit Hilfe der Gleichgewichtsdialyse in HS und gebräuchlichen Zellkulturlösungen bestimmt. Die Zellaufnahme und Retention von IDA wurde in einer sensiblen und einer Pgpexprimierenden, resistenten humanen Leukämiezellinie (HL60 und HL60Vinc), sowie in Lymphozyten gesunder Probanden untersucht. Die Versuchsbedingungen wurden durch verschiedene Inkubationsmedien und die Zugabe von RVRP und AGP variiert. Die IDA Konzentration wurde spektrophotofluorometrisch analysiert. Ergebnisse: In den untersuchten Inkubationsmedien variierte die freie Fraktion von IDA um mehr als 7fach von ungefähr 60% in 15% FCS/PBS zu nur 8% in HS. In den Zellinien HL60 und HL60Vinc war die zelluläre Aufnahme von IDA in dem Medium mit niedrigen Proteinkonzentrationen ungefähr dreimal höher als in HS. Die Bedeutung von Pgp für das Resistenzverhalten der Leukämiezellinie zeigte sich durch die erniedrigte Akkumulation von IDA in den resistenten Zellen. RVRP konnte in allen Medien die Differenz der IDA Aufnahme und Retention zwischen der sensiblen und der resistenten Zellinie aufheben. Jedoch konnte RVRP nicht den Effekt von hohen Proteinkonzentrationen auf die IDA Aufnahme ausgleichen. In Anwesenheit von AGP konnte sowohl in den Medien mit hohen als auch niedrigen Protein konzentrationen nur eine sehr geringe Chemosensitizerwirkung nachgewiesen werden. Das Akkumulationsverhalten der Lymphozyten glich der sensiblen HL60 Zellinie. Schlußfolgerung: Proteinbindungsphänomene können die Aktivität von Zytostatika und Chemosensitizern erheblich beeinflussen. So ist in vitro die Serumproteinbindung eine wichtige Determinante für die zelluläre Aufnahme von IDA. Der Modulationseffekt von RVRP reagiert weniger sensitiv auf Unterschiede in der Gesamtproteinkonzentration, allerdings kann er durch erhöhte AGP Konzentrationen, wie sie bei Tumorpatienten vorkommen, erheblich beeinflußt werden. Bei der Interpretation von in vitro funktionellen Tests der zytostatischen Effektivität und Chemosensitizerwirkung sollte daher die Serumproteinbindung berücksichtigt und Untersuchungen in HS einbezogen werden.
Functional expression of recombinant N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors in eukaryotic cell lines
(2000)
Methodik: Die in dieser Arbeit entwickelte flowzytometrische Methode ist aufgrund der guten Korrelation zur gängigen Europium Immune Release Methode zur Bestimmung der NK-Zell-, bzw. CD 8 , zytotoxischen T-Lymphozyten Aktivität gut geeignet. Der geringe Zeit- und Kostenaufwand sprechen für die Anwendung dieser Methode. Enzympräparation: Die in dieser Arbeit verwendete Enzympräparation kann die NK-Zell bzw. CD 8 , zytotoxischen T-Lymphozyten Aktivität signifikant steigern. Eine signifikante Mehrfachstimulation ist ebenfalls möglich. Möglicherweise beruht dieser Effekt auf einer erhöhten Freisetzung von TNFa durch die Effektorzellen, die die Targetzellen zum (programmierten) Zelltod bringen. Ferner wird über die Freisetzung weiterer Zytokine berichtet, die eine Stimulierung der Effektorzellen bewirken (durch IL1b und IL6). Immunkomplex gebundene TNFa Moleküle können durch die proteolytische Aktivität freigesetzt werden. Die Ergebnisse weisen auf eine unspezifische Veränderung der Membranbestandteile der Effektorzellen hin, welche eine Freisetzung von Zytokinen bewirkt. Ferner kann die proteolytische Aktivität der Enzympräparate verschiedene Immunkomplexe und sogenannte Blockingfaktoren auflösen. Fazit: Eine signifikante und konzentrationsabhängig immunstimulierende Wirksamkeit der Enzyme ist gegeben. Diskussionswürdig dürfte hier nur die enterale Resorption bzw. Persorption sein (s.Kap I). Die parenterale Applikation ist wegen einer anaphylaktischen Reaktion risikoreich. Denkbar wäre eine ex vivo "Therapie" isolierter humaner Lymphozyten mit anschließender Wiederzufuhr in den Kreislauf. Die Aktivierenden Konzentrationen für die Enzyme liegen im Bereich von 20 bis 160 µg/ml bei einer Einfachstimulation. Bei höheren Konzentrationen als 320 µg/ml beginnt der toxische Bereich. Bei der Mehrfachstimulation von Lymphozyten liegt der aktivierende Bereich zwischen 10 bis 80 µg/ml, wobei die höheren Konzentrationen toxisch wirken. Retinoide: Eine konzentrationsabhängige signifikante Steigerung der NK-Zell- bzw. CD 8 , zytotoxischen T-Lymphozyten Aktivität ist gegeben. Die NK Zellaktivität konnte bei Konzentrationen von 10 8 bzw. 10 6 M mit Retinsäure und Retinol gesteigert werden, die Aktivität von CD 8 zytotoxischen T-Lymphozyten hingegen nur durch Retinsäure. Das Lösungsmittel DMSO bewirkte keine signifikante Aktivitätsänderungen. Diskutiert wird hier eine erhöhte Expression des IL2-Rezeptors sowie die des CD3 Rezeptors, als Ursache für die Aktivitätssteigerung führen soll. Der Fas-Ligand hingegen wird herabreguliert, was eine "Selbsttötung" der Effektorzellen verhindert. Die vermehrte Produktion von Zytokinen (IL2, IL4, IL6, IL10 und IFNgamma), deren Gehalt die im Überstand Retinol behandelter Zellen zunimmt, kann ebenfalls zur Aktivitätssteigerung führen.
Für eine erhebliche Patientenanzahl gestaltet sich bei kurativ reseziertem Primärtumor eine hepatische Metastasierung zum limitierenden Faktor für die Überlebenszeit. Aufgrund des speziellen Metastasierungsverhaltens ist das hauptsächlich die Gruppe der kolorektalen Primärtumoren, die eine hohe Inzidenz an hepatischen Filiae aufweist. Bisher profitieren nur eine sehr geringe Anzahl der Betroffenen von der Möglichkeit der operativen Resektion solitärer Läsionen. Über 70% dieser Fälle erleiden jedoch wieder intrahepatische Tumorrezidive. Die systemische oder regionale Chemotherapie konnte bisher im Vergleich zu resezierten Patienten nur geringe Verbesserungen der Überlebenszeiten bei oftmals erheblichen Einschränkung der Lebensqualität erzielen. Vor diesem Hintergrund wurde die minimal invasive Laserinduzierte Thermotherapie (LITT) entwickelt, mit der es möglich ist, perkutan gezielt Tumoren in soliden parenchymatösen Organen zu zerstören. Dabei kann das umgebende Gewebe maximal geschont und der Eingriff in lokaler Anästhesie mit einem sehr kurzem Krankenhausaufenthalt und in Kürze auch ambulant durchgeführt werden. Voraussetzung für den optimalen Erfolg eines regionalen Verfahrens ist die genaue topographischen Darstellung der erzielten Koagulationsnekrose während und nach der Intervention. Die Magnetresonanztomographie hat sich bei dieser Aufgabe als nichtinvasives und genaues Instrument zur Dokumentation der intraoperativen Temperaturausbreitung durch temperatursensitive T1gew. Sequenzen und mittels optimierter Sequenzprotokolle zur Nachkontrolle der laserinduzierten Nekrosen erwiesen. Die vorliegenden Daten für eine Gruppe von 41 Patienten aus einer frühen klinischen Phase (Phase 2) behandelt mit konventionellen Applikatorsystemen und Leistungen bis zu maximal 5,6 Watt, dokumentieren eine gute lokale Tumorkontrollrate für 3 Monate und eine noch akzeptable Remissionsrate für die 6 MonatsKontrolle. Für die Gruppe der kolorektalen Karzinome konnten mittlere Überlebenszeiten von 29 Monaten dokumentiert werden. An Nebenwirkungen traten lediglich nicht therapiebedürftige Pleuraergüsse und subkapsuläre Hämatome auf, was den patientenschonenden, minimal invasiven Charakter des Verfahrens unterstreicht. Die nach der KaplanMeierMethode berechneten kumulativen Überlebensraten von etwa 28 Monaten im Vergleich zu unbehandelten Lebermetastasen sind unter der Berücksichtigung der überwiegend palliativen Ausgangssituation der Patienten als Erfolg zu betrachten. Hier können mit weiter optimierten Applikationssystemen in der 3. Phase der klinischen Entwicklung weit höhere lokale Kontrollraten dokumentiert werden, deren Auswirkung auf die Gesamtüberlebenszeit noch untersucht werden muß. Damit wurde mit der MRgesteuerten LITT ein neues minimal invasives Therapieverfahren zur Erlangung einer lokalen Tumorkontrolle entwickelt, das in palliativer, aber auch in einzelnen Fällen in kurativer Situation eine Therapieoption für Patienten mit Lebermetastasen vor allem kolorektaler Tumoren bietet. Die gute Verträglichkeit mit der Beschränkung auf Lokalanästhesie macht auch die Behandlung von Patienten vertretbar, die durch lange Chemotherapie stark in der Lebensqualität eingeschränkt sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein durch Zellschrumpfung aktivierter nichtselektiver Kationenkanal, der in der M1 Sammelrohrzellinie der Maus bereits früher beobachtet worden war [Volk et al., 1995], hinsichtlich seiner Selektivität, seines Inhibitorspektrums und seines Aktivierungsmechanismus mittels der Patch ClampTechnik näher charakterisiert, und es wurde geprüft, ob dieser oder ein ähnlicher Kanal auch von anderen Zellinien exprimiert wird, wobei außer epithelialen Zellinien (HT 29 , BSC1) auch solche aus Muskel (A10) und Ner vengewebe (Neuro2a) untersucht wurden. Zellschrumpfung in symmetrischer NaClLösung mit Zusatz von 100 mM Saccharose im Bad stimulierte einen von Kationen getragenen Einwärtsstrom. Während der initialen Phase der Aktivierung durch extrazelluläre Hyperosmolarität konnten Schaltvorgänge von Einzelka nälen beobachtet werden. Die Einzelkanalleitfähigkeit in den verschiedenen Zellinien betrug 15 bis 27 pS. Der Strom stieg nach wenigen Minuten um das 30 bis 60fache an. Austausch des extrazellulären Natriums durch das schlecht permeierende NMDG führte zum kompletten Sistieren des Einwärtsstroms. Die Aktivierung des nichtselektiven Kationenstroms war unab hängig von der absoluten Osmolarität der Badlösung. Sie wurde ausschließlich durch osmo tisch bedingte Volumenabnahme (Schrumpfung) der Zellen hervorgerufen, wobei die Zell schrumpfung der Aktivierung des Stroms geringgradig vorauseilte. Die Aktivierung durch Zellschrumpfung war reversibel und konnte mit dem gleichen Zeitverlauf und mit der glei chen Leitfähigkeitszunahme auch zweimal hintereinander ausgelöst werden. Die stimulierte Kationenleitfähigkeit war hochselektiv für Kationen über Anionen, aber nichtselektiv für die monovalenten Kationen NH 4 , Natrium, Kalium und Lithium (Leitfähig keitssequenz NH 4 > Na > K > Li ). Für divalente Kationen wie Kalzium und Barium war keine Leitfähigkeit meßbar. Flufenaminsäure (100 µM) hemmte den stimulierten Einwärts strom um mehr als 80 %, Diphenylamin2Carboxylsäure (DPC) und sein Derivat Dichlor DPC (DCDPC) hatten einen etwas geringeren Hemmeffekt. Noch schwächer hemmte LOE 908. Amilorid, Quecksilber und Bumetanid hatten praktisch keine Hemmwirkung auf den stimulierten Einwärtsstrom. Maitotoxin, ein Aktivator mancher nichtselektiver Kationenka näle, hatte unter isoomotischen Bedingungen keine stimulatorische Wirkung auf den Strom. Im Gegensatz zum Ca 2 aktivierten nichtselektiven Kationenkanal, der in exzidierten Membranflecken beobachtet wird, war die Aktivierung des schrumpfungsinduzierten nicht selektiven Kationenkanals unabhängig von der zytoplasmatischen Ca 2 Konzentration. Das Ausmaß der Stimulation war allerdings vermindert, wenn die Pipettenlösung hohe Konzen trationen von Kalziumchelatoren (10 mM EGTA oder 10 mM BAPTA) enthielt. Dagegen hemmte Magnesiumentzug die Antwort auf Zellschrumpfung fast vollständig. ATP in Kon zentrationen bis 10 mM in der Pipettenlösung konnte die Aktivierung des Einwärtsstroms nicht verhindern, nur reduzieren. Dagegen unterdrückte ATPVerarmung der Zellen (durch Inkubation mit Rotenon und 2Deoxyglukose) die Antwort auf Zellschrumpfung völlig. Auch durch Zusatz von 1 mM ATP zur Pipettenlösung konnte die Antwort in ATPverarmten Zel len nicht wiedergewonnen werden, obwohl die Zellen nach Auswaschen der Stoffwechsel gifte wieder normal reagierten. Die Proteinkinasehemmstoffe Staurosporin und Calphostin C (beide in der Konzentration von 1 µM) konnten die Antwort unterdrücken. Einige auf das Zytoskelett wirksame Substanzen (Cytochalasin D und Taxol) hatten ebenfalls hemmende Wirkungen. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, daß der schrumpfungsaktivierte nichtselekti ve Kationenkanal offenbar ubiquitär exprimiert wird. Der Aktivierungsmechanismus ist kom plex und abhängig von intrazellulärem ATP und Magnesium. Vermutlich sind Proteinkinasen und Zytoskelettelemente an der Kanalaktivierung beteiligt. Der Kanal dürfte im Rahmen der Zellvolumenregulation von Bedeutung sein und spielt möglicherweise eine Rolle für Zellpro liferation und Apoptose.