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Unsere Kultur beinhaltet zahlreiche Vorstellungen darüber, welche Probleme in Liebesbeziehungen auftreten können, welche Ursachen diese Probleme haben und wie mit ihnen umzugehen sei. Dominiert wurden diese Vorstellungen in der Literatur zwischen Empfindsamkeit und Romantik bekanntermaßen durch einige wenige epochenübergreifende Motive: Untreue, der Gegensatz von gesellschaftlicher oder moralischer Pflicht und Neigung, der Tod des anderen, einseitige und verhinderte Liebe bildeten die immer wiederkehrenden Konfliktursachen der meisten Liebesgeschichten. Dabei floss die Geschlechterdifferenz in die Darstellungen zwar stets mit ein, wurde aber in der Regel als solche nicht reflektiert. Die in der Arbeit untersuchten Texte zeigen nun, dass neben diesen typischen Liebesgeschichten auch eine bisher kaum beachtete Ideentradition besteht, die Liebeskonflikte explizit unter dem Aspekt der Geschlechterdifferenz beschreibt und dieser Differenz eine grundlegende Bedeutung beimisst. Dabei konnte für die fünf in dieser Arbeit ausgewählten Konfliktfelder Folgendes festgestellt werden: Egalitäre Liebe versus männliche Eheherrschaft Ein breit diskutiertes Konfliktfeld betrifft das Verhältnis von egalitärer Liebe und männlicher Eheherrschaft. Seit der Mitte des 18. Jahrhunderts setzt sich in Deutschland die Idee der Liebesehe durch, wobei Liebe oftmals ausdrücklich im Gegensatz zu jeglicher Form von traditioneller Herrschaft zwischen den Geschlechtern begriffen wird. Sozial gedeckt muss sie in die Ehe führen. Dort wird aber nicht nur praktisch, sondern auch theoretisch bis ins 20. Jahrhundert hinein an der Herrschaft des Mannes über die Frau festgehalten. Wie reflektiert sich dieser Gegensatz um 1800? Ich habe in meiner Arbeit unter dieser Perspektive eine Reihe von literarischen, philosophischen und populärpädagogischen Texten untersucht, die einen ersten Eindruck der eher theoretisch-normativen Diskurse dieser Zeit geben. Die Autoren sind Gellert, Kant, Fichte, Hegel und Campe. Dem stelle ich ein populäres Lustspiel von August von Kotzebue und einen autobiographischen Text die Jugenderinnerungen von Elisa von der Recke gegenüber. Diese Texte ermöglichen es, der theoretischen eine eher alltagsorientierte Sichtweise des Problems zur Seite zu stellen. Für die philosophisch-pädagogischen Schriften lässt sich Folgendes erkennen: Erstens wird der Widerspruch zwischen egalitärer Liebe und männlicher Eheherrschaft, entsprechend einer Grundkategorie der Zeit, vorwiegend entlang der Differenz Vernunft Natur bearbeitet. Aufgeboten werden unterschiedliche Varianten einer geschlechterdifferenzierten Anthropologie, die sich teilweise direkt widersprechen (zum Beispiel bei Kant und Fichte). Zweitens wird an die Vernunft und Klugheit appelliert. Dies geschieht ebenfalls widersprüchlich, nämlich entweder in konsensorientierter (Gellert) oder aber manipulativer Ausrichtung (Kant und Campe). Eine allgemein getragene argumentative Problemlösung ist nicht zu erkennen, verbindendes Element ist jedoch die vermittelnde Funktion: Liebe und Herrschaft werden für kompatibel erklärt. Demgegenüber beinhalten die Texte von Kotzebue und Elisa von der Recke auch eine andere Diskursform. Bei Kotzebue zeichnet sich momenthaft das Bild einer durchaus emanzipierten Frau ab, deren Verhalten zu den vorherrschenden weiblichen Normen des literaturwissenschaftlichen Kanons nicht recht passen will. Hier könnten sich - dem wäre aber erst genauer nachzugehen - Tendenzunterschiede zwischen der sogenannten hohen und der Unterhaltungsliteratur der Zeit abzeichnen. Während bei Kotzebue die Eheherrschaft aber letztlich affirmiert wird, zeichnet Elisa von der Recke in ihren Jugenderinnerungen anhand dreier Frauengenerationen das Bild einer Lebenswelt, für die das Spannungsverhältnis von Liebe und Patriarchat sowohl identitätsstiftend als auch kaum überbrückbar erscheint. Die zahlreichen Klugheitsratschläge der Zeit bedeuten letztendlich für die Frau, nicht aber für den Mann, einen Verzicht auf die "wahre" gegenseitige Liebe. Gemeinsame Weltsicht versus Zunahme der Individualität Zu diesem Konfliktfeld untersuchte ich exemplarisch die Erzählung Der Sandmann von E.T.A. Hoffmann. Hoffmanns Text erweist sich in dieser Perspektive als eine differenzierte Satire genau dieser Problematik und verschiedener Strategien, unter patriarchalen Bedingungen mit ihr umzugehen. Der Autor illustriert an der Figur Nathanaels ein Extrem an mangelnder Anpassungsleistung und der Neigung zur Projektion gewünschter Eigenschaften auf die Geliebte zur Vermeidung eigener Veränderung. Er weist dies deutlich als ein geschlechtsspezifisches Verhaltensschema aus. Dem korrespondieren auf je unterschiedliche Weise die weiblichen Figuren der Erzählung. Dabei wird an der Figur Olimpias vorgeführt, wie absurd sich eine patriarchal verordnete Bestätigung darstellt. Hoffmann erkennt damit das soziale Bestätigungsproblem gesteigerter Individualität als ein allgemein bürgerliches, führt das Scheitern der Lösung dieses Problems in der patriarchalen Liebesbeziehung vor und verweist so bereits auf eine wesentliche Ursache der heutigen Krise traditioneller Beziehungsmuster. Geschlechterstereotypen versus Wahrnehmung von Individualität Der Liebesdiskurs des 18. Jahrhunderts fordert seit der Empfindsamkeit die genaue Kenntnis der Individualität des Geliebten als Voraussetzung wahrer Liebe. Zugleich jedoch bewegen sich Liebende in einem Umfeld, das den sozialen Umgang über stereotype Geschlechterbilder strukturiert, die eine Wahrnehmung des anderen als Individuum gerade verstellen können. Inwieweit wird dies im 18. Jahrundert als Problem wahrgenommen und verarbeitet? Hier zeigt meine Arbeit, unter anderem anhand des frühempfindsamen Briefwechsels zwischen Meta Moller und Friedrich Gottlieb Klopstock, exemplarisch Folgendes: Klopstock, der als Inbegriff des empfindsamen Dichters gilt, zeigt zumindest in den Briefen an seine spätere Frau kein Bewusstsein dieser Problematik. Er bleibt in seiner Kommunikation bei einer vorempfindsamen Konfliktwahrnehmung stehen. Moller hingegen bringt die Bilderproduktion der Geschlechterdifferenz als störenden Faktor der Annäherung deutlich zur Sprache. Sie befürchtet, Klopstock könne sich ein durch Weiblichkeitsentwürfe entstelltes Bild von ihr machen, er könne sie als Muse funktionalisieren und/oder sei an ihren ernsthaften Seiten "sie ist ja nur eine Frau" nicht interessiert. Darüber hinaus konfrontiert sie Klopstock in sarkastisch-ironischem Ton mit seinem Fehlverhalten. Insofern ist die These Ulrike Prokops, Meta Moller setze typisch für Frauen ihrer Generation Selbstverleugnung und narzisstische Identifikation an die Stelle aktiver Auseinandersetzung, kritisch zu ergänzen. "Schale Alltäglichkeit" versus "Die große Liebe" Ehen werden, um es mit Luhmann zu pointieren, im Himmel geschlossen und im Auto geschieden. Das Ideal der Liebesehe stellt an die Gatten Anforderungen an Aufmerksamkeit und Zuwendung, die in einem durch Geschlechterrollen differenzierten gemeinsamen Alltag schwer zu erfüllen sind. Viele der untersuchten Texte dieser Arbeit verweisen auf dieses Problem. Eine der dichtesten Auseinandersetzungen damit findet sich jedoch in der Erzählung Das mißlungene Opfer von Therese Huber: Huber legt hier eine vielschichtige Reflexion über Liebes- und Eheprobleme vor, die durch Bezüge zu Goethes Werther stereotype Leseerwartungen des Publikums (Pflicht versus Neigung) herausfordert. Diese Leseerwartungen konfrontiert sie dann mit der Darstellung der geschlechterdifferenzierten Arbeitsteilung in der bürgerlichen Ehe. Zugleich dokumentiert sie verschiedene weibliche Attributionsmuster, die den Alltag männlicher Lieblosigkeit entschuldigen. Der Text changiert dabei zwischen Alltagsdarstellung und bis ins surreal-komische getriebenen Situationen kommunikativer Entfremdung, überlässt es aber der Leserin, eigene Erfahrungen und Sehnsüchte im Text bestätigt oder hinterfragt zu finden. Weibliche Pflichterfüllung versus Bedürfnis nach individuellem Glück Die Idee der Liebesehe ist an die Freiwilligkeit der Partnerwahl und eines glücklichen Zusammenlebens gebunden. Sozialgeschichtlich betrachtet wurden Ehen aber um 1800 bekanntermaßen häufig gegen den Willen der Frau geschlossen; und sie verliefen für diese häufig nicht glücklich. Eine bislang kaum zur Kenntnis genommene umfangreiche Darstellung der Lage und Emanzipation einer Frau in einer solchen unglücklichen Zwangsehe sind die Eheerinnerungen Elisa von der Reckes. Der Text ist, wie sich zeigen lässt, entgegen der Überzeugung seines Herausgebers, keine Sammlung von Briefen, sondern eine literarische Bearbeitung und Ergänzung der Tagebücher der Autorin. Die Autorin legt hier eine ungewöhnlich realitätsnahe und die Grenzen des intimschicklichen überschreitende Milieustudie vor, in deren Zentrum der bedrückende Ehealltag einer jungen Frau steht. Sozialisiert ist sie in einer Umwelt, in der ländlich- patriarchale, galante und empfindsame Ehe- und Liebesdiskurse aufeinander prallen. Ihre Ehegeschichte erweist sich so als eine psychologische Dokumentation kognitiver Dissonanzen, verdrängter Bedürfnisse, psychosomatischer Symptome, Rationalisierungen und der Instrumentalisierungen von Sexualität im Ehealltag. Interessant ist dieser Text auch hinsichtlich der Frage nach der Freiheit von Subjekten gegenüber den sie formenden Diskursen. Er zeigt beispielhaft, wie eine Frau mit Bruchstücken des empfindsamen Liebesdiskurses und des autoritären Ehe- und Pflichtdiskurses für sich selbst eine individuelle Ehe- und Liebeskonzeption entwickelt und auf dieser Grundlage ihre Vorstellung eines richtigen Lebens gegen die Überzeugungen ihres gesamten sozialen Umfeldes durchsetzt. Weiterführende Fragestellungen Ich möchte nun abschließend einige weiterführende Fragestellungen andeuten, die durch die Ergebnisse meiner Arbeit nahegelegt werden. Erstens: Die Interpretation von Hoffmanns Sandmann zeigt, dass auch klassische Texte unter der hier dargestellten Perspektive neue Facetten erkennen lassen. An dieser Stelle bietet sich etwa eine Betrachtung der Frühromantik an, zum Beispiel unter der Perspektive, ob die Unterscheidung männlich/weiblich in Bezug auf Liebeskonflikte dort eine wesentlich andere ist, als in der Zeit ansonsten üblich. Zudem legen die Werke von Therese Huber und Elisa von der Recke nahe, weitere bisher weitgehend unbekannte Texte zur Analyse historischer Liebeskonfliktdiskurse heranzuziehen. Ähnliches ergibt sich aus Kotzebues Lustspiel für den Bereich der sogenannten populären Literatur. Zweitens: Die Texte von Huber und Elisa von der Recke werfen die Frage auf, wie Liebeskonflikte aus der Perspektive von Müttern und Vätern wahrgenommen werden. Die Untersuchung beider Texte legt hier erste Spuren, deren Weiterverfolgung fruchtbar sein könnte. Drittens: Es ist auffällig, dass keiner der untersuchten Texte eine wirkliche Alternative zum modernen Liebesdiskurs andeutet, außer in Form eines Rückzugs auf vorempfindsame Liebesideen oder Freundschaften. Hier schließt sich die auf die Zukunft gerichtete Frage an: Wo im modernen Liebesdiskurs ist um es mit Foucault zu formulieren die Gegenmacht zu finden? Oder verschwindet dieser Diskurs allmählich und einer liebenden Annäherung wird in einigen Generationen so begegnet, wie dies die emanzipierte Elisa von der Recke gegenüber den linkischen Annäherungen ihres Gatten getan hat: mit kaltem Ernste, aber ohne Zeichen des Unwillens: "Unter uns, mein Theurer, sind solche Tändeleien überflüssig."
In der vorliegenden Untersuchung wurden Populationen der Gattung Corbicula im Rhein mit Individuen aus der Mosel, der Weser sowie aus Frankreich, Spanien, Nordamerika und dem Nahen und Fernen Osten sowohl mit genetischen als auch morphologischen Methoden untersucht. Aus diesen Daten sollte ermittelt werden, wie viele Taxa bei der rezenten Besiedelung Europas auftraten und welche Migrationsrouten hierbei nachgewiesen werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass im Rhein zwei hybridisierende genetische Linien auftraten, wobei keine Rückkreuzung mit den Eltern nachgewiesen werden konnte. Die Hybride waren morphologisch nicht zu unterscheiden. Hinweise auf einen unterschiedlichen Chromosomensatz dieser Linien bzw. eine Polyploidie konnte nicht gefunden werden. In der Rhone wurde eine weitere Linie entdeckt. Eine der genetischen Linien im Rhein konnte im Vergleich zu Individuen aus Fernost als C. fluminea identifiziert werden. Die Herkunft der beiden Linien aus Rhein und Rhone blieb unklar, da sie nicht Individuen aus Israel oder Nordamerika zugeordnet werden konnten. Eine Polytomie der MP- und ML-Analysen war nicht auf einen zu geringen Datensatz zurückzuführen, vielmehr konnte gezeigt werden, dass Corbicula im Pleistozän eine Radiation durchief. Schalenmorphologisch konnten die genetischen Linien aus dem Rhein nicht durchgehend den zwei auftretenden Morphen zugeordnet werden. Gleichzeitig schienen diese Individuen die Extreme einer weltweiten Variabilität der Schalenform darzustellen. Ein morphologischer Vergleich von Schalen aus der Sammlung Senckenberg zeigte keine Unterschiede zwischen Individuen, die als C. fluminalis und C. fluminea bezeichnet waren. Vielmehr scheint die Schalenform nicht genügend conchologischen Merkmale zu besitzen, um die genetischen Linien zu unterscheiden. Die Besiedelung Europas durch die Körbchenmuschel erfolgte mehrfach unabhängig in verschiedenen Flusssystemen Südwest- und Mitteleuropas Anfang der 1980er Jahre. Auf- grund der hier nachgewiesenen Isolationswirkung von Stauwehren der Bundeswasserstrassen auf Makroinvertebraten und der Ergebnisse der DAF-Fingerprints von Corbicula- Populationen wurde die Mosel vermutlich von Frankreich aus besiedelt.
Für eine zukünftige Gentherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist ein effizienter, spezifischer und sicherer Gentransfer in CD4-positive Zellen des peripheren Blutes erforderlich. Hierzu bieten sich vom murinen Leukämievirus (MLV) abgeleitete retrovirale Pseudotypvektoren an, die das Hüllprotein (Env) des HIV-1 oder des simianen Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm) tragen und daher einen selektiven Gentransfer in CD4-positive Zielzellen bewirken (Transduktion). [MLV(SIVagm)]-Vektoren haben gegenüber [MLV(HIV-1)]-Vektoren den Vorteil, daß sie von Seren HIV-1-positiver Patienten nicht neutralisiert werden und daher auch in HIV-1-infizierten Patienten angewendet werden könnten. Jedoch kann aufgrund des Tropismus von SIVagm mit [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren nur die kleine Subpopulation der CCR5-positiven Zellen innerhalb der humanen CD4-positiven Lymphozyten (3 bis 15%) transduziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Tropismus des SIVagm Env so zu modifizieren, daß auch die Mehrzahl der CD4-positiven Lymphozyten, die den CXCR4-Korezeptor exprimieren (70 bis 95%), transduziert werden kann. Hierzu wurde die putativ für die Korezeptorbindung verantwortliche V3- Loop-Region im Env des SIVagm durch die homologe Region eines CXCR4-tropen HIV-1-Stammes ersetzt. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [MLV(SIVagm-X4)]- Pseudotypvektoren herzustellen, die spezifisch CD4/CXCR4-positive Zellen transduzieren können. Neben der Bedeutung für die Generation neuer Vektoren für die Gentherapie beweist dieses Ergebnis die bisher nicht gezeigte Äquivalenz der V3- Loops der Hüllproteine von HIV-1 und SIVagm für die Korezeptornutzung. Um die neuen [MLV(SIVagm)]-Vektoren charakterisieren zu können und für eine spätere Anwendung weiterzuentwickeln, wurden stabile Zellinien etabliert, die große Vektormengen mit Titern zwischen 6x103 und 7,6x105 i.E./ml produzierten. Mittels Ultrazentifugation konnten Vektorpräparationen mit Titern bis zu 108 i.E./ml hergestellt werden. Die neu generierten [MLV(SIVagm-X4)]-Vektoren erwiesen sich wie die [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren als resistent gegenüber der Neutralisierung durch Seren HIV-1-infizierter Spender und könnten damit in vivo angewendet werden. In Experimenten zur Bestimmung der Transduktionseffizienz in primären peripheren Blutlymphozyten humaner Spender konnte der selektive Gentransfer mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren in CD4-positive Zellen gezeigt werden, während herkömmliche, amphotrope Vektoren CD4-positive und -negative Lymphozyten gleichermaßen transduzierten. Beide [MLV(SIVagm)]-Vektoren erlaubten im Vergleich zu den eingesetzten amphotropen MLV-Vektoren eine höhere Transduktionseffizienz in CD4-positiven Zellen. Neben Zielzell-Spezifität und Effizienz ist die Sicherheit neuer Vektorsysteme entscheidend für die Anwendbarkeit in der humanen Gentherapie. Eine Übertragung replikationskompetenter Retroviren (RCR) gilt hierbei als das Hauptrisiko bei der Nutzung retroviraler Vektoren. Auch bei der Herstellung von [MLV(HIV-1)]- oder [MLV(SIVagm)]-Pseudotypvektoren könnten durch Rekombinationsereignisse in den Verpackungszellen replikationsfähige Hybridviren entstehen. Bei der Untersuchung dieser Vektorsysteme wurde allerdings bisher keine spontane Bildung von RCR nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, durch molekulare Klonierung gezielt derartige Hybridviren zu generieren, um zu klären, ob solche Onko/Lenti-Hybridviren replikationsfähig sein können, zudem sollte gegebenenfalls das pathogene Potential dieser Viren untersucht werden. Dazu wurden die vollständigen Leserahmen des rev- und des env-Gens des HIV-1 bzw. SIVagm anstelle des MLV env-Gens in das Genom eines infektiösen molekularen Klon des MLV inseriert. Die Klonierungsstrategie wurde dabei so gewählt, daß alle notwendigen mRNAs gebildet werden konnten. Die Hybridvirusklone waren nach Transfektion in 293T-Zellen tatsächlich in der Lage, neben den MLV-Genen auch HIV-1 bzw. SIVagm env und rev funktionell zu exprimieren. Es konnten infektiöse Partikel nachgewiesen werden, die das Hybridvirusgenom auf Zielzellen übertragen konnten. In den infizierten Zielzellen wurde jedoch nur die Expression von MLV/SIVagm nachgewiesen werden. Keines der beiden Hybridviren erwies sich als replikationskompetent. Dies deutet darauf hin, daß die Bildung replikationskompetenter Onko/Lenti-Hybridviren unwahrscheinlich ist. Mit den [MLV(SIVagm)]-Vektoren steht somit ein Vektorsystem zur Verfügung, das sich für In-vivo-Anwendungen im HIV-infizierten Patienten eignet. Es konnte gezeigt werden, daß humane CD4-positive Lymphozyten mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren spezifisch, aber auch effizienter und sicherer transduziert werden als unter Verwendung bisher beschriebener amphotroper MLV-Vektoren.
Im Rahmen der Aufgabenstellung, Propenoxid durch eine heterogen initiierte homogene Autoxidation herzustellen, wurde ein neuer Reaktortyp konzipiert. Die wesentliche Anforderungen an die Reaktionsführung war dabei nach dem Katalysator einen steilen Temperaturgradienten im Abgasstrom zu verwirklichen. Die komplexen Wechselwirkungen der Autoxidation und deren Mechanismus sind nicht zweifelsfrei aufgeklärt. Insbesondere das Ausmaß der Radikalbildung ist nur unter NichtReaktionsbedingungen quantitativ bekannt. Anhand der verfügbaren Daten konnten daher keine quantitativen Rückschlüsse hinsichtlich Reaktorauslegung und erforderlichen Katalysatormengen bzw. Katalysatoraktivitäten gezogen werden. Basierend auf der postulierten Initiierung der Autoxidation durch Allylradikale wurde das Konzept des Reaktors entwickelt und dieser modular ausgelegt, um eine Nachoptimierung zu ermöglichen. Wegen der Unsicherheiten über das Ausmaß von Radikalbildung und Radikalreaktionsgeschwindigkeiten wurde der Reaktor modular ausgelegt und weite Bereiche an Reaktionsbedingungen (Temperatur und Verweilzeiten am Katalysator und im postkatalytischen Volumen) für verschiedene Katalysatorpräparationen ausgetestet. Aktivität wurde außer im Falle von Strontiumnitrat als Katalysator nur unter Reaktionsbedingungen gefunden, die bereits eine Leeraktivität bedingen. Die These, daß die von Keulks et al. [21,22] beobachtete Aktivität von Bismutoxid in der heterogen initiierten Autoxidation auf die von verschiedenen Autoren [26,27,29] beobachtete Allylradikalbildung über Bismutoxid zurückzuführen ist, ließ sich im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigen. Die Erkenntnis aus Arbeiten von Maier et al. [17], daß die Reaktion bei hohen Drücken (größer 10 bar) schneller und selektiver verläuft, stellt das Konzept einer heterogenen Initiierung bzw. Katalyse grundsätzlich in Frage. Durch die Druckerhöhung wurden sehr respektable RaumZeitAusbeuten erreicht und die Selektivität zu Propenoxid gesteigert, wobei letzteres auf die Umsetzung bei niedrigeren Temperaturen zurückzuführen sein dürfte, die durch die erhöhten Reaktionsraten ermöglicht wird. Im Rahmen von in dieser Arbeit durchgeführten Leertests unter Druck im mikrostrukturierten Reaktor konnte diese Reaktionsbeschleunigung bereits bei Drücken von 3 bar nachgewiesen werden. Beim Übergang auf 4,5 bar verdoppelte sich die Selektivität zu Propenoxid auf 15% bei fünffach erhöhtem (1,6%) Propenumsatz. Dieser Druckbereich war in den Arbeiten von Maier et al. nicht untersucht worden. Eine weitere Drucksteigerung bedingte aufgrund des hohen Sauerstoffpartialdrucks eine Explosion. Angesichts der Tatsache, daß bereits ohne Katalyse bei höheren Drücken hohe RaumZeitAusbeuten erreichbar sind, wurde das Vorhaben nicht weiter verfolgt und eine homogene Katalyse der Autoxidation durch das Abgas der Propandehydrierung getestet, die über Propylradikale verläuft. Diese hätte aufgrund der Verwendung von Propan anstelle eines Teils des Propens den Vorteil geringerer Rohstoffkosten. Auch hier konnte keine Übertragung der Reaktion auf die postkatalytische Zone, deren Temperatur auf unter 250°C begrenzt war, belegt werden. Lediglich die bekannte thermische Oxidation von Propen und Propan unter Nettoumsatz von Propan zu Propenoxid konnte in der Katalysatoraufnahme durchgeführt werden, wobei die Katalysatoraufnahme hier die Funktion eines Rohrreaktors erfüllte. Mit allen drei entwickelten Reaktortypen konnte ein steiler Temperaturgradient im Abgasstrom des Katalysators durch Zumischen kalter Gasströme bedingt verwirklicht werden, wobei die Limitierungen hinsichtlich der Höhe des Gradienten durch Wärmeleitungseffekte des Gehäuses hervorgerufen wurden. Dieses Reaktorschema erwies sich zwar als untauglich in der angestrebten Reaktion könnte aber für andere Reaktionen, die entsprechende Anforderungen an Temperaturgradienten haben, sinnvoll eingesetzt werden. Beispielsweise stellt die selektive Methanoxidation diese Anforderung, findet aber bei wesentlich höheren Temperaturen statt (>1000°C). Die Propenoxidation mit Wasserstoff/Sauerstoffgemischen, die zuvor nur über auf Titanoxid geträgerten Goldkatalysatoren beschrieben wurde, konnte erfolgreich an auf Titanoxid gefällten Silberkatalysatoren durchgeführt werden. Parallel zu dieser Arbeit wurden allerdings Patente der BAYER AG offengelegt, die die Aktivität von mit SilbernitratAmmoniaklösungen imprägnierten Titanoxid und TS1Katalysatoren beschreiben. Erstmalig wurde jedoch ein Titanoxid geträgerter Silberkatalysator in dieser Reaktion hinsichtlich verschiedener Beladungsgraden mit Silber, Calcinierungstemperaturen und den Reaktionsparametern Temperatur, Verweilzeit und Gaspartialdrücken untersucht. In allen Aspekten war eine erstaunliche Ähnlichkeit des Silber/TitanoxidSystems mit dem Gold/TitanoxidSystem festzustellen, welches in den letzten Jahren von verschiedenen Arbeitsgruppen gründlich untersucht wurde. So findet sich eine optimale Aktivität für die Silberkatalysatoren bei 2% Beladung mit Silber und einer Calcinierungstemperatur von 400°C. Diese betrug mit 4,14 g kg(Kat.) 1 h 1 nahezu die Hälfte der von Goldkatalysatoren (10,4 g kg(Kat.) 1 h 1 ) und die im TEM beobachteten Partikelgrößen des Silbers entsprechen mit 2 bis 4 nm denen der Goldpartikel [46]. Mit XRD konnte eine mit zunehmender Calcinierungstemperatur zunehmende Primärpartikelgröße bzw. Kristallisation des Titanoxids nachgewiesen werden. Mit zunehmender Temperatur findet eine schnellere Desaktivierung der Katalysatoren statt. Auch bei der üblichen Reaktionstemperatur von 50°C findet eine Desaktivierung über mehrere Tage statt. Mit zunehmender Verweilzeit am Katalysator sinkt die Reaktionsrate trotz differentieller Umsätze aufgrund der Produktinhibierung der Reaktion. Diese Produktinhibierung bewirkt durch Folgereaktionen die Belegung der Silberkatalysatoren mit verschiedenen Oligomeren des Propenoxids, die in TGMSExperimenten erst oberhalb 400°C vollständig desorbieren und auch die Desaktivierung bewirken. Die Reaktionsrate ist ungefähr proportional sowohl dem Propen, als auch dem Wasserstoffpartialdruck und unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck. Auch die von Goldkatalysatoren berichtete Aktivität in der Tieftemperaturoxidation von CO und Propan konnte bei den Silberkatalysatoren gefunden werden. Eine Verbesserung hinsichtlich Standzeit des Katalysators könnte durch den Einsatz von TS1 als Trägermaterial erzielt werden, welches im Falle der Goldkatalysatoren keiner Desaktivierung unterlag. Dieses wurde mit der hohen Verdünnung der Titanzentren erklärt [47]. Auch durch den Zusatz von Gold bzw. anderen Dotierungsmetallen könnte eine weitere Verbesserung der Katalysatoren möglich sein. Ein Ansatz dazu wäre die chloridfreie Coimprägnierung mit Cyano Komplexen des Silbers und Goldes. Die bisher erzielten Ergebnisse sind jedoch noch sehr weit von technisch relevanten Umsätzen und Standzeiten entfernt. Die Erkenntnis, daß Silberkatalysatoren ähnliche Eigenschaften wie die von Haruta beschriebenen Goldkatalysatoren haben, eröffnet jedoch neue Perspektiven für die Untersuchung dieser Katalysatorklasse.
Die Protoonkogene Ras und Raf spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung eines extrazellulären Signals in den Zellkern. Die direkte Interaktion zwischen GTP-gebundenem, aktiviertem Ras und der Proteinkinase Raf führt zur Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade, die eine entscheidende, regulatorische Rolle bei onkogenen, mitogenen und entwicklungsabhängigen Signalwegen besitzt. Die Beeinflussung der Kaskade stellt daher einen interessanten Ansatz für die Arzneistoffentwicklung dar. Trotz der bekannten Proteinstrukturen von Ras und Raf sind bisher nur wenige Stoffe gefunden worden, die die Interaktion direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Testsystem auf der Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-System etabliert, mit dessen Hilfe Effektoren der Ras/Raf-Wechselwirkung schnell und einfach identifiziert werden können. Das erste Ziel der Arbeit war die Etablierung einer Testmethode in 96-well-Microtiterplatten, die einen schnellen Durchsatz verschiedener Proben erlaubt. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit 469 Reinsubstanzen und Pflanzenextrakte in verschiedenen Konzentrationen getestet. Durch die Verwendung geeigneter Kontroll-Hefestämme konnte außerdem eine Aussage über die Spezifität der Substanzinteraktion getroffen werden. Bei einigen Ras/Raf-aktivierenden Substanzen konnten über die Testung systematischer Substanzreihen Struktur-Wirkungsbeziehungen aufgestellt werden. Cycloalkylidencarbonsäuren wurden als erste potente Ras/Raf-Aktivatoren identifiziert, deren wahrscheinlicher Interaktionsbereich durch die Expression verkürzter Raf-Mutanten auf den Bereich von AS 131-194 von Raf eingeschränkt werden konnte. Sie stabilisieren nicht nur die Bindung von mutiertem, sondern auch von Wildtyp-Ras an Raf. In einem zweiten, unabhängigen Säugerzell-Testsystem, das auf der Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade und dem anschließendem Nachweis des phosphorylierten MEK-Proteins beruht, lieferten die aktiven Verbindungen erste Hinweise auf eine Aktivierung der Signalkaskade. Mögliche Optimierungen der beiden verwendeten Testsystem, sowie Alternativen, weitergehende Experimente und Einsatzgebiete von Ras/Raf-Effektoren werden abschließend diskutiert.
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden fünf verschiedene Experimente mit der Schwerionen-Mikrosonde der GSI durchgeführt. Vier dieser Experimente waren erfolgreich, bei einem Experiment wurden nicht die erhofften Ergebnisse erzielt. Alle Experimente haben Ziele und Fragestellungen verfolgt, die vornehmlich mit einer Ionen-Mikrosonde bearbeitet werden können. Es wurde gezeigt, dass durch die Anwendung fein fokussierter Ionenstrahlen physikalische und technische Probleme im Mikrometerbereich sehr effizient und erfolgreich aufgeklärt werden können. Die hohe örtliche Auflösung der Mikrosonde in Verbindung mit den bekannten auf Ionenstrahlen basierenden Analysemethoden ermöglicht den Zugriff auf Informationen, die auf anderem Wege gar nicht oder nur schwer zugänglich sind. Das erste der fünf Experimente an der Mikrosonde untersuchte die Eigenschaften von polykristallinem CVD Diamant, bei der Verwendung dieses Materials als Detektor für Schwerionen. Der große Nachteil dieses Detektormaterials ist die geringe Fähigkeit, im Detektor erzeugte Ladungsträger verlustfrei zu den Elektroden zu transportieren, um sie dort zu sammeln. Häufig werden bei diesem Transportprozess vom Entstehungsor t der Ladungsträger zu den Elektroden über 90 % der ursprünglich vorhandenen Ladungsträger von Ladungsträgerfallen im Diamantmaterial eingefangen. Es bestand der starke Verdacht, dass diese Fallen vorwiegend in den Korngrenzen zwischen den Diamanteinkrista llen lokalisiert sind. Aus diesem Verdacht begründete sich die Hoffnung, dass die Einkristalle im CVD Diamant ein wesentlich besseres Ladungssammlungsverhalten zeigen würden. Da die Ionenmikrosonde einen Ionenmikrostrahl mit einem lateralen Fokusdurchmesser von ca. 0,5 µm über eine Targetfläche von 1 x 1 mm² rastern kann und dabei Punkt für Punkt die Reaktion des Targetmaterials nachweisen kann, ist sie das geeignete Werkzeug zur Untersuchung von Ladungssammlungsprozessen im Bereich der Einkristalle und der Korngrenzen. Bei der Auswertung der Ergebnisse des Experiments ist aufgefallen, dass man für das CVD Diamantmaterial innerhalb der Ionenbestrahlung zwei verschiedene Zustände unterscheiden muss. Ein unbestrahlter CVD Diamant verhält sich in Bezug auf die Ladungssammlungs- eigenschaften wesentlich anders als ein bestrahlter CVD Diamant, der schon eine gewisse Ionendosis akkumuliert hat. Beim unbestrahlten Diamant ist zu beobachten, dass sowohl in den Einkristallen als auch in den Korngrenzen sehr effektive Ladungsträge rfallen existieren. Die generelle Aussage, dass Diamanteinkristalle eine bessere Ladungssammlung zeigen, kann hier nicht bestätigt werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass es, im etwa 300 x 350 µm großen Scannfeld, Bereiche mit sehr guten Ladungssammlungseigenschaften (Effizienz über 90 % im Maximum der Verteilung) gibt und in unmittelbarer Nähe Bereiche mit geringster Ladungssammlungs- effizienz (etwa 8 % im Maximum der Verteilung) existieren. Es konnte nicht geklärt werden, ob diese Bereiche aus Einkristallen bestehen oder sich über Korngrenzen ausdehnen. Die beobachtete 90%ige Ladungssammlungseffizienz ist jedoch ein eindeutiger Nachweis der Möglichkeit, die Detektoreigenschaften dieses Materials wesentlich verbessern zu können, wenn es gelingt, die Besonderheiten dieses hocheffizienten Bereichs aufzuklären. CVD Diamantdetektoren, die schon eine gewisse Ionendosis akkumuliert haben, werden auch als gepumpte Detektoren bezeichnet. Das Pumpen des Detektors kann dabei auch durch andere Formen der Energiezufuhr, beispielsweise mit Hilfe eines Lasers erfolgen, wichtig ist nur, dass eine große Zahl der Ladungsträgerfallen mit Ladungsträgern gefüllt sind. Da diese Fallen im CDV Diamant relativ tief sind, werden gefüllte Fallen nicht schnell entleert und sie stören, so lange sie gefüllt sind, die Ladungssammlung nicht mehr. Die Ladungs- sammlungseffizienz gepumpter Diamantdetektoren verbessert sich sehr stark im Vergleich zum ungepumpten Material. Das Maximum der Verteilung des Ladungssammlungsspektrums verschob sich von etwa 15 % Effizienz beim ungepumpten Detektor zu mehr als 50 % Effizienz beim gepumpten Detektor gemittelt über das gesamte Scannfeld. Bei der Betrachtung des Einflusses der Korngrenzen im gepumpten Material konnte festgestellt werden, dass die Einkristalle nun tatsächlich wesentlich weniger zum Verlust der Ladungsträger beitragen als die Korngrenzen. Die Korngrenzen zeichneten sich beim gepumpten CVD Diamant deutlich als dominante Bereiche des Ladungsträgerverlustes ab. Somit haben wir die bestehende Vermutung über den dominierenden Ladungsträgereinfang in den Korngrenzen für den gepumpten CVD Diamanten bestätigen können, beim ungepumpten Material hingegen verwerfen müssen. Eine weitere Aufklärung der Unterschiede zwischen den beiden Zuständen wür de hier zu einem besseren Verständnis der Vorgänge führen. Zudem wurde am CVD Diamant eine Hochdosisbestrahlung vorgenommen, bei der bestimmt werden sollte ab, welcher Ionendosis das Material soweit geschädigt ist, dass eine Trennung der Detektorsignale von den Rauschsignalen nicht mehr möglich ist. Für einen 8,3 MeV/u 12C-Strahl war diese Trennung ab einer Dosis von 8,0 x 1013 Ionen/cm² nicht mehr möglich, was bedeutet, dass der Detektor hier seine Verwendbarkeit verliert. Eine weitere Gruppe von drei Experimenten befasste sich mit der Wirkung von schnellen, schweren Ionen auf Halbleiterbauelemente. Diese anwendungsorientierten Experimente sollten Ursachen für das Fehlverhalten mikroelektronischer Bauelemente bei Ionentreffern an bestimmten Orten und zu bestimmten Zeitpunkten untersuchen, beziehungsweise Grundlagen für die theoretische Betrachtung der Vorgänge liefern. Beim ersten der drei Experimente wurde das Auftreten von Single Event Upsets in Verbindung mit Single Event Latchups in SRAM Bausteinen untersucht. Die Latchups werden bei den üblichen Testverfahren durch einen Spannungsabfall an einem externen Widerstand in der Versorgungsleitung erkannt. Mit Hilfe der Mikrosonde wurde nachgewiesen, dass diese Methode der Latchupdetektion unzureichend sein kann. Da die internen Versorgungsleitungen in der Halbleiterstruktur selber Widerstände bilden, kann der Latchup am äußeren Widerstand unter bestimmten Bedingungen nicht erkannt werden. Hier spielt die Länge der integrierten Versorgungsleitung eine wesentliche Rolle. Die bild- gebenden Verfahren der Mikrosonde bei der simultanen Messung von Latchups und Upsets können hier Latchups entdecken, die im üblichen Testverfahren nicht erkennbar waren. Das zweite dieser drei Experimente hatte das Ziel, die Upsetempfindlichkeit einer getakteten CMOS- Struktur im Bereich der Schaltflanken zu bestimmen. Hierzu wurden die Schaltzeit- punkte des ICs mit dem vom UNILAC gelieferten Ionenstrahl synchronisiert. Einzelne Ionen trafen den Schaltkreis nur innerhalb eines Zeitfensters von 2 nsec um die Schaltflanke. Da der getaktete integrierte Schaltkreis im Bereich der Schaltflanken besonders empfindlich auf die vom Ion erzeugten zusätzlichen Ladungsträger reagiert, sollten die Upsetwahrscheinlichkeiten innerhalb des Schaltprozesses mit möglichst hoher zeitlicher Auflösung vermessen werden. Die Bestimmung der Trefferzeitpunkte mit einer zeitlichen Genauigkeit von 1 ns oder besser brachte jedoch eine Vielzahl von Problemen mit sich, die letztlich dazu führten, dass dieses Experiment nicht erfolgreich abgeschlossen werden konnte. Auf Grund seiner hohen technischen Bedeutung wurde es in dieser Arbeit aber beschrieben und sollte nach der Verbesserung der Treffererkennung erneut durchgeführt werden. Es wäre das erste Experiment, in dem die Empfindlichkeit einer CMOS- Struktur gegen Ionenstrahlen mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung gemessen wird. Das dritte Experiment dieser Serie befasste sich mit der für theoretische Vorhersagen wichtigen Größe des elektronischen Durchmessers der Ionenspur. Aus der vom Schwerion erzeugten Spur breitet sich eine elektronische Stoßkaskade aus. Diese freien Ladungsträger können ungewollte Schaltvorgänge in integrierten Schalkreisen auslösen. Da die Integrationsdichte in modernen Baugruppen immer höher wird, kann die vom Ion erzeugte Spur aus freien Ladungsträgern mehrere Transistoren beeinflussen. Die Ausdehnung dieser Spur kann nicht mehr als vernachlässigbare Größe eingestuft werden. Um den Durchmesser der Spur zu bestimmen, wurde ein fein fokussierter 5,9 MeV/u Nickel-Strahl über eine Probe aus Mikrostreifen gerastert, und die in den Streifen gesammelten Ladungssignale wurden gemessen. Trotz einiger Probleme mit der kapazitiven Kopplung von Signalen zwischen den Streifen und dem Substrat und de n Streifen untereinander konnte der Durchmesser der elektronischen Spur bei diesem Test zu etwa 1,2 µm bestimmt werden. Es sollte der Versuch unternommen werden, diesen ersten experimentellen Wert durch weitere verfeinerte Messungen zu bestätigen und vor allem sollte versucht werden, das Dichteprofil der Elektronen in der Ionenspur mit dieser Technik zu bestimmen. Diese Informationen wären von großem Wert für theoretische Modelle zur Empfindlichkeit von integrierten Elektroniken gegen die Effekte einzelner Ionen. Im fünften und letzten Experiment dieser Arbeit wurde die Ionen-Mikrosonde als Werkzeug zur Strukturierung eines Hochtemperatur Dünnfilm Supraleiters eingesetzt. In der sogenannten Shubnikov-Phase können magnetische Flussquanten in den Supraleiter eindringen, obwohl der Zustand der Supraleitung noch vorhanden ist. Diese Flussquanten können durch säulenartige korrelierte Defekte im Supraleiter gebunden werden. Die Spuren schwerer Ionen bilden solche kolumnaren Defekte, die mit Hilfe der Mikrosonde aufgeprägt werden können. Da bei dieser Strukturierung eine hohe Defektdichte erforderlich war, konnte aus Zeitgründen eine Strukturierung mit dem schreibenden Ionenstrahl nicht realisiert werden. Stattdessen wurde eine Schlitzmaske verwendet, die mit Hilfe der Mikrosonde verkleinert auf der Oberfläche des Supraleiters abgebildet wurde. Auf diese Weise wur de dem Supraleiter eine Defektstruktur aus Stegen, die in einem bestimmten Winkel orientiert waren, aufgeprägt. An dem so erzeugten Supraleiter wurden dann an der Universität Mainz die elektrischen Transporteigenschaften des Materials unter dem Einfluss eines gepinnten magnetischen Feldes gemessen. Da die erwarteten Effekte aus dem Pinning der magnetischen Flussquanten erst dann eine messbare Größe annehmen, wenn dem Supraleiter Defektstrukturen in der Größenordnung von einigen µm aufgeprägt werden, ist auch hier die Ionen-Mirkrosonde das einzige verfügbare Instrument für diese Aufgabe. Mit dieser Arbeit wurde deutlich gemacht, dass eine Ionen-Mikrosonde ein vielseitig einsetzbares Instrument ist, das vor allem aufgrund der hohen Bedeutung von miniaturisierten Systemen in der modernen Forschung und Technik ein hohes Verwendungspotential besitzt. Alle hier vorgestellten Experimente wären ohne den Einsatz der Mikrosonde nicht durchführbar gewesen. Neben diesen Experimenten werden an der GSI noch eine Reihe weiterer Experimenten zum Beispiel im Bereich der Biophysik bearbeitet, die ihrerseits von der einzigartigen Möglichkeit der µm-genauen Platzierung schwerer Ionen profitieren.
Natürliche Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung - Schlüssel zur Echtheit ätherischer Öle
(2002)
Als Grundlage für die Beurteilung der Echtheit ätherischer Öle können zwei biochemische Prinzipien Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung während der Biosynthese herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die enantioselektive Kapillargaschromatographie sowie die online-Kopplung der Gaschromatographie mit der Isotopenmas- senspektrometrie zur Authentizitätsbewertung verschiedener ätherischer Öle eingesetzt. Die Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen mittels Multidimensionaler Gaschromatographie-Massenspektrometrie (MDGC-MS) sowie von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS (Gaschromatographie-Combustion- Isotopenmassenspektrometrie) sind etablierte Methoden, die in der Authentizitätsbewertung von Aroma- und Duftstoffen eingesetzt werden. Dagegen ist die Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS (Gaschromatographie-Pyrolyse-Isotopenmassenspektrometrie) eine relativ neue Methode. In der vorliegenden Arbeit wurden Strategien zur Bestimmung von zuverlässigen 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS entwickelt. Die Kalibrierung des Referenzgases mit Hilfe von internationalen Standards kann nur mittels eines Elemental Analyzers (EA-IRMS) erfolgen, da für die Gaschromatographie geeignete Standards nicht zur Verfügung stehen. Daher ist insbesondere der Vergleich von Isotopenverhältnissen von Standardsubstanzen, die mittels TC/EA-IRMS und GC- P-IRMS bestimmt wurden, von Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, dass eine Konditionierung (Einbringen einer Kohlenstoffschicht) des Pyrolysereaktors im GC- P-IRMS-System notwendig ist, um für die untersuchten Aromastoffe mittels GC-P- IRMS zum Elemental Analyzer vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Von zwei verschiedenen getesteten Methoden zur Konditionierung des Pyrolysereaktors war die Konditionierung durch Einleiten von Methan in den Pyrolysereaktor die geeignetere und effektivere Methode. Weiterhin wurden der Einfluss des Trägergasflusses des Gaschromatographen auf die bestimmten Isotopenwerte sowie der lineare Bereich der Methode untersucht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die mittels GC-P-IRMS bestimmten Isotopenverhältnisse von verschiedenen Parametern abhängig sind. Richtige Ergebnisse zu erzielen setzt folgende Konditionen voraus: Konditionierung des Pyrolysereaktors, optimaler Trägergasfluss sowie Mindestmenge des Analyten (> 0,3 µg on column). Die neuen Möglichkeiten, die die online-Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen in der Authentizitätsbewertung von Lavendelölen, Anis- und Fenchelölen sowie Kümmelölen bietet, wurden erstmalig untersucht. Darüber hinaus wurden die enantioselektive Kapillargaschromatographie und die Bestimmung von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Bereiche der 2HV-SMOW-Werte von Linalool und Linalylacetat aus authentischen Lavendelölen deutlich vom Bereich der Isotopenverhältnisse kommerziell erhältlicher, synthetischer Analoga unterscheiden und somit eine Verfälschung von Lavendelölen mit synthetischem Linalool und/oder Linalylacetat nachweisbar ist. Mit dieser Methode konnten diverse Handelsöle eindeutig als verfälscht beurteilt werden. Über die Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Linalool und Linalylacetat dieser Öle konnte die Aussage bestätigt werden (hohe Reinheit zugunsten des (R)-Enantiomeren in genuinen Lavendelölen). Anhand der unterschiedlichen 13C/12C-Isotopenverhältnisse ist eine Unterscheidung zwischen synthetischem und Linalylacetat aus Lavendel möglich. Die 13CV-PDB-Werte von synthetischem und natürlichem Linalool aus Lavendelölen liegen im gleichen Bereich und sind somit zur analytischen Differenzierung natürlich/naturidentisch nicht geeignet. Mittels GC-C(P)-IRMS Analyse von trans-Anethol aus Fenchel- und Anisölen wurden die authentischen Bereiche der 13C/12C- und 2H/1H-Isotopenverhältnisse ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass sich einige der synthetischen trans-Anethol- Muster nur aufgrund eines der beiden bestimmten Isotopenverhältnisse von dem authentischen Bereich abgrenzen lassen. Somit konnte gezeigt werden, dass die integrale Betrachtungsweise der 13CV-PDB-Werte und der 2HV-SMOW-Werte biogener Stoffe für die Authentizitätsbewertung von großer Bedeutung ist. Zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen wurden die Enantiomerenverhältnisse, die 13C/12C- und die 2H/1H-Isotopenverhältnisse der Hauptkomponenten Limonen und Carvon bestimmt. Aufgrund der 2HV-SMOW-Werte von Limonen lassen sich keine Unterscheidungen zwischen kommerziell erhältlichen Limonen und Limonen aus Kümmelölen treffen. Dagegen können die 13CV-PDB-Werte von Limonen zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen herangezogen werden. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Bestimmung von 2H/1H- Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS neue Möglichkeiten in der Echtheitsbewertung ätherischer Öle bietet. Insbesondere die integrale Betrachtung von 2HV- SMOW- und 13CV-PDB-Werten ( 2H/ 13C-Korrelation) wird eine Authentizitätsbewertung künftig noch wesentlich differenzierter möglich machen. Weitere Perspektiven wird die Bestimmung von 18O/16O-Isotopenverhältnissen bieten. Die Authentizitätsbewertung anhand der Multielement-Analyse mittels GC- IRMS eröffnet gerade für achirale Aromastoffe Perspektiven, stellt aber auch eine Ergänzung zur enantioselektiven Analytik dar.
In dieser Arbeit wurde ein relativistisches Punktkopplungsmodell und seine Anwendbarkeit auf Probleme in der Kernstrukturphysik untersucht. Der Ansatz ist in der Kernstrukturphysik recht neu. Aus diesem Grund war es ein wichtiges Ziel festzustellen, wie gut sich das Modell zur Beschreibung von Grundzuständen von Kernen eignet. Während sich Modelle wie das Relativistic-Mean-Field-Modell mit Mesonenaustausch und Hartree-Fock-Rechnungen mit Skyrme-Kräften in vielen detaillierten Untersuchungen bewährt haben, musste dies für das relativistische Punktkopplungsmodell erst gezeigt werden. Als erster Schritt war eine sorgfältige Anpassung der Kopplungskonstanten des Modells erforderlich. Um möglichst einen optimalen Satz an Parametern zu erhalten, wurden verschiedene Optimierungsverfahren getestet und angewandt. Die Parameter der effektiven Mean-Field-Modelle sind untereinander stark korreliert. Zusammen mit der Nichtlinearität der Modelle führt diese Tatsache auf die Existenz vieler lokaler Minima der zu minimierenden x2-Funktion, was eine flexible Anpassungsmethode erfordert. Als besonders fruchtbar erwies sich eine Kombination aus der Methode Bevington-Curved-Step mit dem Monte-Carlo-Algorithmus simulated annea/ing. Durch die Anpassung der Kraft PC-F1 an experimentelle Daten in einem x2-Fit ist es gelungen, mit dem Punktkopplungsmodell eine Vorhersagekraft zu erreichen, die der etablierter RMF-FR- und SHF-Modelle gleicht. Dies ist nicht selbstverständlich, da die Modelle eine deutlich unterschiedliche Dichteabhängigkeit der Potenziale besitzen. Weiterhin haben wir gesehen, dass die Anpassungsprozedur der Parameter eine komplizierte Aufgabe darstellt und noch in mancher Hinsicht ausgearbeitet und verbessert werden kann. Das Punktkopplungsmodell mit der Kraft PC-F1 verhält sich für viele Observablen sehr ähnlich wie das RMF-FR-Modell. Dies betrifft die Beschreibung der bulk properties von symmetrischer Kernmaterie, Neutronenmaterie, Bindungsenergien, Spin-Bahn-Aufspaltungen, Observablen des nuklearen Formfaktors, Deformationseigenschaften von Magnesium-Isotopen, die Spaltbarriere von 240Pu sowie die Vorhersage der Schalenstruktur von überschweren Elementen. Dabei werden aber insbesondere Radien besser beschrieben als mit den RMF-FR-Kräften. Oberflächendicken werden, im Einklang mit dem RMF-FR-Modell, als zu klein vorhergesagt. Deutliche Unterschiede treten bei Deformationsenergien einiger Kerne auf (sie sind größer als beim RMF-FR-Modell und oft kleiner als die von dem SHF-Modell vorhergesagten) sowie bei Dichtefluktuationen in Kernen. Die vektoriellen Dichten der Nukleonen oszillieren nicht so stark wie die des RMF-Modells mit Mesonenaustausch, was auf die fehlende Faltung der nukleonischen Dichten zurückgeführt werden kann. Im Vergleich zum Skyrme-Hartree-Fock-Modell ergeben sich deutliche Unterschiede in der Beschreibung von symmetrischer Kernmaterie und Neutronenmaterie. Relativistische Modelle sagen eine höhere Sättigungsdichte und Bindungsenergie vorher. Die vorhergesagte Asymmetrieenergie ist deutlich größer als die Werte des SHF- bzw. Liquid-Drop-Modells. Die Beschreibung von Neutronenmaterie weicht stark von modernen Rechnungen [Fri8 1] und den Vorhersagen von Hartree-Fock-Rechnungen mit der Skyrme-Kraft SLy6 ab. Die Vorhersagen zu überschweren Kernen stimmen in Bezug auf magische Zahlen mit anderen relativistischen Modellen überein: Der doppelt-magische, überschwere Kern besitzt Z = 120 Protonen und N = 172 Neutronen. Im Einklang mit anderen selbstkonsistenten Vorhersagen zeigt seine Baryonendichte eine Semi-Blasenstruktur. Die Spaltbarrieren der Kerne 292 120 und 298 114 sind von ähnlicher Größenordnung wie die von anderen untersuchten RMF-Kräften. Die Lage des isomeren Zustandes im symmetrischen Spaltpfad liegt beim RMF-PC-Modell sehr tief, was auf eine geringe Oberflächenenergie schließen lässt. Die deutlichen Unterschiede zu den Vorhersagen von Hartree-Fock-Rechnungen mit Skyrme-Kräften zeigen, dass sich gewisse Eigenschaften der Modelle besonders stark bei überschweren Elementen auswirken. Überschwere Elemente sind ein sensitives Testfeld für die Modelle. Hier bedarf es dringender Untersuchungen, um längerfristig zuverlässige Vorhersagen machen zu können. Besonders in den Rechnungen von Bindungsenergien in Isotopen- und Isotonenketten sowie für Neutronenmaterie zeigt das Punktkopplungsmodell Schwächen im isovektoriellen Kanal der effektiven Wechselwirkung, die denen des RMF-FR-Modells ähneln. Dies bestätigt den Verdacht, dass dieser Kanal modifiziert werden muss. Deshalb wurden mehrere Varianten des RMF-PC-Modells mit Erweiterungen im isovektoriellen Kanal getestet. Ein interessantes Ergebnis der Untersuchungen zu den erweiterten Parametersätzen des Punktkopplungsmodells ist, dass sich eine Anpassung zusätzlicher Terme im isovektoriellen Kanal der Wechselwirkung mit den in dieser Arbeit verwendeten Fitstrategien nicht bewerkstelligen lässt. Andererseits zeigen die Modelle gerade in dieser Hinsicht noch unverstandene Schwächen. Dies zeigt, dass in der Zukunft eine Erweiterung der Fitstrategie wichtig wird. Kerne mit großem Isospin und z.B. Neutronenmaterie könnten hier Verwendung finden. Neue experimentelle Daten zu exotischen Kernen werden hierbei von großem Nutzen sein. Untersuchungen zur Natürlichkeit der angepassten Kopplungskonstanten mit Hilfe der naiven dimensionalen Analyse haben gezeigt, dass die Kraft PC-F1 dieses Kriterium erfüllt. Dies ist besonders interessant, da bei dieser Kraft alle Kopplungskonstanten frei im Fit variierbar waren. Die Kopplungskonstanten des Modells bzw. die korrespondierenden Terme absorbieren auch Vielkörpereffekte, weshalb es interessant ist, dass dieses Kriterium anwendbar ist. Parametersätze für erweiterte Punktkopplungsmodelle erfüllen bisher nicht das Kriterium der Natürlichkeit, was noch einmal ihre ungenügende Fixierungsmöglichkeit in den verwendeten Fitstrategien unterstreicht. Die Struktur des relativistischen Punktkopplungsmodells ermöglicht es, die Austauschterme der 4-, 6- und 8-Fermionen-Terme als direkte Terme umzuschreiben. Diese Möglichkeit ebnet den Weg für relativistische Hartree-Fock-Rechnungen für endliche Kerne, die numerisch kaum aufwendiger sind als die Rechnungen mit der Hartree-Version des Modells. Dabei bedürfen die Ableitungsterme gesonderter Behandlung. Allerdings muss dazu auch der Modellansatz erneut überdacht werden: das Pion bzw. die dazu korrespondierenden Terme sollten Bestandteil dieser Formulierung sein und durch die Austauschterme Beiträge zu den mittleren Potenzialen liefern. Relativistische Hartree-Fock-Rechnungen mit dem Punktkopplungsmodell werden es ermöglichen, den Zusammenhang zwischen relativistischen und nichtrelativistischen Hartree-Fock-Modellen systematisch und im Detail zu studieren. Längerfristig können diese Studien zu einer quantitativen Verbesserung der Modelle und damit einhergehend zu ihrem klaren Verständnis führen. Die mikroskopische und selbstkonsistente Beschreibung von Atomkernen ist eine faszinierende und spannende Herausforderung, sie anzunehmen war Ziel und Aufgabe dieser Arbeit.
Vanille ein tropisches Orchideengewächs liefert eines der bedeutendsten Aromen weltweit. Die stetig wachsende Nachfrage und das hohe Preisniveau sind allerdings häufig die Ursache für Verfälschung von Vanilleextrakten und -aromen. Ziel der Arbeit war es daher, die Methoden zur Echtheitsbewertung von Vanille weiter zu entwickeln. Daneben sollten Untersuchungen im Hinblick auf aromaaktive Minorkomponenten durchgeführt werden. Als Basisdaten für die Authentizität von Vanille dienen häufig Verhältniszahlen, die aus den Gehalten der Hauptinhaltsstoffe Vanillin, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillinsäure und 4-Hydroxybenzoesäure gebildet werden. Um diese Verhältniszahlen zuverlässig bestimmen zu können, wurden eine hochdruckflüssigkeits-chromatographische (HPLC) und zum ersten Mal eine gas-chromatographische (GC) Methode entwickelt. Unter Verwendung von internen Standards konnte mit beiden Methoden eine zuverlässige Quantifizierung erzielt werden. Die ermittelten Werte erwiesen sich als unabhängig von der Analysenmethode, von Erntejahrgang und Herkunft der Schoten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die bisher zur Bewertung herangezogenen Richtwerte im Vergleich mit den im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Werte durchweg zu enge Spannbreiten aufweisen. Die neu bestimmten Daten zur quantitativen Zusammensetzung von Vanilleschoten stellen daher wertvolle Basiskriterien für eine Echtheitsbewertung von Vanille dar. Für eine weitergehende, noch zuverlässigere Authentizitätsbewertung wurden die 13C/12C-Verhältnisse von Vanillin und der zweiten Hauptkomponente 4- Hydroxybenzaldehyd ermittelt. Als grundlegende Voraussetzung für die Bestimmung korrekter Isotopenwerte wurde zum einen die Gerätekonfiguration optimiert, um eine vollständige Verbrennung zu gewährleisten, zum anderen wurde der Einfluss der Schotenaufarbeitung untersucht. Durch Korrelation der Delta13CV-PDB-Werte der beiden Komponenten konnten klare Authentizitätbereiche festgelegt werden. Insbesondere durch die integrale Betrachtungsweise beider Kriterien Verhältniszahlen und Isotopenwerte konnte die Authentizitätsbewertung von Vanille erheblich verbessert werden. Neben den Hauptkomponenten kommen in der Vanille aber auch eine große Zahl von aromaaktiven Minorkomponenten vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher auch Untersuchungen zu einigen dieser Minorkomponenten durchgeführt werden. Dabei ermöglichte es der Einsatz der neuen, hochempfindlichen Methode der Stir Bar Sorptive Extraction, eine enantioselektive Analyse von - Nonalacton und verschiedenen Monoterpenen durchzuführen. -Nonalacton konnte dabei in allen untersuchten Proben mit einem nahezu racemischen Enantiomerenverhältnis nachgewiesen werden. Die Enantiomerenreinheit und die Schwankungen der Enantiomerenverhältnisse für die untersuchten Monoterpene waren stark variierend. Es konnte dabei aber weder eine Herkunfts- noch eine Jahrgangsabhängigkeit festgestellt werden. Die sehr geruchsaktive Substanz Guajacol wurde in Schoten der Gattungen V. planifolia und V. tahitensis semiquantitativ untersucht. Es konnte aber auch hier keine Abhängigkeit von der Herkunft der Schoten festgestellt werden. Um weitere geruchsaktive Minorkomponenten zu identifizieren, wurde ein Headspace- Extrakt von Vanilleschoten mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie untersucht. Es konnten dabei die beiden Substanzen Kreosol und 4- Hydroxybenzylamin identifiziert werden. Letztgenanntes war bisher als natürlicher Aromastoff nicht bekannt. Obwohl beide Komponenten nur im ppb- Bereich vorkommen, leisten sie dennoch eine Beitrag zum Gesamtaroma von Vanille. Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Wege im Hinblick auf die Analytik und Authentizitätsbewertung von Vanille aufgezeigt werden.
Der Cytochrom-bc1-Komplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubihydrochinon auf Cytochrom c in der Atmungskette und in der bakteriellen Photosynthese. Das Enzym stellt somit das Bindeglied zwischen den Ubihydrochinon bildenden Dehydrogenasen und der Cytochrom c oxidierenden Cytochrom-c-Oxidase dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen des Cytochrom-bc1-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mit seinen Substraten Ubichinon und Cytochrom c sowie mit Phospholipiden der inneren Mitochondrienmembran untersucht. Durch Analyse von Gesamtlipidextrakten aus Proben des Cytochrom-bc1-Komplexes konnte gezeigt werden, daß das Enzym in Anwesenheit von vier verschiedenen Phospholipiden gereinigt und kristallisiert werden kann. In der Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å Auflösung wurden fünf Bindungsstellen für Phospholipide und eine Bindungsstelle für ein Detergensmolekül identifiziert. Die Bindungsstelle für eines der Phospholipide, ein Cardiolipin-Molekül, liegt am Eingang eines von zwei Protonierungspfaden für die Ubichinon-Reduktionsstelle (Qi-Bindungsstelle). Ein Phosphatidylinosit-Molekül befindet sich in einer außergewöhnlichen Position unweit der flexiblen "Linker"-Region des Rieske Eisen-Schwefel-Proteins und trägt vermutlich zur Stabilisierung dieser katalytischen Untereinheit bei. Durch Röntgenbeugung an Kokristallen bestehend aus Cytochrom-bc1-Komplex und gebundenem Cytochrom c konnte die dreidimensionale Struktur dieses transienten Enzym-Substrat-Komplexes bei 2,97 Å ermittelt werden. Die Kristallstruktur ist die erste Struktur des Cytochrom c im Komplex mit einem seiner beiden Redoxpartner aus der Atmungskette. Sie zeigt, daß das Cytochrom c hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen an das Cytochrom c1 bindet und daß die Nähe der beiden c-Typ Hämgruppen eine schnelle Reduktion des Cytochrom c erlaubt. Im homodimeren Cytochrom-bc1-Komplex ist nur eine der beiden Bindungsstellen für Cytochrom c besetzt. Diese hälftige Substratbindung zeigte sich auch für das Ubichinon in der Qi- Bindungsstelle und weist darauf hin, daß die beiden Monomere des Enzyms unabhängig voneinander oder sequentiell arbeiten können. Möglicherweise dient dies der Regulation der Enzymaktivität des Cytochrom-bc1-Komplexes. Durch partielle Reduktion des Cytochrom-bc1-Komplexes in Anwesenheit von Ubichinon konnte ein proteingebundenes Ubisemichinonradikal erzeugt und durch Schockgefrieren stabilisiert werden. Die spektralen Eigenschaften dieses Radikals sind typisch für ein Ubisemichinon an der Qi-Bindungsstelle. Durch Spektroskopie an einer Probe, die einem Wasserstoff/Deuterium-Austausch unterzogen wurde, konnte gezeigt werden, daß dieses Radikal von Protonen koordiniert wird, die mit dem Solvens im Austausch stehen. Dies steht in Übereinstimmung mit der Theorie des Q-Zyklus und wurde durch die hochauflösenden Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å vorhergesagt. Die erzielten Ergebnisse zeigen neue Informationen zum Wechselspiel des Cytochrom- bc1-Komplexes mit Phospholipiden aus der inneren Mitochondrienmembran. Die Bestimmung der Struktur des transienten Komplexes bestehend aus Enzym und Cytochrom c erweitert das Bild über den Elektronentransfer durch Cytochrom c zwischen dem Cytochrom-bc1-Komplex und der Cytochrom-c-Oxidase. Das mögliche Zusammenwirken der Bindungstellen für Cytochrom c und Ubichinon ist ein neuer mechanistischer Aspekt, der auf eine Regulation der Enzymaktivität schließen läßt.
Nichtmethan-Kohlenwasserstoffe sind in Gegenwart von Stickstoffoxiden (NO, NO2) wichtige Vorläufersubstanzen von troposphärischen Photooxidantien (z. B. Ozon), die beim photochemischen Metabolismus gasförmiger organischer Verbindungen durch Hydroxylradikale (OH) unter Einwirkung von Sonnenlicht gebildet werden. Experimenteller Beitrag dieser Arbeit ist die Charakterisierung, Modifizierung, Optimierung und Qualitätssicherung des zur Messung von leichtflüchtigen atmosphärischen C2-C10 Kohlenwasserstoffen verwendeten mobilen Gaschromatographen (GC) mit Flammenionisationsdetektor (AirmoVOC HC2010). Im Rahmen des vom BIvIBF geförderten Berlin Ozonexperiments BERLIOZ, das im Sommer 1998 im Großraum Berlin/Brandenburg stattfand, wurden an einer ländlichen Bodenstation in Blossin, 40 km südöstlich Berlins, in situ Messungen von 69 Nichtmethan-Kohlenwasserstoffen durchgeführt. im Vorfeld der Feldkampagne wurde der GC einer umfangreichen Qualitätssicherung unterzogen. Bei einer Immissionsvergleichsmessung, die unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen stattfand, ergab sich eine mittlere konzentrationsabhängige Abweichung des HC-2010 von ± 16% und ein konstanter Offset (Bias) von 0,71 nmol/m3 (16 pptv) vom Referenzmeßverfahren des Forschungszentrums Jülich. Die Geräteblindwerte waren für die meisten Analyten kleiner 0,3 nmol/m3 (6 pptv). Aus der dreifachen Standardabweichung der Blindwerte ergaben sich die für Außenluftuntersuchungen geforderten Nachweisgrenzen um 0,4 nmol/m3 (10 pptv). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der BERLIOZ-Datensatz hinsichtlich einer Bestandsaufnahme ausgewertet. Die beobachteten Konzentrationen der einzelnen Kohlenwasserstoffe wiesen jeweils eine logarithmische Normalverteilung auf, die Charakterisierung des Datensatzes erfolgte deshalb nicht anhand von arithmetischem Mittelwert und Standardabweichung, sondern mit geometrischem Mittelwert und multiplikativer Standardabweichung. Anhand der OH-Verlustrate wurde der Einfluß der verschiedenen Kohlenwasserstoffe auf die lokale Bildung von Photooxidantien untersucht. Der natürliche Kohlenwasserstoff Isopren lieferte mit 70% den weitaus größten mittleren Beitrag zur Photooxidantienproduktion am Boden. In der Grenzschicht verlor isopren allerdings seine dominante Rolle. Sein Beitrag schrumpfte mit zunehmender Höhe auf 20-40%. in der in 200 m Höhe beobachteten Abluftfahne Berlins verursachten anthropogene Kohlenwasserstoffe rund 2/3 der OH-Verlustrate, wobei die reaktiven C3/C4-Alkene alleine bereits 50% beitrugen.
Regulation des CFTR
(2002)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation des humanen CFTR an isolierten Makropatches von Xenopus-Oozyten untersucht. Die inside-out-Konfiguration ermöglicht den einfachen Zugang zu den zytosolischen Domänen, welche die CFTR- Aktivität steuern. Daher ist es mit dieser bewährten Methode möglich, die Interaktion des CFTR mit Nukleotiden, insbesondere unter dem Einfluss der Phosphorylierung, weitergehend zu charakterisieren. Die Strom-Spannungskennlinie des ATP-induzierten CFTR-Chloridstroms weicht bei zunehmendem Haltepotenzial von dem Verlauf ab, der aufgrund der Goldmann- Hodgkin-Katz-Gleichung zu erwarten ist. Dies weist auf einen hemmenden Einfluss des in der Badlösung vorhandenen Aspartats hin. Die transienten Ströme bei schnellen Chloridkonzentrationswechseln bestätigen diese Hemmung und legen einen inhibitorischen Einfluss auf das CFTR-Gating nahe. Die Koexpression des CFTR mit dem Fusionsprotein Bakteriorhodopsin-PKA katalytische Untereinheit (BR-PKA) erm glicht die Kanalaktivierung durch einfache ATP-Zugabe. Es wurde gezeigt, dass diese Koexpression die apparente Affinität für MgATP erhöhte. Eine naheliegende Vermutung ist, dass diese Affinitätszunahme durch einen erhöhten Phosphorylierungsgrad hervorgerufen wird, was durch die Messungen mit dem Proteinkinaseinhibitor PKI unterstützt wird. Durch die Aktivierung der koexprimierten membrangebundenen cGMP-abhängigen Proteinkinase II (cGKII) kann der CFTR sowohl in Ganzzellmessungen, als auch in Makropatches phosphoryliert werden. Der Vergleich der ATP-Konzentrationsabhängigkeiten des CFTR unter permanenter (KM = 29 µM) und vorübergehender cGKII-Stimulierung (KM = 64 µM) belegt eine Abnahme des apparenten KM bei kontinuierlicher Kinaseaktivität und somit vermutlich erhöhter Phosphorylierung. Die Öffnungs- und Schlieflkinetik des Kanals wird durch diese permanente Kinaseaktivität nicht beeinflusst. Die zeitabhängige Abnahme des CFTR-Chloridstroms, der Rundown, kann nicht durch eine permanente Proteinkinaseaktivität von BR-PKA oder cGKII aufgehoben werden. Die Signalabnahme tritt auch unter Bedingungen auf, bei denen mögliche vorhandene Phosphatasen (v.a. PP2C) inaktiv sind. Daraus folgt, dass der Rundown des CFTR nicht nur durch Dephosphorylierung verursacht wird. Für Einzelkanalmessungen wird eine Verringerung der Offenwahrscheinlichkeit des epithelialen Natriumkanals ENaC durch den aktivierten CFTR beschrieben. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Makropatchmessungen bestätigen diese Inhibition nicht. Die CFTR- und Natriumkanal-vermittelten Ströme sind, unabhängig von dem Verhältnis der Einzelströme und dem anliegenden Haltepotenzial, generell additiv. Der präphosphorylierte CFTR kann auch durch ATP-Zugabe geöffnet werden, wenn die Badlösung kein Magnesium enthält. Da unter diesen Bedingungen keine ATP- Hydrolyse erfolgen kann, muss eine Kanalaktivierung durch einfache ATP-Bindung möglich sein. Es tritt eine Verringerung der apparenten ATP-Affinität, nicht aber des maximalen Chloridstroms auf, wenn das Magnesium aus der Badlösung entfernt wird (KM[MgATP] 70 µM; KM[ATP]> 1 mM). Die Möglichkeit der nichthydrolytischen Aktivierung wird dadurch bestätigt, dass auch mit dem nicht-hydrolysierbaren ATP- Analog AMP-PNP eine Kanalöffnung erfolgt. Magnesium ist nicht nur an der ATP-Hydrolyse beteiligt, sondern beeinflusst darüber hinaus die Kanalaktivität. Aus den Messungen bei unterschiedlichen freien Mg2 - Konzentrationen in der Badlösung geht ein inhibitorischer Einfluss dieses Kations auf den stationären Maximalstrom und ein komplexer Einfluss auf die Öffnungskinetik hervor. Die Walker-A und die Walker-B-Dom nen von Nukleotidbindestellen sind an der Bindung und Hydrolyse von MgATP in ATPasen beteiligt. Mit CFTR- Mutanten, in denen die Walker-A (K1250A), bzw. die Walker-B (D1370N)-Domäne der zweiten Nukleotidbindestelle (NBD2) mutiert sind, kann die Beteiligung der NBD2 an der Kanalöffnung belegt werden. Die langsame K1250A-Mutante öffnet in Abwesenheit von Magnesium nicht. Dagegen ist sowohl die Öffnungs- und Schließkinetik, als auch die ATP-Affinität der D1370N-Mutante mit der des Wildtyps vergleichbar, weist aber im Gegensatz zu diesem keinerlei Magnesiumabhängigkeit auf. Auf Grundlage dieser Daten wird ein Modell vorgeschlagen, in dem alternativ zu dem hydrolytischen Öffnungszyklus, in dem zunächst eine ATP-Hydrolyse an der NBD1 erfolgt, auch die nichthydrolytische Öffnung über die NBD2 möglich ist.
Ziel dieser Arbeit ist es, Wege darzustellen, wie die Thematik Ökobilanzen im Chemieunterricht allgemeinbildender Schulen behandelt werden kann. Ökobilanzen sind definiert als ein Verfahren zur Ermittlung der potentiellen Umweltbelastungen eines Produktes über dessen gesamten Lebensweg. Ein solcher Lebensweg besteht aus mehreren Abschnitten. Am Anfang steht die Rohstoffgewinnung, dann folgt die Herstellung des Produktes, darauf der Gebrauch/Verbrauch und schließlich die Entsorgung oder das Recycling. Die grundlegende Vorgehensweise, wie eine (klassische) Ökobilanz aufzustellen ist, ist ausführlich in den DIN EN ISO-Normen 14040 bis 14043 beschrieben. Für den Chemieunterricht ist aber ein solche, den gesamten Lebensweg umfassende und DIN-gerechte Betrachtung zu zeitaufwendig und schwierig. Daher wurde nach Lösungsmöglichkeiten gesucht, dieses aufgrund seines Umweltbezuges interessante Thema dennoch für den Unterricht erschließen zu können. Es wurde ein kombinierter experimenteller und computerunterstützter Zugang entwickelt. Schwerpunkt ist der Chemieunterricht der Sekundarstufe II, jedoch kann die Thematik Ökobilanzen aufgrund umfassender didaktischer Reduktion bereits in der Sekundarstufe I oder ganz vereinfacht sogar im Sachunterricht der Grundschule behandelt werden. Methodische Möglichkeiten werden auch für diese Schulstufen vorgestellt. Für die Sekundarstufe II wurden Experimente erarbeitet, deren Daten zu den Stoff- und Energieströmen dazu dienen, eine vereinfachte Ökobilanz im Unterricht aufstellen zu können. Gegenstand der Experimente ist zum einen die Herstellung von entionisiertem Wasser über Destillation und Ionenaustausch, zum anderen die Herstellung und das Recycling von Kunststoffen. Die Experimente sind so konzipiert, daß sie von Schülern selbst durchgeführt werden können. Um die Auswertung und die Aufstellung der Ökobilanz zu vereinfachen und somit zu beschleunigen, wurde das Programm ÖKO-BILLY unter Microsoft Excel 97 entwickelt, welches hier ebenfalls vorgestellt werden soll. Es dient nicht nur Datenerfassung, sondern ist darüber hinaus auch ein Lernprogramm, welches den Aufbau und die Durchführung einer Ökobilanz demonstriert. Durch die Kombination von Experiment und Computerprogramm kann die Thematik Ökobilanzen erfolgreich im Chemieunterricht der gymnasialen Oberstufe vermittelt werden.
Weltweit stellen die tropischen Tieflandregenwälder die Zentren der Artenvielfalt und Biodiversität dar. Sie sind das komplexeste aller terrestrischen Ökosysteme. Zu der Frage nach den Ursachen ihrer Artenvielfalt und deren Aufrechterhaltung gibt es neben theoretischen Erklärungsansätzen bisher kaum Studien, die versuchen, die Artenvielfalt eines Taxons bedingende ökologischen Faktoren kausal zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, diese Thematik mit Hilfe eines neuen Forschungsansatzes aufzugreifen. Die Artenabnahme eines Taxons und die sie potentiell verursachenden Faktoren sollten entlang eines Höhengradienten aufgenommen werden, um im Umkehrschluß Hinweise zu finden, welche Bedingungen für die Aufrechterhaltung der Artenvielfalt entscheidend sind. Ameisen boten sich aufgrund ihrer starken Artenabnahme mit zunehmender Höhe besonders als Untersuchungsobjekt an. Sie nehmen zudem eine Schlüsselrolle im Ökosystem Tieflandregenwald ein, stellen unter den Invertebraten eine der taxonomisch mit am besten bearbeiteten Gruppen dar, und selbst einzelne Individuen können aufgrund ihrer eusozialen und seßhaften Lebensweise definitiv dem Fundort bzw. der Fundhöhe zugeordnet werden. Der grundlegende Versuchsansatz bestand darin, alle Untersuchungen vergleichend in Boden- und Vegetationsstratum durchzuführen. Dementsprechend wurden entlang des Höhengradienten in beiden Straten die Artenabnahme der Ameisen sowie abiotische und biotische Parameter aufgenommen. Weiterhin wurde eine Art (Diacamma sp.) exemplarisch herausgegriffen, um eventuelle Veränderungen ihrer Ökologie zu erfassen. Die Abnahme der Artenvielfalt von Ameisen am Boden und in der niederen Vegetation verläuft unterschiedlich. Dieser Unterschied ist jedoch nicht auf grundlegend unterschiedliche Faktoren zurückzuführen, sondern auf deren unterschiedliche Ausprägung entlang des Höhengradienten. Es handelt sich hier in beiden Straten zusammenfassend vor allem um vier Faktoren: Temperatur, Feuchtigkeit (umfaßt relative Luftfeuchtigkeit, Nebel, Regen und Staunässe), Nistraumverknappung und Nahrungsverknappung. Die in dieser Studie festgestellte signifikant positive Korrelation von Arten- und Temperaturabnahme betont die besondere Bedeutung des Parameters Temperatur. Diese wirkt einerseits durch eine Beeinträchtigung des Stoffwechsels direkt auf adulte Tiere und Brut und andererseits indirekt über die Veränderung abiotischer (Feuchtigkeit und Nistraum) und biotischer (Nahrung) Parameter. Die jeweiligen relativen Anteile von direktem und indirektem Temperatureinfluß, die mit zunehmender Höhe zur Artenabnahme führen, sind mit den vorliegenden Daten nicht quantifizierbar. Zudem verändern sich die Relationen entlang des Höhengradienten. Anhand ökologischer Überlegungen kann dennoch eine Einschätzung der jeweiligen Bedeutung der Einzelfaktoren vorgenommen werden. Der direkte Einfluß von Temperatur wird in der vorliegenden Studie mehrfach verdeutlicht. Diacamma sp. zeigt beispielsweise eine verminderte Leistungsfähigkeit durch eine signifikant geringere Bauaktivität mit steigender Höhe. Zudem scheint Diacamma sp. in der Lage zu sein, die Architektur ihrer Nester so zu verändern, daß sie thermoregulatorisch der Temperaturabnahme entgegenwirkt. Diese ethologische Flexibilität ermöglicht Diacamma sp., ihr Vorkommen über ihre physiologische Toleranz hinaus auszudehnen. Ein weiterer Hinweis auf einen direkten Temperatureinfluß ergibt sich aus der generellen Reduktion der Koloniegrößen mit zunehmender Höhe. Sie könnte unter anderem durch eine verringerte Fouragieraktivität begründet sein. Weiterhin nimmt die Nestdichte in beiden Straten in dem Höhenbereich signifikant ab, in dem die Durchschnittstemperaturen unter den ökologisch für Ameisen kritischen Schwellenwert von 20°C sinken. Der überwiegende Teil der Ameisen beider Straten nistet in thermoregulatorisch ungünstigem Nistraum (z.B. kleines Totholz, Laub, Humusschicht, Karton). Daher kann die Temperaturabnahme direkt zu einer Nistraumverknappung führen. Am Boden hat die temperaturinduzierte Zunahme von Staunässe mit steigender Höhe einen zusätzlichen negativen Effekt auf die Ressource Nistraum. Insbesondere die Schicht, in der die meisten Nester gefunden wurden (Humus-Wurzel-Schicht), ist davon betroffen. Zudem führt die signifikant an Höhe zunehmende Humus-Wurzel-Schicht dazu, daß der Oberboden im Übergang zwischen Tiefland- und unterem Bergregenwald immer weniger als Nistraum zur Verfügung steht. Im Bergregenwald hingegen treten durch vermehrten Epiphytenbewuchs für Bodenameisen neue Nistmöglichkeiten in der niederen Vegetation auf. In der Vegetation werden durch zunehmende Feuchtigkeit die Kartonnester instabil und damit in größeren Höhen unbrauchbar. Zudem trägt die temperaturabhängige Veränderung der Wuchsform des unteren Bergregenwaldes durch eine räumliche Verkleinerung des Gesamtlebensraumes zu einer Reduzierung der Nist- und Nahrungsressourcen bei. Die Nahrungsverfügbarkeit für Ameisen wird am Boden und in der niederen Vegetation ebenfalls negativ von Temperatur und Feuchtigkeit beeinflußt. Am Boden wird die Nahrungsverknappung z.B. durch den signifikant zunehmenden Nistabstand und den signifikant abnehmenden Beuteeintrag / Zeit von Diacamma sp. Kolonien deutlich. Es ist anzunehmen, daß Nahrungsmangel bei ihrer Verbreitungsgrenze von 1050 m eine wichtige Rolle spielt. Die Nahrungsverknappung für die räuberisch lebenden Bodenameisen wird vermutlich vor allem durch die Abnahme wichtiger Beutegruppen (z.B. Termiten) verursacht. Weiterhin hindert (Stau)Nässe kleine Ameisenarten (die große Mehrheit der hier gesammelten Arten) an der Nahrungssuche. In der niederen Vegetation verursacht der Wechsel des Florentyps auf Familienniveau zwischen Tieflandregenwald und Bergregenwald mit großer Wahrscheinlichkeit eine entscheidende Verknappung der Nahrungsressourcen über die Abnahme von Pflanzen mit extrafloralen Nektarien und der mit Ameisen assoziierten Trophobionten. Die Arten- und Abundanzabnahme der Ameisen verstärkt diese Tendenz wiederum durch negative Rückkopplung, da eine geringere Nachfrage das Angebot bzw. die Produktion der Nahrungssubstrate reduziert. Die vorliegenden Ergebnisse geben weiterhin Hinweise, welche Faktoren bei der Faunenverarmung in anthropogen veränderten Habitaten eine wichtige Rolle spielen können. Der größte Teil der Artenvielfalt des untersuchten primären Regenwaldes wird von kleinen Arten gestellt. Diese wiederum weisen in besonderem Maße eine Sensibilität gegenüber mikroklimatischen Veränderungen auf. Insbesondere abiotische Extreme wie Nässe und niedrige Temperaturen oder Trockenheit in Kombination mit hohen Temperaturen sind Faktoren, die sie am Fouragieren und Nisten hindern können. Daher trägt eine gut ausgebildete Laubstreu- bzw. Humusschicht grundsätzlich zur Artenvielfalt der Bodenameisen bei. Die Laubstreuschicht dient als Fouragierstratum, die Humusschicht als Hauptniststratum, und beide zusammen wiederum sind ein Schutz gegen die Austrocknung des Oberbodens. Ihre Bewahrung sowie die eines möglichst ausgewogenen Mikroklimas sind Grundvoraussetzung für die Vermeidung einer Artenverarmung. Für die niedrige Ausbreitungsgrenze von Ameisen an feucht-tropischen Höhengradienten (ca. 2300 m) scheinen spezielle Charakteristika ihrer eusozialen Lebensweise entscheidend zu sein. Hier sind insbesondere die ökologische Notwendigkeit geschützten Nistraums, energieaufwendiger Fouragierleistung und hoher Brut-Entwicklungstemperatur sowie die Unfähigkeit zur aktiven Nest- Temperaturerhöhung zu nennen. Historisch tiergeografische Gründe scheinen für die starke Abnahme der Ameisenvielfalt mit zunehmender Höhe bzw. für ihre Ausbreitungsgrenzen eine eher untergeordnete Rolle zu spielen. Temperaturabnahme allein bedingt jedoch nicht zwingend eine Artenabnahme, wie im unteren Bergregenwald an der gleichbleibenden Artenzahl des Bodenstratums deutlich wird. Die Bodenameisen müssen hier Lösungswege gefunden haben, dauerhaft mit weit unter 20°C liegenden Temperaturen, starker Nässe und geringer Sonneneinstrahlung zurecht zu kommen. Insofern können in den submontanen und montanen Bereichen der Regenwälder Höhenspezialisten vermutet werden, die jedoch nicht die subalpinen Regionen erreichen. Zusammenfassend ist festzuhalten, daß für eine hohe Artenvielfalt von Ameisen eine relativ hohe Temperatur, ausgewogen hohe Feuchtigkeit, Nistraumvielfalt und Nahrungsmenge sowie -qualität von entscheidender Bedeutung sind. Eine nähere experimentelle Analyse ihres jeweiligen relativen Gewichtes und ihrer konkreten Wirkweise auf einzelne Arten bzw. Artengruppen wäre für die Zukunft wünschenswert.
Die Kichererbse (C. arietinum L.) ist eine der ältesten kultivierten Leguminosen und stellt eine Nahrungsgrundlage in vielen Ländern mit semiaridem Klima dar. Seit einigen Jahren unterstützen molekulare Marker sowohl die Züchtungsforschung als auch die Genomanalyse dieser Pflanze, so daß bereits eine genetische Karte des Kichererbsengenoms erstellt werden konnte. Da repetitive Komponenten einen Großteil des Genoms ausmachen können, ist ihre Charakterisierung zum Verständnis der Organisation des Kichererbsengenoms unerläßlich. Insgesamt konnten sieben repetitive Sequenzfamilien aus C. arietinum isoliert und identifiziert werden, von denen einige direkt in der Genomanalyse bzw. für taxonomische Fragen Anwendung fanden. Außerdem wurde ein universelles Primerpaar zur schnellen Detektion von DNA-Transposons entwickelt und verwendet. 1. Die beiden Satellitenelemente CaSat1 und CaSat2 sowie das Ty3-gypsy-ähnliche Retrotransposon CaRep stellen vermutlich die abundantesten Familien repetitiver Sequenz dar. Die beiden AT-reichen Satelliten bestehen aus 162-167 bzw. 100 Bp langen, hintereinander (,,head-to-tail") angeordneten Monomeren. CaSat2 ist ein dominanter Bestandteil des pericentrischen Heterochromatins, während CaSat1 hauptsächlich in der Nachbarschaft der 18S-5.8S-25S rDNA-Loci lokalisiert ist. Eine Verwandtschaft von CaSat1 zu IGS-Sequenzen ist nicht auszuschließen. Eine vollständige Kopie des dispersen Retroelements CaRep, das im pericentrischen Heterochromatin konzentriert ist, jedoch den zentralen Bereich von CaSat2 ausspart, konnte rekonstruiert werden. Das Element ist 11.4 Kbp lang und hat relativ lange, flankierende LTRs von je 3.3 Kbp. Alle drei hochrepetitiven Elemente sind spezifisch für die Gattung Cicer. Die genomische Organisation von CaRep wurde offenbar während der Evolution der annuellen Cicer-Spezies mehrfach rearrangiert. 2. Da die beiden Satelliten CaSat1 und CaSat2 in allen untersuchten Spezies der Gattung Cicer (außer C. cuneatum) vorhanden sind, lassen sich ihre Abundanz und Organisation zur Klärung taxonomischer Fragen verwenden. Die Ergebnisse unterstützen die Außenseiterrolle von C. cuneatum innerhalb der annuellen Cicer- Spezies und damit Thesen zu einem separaten Ursprung dieser Annuellen sowie die Forderung nach der taxonomischen Trennung von der Sektion Monocicer. Auch unterstützen und ergänzen die Ergebnisse über die Satellitenelemente bereits vorliegende molekulare Daten, Karyotypisierungen sowie Kreuzbarkeitsdaten und bestätigen die Gruppierung von C. chorassanicum sowie der ersten Kreuzungsgruppe. 3. Das hochabundante Retrotransposon CaRep kann für eine S-SAP (,,sequence-specific amplified polymorphisms")-ähnliche Markertechnik verwendet werden und liefert polymorphe molekulare Marker, die sich in die genetische Karte integrieren lassen. Die damit detektierten Polymorphismen werden vermutlich durch Variabilität innerhalb der LTR-Sequenzen erzeugt. Ein Teil der so generierten Marker ist mit den Resistenzgenloci gegen Fusarium oxysporum f.sp. ciceri gekoppelt. Die Hybridisierung bestätigt, daß durch die Marker tatsächlich Loci des Retrotransposons auf der genetischen Karte lokalisiert werden. 4. Unabhängig davon konnten durch PCR-Ansätze die drei mittelrepetitiven, dispersen Retrotransposonfamilien CaDis, CaTy und CaLin identifiziert werden. Von den beiden LTR-Retrotransposons CaDis und CaTy gehört letztere Familie zur Ty1-copia- Untergruppe, CaLin repräsentiert ein non-LTR-Element der LINE-Klasse. Alle drei Familien sind weniger abundant als CaRep und in den distalen Bereichen einiger oder aller Heterochromatinblöcke bzw. in den angrenzenden euchromatischen Regionen zu finden. Im Gegensatz zu den hochabundanten Familien kommen homologe Sequenzen der drei Familien auch außerhalb der Gattung Cicer vor und deuten auf eine evolutiv frühe Anwesenheit innerhalb der Fabaceen hin. Die sehr heterogenen Sequenzen von CaLin sind vermutlich sehr ursprünglich und haben während der Evolution der Annuellen keine großen Rearrangements erfahren. CaDis-Sequenzen werden in vielen Geweben transkribiert, jedoch ist unklar, ob dies auf eine Aktivität des Elements hinweist oder auf das Durchlesen benachbarter Gene zurückzuführen ist. 5. Um auch transposable Elemente der Klasse II (DNA-Transposons) nachweisen zu können, wurde ein degeneriertes Primerpaar aus dem Bereich der Transposase abgeleitet, mit dessen Hilfe pflanzliche En/Spm-Elemente in über 30 Pflanzenarten aus 20 Gattungen, darunter auch wichtigen Kulturpflanzen wie Zuckerrübe, Weizen und Erbse nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz stellt einen Ausgangspunkt für die Charakterisierung solcher Elemente in beliebigen Pflanzengenomen und ihre Verwendung bei der Genomanalyse sowie zur Genidentifikation und -isolation dar. 6. Die niedrig- bis mittelrepetitive, disperse En/Spm-Familie aus C. arietinum (CaEn/Spm) umfaßt drei Subfamilien und ist auf mindestens sechs Chromosomen im distalen Teil der Heterochromatinblöcke angrenzend an euchromatische Bereiche lokalisiert. Die hier vorgelegten Befunde umfassen die erste chromosomale Lokalisation eines DNA-Transposons in Pflanzen durch FISH. Die genomische Organisation homologer Sequenzen in anderen Cicer-Spezies deutet möglicherweise auf transposable Aktivität während der Evolution der Annuellen hin. CaEn/Spm- ähnliche Elemente scheinen bereits in einem Vorgänger von C. arietinum und nahe verwandten Leguminosen vorhanden gewesen zu sein. Durch die vorliegenden Daten war es möglich, ein vorläufiges Modell der Verteilung repetitiver Sequenzen auf den acht Kichererbsenchromosomen zu entwerfen, das für die weitere Genomanalyse von C. arietinum genutzt werden kann. Obwohl vermutlich nur ein Teil aller repetitiven Komponenten dieses Genoms charakterisiert wurde, deutet sich - im Gegensatz zu Pflanzen mit vergleichbarer Genomgröße - durch die Konzentration repetitiver Sequenzen im pericentrischen Heterochromatin eine Ähnlichkeit zur Chromosomen- organisation in Arabidopsis thaliana an.
Die vorliegende Arbeit befasst sich im Wesentlichen mit zwei Zielen. Zum einen sollte durch den selektiven Einbau von modifizierten Nukleosiden der UUCG-Tetraloop untersucht werden, um seine ungewöhnlich hohe Stabilität besser zu verstehen. In einem zweiten Projekt stand die Entwicklung einer neuen Methode für das Spin-Labeling von Oligonukleotiden für die ESR-Spektroskopie im Mittelpunkt. Die einzigartige hohe Stabilität des UUCG-Tetraloops beruht auf der Ausnutzung der drei stabilisierenden Faktoren: Wasserstoffbrücken, Basenstapelung und Solvatation. Für die Untersuchung des UUCG-Tetraloops wurden 2´-Fluorpyrimidine 22a/b, 23a/b und 27a/b, 2´- Desoxyuridin 26a/b sowie ein dem Uridin isosterer Baustein 28a/b eingesetzt (Abb. 10.1). Während die Bausteine 27a/b und 28a/b vorlagen, sind die Bausteine 22a/b, 23a/b und 26a/b synthetisiert worden. 2´-Fluorpyrimidine können durch die fehlende 2´-OH-Funktion nicht als Wasserstoffbrückendonor dienen. Weiterhin verschiebt die Fluorierung in ribo- bzw. arabino- Stellung das C3´-endo/C2´-endo Gleichgewicht. Im Vergleich mit dem Einbau von 2´- Desoxyuridin lassen sich Aussagen über Vorzugskonformation und Beteiligung an Wasserstoffbrücken einzelner Nukleotide im Loop machen. Ein Schlüsselmolekül für die Synthese der 2´-Fluor modifizierten Bausteine 22a/b und 23a/b ist 2,2´-Anhydro-1-( -D-arabinofuranosyl)uracil 19 welches durch die Umsetzung von Uridin 18 mit Diphenylcarbonat und Natriumhydrogencarbonat in HMPT erhalten werden kann. Dieses ermöglicht die selektive Einführung eines Fluor-Atoms. Die 2´-Fluornukleoside wurden nach Standardbedingungen in Phosphoramidite überführt. Die Darstellung des Cytidinbausteins 23a/b gelang durch direkte Umsetzung der Verbindung 22a/b mit 1,2,4-Triazol und POCl3. Diese Reaktion erspart einen gesonderten mehrstufigen Syntheseweg für die Verbindung 23a/b ausgehend vom Cytidin. Die Bausteine wurden selektiv an verschiedenen Positionen im Loop- und Stembereich der UUCG-Haarnadelschlaufe mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten eingebaut. Die Aufreinigung der erhaltenen RNA-Stränge erfolgte durch Anionenaustausch-HPLC. Nach der Charakterisierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Stränge mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Neben den Tm-Werten wurden auch die thermodynamischen Parameter bestimmt. Aus den gemessenen Daten konnten im Wesentlichen folgende Ergebnisse erzielt werden: * Der Einbau aller Bausteine im Loopbereich führte zu einer Destabilisierung im Vergleich zum nativen Loop. Die Inkorporation von UF im Stembereich hatte eine beachtliche Stabilisierung der Struktur zur Folge, im Fall des Stranges HP19 von 8°C (siehe Tab. 7.1, Seite 79) * Der Einbau von UF an der Position U4 führte erwartungsgemäß zu einer Destabilisierung, da die durch NMR-Daten belegte Wasserstoffbrücke zu G7 nicht ausgebildet wird. * An der Position U4 liegt bevorzugt eine C2´-endo Konformation vor. * Von besonderer Bedeutung für die Stabilität des Loops ist die Position C6. Die Inkorporation von CF hat eine besonders deutliche Destabilisierung zur Folge, woraus auf eine bevorzugte C2´-endo Konformation geschlossen werden kann. Zum anderen spielen hier Solvatationseffekte eine Rolle, da die 2´-OH-Funktion des nativen Loops Kontakt zum Lösungsmittel hat. * Der Einbau des isosteren Bausteins 28a/b führte an keiner Position zu einer Stabilisierung, obwohl durch das ausgeprägte -System eine bessere Basenstapelung zu erwarten wäre. Im Gegenteil wir durch die modifizierte Base der Tetraloop nachhaltig destabilisiert (12°C). * Auffällig ist eine Abflachung der erhaltenen Schmelzkurven, die auf eine Abnahme der Kooperativität oder das Vorhandensein verschiedener Zwischenstufen schließen lässt. Auch NMR-Ergebnisse belegen, dass der Tetraloop ein hohes Maß an Flexibilität zeigt. Die erhaltenen Daten sind in Übereinstimmung mit einer auf NMR-Daten beruhenden simulierten Struktur, die Williams et al, 2001 vorgeschlagen haben. * Die Mehrfacheinbauten zeigen, dass die stabilisierenden Kräfte dieses Tetraloops synergetisch scheinbar optimal zusammenwirken und nur schwer getrennt voneinander betrachtet werden können. Im zweiten Projekt sollten Oligonukleotide durch das Anbringen von Spin-Labeln für die ESR-Spektroskopie zugänglich gemacht werden. Zunächst ist der durch seine Starrheit geeignete Label 29 in einer 8-stufigen Synthese ausgehend von 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-4-on 41 synthetisiert worden. Nach der Bromierung in und ´-Position wird durch eine Favorskii-Umlagerung der Fünfring aufgebaut. Die Oxidation des Amins wurde mit H2O2/Natriumwolframat durchgeführt. Nach der basischen Hydrolyse wird die Seitenkette über ein Weinrebamid zum Aldehyd reduziert. Eine direkte Reduktion war nicht möglich. Das terminale Alkin des Labels 29 wir durch Seitenkettenverlängerung durch eine Wittig- Reaktion mit anschließender Dehydrochlorierung erhalten. Ein alternativer Syntheseweg, der die Oxidation des Amins zum Nitroxid auf einer späteren Stufe vorsieht, war nicht erfolgreich. Da die Ankupplung des Labels an die 5-Position eines Uridin- oder Desoxyuridin- Bausteins während der Festphasensynthese am Syntheseautomaten erfolgen soll, ist der entsprechende 5-Ioduridinphosphoramidit- bzw. 2´-Desoxy-5-Ioduridinphosphoramidit- baustein synthetisiert worden. Nach der Schützung der freien Hydroxylgruppen mit der Acetylschutzgruppe ist die Iodierung der 5-Position mit Iod und Cerammoniumnitrat durchgeführt worden. Nach der Entschützung der Hydroxylgruppen wurden die Phosphoramidite nach Standardmethoden synthetisiert. Im Gegensatz zu bisherigen Arbeiten, die ein gelabletes Phosphoramidit am Synthesizer eingebaut haben, wurde die Kupplung des Labels in dieser Arbeit während der Festphasensynthese durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass im Gegensatz zu dem gelabelten Amidit pro Kupplung nur geringe Mengen des Spin-Labels verbraucht werden. An der zu markierenden Position wird ein 5-Ioduridin oder 2´-Desoxy-5-ioduridinbaustein eingebaut und danach die Säule vom Synthesizer entfernt. Nun wird mit Hilfe von Spritzen eine Mischung des Labels, des Palladium(0)-Katalysators und CuI in DMF/Triethylamin auf die Säule aufgegeben. Nach der erfolgten Kupplung wird die Säule wieder am Synthesizer installiert und die Synthese fortgesetzt. Es hat sich aus Gründen der einfacheren Handhabbarkeit als günstiger erwiesen, als Katalysator nicht Tetrakis-(triphenylophosphin)-palladium(0) 66 sondern Bis- (triphenylphospin)-palladium(II)-dichlorid 68 einzusetzen. Die Kupplungsausbeuten des Labels lagen nach HPLC-Daten bei über 90% für die Stränge SG1 bis SG4 (siehe Tab. 9.2, Seite 132). Die Ausbeuten lagen damit genauso hoch wie die Kupplung des als Vergleichsverbindung eingesetzten Hexins. Während die HPLC-Aufreinigung bei den kurzen Strängen erfolgreich war, waren bei den längeren Strängen SG7 bis SG9 die Unterschiede in den Retentionszeiten geringer, sodass es bei noch längeren Strängen nötig werden könnte, die Stränge mittels Gelelektrophorese aufzureinigen. Die Analytik erfolgte durch ESR-Spektroskopie, enzymatischen Verdau und Massenspektrometrie. Jedoch habe sich sowohl die MALDI-TOF als auch die ESI- Massenspektrometrie als problematisch erwiesen. Die Spektren waren oft nicht aussagekräftig und wenig reproduzierbar. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten ausgehend von dieser Arbeit werden folgende Untersuchungen angeregt: * Die Untersuchung, ob FPLC oder Gelelektrophorese geeignete Methoden darstellen, um längere gelabelte Stränge aufzureinigen. * Darstellung von iodierten Purinnukleosiden, um beliebige Positionen innerhalb eines Oligonukleotids mit einem Spin-Label markieren zu können. * Den Mehrfacheinbau von Spin-Labeln um Abstände in kleinen RNA-Strukturen, z.B. Ribozymen zu bestimmen. Hier können auch Wechselwirkungen mit anderen paramagnetischen Sonden wie Manganionen ausgenutzt werden.
Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Rattanpalmen, die kletternden Vertreter der Unterfamilie Calamoideae, sind ein Charakteristikum aller südostasiatischen Regenwälder. Etwa 600 Arten sind gegenwärtig bekannt, ihr Verbreitungsgebiet erstreckt sich von Afrika bis in den Pazifik, mit einem deutlichen Schwerpunkt in Südostasien. Neben seiner ökologischen Rolle ist Rattan das wichtigste kommerzielle Produkt der Wälder Südostasiens nach dem Holz selbst. Da bisher fast der gesamte Bedarf aus den natürlichen Beständen entnommen wurde, werden vor allem die qualitativ hochwertigsten Arten zunehmend seltener und gelten zum Teil bereits als gefährdete Arten. Bereits 1980 wurden in Malaysia die ersten Versuche gestartet, Rattan in großem Umfang in Pflanzungen anzubauen, wobei Pflanzungen in Gummiplantagen eine besonders attraktive Lösung bieten. Mit der Anlage von Pflanzungen ist aber auch mit einer geänderten Schädlingssituation zu rechnen, die früher oder später zu Schädlingsproblemen führen wird. Zur Beurteilung derartiger Entwicklungen ist aber eine möglichst umfassende Kenntnis der natürlichen Verhältnisse, der potentiellen Schadinsekten sowie natürlicher Schutzfaktoren unabdingbar. Gemessen an der Bedeutung von Rattan, ist der Kenntnisstand über seine Ökologie und speziell der mit ihm assoziierten Insektenfauna ausgesprochen gering. Ziel des vorliegenden Projektes war es, eine möglichst breite Datenbasis über die mit Rattan assoziierte herbivore Insektenfauna zu erarbeiten, wobei Calamus manan als wichtigste kommerzielle Art in Malaysia den Schwerpunkt bildet, und durch den Vergleich verschiedener Pflanzungen und des natürlichen Habitats Entwicklungstendenzen aufzuzeigen. Diese Studie wurde auf der Halbinsel Malaysia durchgeführt, Untersuchungsgebiete für Calamus manan waren eine Pflanzung unter Gummibäumen in Kg. Bongsu, Perak, eine Versuchspflanzung in Sekundärwald in Sg. Buloh, Selangor, eine Dorfpflanzung in Sekundärwuchs in Ulu Gombak, Selangor, sowie das natürliche Habitat, ebenfalls in Ulu Gombak. Pflanzungen von Calamus caesius wurden in Sg. Buloh und der Dorfpflanzung in Ulu Gombak bearbeitet, im natürlichen Habitat in Ulu Gombak wurden des weiteren die Rattanarten Calamus scipionum, C. ornatus, C. insignis und Korthalsia rigida untersucht sowie als Vergleichsart die stammbildende Palme Caryota mitis. Über zwei Untersuchungsperioden von zusammen 20 Monaten wurde die markierten Versuchspflanzen monatlich auf herbivore Insekten untersucht sowie Wachstumsdaten erhoben. Die Wachstumsraten zeigten große Unterschiede sowohl zwischen den einzelnen Pflanzen eines Plots als auch zwischen den verschiedenen Plots. Der mittlere jährliche Blattzuwachs für Calamus manan betrug in den Pflanzungen 4,914,2 Blätter, im natürlichen Habitat dagegen nur 1,6. Die Wachstumsraten für Calamus caesius betrugen 10,2 und 12,0 Blätter/Jahr, die im natürlichen Habitat untersuchten Pflanzen legten im Mittel zwischen 0,8 und 2,2 Blätter pro Jahr an. Die festgestellten Blattzuwachsraten umspannen damit fast die gesamte Bandbreite der in der Literatur für Palmen berichteten Blattzuwachsraten von 0,5 bei Arenga obtusifolia bis 14,428,8 bei Elaeis guineensis. Gute Korrelationen zwischen Blattzuwachs und allen aufgenommenen Größenparametern sind für alle bearbeiteten Calamus mananPflanzungen und Calamus caesius in Sg. Buloh gegeben, Wachstumsleistung und verschiedene Größendimensionen der Pflanze zeigen sich hier eng gekoppelt. Die festgestellten Schäden am jüngsten Blatt betrugen im Mittel der Plots zwischen 5,33 % und 12,20 % entfernte Blattfläche. Da die Schäden in 10%-Klassen abgeschätzt wurden, sind die Unterschiede zwischen den Plots als geringfügig anzusehen, sie entsprechen der allgemeinen Beobachtung, daß Schäden durch herbivore Insekten üblicherweise unter 10 % liegen. Verschiedene Schadenstypen wurden identifiziert, wobei hohe Schäden eines Typs fast immer mit einem geringen Anteil an den Gesamtaufnahmen und ein hoher Anteil mit geringen Schäden verbunden ist. Für alle Calamus manan-Pflanzungen, mit Ausnahme der Dorfpflanzung, bestehen signifikante negative Korrelationen zwischen Blattschäden und Pflanzenhöhe, teilweise auch mit dem Blattzuwachs. Ebenso bestehen signifikante negative Korrelationen für die Blattschäden an Calamus caesius mit den Wachstumsraten der zweiten Beobachtungsperiode. Da Literaturangaben zufolge das Wachstum von Palmen sehr tolerant gegenüber Blattflächenreduktionen ist und die meisten gefundenen Herbivoren eher eine Präferenz für größere Pflanzen zeigen, werden diese Korrelationen dahin gehend interpretiert, daß schneller wachsende Individuen weniger Schäden akkumulieren als langsamer wachsende. Im Verlauf dieser Studie wurden etwa 106 Arten auf verschiedensten Palmen festgestellt, davon 60 Arten auf den markierten Palmen der Plots. 51 Arten wurden auf der Hauptuntersuchungsart Calamus manan nachgewiesen. Wie die Zeit-Arten-Beziehung zeigt, ist die Fauna sicher noch nicht vollständig erfaßt. Dem gegenüber stehen 16 Arten, die bisher in der Literatur für die Halbinsel Malaysia berichtet wurden. Insgesamt gefunden wurden in den Plots 5557 Individuen aller Stadien, 79,6 % davon Lepidoptera, 18,0 % Coleoptera und 2,4 % Orthoptera. Bedeutendste Gruppe waren die Hesperiiden mit 56,3 %, gefolgt von den Oecophoridae mit 18,3 % und den Hispinae (Chrysomelidae) mit 17,9 %. Eine ähnliche Faunenzusammensetzung aus Hispinae, Hesperiidae und Psychidae wurde in Pflanzungen von Metroxylon sagu festgestellt; im Gegensatz dazu steht die Ölpalmenfauna in Südostasien, deren wichtigste Vertreter den Familien Psychidae und Limacodidae angehören. In den Plots wurden 11 Arten von Hesperiiden gefunden, weitere 15 Arten wurden außerhalb der Plots und an anderen Palmen gefunden. Häufigste Hesperiide und häufigster Fund überhaupt war mit 1336 Exemplaren Salanoemia sala. Sie stellt 24,0 % aller Funde bzw. 42,7 % aller Hesperiidae und war in 8 der 13 Plots, darunter alle Calamus manan-Plots, vertreten. Über die Biologie dieser Art war bisher nichts bekannt. Wie fast alle Hesperiidenlarven legen die Larven von S. sala Schutzbauten an. Exemplarisch für andere Hesperiiden wird hier die Larvenbiologie dieser Art dargestellt und diskutiert. Ein starker Populationsanstieg in allen drei Kg.-Bongsu-Plots während eines Monats markiert diese Art als potentielle Problemart. Lotongus calathus trat nur in einem einzigen Plot, in Sg. Buloh, auf, stellt mit 30,6 % aller Hesperiidenfunde aber dennoch die zweithäufigste Art. Die Larvenbiologie dieser Art ist insofern einmalig, als die Larven in Symbiose mit einer häufigen Ameisenart, Dolichoderus thoracicus, leben. Die Larven stellen mit ihren Blattrollen Nistraum zur Verfügung, während die Ameisen offensichtlich Schutz gewähren. Dies erlaubt es L. calathus, eine sehr viel höhere Population aufzubauen als alle anderen Hesperiiden in diesem Plot zusammen. Das Zusammenkommen der Symbiosepartner scheint unter natürlichen Bedingungen ein relativ seltenes Ereignis zu sein, das durch die Anlage der Calamus manan-Pflanzung eine große Förderung erhielt. Als weitere regelmäßig an Calamus manan vorkommende Hesperiiden wurden Quedara monteithi, Gangara thyrsis und Erionota hiraca identifiziert. Die beiden erstgenannten sind bereits in der Literatur von Rattan beschrieben, Auflistungen der Arten E. thrax oder E. torus in der Literatur sind mit hoher Wahrscheinlichkeit E. hiraca zuzuschreiben. Eine noch unbeschriebene Art der Gattung Zela wurde nur wenige Male an Calamus manan gefunden, sie neigt jedoch zu Massenbefall und ist daher als weitere Problemart anzusehen. Korthalsia rigida besaß mit Acerbas martini eine eigene Hesperiidenart, ebenso Caryota mitis mit Plastingia naga. Letztere ist nahe mit Salanoemia sala verwandt und besitzt eine sehr ähnliche Larvenbiologie. Die Nymphalidae stellen nur 2,6 % der Gesamtfunde, sind damit aber dritthäufigste Lepidopterenfamilie. In den Untersuchungsplots wurden sechs verschiedene Arten gefunden, zwei Satyrinae und vier Amathusiini. Wichtigste Art war Amathusia ochraceofusca, die fast die Hälfte aller Nymphaliden stellt. Sie trat an Calamus manan in Kg. Bongsu und Sg. Buloh auf, ihre Larven leben, wie die meisten Amathusiini, gesellig. Weitere wichtige Funde waren die beiden Satyrinen Elymnias panthera und Coelites epiminthia, die ebenfalls in den Calamus manan-Pflanzungen auftraten. Während E. hypermnestra, die in dieser Studie nicht an Rattan gefunden wurde, ein bekannter Palmenschädling ist, war die Larvenbiologie von E. panthera ebenso wie von C. epiminthia bisher unbekannt. Die Familie Oecophoridae, vertreten durch eine einzige, bisher noch unidentifizierte Art, stellt mit 18,3 % der Gesamtfunde sowohl die zweithäufigste Art als auch Gruppierung. Sie trat in allen Pflanzungen sowie an Calamus manan und C. scipionum im natürlichen Habitat auf. Analog zu den Hesperiiden legen die Larven Schutzbauten an, die hier aber aus einem durchsichtigen Seidengewebe bestehen. Ein starker Populationsanstieg während der Beobachtungszeit markiert auch diese Art als potentielle Problemart. Andere Arten von geringerer Bedeutung waren die Notodontide Ambadra sp. sowie die beiden Limacodidae Olona gateri und Thosea vetusta. Eine Art der Gattung Batrachedra, die als Schädling der Infloreszenzen von Kokospalmen bekannt ist, wurde exklusiv auf Caryota mitis gefunden, die von ihr verursachten Schäden sind das vorherrschende Schadensbild dieser Palme. Nach den Hesperiiden und der Oecophoride stellt die Unterfamilie Hispinae der Chrysomelidae die dritte bedeutende Herbivorengruppe an Rattanpalmen dar. Auf sie entfallen 17,9 % der Gesamtfunde. Larven und Adulte besiedeln dieselben Wirtspflanzen, wobei die Larven fast ausschließlich auf den jungen, noch nicht vollständig aufgefalteten Blättern zu finden sind. Octodonta nipae stellt ein Drittel aller Hispinae, die Art wurde nur auf Calamus manan in Kg. Bongsu und der Dorfpflanzung gefunden. O. nipae lebt gesellig und scheint eine starke Förderung durch Blätter zu erfahren, die durch Schlingpflanzen im Unterwuchs am Auffalten gehindert werden. Pistosia spp. und Callispa spp. waren mit vier bzw. 12 Morphospezies vertreten und kamen in jeweils 12 der 13 Plots vor. Curculionidenlarven, die nicht aufgezogen werden konnten, kamen in einer Reihe von Pflanzen vor. Ihr Anteil ist eher unbedeutend, da ihr Auftreten aber meist den Tod der ganzen Pflanze bedeutet, stellen sie ebenfalls potentielle Problemarten dar. Cerambycidenlarven, die zwischen Blattscheide und Stamm minieren, wurden ebenfalls nur sehr selten gefunden, vor allem da sie ältere Pflanzen bevorzugen. Ihre Fraßspuren vermindern den Marktwert der geernteten Stämme, sie sind aus ökonomischer Sicht daher momentan einer der bedeutendsten Schädlinge. Eine Reihe von Orthopteren der Familien Acrididae und Chorotypidae wurden vor allem in den Pflanzungen unter Gummibäumen in Kg. Bongsu gefunden. Sie dürften polyphag sein und wohl vor allem an den Pflanzen des Unterwuchses fressen. Bestimmendes Element aller Calamus manan-Plots sind die vier Hesperiiden Salanoemia sala, Quedara monteithi, Erionota hiraca und Gangara thyrsis, dazu die Oecophoride und Pistosia sp. 2. Sg. Buloh erhält durch die massive Präsenz der Hesperiide Lotongus calathus eine Sonderstellung Die Artenzahlen der Plots liegen zwischen 13 und 24, wobei in den artenärmeren Plots relativ viele Funde an unmarkierten Pflanzen dazukommen, so daß die vollständigen Artenzahlen ähnlich liegen dürften. Die Gesamtfundzahlen nehmen mit abnehmender Natürlichkeit des Systems von 0,82 Funden/Pflanze im natürlichen Habitat bis 18,4 in einer der Pflanzungen unter Gummibäumen zu, der Diversitätsindex nimmt in der entsprechenden Richtung ab. Sg. Buloh fällt hierbei, wie bereits erwähnt, mit 25,24 Funden pro Pflanze und dem niedrigsten aller Diversitätsindizes aus der Reihe. Clusteranalysen, basierend auf den reinen Artenlisten, gruppieren die Plots in etwa entsprechend der Natürlichkeit. Clusteranalysen auf Basis von Arten und Abundanzen stellen den Sg.-Buloh- Plot abseits der anderen, die drei Kg.-Bongsu- Plots werden zusammengruppiert, ebenso die Pflanzung und das natürliche Habitat in Ulu Gombak. Die beiden Calamus caesius-Plots sind einander in Artenzahlen, Abundanzen und Diversitätsindex ähnlicher als die C. manan-Plots untereinander. Vergleiche mit den entsprechenden C. manan-Plots in denselben Lokalitäten ergeben weder eine eindeutige Gruppierung nach den Pflanzenarten noch nach den Lokalitäten. Die Fauna an Calamus caesius in Sg. Buloh war durch die Hesperiide Zela zeus und die Oecophoride dominiert. Beide Arten sind auch in der Dorfpflanzung in Ulu Gombak zumindest prinzipiell vorhanden, hier ist jedoch keine Art dominant. Im natürlichen Habitat war die Fauna von Korthalsia rigida durch die Hesperiide Acerbas martini dominiert, Caryota mitis durch die Hesperiide Plastingia naga und durch Batrachedra sp. Die verschiedenen Calamus-Arten wiesen keine dominanten Arten auf. In den Clusteranalysen zeigten die Plots im natürlichen Habitat wenig Beziehungen zueinander. Ausblick Insgesamt sind von den 106 Arten dieser Studie 88 Arten auf Rattan gefunden worden, maximal 11 davon waren bisher von Rattan bekannt. Eindeutig dominiert wird die mit Rattan assoziierte Fauna durch die Ordnung Lepidoptera, insbesondere von den Hesperiiden. Unter den Foliovoren wurden drei der Hesperiiden und die Oecophoride als potentielle Problemarten identifiziert. Allerdings liegen die festgestellten Fundzahlen noch unter allen für andere kommerziell interessante Palmen aufgestellten Schwellenwerten, die für Rattan vermutlich ohnehin höher angesetzt werden müßten.
In dieser Arbeit werden mit Hilfe von Röntgenstreuung Polymere untersucht, die auf molekularer Ebene eine lamellenartige Schichtstruktur aufweisen. Diese Ordnung wird bei hohen Temperaturen zerstört, das Polymer wandelt sich in eine homogene Schmelze um. Ziel dieser Arbeit ist es, die Ursachen dieser Phasenumwandlung, d.h. ihre treibenden Kräfte zu erforschen. Hierzu werden mehrere Polymere verschiedener Zusammensetzung untersucht und der Einfluss von mechanischem "Stress" auf die Phasenumwandlung überprüft. Die untersuchte Polymerklasse ist ein sogenanntes Diblockcopolymer , d.h. die Polymermoleküle bestehen aus jeweils zwei linearen Polymerkettenstücken verschiedener Polymersorten (hier: {\em Polystyrol} und {\em Polybutadien}), die "Kopf an Kopf" miteinander verbunden sind. Durch diese molekulare Verbindung ist eine Auftrennung auf makroskopischem Massstab, etwa vergleichbar der Entmischung von "Ol und Wasser, nicht möglich. Mikroskopisch kann das Polymer durch eine günstige Ausrichtung der Moleküle zueinander die Kontakte zwischen den Polystyrol- und Polybutadien-Teilketten minimieren. Diese Abnahme der Gesamt-Wechselwirkungsenergie führt zum Aufbau einer lamellaren Struktur und bedeutet gleichzeitig eine Absenkung der Entropie. Bei Erhöhung der Temperatur kann der entropische Beitrag zur freien Energie dominant werden, d.h. die Ordnung wird zerstört. Die Experimente wurden am Max-Planck-Institut für Polymerforschung in Mainz unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. Manfred Stamm (inzwischen an der Universität Dresden) durchgeführt. Dort wurden die Polymere synthetisiert und eine vorhandene Röntgenkleinwinkelstreuanlage für die hier vorgestellten Messungen genutzt. Weiterhin wurde eine Scherapparatur so umgebaut, dass die gleichzeitige Messung von Scherung und Röntgenkleinwinkelstreuung im Time-Slicing-Verfahren möglich war. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Röntgendetektor entwickelt, der die korrelierte Datenerfassung von Scherung und Röntgenstreuung im Zeitmassstab deutlich unter einer Sekunde ermöglicht. Die hier vorgestellten Experimente gliedern sich zum einen in statische Röntgenmessungen an verschiedenen Polymersystemen, welche die Temperaturabhängigkeit der inneren, molekularen Struktur untersucht, bei der Umwandlung von der lamellenartigen Schichtstruktur zur homogenen Schmelze und umgekehrt. Hierbei zeigen sich keine Hystereseeffekte und eine gute Übereinstimmung mit {\em MC-CMA}-Simulationen. Die einzelne Polymerkette wird beim Phasenübergang leicht gestreckt. Die beobachteten Phänomene werden durch feldtheoretische Modelle nicht vollständig wiedergegeben. Zum anderen wird der Einfluss von mechanischem "Stress" in Form einer oszillatorischen Verscherung auf diese Umwandlung und bei Temperaturen nahe dieser Umwandlung untersucht. Der anisotrope Aufbau der lamellenartigen Schichtstruktur bewirkt ein stark nichtlineares mechanisches Verhalten des Polymers, das mit dem Aufbau einer Vorzugsorientierung der Lamellen zur Richtung der Verscherung einher geht. Die Kinetik dieser Orientierungsphänomene wurde mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung während der mechanischen Beanspruchung gemessen. Es ergibt sich innerhalb der Messungenauigkeit von 1-2\,K keine Erhöhung der Umwandlungstemperatur. Abhängig von den Scherparametern zeigen sich knapp unterhalb der Umwandlungstemperatur unterschiedliche Vorzugsorientierungen, deren zeitliche Abfolge irreversibel ist. Für das Auftreten der verschiedenen Vorzugsorientierungen zum Scherfeld werden verschiedene Parameter auf unterschiedlichen Größenskalen verantwortlich gemacht. Das komplexe Zusammenwirken dieser strukturellen Details kann durch die mechanische Beanspruchung "getestet" werden. Der Aufbau einer langreichweitigen Ordnung wird durch die externen Kräfte beschleunigt.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Die enorme genetische Variabilität von HIV-1[14],[50] und die mangelnde Korrelation zwischen genetisch definierten Subtypen einerseits und antigener Variation[51]-[56] andererseits verhindern bisher die Entwicklung eines effizienten, breit neutralisierenden Impfstoffes. Neueren Ansätzen liegt daher das Konzept einer serologischen Klassifikation zu Grunde[61],[62], die verschiedene HIV-Subtypen nach ihrer serologischen Reaktivität und nicht nach ihrem genetischen Ursprung klassifiziert. Diese Ansätzen beruhten allerdings auf der Verwendung ausgewählter Consensus-Modellpeptide der immunodominanten V3-Region des viralen Hüllproteins gp120 und monoklonaler Antikörper weniger HIV-1-Subtypen[61]. Somit ist nicht auszuschließen, dass aus dem Einsatz weiterer Peptide und anderer Antikörper bislang unidentifizierte Serotypen resultieren. Es lag nahe, den ursprünglichen Ansatz auf eine wesentlich breitere Basis von Antikörpern und Peptiden zu stellen. Als Antikörperquelle kamen hierbei die polyklonalen Seren HIV-1-positiver Patienten in Betracht; man machte sich dabei das native HIV-spezifische Antikörperreservoir zu Nutze. Seitens der Peptide als Zielmoleküle einer Ermittlung serologischer Reaktivität bot sich ein kombinatorischer Zugang an. Ziel der vorliegenden Arbeit war demnach die Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das Screening humaner HIV-positiver Seren gegen kombinatorisch erzeugte Peptide mit dem Hintergrund, einen minimalen Satz reaktiver Peptide zu identifizieren, die eine serologisch basierte Charakterisierung der Reaktivität verschiedener HIV-1-Subtypen erlaubt. Um Reaktivitätsmuster zwischen Seren verschiedener Subtypen ermitteln und ausschließlich signifikante, hochreaktive Sequenzen finden zu können, sollte dieses Assay zudem die Möglichkeit der mehrfachen Wiederholbarkeit mit derselben Peptidbibliothek bieten. Diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit umgesetzten Ziele lassen sich somit wie folgt zusammenfassen: Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen und eindeutigen massenspektrometrischen Sequenzierung von Peptiden aus kombinatorischen Bibliotheken, Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das iterative Screening HIV-positiver Seren gegen festphasengebundene Peptide, Screening von Serenpools verschiedener genetisch bestimmter Subtypen von HIV-1 gegen eine kombinatorische Peptidbibliothek, die die genetische Variation der V3-Region von gp120 reflektiert, und Multivariate Analyse der gefundenen Peptidsequenzen mit dem Ziel einer serologischen Interpretation derselben. Das Verfahren zur schnellen und im Vergleich zum herkömmlichen Kettenabbauverfahren nach Edman weniger aufwändigen massenspektrometrischen Sequenzierung als reaktiv bestimmter Peptide basiert auf der adaptiven Einführung Kettenabbruch erzeugender Sequenzen während der Synthese der kombinatorischen Peptidbibliothek nach einer modifizierten One Bead One Peptide"-Synthese[118],[119]. Diese Codierung wird sequenztreu durch den Einsatz von Mischungen aus der Fmoc-geschützten Aminosäure, die für diese Sequenzposition vorgesehen ist, und ihres N-terminal permanent blockierten Derivats eingeführt. Das Programm Biblio optimiert das Codierungsmuster hinsichtlich minimaler Einführung von Terminationssequenzen und minimalem Einsatz Kettenabbruch erzeugender Reagenzien, um den Anteil des Hauptpeptids pro Bead nur so gering wie möglich zu vermindern. Eine MALDI-massenspektrometrische Analyse der Peptide eines betreffenden Beads liefert somit neben dem Signal des Hauptpeptids auch die Sequenz des Peptide codierenden Signale. Diese werden von Biblio zur gesuchten Peptidsequenz decodiert. Des weiteren konnte ein immunologisches Testsystem für das iterative Screening festphasengebundener Peptide entwickelt werden. Dieses beruht auf der Detektion der Bindung des Serumantikörpers an das Peptid durch einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem fluoreszenten Farbstoff markiert ist. Eine Bindung ließ sich somit fluoreszenzmikroskopisch nachweisen. Um eine Wiederholbarkeit des Screenings zu gewährleisten, wurde die Peptidbibliothek mittels eines Epoxidharzklebstoffs auf der Probenunterlage fixiert. Eine Entfernung des Immunkomplexes gelingt durch mehrfache Behandlung mit pH 1. Eine 80640 Spezies umfassende Decapeptidbibliothek, die die genetische Variabilität der immunodominanten V3-Schleife der viralen Hüllproteins gp120 von HIV-1 wiedergibt, wurde gegen Serenpools verschiedener HIV-1-Subtypen gemäß diesem Verfahren iterativ gescreent. Insgesamt 36 Peptide konnten aufgrund ihrer intensiven Fluoreszenz als hochreaktiv erkannt werden; sie wurden mit MALDI-Massenspektroskopie und anschließender Decodierung durch Biblio sequenziert. Eine Auswahl von vier der 36 ermittelten Sequenzen erwies sich als ausreichend für eine Differenzierung der zugrunde liegenden HIV-1-Subtypen. Eine anschließende multivariate Analyse der gefundenen Sequenzen in bezug auf ihr Seroreaktivitätsmuster ermöglichte die Bestimmung neuer, konservierter Epitope der Bindung polyklonaler Serenantikörper von HIV-1 und die Identifikation der für diese Bindung kritischen Aminosäurepositionen der betrachteten Decapeptide. Diese Epitope könnten in nachfolgenden Studien auf ihre Bedeutung hinsichtlich ihres Neutralisationspotentials bezüglich primärer HIV-Isolate getestet werden. Das hier entwickelte Verfahren zum iterativen Screening codierter Peptidbibliotheken jedoch ist nicht auf das HIV-System beschränkt, es bietet vielmehr einen universellen Zugang zur reaktivitätsbasierten Evaluation festphasengebundener Substanzbibliotheken, die die volle genetische Variabilität ihrer biologischen Zielregion abbilden. Eine dieser Regionen könnte beispielsweise der Antigenrezeptor von B-Lymphocyten darstellen, der die B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Diese regen die B-Zelle zur Proliferation und deren Nachkommen zur Differenzierung zu antikörpersezernierenden Zellen gegen diese Antigene an. Sie bilden damit ein interessantes Ziel, auf diesem Wege eine effektive Immunantwort hervorzurufen[146],[150].
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Eine verteilte Infrastruktur für typ- und diensterweiterbare orthogonale digitale Bibliotheken
(2002)
Ziel dieser Arbeit war es, eine verteilte Infrastruktur zu entwickeln, die die Realisierung skalierbarer erweiterbarer orthogonaler Digitaler Bibliotheken erlaubt. Dabei sollte die Skalierbarkeit sowohl hinsichtlich der Zahl der unterstützten Anwender als auch hinsichtlich der Zahl der gespeicherten Dokumente gewährleistet sowie die Erweiterbarkeit um neue Typen und um neue Dienste sichergestellt werden. In einem ersten Schritt wurde ein Modell skalierbarer erweiterbarer orthogonaler Digitaler Bibliotheken entworfen, das die für Erweiterbarkeit und Orthogonalität notwendigen Elemente und Mechanismen identifiziert. Anhand dieses Modells erfolgte dann eine Untersuchung existierender Systeme zur Verarbeitung digitaler Dokumente im Hinblick auf ihre Eignung zur Realisierung einer skalierbaren, erweiterbaren, orthogonalen Digitalen Bibliothek. Resultat dieser Untersuchung war, daß in existierenden Systemen zur Verarbeitung digitaler Dokumente Erweiterbarkeit nur auf Kosten der Orthogonalität oder Skalierbarkeit unterstützt wird. Als Grund dafür wurde eine mangelnde Unterstützung der transparenten Erweiterung und Interpretation der Zuordnungsfunktion durch diese Systeme erkannt. Die Ursache dieses Mangels ist die unzureichende Benennung der Elemente der Zuordnungsfunktionen in den existierenden Systemen. Um eine Infrastruktur für Digitale Bibliotheken zu entwickeln, die die genannten Anforderungen erfüllt, wurden drei Maßnahmen getroffen: die Einführung einer systemweit eindeutigen Benennung der Elemente der Zuordnungsfunktion, der Entwurf eines Mechanismus zur transparenten Verteilung der Zuordnungsfunktion in der Digitalen Bibliothek und die Entwicklung eines Mechanismus zur transparenten Bereitstellung von Dokumentmethoden in den, an der Digitalen Bibliothek beteiligten Rechnerknoten. Die eindeutige Benennung wurde durch die Definition orthogonaler Operationen ermöglicht. Die Verteilung der Zuordnungsfunktion in der Digitalen Bibliothek konnte durch die Einführung von Metadokumenten erreicht werden. Das Konzept der Metadokumente basiert auf der Erkenntnis, daß die Komponenten der Digitalen Bibliothek nur die Teile der Zuordnungsfunktion benötigen, die sich auf die Dokumente beziehen, die sie bearbeiten. Diese dokumentspezifischen Teile der Zuordnungsfunktion erhält man durch Partitionieren der Zuordnungsfunktion entlang der Dimension der Dokumente. Die dokumentspezifischen Zuordnungsfunktionen werden dann zusammen mit dem Dokumentinhalt in Form eines Metadokuments zusammengefaßt. Aufgrund des Verzichts auf eine Typabbildung ist in jedem Metadokument die vollständige dokumentspezifische Zuordnungsfunktion gespeichert. Die Verteilung der Zuordnungsfunktion in der Digitalen Bibliothek ist damit allein durch den Transport des Dokumentinhalts in Form der Metadokumente möglich geworden. Die transparente Bereitstellung der Dokumentmethoden konnte durch Verwendung von mobilen Programmen zur Implementierung von Dokumentmethoden erreicht werden. Digitale Bibliotheken lassen sich so durch Erstellung eines entsprechenden Metadokuments durch den Dokumentautor transparent um neue Dokumenttypen erweitern. Es wurde gezeigt, wie auf der Basis dieser Infrastruktur eine Vielzahl verschiedener Dokumenttypen realisiert werden können. Dazu zählen Dokumente, die unterschiedliche Formen der Präsentation realisieren, sowie Dokumente zur verteilten Datenhaltung, zur Aggregation von Dokumenten und zur Realisierung zugriffsgeschützter und vertraulicher Dokumente. Die Erweiterung um neue Dienste wurde durch die Definition mobiler Dokumente ermöglicht, die die Verteilung neuer Dienstfunktionen innerhalb der Digitalen Bibliothek erlauben. Mobile Dokumente können, analog zu nicht mobilen Dokumenten, durch den Autor des Dokuments, in diesem Fall den Gestalter des Dienstes, transparent in die Digitale Bibliothek integriert werden. Zusammen mit der Möglichkeit zur Einführung neuer orthogonaler Operationen läßt sich dadurch das Dienstspektrum der Digitalen Bibliothek dynamisch erweitern. Die Elemente der Infrastruktur wurden unter der Verwendung standardisierter Protokolle und existierender Laufzeitumgebungen für interpretierte Sprachen realisiert. Auf der Basis dieser Realisierung wurden verschiedene Dokumente implementiert, anhand derer die Umsetzbarkeit der entwickelten Konzepte demonstriert werden konnte. Der Einsatz plattformunabhängiger Sprachen zur Implementierung von Dokumentmethoden ermöglicht eine Integration zukünftiger Plattformen in die Infrastruktur, ohne daß dazu eine Änderung der existierenden Dokumente und Methoden notwendig wird. In dieser Arbeit wurde eine Infrastruktur entworfen, auf deren Grundlage sich skalierbare erweiterbare orthogonale Digitale Bibliotheken realisieren lassen. Das resultierende System läßt sich durch die Dokumentautoren und Dienstgestalter transparent um neue Dokumenttypen und Dienste erweitern. Durch die konsequente Vermeidung zentraler Komponenten konnte die Skalierbarkeit des Systems in der Zahl der unterstützten Anwender sowie in der Zahl der verwalteten Dokumente sichergestellt werden. Ausgehend von den in dieser Arbeit entwickelten Konzepten können weitergehende Fragestellungen diskutiert werden. So kann die Möglichkeit zur einer engeren Integration der Präsentation aggregierter multimedialer Dokumente, wie sie z. B. im InformediaProjekt bei der synchronisierten Darstellung geographischer Regionen und darauf bezogener VideoDaten vorgenommen wird (vgl. [13]), untersucht werden. Eine Integration unterschiedlicher Dokumente im Präsentationsraum könnte durch die Definition einer orthogonalen MultimediaPresentOperation geschehen, die die Angabe von Koordinaten im Dokument und Präsentationsraum, wie sie z. B. in HyTime [64] möglich ist, zur Kontrolle der Präsentation erlaubt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Schutz einzelner AusführungsServer gegen böswillige Dokumentmethoden behandelt. Mit der Möglichkeit zur Erstellung mobiler Dokumente verdient der Schutz des ServerVerbundes zur Begrenzung der Ressourcennutzung durch einen Initiator ebenfalls eine eingehendere Betrachtung. Hier könnten Konzepte aus Infrastrukturen für mobile Agenten, z. B. AgentTcl [42], angepaßt werden, z. B. die Kontingentierung der Ressourcennutzung auf den Rechnerknoten innerhalb einer administrativen Domäne und die Verwendung elektronischen Geldes zur Limitierung der Ressourcennutzung durch mobile Dokumente, die sich zwischen mehreren administrativen Domänen bewegen. Zur Effizienzsteigerung könnten Verfahren zur Übersetzung von plattformunabhängigem Zwischencode in nativen Code der Zielmaschine, wie sie beispielsweise in [33] beschrieben sind, eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang sind geeignete Mittel für eine Durchsetzung der Sicherheitsanforderungen auszuwählen und ihr Einfluß auf den zu erwartenden PerformanceGewinn zu untersuchen.
Ziel dieser Arbeit war es, mit der Methode der NMR-Spektroskopie strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Fettsäurebindungsproteinen zu untersuchen. NMR-Spektren von Proteinen mit hohem -Faltblattanteil, wie H-FABP, zeigen häufig eine große Dispersion mit einer typischen Verteilung tief- und hochfeldverschobener Signale. Es wurden 1D/2D 1H-NMR Spektren für den Wildtyp und mehrere Mutanten (F4E, F4S, F4S/W8E, W8E, F16E, F16S, K21I, F64S, L66G und E72S) des humanen H-FABP aufgenommen und so weit wie möglich zugeordnet. Auf diese Weise ließ sich bestimmen, ob die typische -Faßstruktur des Wildtyp bei den Mutanten noch intakt ist. Fast alle Mutanten wiesen eine Signalaufspaltung von 10,2 bis 0,4 ppm wie der Wildtyp auf, nur die W8- Mutanten W8E und F4S/W8E zeigen keine Struktur mehr. H-FABP zeigt in NMR-Spektren sogenannte Spinsystem-Heterogenitäten, die auf mehrere parallel existierende konformationelle Zustände zurückzuführen sind und im NMR- Zeitfenster ( < 200 ms) nicht untereinander austauschen. Diese Spinsystem-Heterogenitäten werden nicht direkt durch Liganden verursacht, da sie auch in delipidierten H-FABP-Spektren vorhanden sind. Noch sind sie abhängig von der Position der in räumlicher Nachbarschaft befindlichen Seitenkette des F57, da sie auch in den Spektren einer F57S-Mutante anwesend sind. Eine Relipidierung der H-FABP Proben mit unterschiedlichen Fettsäuren führte zu einer selektiven Bevorzugung einzelner Spinsysteme. So konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung beim H-FABP nach einem ,,selected-fit" Mechanismus abläuft, bei dem je nach gebundenem Liganden (Palmitin-, Palmitolein-, Stearin- oder Ölsäure) unterschiedliche, schon vorher vorliegende Konformationen des Proteinrückgrates bevorzugt werden. Ein weiterer Teil der hier vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP. Es wurde zur Strukturaufklärung die holo-Form des Proteins verwendetet, die ein Fettsäuregemisch endogener Fettsäuren enthielt. Durch den Einsatz mehrdimensionaler homonuklearer und 15N-editierter NMR-Experimente gelang es, nahezu alle 1H und 15N Resonanzen der Aminosäuren zuzuordnen. Lediglich für K37 konnten in den Spektren keine Signale gefunden werden. Nach einer automatisierten Zuordnung der aus den NOESY-Spektren gewonnenen Abstandsbeschränkungen wurde zur Verfeinerung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP ein strukturgefilterter Iterationsprozeß durchlaufen. Mit 2490 Abstandsrandbedingungen zwischen Protonenpaaren sowie 106 stereospezifischen Zuordnungen wurden Torsionswinkeldynamikrechnungen mit abschließender Energieminimierung durchgeführt. Ein mittlerer globaler RMSD-Wert der Proteinrückgratatome von 0,85 ± 0,12 Å erfüllt die Ansprüche einer hochaufgelösten Struktur. Die Tertiärstruktur entspricht einem -Faß bzw. einer -Muschel. Sie besteht aus zehn antiparallelen -Faltblattsträngen und einer kurzen Helix-Turn-Helix Domäne. Die - Faltblattstränge bilden zwei nahezu orthogonale -Faltblätter von jeweils fünf Strängen. Die Lösungsstruktur ähnelt trotz teilweise niedriger Sequenzhomologie den bereits bekannten Strukturen der FABPs aus unterschiedlichsten Organismen. Eine sehr gute Übereinstimmung wurde im Vergleich mit der Lösungsstruktur des H-FABP beobachtet. Die enge Verwandtschaft beider zur Unterfamilie IV gehörenden Proteine äußert sich durch die hohe Sequenzhomologie (67%), die Ähnlichkeit der Konformation und Bindungsaffinität der Liganden, die helikale Konformation am N-Terminus (V1-F4) und ein vergleichbares Wasserstoffbrückennetzwerk innerhalb der Bindungstasche.
In dieser Arbeit, deren Hauptanliegen die Erstellung eines pflanzensoziologischen Systems war, wurde die Segetalvegetation der Sudanzone Westafrikas durch vegetationskundliche Aufnahmen erfasst. Zu den Aufnahmen wurden Bodenproben entnommen und Befragungen über die Anbaumethoden sowie Nutzung der Segetalarten durchgeführt. Um ein repräsentatives Bild der Segetalvegetation zu erreichen, wurden Regionen in Burkina Faso, Nigeria, Benin, Senegal und Mali zur Analyse ausgewählt, die in der Süd-, Nordsudanzone sowie in angrenzenden Gebieten der Sahelzone lagen. 601 Arten aus 70 Familien wurden identifiziert. Vier Familien, nämlich Poaceae, Leguminosae- Papilionaceae, Cyperaceae und Asteraceae dominieren in der Segetalflora und stellen die Hälfte der Arten, während die übrigen Familien, mit oft nur einem Vertreter, weniger repräsentiert sind. Corchorus tridens, Mitracarpus scaber und Leucas martinicensis, die drei häufigsten Segetalarten in der Sudanzone stammen jedoch nicht aus den vier oben genannten Familien. Die meisten Arten sind Therophyten und haben eine in den Tropen eingeschränkte Verbreitung. Es sind entweder pantropische (42 %), afrikanische Arten (32) oder paläeotropische Arten (20 %). Aus den 1120 Aufnahmen wurden 65 Gesellschaften beschrieben. Ein Vergleich dieser Gesellschaften führte zur Erarbeitung einer synoptischen Tabelle, deren Einheiten zur Herausarbeitung von pflanzensoziologischen Syntaxa dienten. Dabei wurden die bis dato beschriebenen Einheiten der Segetal- sowie Ruderalvegetation in den Tropen zum Vergleich einbezogen. Ein pflanzensoziologisches System der Segetalvegetation in der Sudanzone wurde erstellt. Zwei neue Klassen wurden definiert: die Leucetea martinicensis und die Caperonietea palustris. Die Leucetea martinicensis kommen auf den trockenen Böden vor und enthalten zwei Ordnungen: die Commelinietalia benghalensis auf gedüngten und die Polycarpeaetalia corymbosae auf ungedüngten Feldern. Die Commelinietalia benghalensis bestehen aus zwei Verbänden, dem Celosion trigynae und dem Tridaxion procumbentis. Der erste Verband ist sowohl in der Nord- als in der Südsudanzone anzutreffen, während der zweite nur in der Südsudanzone zu beobachten ist. Die Polycarpeaetalia corymbosae beinhalten drei Verbände: das Brachiarion distichophyllae, das Merremion tridentatae und das Jacquemontion tamnifoliae. Das Brachiarion distichophyllae kommt überall in der Sudanzone vor und bevorzugt die häufigen pisolithenreichen Böden. Das Merremion tridentatae ist auch in der gesamten Sudanzone verbreitet. Es ist überwiegend auf ausgesprochen sandigen Böden zu finden. Das Jacquemontion tamnifoliae hat einen eindeutigen Schwerpunkt in der Sahelzone und den Übergangsgebieten zur Sudanzone. Das ist der Verband, der auf den Hirsefeldern der Dünen in der Sahelzone wächst. Die Caperonietea palustris sind eine edaphisch stark geprägte Klasse. Sie wachsen auf den extrem tonreichen Vertisolen. Da diese eine Seltenheit in der Sudanzone sind, stellen die Caperonietea palustris eine ganz besondere Vegetation in der Sudanzone dar. Darin wurden zwei Assoziationen beschrieben: das Sorghetum arundinaceum und das Hygrophiletum auriculatae. Die Segetalvegetation auf den Reisfeldern in den Senken gehört zur neuen Ordnung Melochietalia corchorifoliae, die den Phragmitetea TÜXEN
Zum Schutz von Umwelt und Bevölkerung vor unerwünschten Nebenwirkungen wird vielfach der Einsatz von Chemikalien auf ein notwendiges Minimum reduziert. Gerade in der Trinkwasseraufbereitung muss deren Wirkung sorgfältig und zuverlässig kontrolliert werden, da es bei einer Unterdosierung leicht zur Kontamination mit Mikroorganismen kommt. Ein Verfahren mag zum Nachweis solcher Mikroorganismen als geeignet erscheinen, wenn es intakte Keime anzeigt. Gerade in vorbehandelten Proben können jedoch nach einer unvollständigen Desinfektion geschädigte Zellen enthalten sein, die sich unter günstigen Bedingungen erholen (Resuscitation), d. h. ihre Vermehrungsfähigkeit wiedererlangen und dadurch Infektionen auslösen können. Also sollten dafür verwendete Medien auch solche Erreger erfassen, da ansonsten falsch negative Ergebnisse die Folge sind. Im mehrstufigen Nachweis von Escherichia coli nach den Deutschen Einheitsverfahren zur Wasser, Abwasser und Schlammuntersuchung (DEV) wird eine Lactose-Pepton-Lösung als Primärkulturmedium beschrieben, die schon für das Membranfilter-Verfahren als nicht optimal eingestuft wurde. Diese Problematik hatte sich in der vorliegenden Arbeit auch für die Flüssig- keitsanreicherung, das zweite Verfahren nach den DEV, gezeigt. Als Ursache für die verminderten Angehraten im DEV-Medium konnte das darin in einer Kon- zentration von 20 µg/l enthaltene Bromkresolpurpur identifiziert werden. Um das Wachstum bestimmter Mikroorganismen anhand ihrer spezifischen Stoffwechselleistungen anzuzeigen, werden geeignete Substrate in Kombination mit entsprechenden pH-Indikatoren verwendet, zu denen auch das Bromkresolpurpur zählt. Für ungeschädigte Keime hatte letzteres im Vergleich mit anderen, Selektionsmitteln enthaltenden Nährmedien besser abgeschnitten und wurde als weniger giftig" bezeichnet. Bei den in dieser Arbeit untersuchten chlorungsvorgeschädigten Zellen bewirkte es eine signifikante Wachstumshemmung. Im Zuge der weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Verminderung der Bromkresolpurpur-Konzentration auf 10 µg/l nur noch bei einem Teil und auf 5 µg/l bei keinem der verwendeten Stämme mehr eine signifikante Veränderung der Angehrate bewirkte. Die Funktion als Farbindikator wurde dadurch nicht beeinträchtigt.
Oft wurden Aeromonas aus Trinkwassersystemen isoliert und ihre Eigenschaften beschrieben. Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit wurden ihre Existenz und ihre Artendiversität in den Biofilmen von Trinkwasserverteilungssystemen in Nordrhein-Westfalen (Deutschland) näher beleuchtet. Hierzu wurden vermehrungsfähige Aeromonas-Arten aus Rohrinkrustationen und Belägen der Rohrinnenoberflächen von Grauguss- und PVC-Trinkwasserrohren isoliert und auf ihre phänotypischen Eigenschaften untersucht. Anhand zahlreicher biochemischer Tests wurden die isolierten Aeromonas-Arten in Unterarten und Biovare unterteilt und mittels Hierarchischer Clusteranalyse weiter klassifiziert. Insgesamt wurden aus fünf der 7 Proben Aeromonas isoliert. Für die Besiedlungsdichte wurden Werte zwischen 24 und 746 KBE/cm2 ermittelt. Eine Abhängigkeit zwischen dem Rohrmaterial (PVC, Grauguss) bzw. dem pH-Wert und der Kolonieanzahl von isolierten Aeromonas konnte nicht festgestellt werden. Während der warmen Jahreszeit wurde in den Belägen eine höhere Koloniezahl von Aeromonas ermittelt. 502 Aeromonas-Kolonien wurden weiter untersucht. Bei 94% der nachgewiesenen Aeromonas-Keime handelte es sich um Aeromonas hydrophila. Außerdem wurden Aeromonas caviae (5%) und Aeromonas sobria (1%) in den Belagssuspensionen identifiziert. Aeromonas caviae nahm in einem System sogar die dominante Rolle ein. Je Probe wurden 120 Aeromonas-Kolonien weiter klassifiziert. Dabei wurden teilweise 35 bzw. 64 Biovare mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften identifiziert. Bei einigen Proben war die Unterteilung von Aeromonas-lsolaten in weitere Biovare kaum ausgeprägt. Die niedrige Besiedlungsrate und die hohe Anzahl von Biovaren schließen eine Massenvermehrung einzelner Aeromonas innerhalb des Biofilms aus. Vielmehr hat Aeromonas hier nur einen Überlebensraum gefunden. Die hohe Anzahl der Biovare ist auf eine zeitlich versetzte Besiedlung von Aeromonas in den Belagsinkrustationen zurückzuführen.
Im Kontext wirtschaftlicher Entwicklungsbemühungen läßt sich mit dem Auftreten von Währungskrisen in den Emerging Markets in den 90er Jahren ein deutlich zu Tage tretender struktureller Wandel erkennen. Kennzeichnend für diese Entwicklung waren zum einen eine zunehmende Vulnerabilität der Volkswirtschaften und zum anderen eine steigende Volatilität internationaler Finanzanlagen. Diesen Phänomenen lagen im wesentlichen zwei Faktoren zu Grunde. Erstens waren die Währungssysteme, die in den 80er Jahren als Mittel der Inflationsbekämpfung und der wirtschaftlichen Stabilisierung etabliert wurden, aufgrund systeminhärenter Probleme und einer fortschreitenden Integration in die internationalen Finanz- und Kapitalmärkte den neuen Herausforderungen nicht mehr gewachsen. Zweitens führte die Öffnung der Kapitalmärkte in Verbindung mit einer weitreichenden Liberalisierung, Deregulierung und Privatisierung zu neuen Formen investiven privaten Kapitals, daß grundlegend anderen Investitionsentscheidungen unterlag als noch die Kapitalzuflüsse der 80er Jahre. Beide Faktoren führten im Verlauf der 90er Jahre zu einer Reihe spekulativer Währungsattacken in den Emerging Markets und einem grundlegenden Wandel in der Währungspolitik dieser Länder. Dieser Prozess ist auch in der heutigen Zeit noch nicht abgeschlossen. Somit können die Krisenszenarien der 90er Jahre auch als logische Konsequenz und Ausdruck einer notwendigen und teilweise überfälligen Reaktion auf strukturelle Veränderungen gewertet werden. In der vorliegenden Arbeit wird dieser Prozeß anhand der Erfahrungen Mexikos und der Pesokrise von 1994, die oftmals als erste Finanzkrise des 21. Jahrhunderts bezeichnet wurde, nachvollzogen und unter Berücksichtigung nachfolgender Krisenszenarien in Asien, Rußland und Brasilien bewertet.
In dieser Arbeit wurden die Periventrikuläre Leukomalazie und die Perinatale Telenzephale Leukoenzephalopathie analysiert. Aus neuropathologischer Sicht sind diese beiden Krankheitsbilder deutlich voneinander abgrenzbar. Die PVL zeigt nekrotische Veränderungen, Axonauftreibungen, Astrogliose, Gitterzellen und ausschließlich eine Begrenzung auf die weiße Marksubstanz. Da die Veränderungen so deutlich und massiv sind, sich gut durch bildgebende Verfahren darstellen und mit klinischer Symptomatik korrelieren lassen, hat die PVL in der Klinik die größere Bedeutung. Dies wird in Zukunft auch so bleiben, und durch die Verbesserung der bildgebenden Verfahren in Kombination mit indirekten diagnostischen Möglichkeiten (EEG, Doppler, Sehtests) wird die Erkennung der PVL eine immer größere Rolle spielen. Die Neuropathologie wird sich wohl in Zukunft mit der terminologischen Unterscheidung zurechtfinden und diese beiden Krankheitsbilder genauer voneinander differenzieren müssen. Da durch die Autopsie das Gehirn viel genauer untersucht werden kann als mit bildgebenden Verfahren, ist eine genauere Differenzierung der einzelnen Fälle möglich. Wie in dieser Arbeit zu sehen, sind die PVL-Fälle nicht so häufig anzutreffen, wie die als PTL bezeichnete Gliose mit hypertrophen Astrozyten, akut geschädigten Gliazellen oder Amphophilen Globuli, oder auch nur mit einer dieser vergleichsweise milden Veränderungen. Wie der Fall John J. NI: 7611 Kapitel 11.10 (PTL) veranschaulicht, können auch bei diesen relativ geringen Hirngewebsveränderungen klinische Auffälligkeiten vorliegen, die nicht durch konventionelle diagnostische Maßnahmen zu erklären und zu erkennen ist. Den in der Literatur erwähnten klinischen Studien gelang es nicht, die klinischen Symptome der PVL 100 %ig mit den morphologischen Veränderungen in Einklang zu bringen. Hierbei werden nur Wahrscheinlichkeiten angegeben (siehe Kapitel 6 Diagnostik und Kapitel 7 Klinik), die den Einzelfall vernachlässigen. Es können also auch mildere pathologische Veränderungen als eine PVL zu einer klinischen Symptomatik führen. Natürlich gilt das auch umgekehrt, denn nicht jede PVL-Läsion muß zur klinischen Auffälligkeit führen. Die Wahrscheinlichkeiten einer gut diagnostizierbaren PVL mit Zysten lassen darauf schließen, daß sich klinische Auffälligkeiten manifestieren. Die Klinik ist also recht uneinheitlich und läßt für den Neuropathologen keine Rückschlüsse auf die zugrundeliegende Erkrankung zu. Wie ja bereits in Kapitel 6.7 Klinische Untersuchung erwähnt, ist die Früherkennung der Symptome von Bedeutung, um rechtzeitig fördernde Maßnahme (Physiotherapie, Mund- Eßtherapie, Sprachtherapie, psychosoziale Betreuung, Funktionstraining und Hilfsmittelversorgung) einzuleiten. Dabei kann die Diagnostik mit den verschiedenen Mitteln die Erklärung der Symptome plausibel machen, aber sie sind nicht immer korrelierbar. Selbstverständlich ist dann die klinische Symptomatik von größerer Bedeutung als die bildgebenden Verfahren. Die PTL, wie sie von Leviton und Gilles (1983) definiert ist, zeigt sich für den Neuropathologen deutlicher als für den Kliniker. Auch wenn die Autoren einen Oberbegriff schaffen wollten, legen sie sich in ihrer eigenen Arbeit von 1983 erneut fest und beschreiben die Veränderungen mit hypertrophen Astrozyten und Amphophilen Globuli als die Perinatale Telenzephale Leukoenzephalopathie (Leviton
Kurz nachdem Jean Paul im Jahr 1796 den letzten Teil des Romanmanuskripts Blumen-, Frucht- und Dornenstücke oder Ehestand, Tod und Hochzeit des Armenadvokaten F. St. Siebenkäs an seinen Verleger abgeschickt hatte, brach er in die damalige Kulturhauptstadt Weimar auf. Dort traf er zum ersten Mal den von ihm mit Distanz bewunderten Goethe. Während dieser Besuch von Goethe selbst unkommentiert blieb, fand eine aus dem gleichen Jahr stammende Äußerung Jean Pauls eine um so größere Resonanz bei dem um sein Image besorgten Dichterfürsten. ...
In der vorliegenden Arbeit wurden die pharmakologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften des Kaliumkanals KCNQ1 und des KCNQ1/MinK (IKs) untersucht. Hierzu wurden die Kanäle in Xenopus-laevis-Oozyten und der KCNQ1/MinK (IKs) in CHO-Zellen exprimiert und in Voltage-Clamp-Experimenten untersucht. Die Blockwirkung des Chromanol-293B-Razemates und die der beiden Enantiomere wurden am KCNQ1- und KCNQ1/MinK-Kanal untersucht. Eine Enantiomerenselektivität der Chromanol 293B-Enantiomere wurde nachgewiesen. Beide Enantiomere wirken abhängig vom Zustand der KCNQ1- und IKs-Kanäle. Das 3S,4R-293B blockierte nur geschlossene Kanäle, während das andere Enantiomer 3R,4S-293B auf geschlossene und auf geöffnete Kanäle wirkte. Als Grundlage dieser Aussagen wurden kinetische Analysen der Kanalkinetiken ohne Blocker und bei partieller Blockade der Kanäle durchgeführt. Die Inhibiton des IKs
Nachdem 1953 von Bates und Griffing [BAT53] der Beitrag der Elektron-Elektron Wechselwirkung neben der Kern-Elektron Wechselwirkung bei der Projektilionisation im Ion-Atom Stoß postuliert und im Rahmen einer 1. Bornschen Näherung beschrieben wurde, gelang in dieser Arbeit zum ersten Mal die ereignisweise Trennung beider Beiträge im Stoß von 3.6 MeV/u C 2 mit Helium durch ein kinematisch vollständiges Experiment, indem die Impulsvektoren des Projektilelektrons ~ p epro , des Targetelektrons ~p etar sowie des ionisierten Targets ~ p R koinzident zum ionisierten Projektil vermessen wurden. Wie sich überraschenderweise herausstellte kann einfach durch Vergleich der Absolutbeträge der Impulsvektoren des Targetelektrons und des Targetkerns für jeden einzelnen Stoß bestimmt werden, ob das Targetelektron "passiv" war und nur das Potenzial des Targetkerns abschirmte ((n-e) Wechselwirkung) oder ob das Targetelektron "aktiv" war und das Projektilelektron in einem Elektron-Elektron Stoß ionisierte ((e-e) Wechselwirkung). Im zweiten Fall bleibt der Targetkern passiv, kompensiert aber ebenfalls ereignisweise das Comptonprofil des ionisierenden Targetelektrons. Der Summenvektor ~q = ~p R ~p etar repräsentiert daher bei der (e-e) Wechselwirkung den korrekten Impuls übertrag des quasifreien Elektron. Die kinematisch vollständige Information über alle beteiligten Stoffteilchen erlaubt es, neben einem detaillierten Einblick in die korrelierte Vier-Teilchendynamik, den gesamten Datensatz nach (n-e) bzw. (e-e) Ereignissen zu sortieren. Die (e-e) Ergebnisse können des weiteren in das Projektilsystem transformiert und dort im Sinne einer Elektronenstoß-Ionisation durch das quasifreie Targetelektron, welches nun Projektil ist, interpretiert werden. Wegen des großen Raumwinkels von Omega = 2pi bis 4 pi für alle Reaktionsfragmente wird im Gegensatz zu klassischen (e,2e) Experimenten weder der Impulsübertrag q noch die Energie Eb des ionisierten Elektrons während der Messung festgehalten. D.h. die Ergebnisse sind im Rahmen der jeweiligen Akzeptanz über alle Impulsüberträge sowie über alle möglichen Energien und Emissionswinkel des ionisierten Elektrons integriert. Prinzipiell können jedoch Impulsübertrag, sowie Elektronenenergie beliebig vorgewählt werden, indem bei der Analyse der Daten entsprechende Fenster gesetzt werden. Die im experimentellen Datensatz enthaltene, vollständige Information erlaubt die Projektion in jeden beliebigen Unterraum. Bei hinreichender Statistik könnten sowohl der dreifach-, als auch jegliche nieder-differentielle Wirkungsquerschnitte aus dem Datensatz extrahiert werden. Aufgrund mangelnder Statistik in dieser ersten Messung stehen jedoch bei zu engen Projektionsfenstern zu wenige Ereignisse zur Verfügung, um signifikante Aussagen treffen zu können. Innerhalb von 12 Stunden effektiver Messzeit konnten 20.000 (e- e) Ereignisse detektiert werden. Realistische Prognosen unterstützen die Annahme, dass während einer weiteren Strahlzeit innerhalb einer Woche 250.000 Ereignisse gemessen werden könnten. Dadurch würde die Einteilung der Daten in kleine Untermengen des Impulsübertrages, vom optischen Limit bis hin zu extrem binären Stößen, bei Elektronenenergien des ionisierten Elektrons von einigen meV an der Kontinuumsschwelle bis hin zu 100 eV Kontinuumsenergie sowohl in koplanarer als auch nicht-koplanarer Geometrie ermöglicht. Ein weitaus asymmetrischeres Stoßsystem ist jedoch für zukünftige Experimente wünschenswert und geplant. Dies bedeutet entweder ein leichteres Target, oder ein schwereres Projektil. Auch angeregte Targetatomen mit Elektronen in hohen (Rydberg-) Zuständen wären denkbar. Die Näherung des Targetelektrons als quasi-freies Elektron wird besser, je kleiner seine Bindungsenergie gegenüber der Bindungsenergie des zu ionisierenden Elektrons ist: Zwar kann das Comptonprofil des quasifreien Elektrons ereignisweise korrigiert werden, es muss aber immer auch ein minimaler Impulsübertrag zur Ionisation des Targets aufgebracht werden. Dieser Unterschied zum (e,2e) mit einem freien Elektron wird jedoch erst vernachlässigbar, wenn die Bindungsenergie des Targetelektrons sehr klein ist gegenüber der des Projektilelektrons, d.h., wenn der Anteil der Targetionisation am Impulsübertrag vernachlässigbar klein ist. (Im hier vorliegenden Fall war das Kohlenstoffelektron jedoch nur ca. doppelt so fest gebunden wie das Heliumelektron.) Weiterhin ist anzunehmen, dass mit kleinerem Z eff des Targets und mit größerem mittleren Radius des Targetelektrons die (n-e) Wechselwirkung an Bedeutung verliert, da die (e-e) Wechselwirkung bei vergleichsweise größeren Stoßparametern stattfindet und der Wirkungsquerschnitt für (n-e) Prozesse mit Z eff skaliert. Diese Überlegungen werden durch Ctmc-Ergebnisse von Olson et al. unterstützt. In Abb. 7.1 werden daher Rechnungen für das Stoßsystem 3.6 MeV/u C 2 auf angeregtes Wasserstoff mit einem Elektron in der n=2 Schale abgebildet. Der Anteil der (n-e) Wechselwirkung ist so klein, dass eine Sortierung der Daten nicht mehr nötig ist: Die Projektilionisation wird nun von der (e-e) Wechselwirkung beherrscht. Im Besonderen sind die im vorangegangenen Kapitel diskutierten Einflüsse der Drei- bzw. Vier-Teilchendynamik offensichtlich bei diesem Stoßsystem gänzlich vernachlässigbar. Die Reduzierung des H-Kerns als "Zuschauer" und somit auch die Reduzierung des Stoßes auf eine (in 1. Ordnung) 2-Teilchen Wechselwirkung zwischen Targetelektron und Projektil scheint nahezu uneingeschränkt gerechtfertigt. In Zukunft werden am Esr der Gsi (weitaus) asymmetrischere Stoßsysteme, wie wasserstoffähnliches Uran auf Helium, zugänglich. Im Esr können derzeit ca. 5 mal 10 hoch 8 Projektile gespeichert, gleichmäßig im Ring verteilt (Gleichstrom-Modus) oder in 1 - 2 "Pakete" von ca. 2 ns Zeitlänge gepackt werden. Die Umlauffrequenz für ein Ionen-Paket oder für ein einzelnes Ion beträgt ca. 2 MHz. Im Gegensatz zu einem Experiment am Strahlrohrende des Unilac passiert ein Projektil, das nicht ionisiert wurde, nach 500ns erneut die Reaktionszone (das Target). Die dadurch erzielte Luminosität erlaubt die Messung von Reaktionen mit vergleichsweise kleinen Wirkungsquerschnitten, welche am Strahlrohrende nicht zugänglich sind. Durch eine elektrische Pulsung des Rückstoßionendetektors in Koinzidenz zur Projektilumladung sowie zum Projektil- und Targetelektron wird man sich in Zukunft von unerwünschten Rückstoßionen aus der reinen Targetionisation befreien können, sodass auch Stoßsysteme, bei denen Targetionisation mehrere Größenordnung wahrscheinlicher ist als die simultane Ionisation von Projektil und Target, zugänglich werden. Die Detektion des hochenergetischen Projektilelektrons wird am Esr jedoch nicht mehr - wie in dieser Arbeit beschrieben - auf dem gleichen Detektor wie das niederenergetische Targetelektron erfolgen können, da diese Geometrie nur eine Akzeptanz für das Projektilelektron bis v p ungefähr gleich 15 a.u. hat und die Impulsauflösung prinzipiell (systematisch) beschränkt ist. In Abhängigkeit vom Stoßsystem kann das Projektilelektron (mit Projektilgeschwindigkeit) am Esr Energien von einigen 100 keV haben. Daher wird in Zukunft die Detektion des Projektilelektrons durch ein 0 0 -Magnetspektrometer in Strahlrichtung hinter dem Reaktions-Mikroskop erfolgen. Da die beiden getrennten Nachweissysteme (Reaktions-Mikroskop, 0 0 -Spektrometer) dann auf die zu detektierende Elektronenenergie optimiert werden können, wird die Impulsauflösung beider Elektronen erheblich verbessert werden. Ein neues Reaktions-Mikroskop, welchen im Rahmen dieser Arbeit geplant und konstruiert wurde, sowie das 0 0 -Magnetspektrometer sind im Aufbau befindlich, und Teile sind bereits im Esr implementiert. Abb. 7.2 zeigt eine technische Zeichnung des Aufbaus. Zu erkennen ist das interne Gasjet-Target des Esr. Der Ionenstrahl durchkreuzt die Kammer von rechts nach links. Das benötigte homogene Magnetfeld zur Führung der Targetelektronen wird durch ein 2m Helmholtz-Spulenpaar realisiert. Die Projektilelektronen, welche in einem kleinen kinematischen Kegel um 0 0 mit Projektilgeschwindigkeit emittiert werden, werden nach dem Durchgang durch das Reaktions-Mikroskop im 0 0 -Spektrometer energie- und winkeldispersiv detektiert. Die Inbetriebnahme erfolgt voraussichtlich in 2002. Bis dahin sind weitere Messungen am Unilac der Gsi für dasselbe Stoßsystem, aber auch mit anderen Projektilen (unterschiedlichen Störungen) geplant. Auch Theoretiker wurden auf die Fragestellungen dieser Arbeit aufmerksam und es sind bereits verschiedene quantenmechanische Rechnungen in Vorbereitung, sodass hoffentlich in naher Zukunft mehrfach-differentielle Wirkungsquerschnitte zur Elektronenstoß-Ionisation von Ionen mit quantenmechanischen Rechnungen höherer Ordnungen quantitativ verglichen werden können.
Das hemmende Umfeld von Ganglienzellen in der Netzhaut des Auges Der Bereich auf der Netzhaut, aus dem Ganglienzellen Lichtsignale erhalten, wird rezeptives Feld genannt. Er umfaßt einen erregenden, zentralen Teil, das rezeptive Feldzentrum, und einen hemmenden, peripheren Teil, das Umfeld. Die antagonistische Organisation (erregendes Zentrum/hemmendes Umfeld) des rezeptiven Feldes verbessert die Signalverarbeitung, indem Kontraste verstärkt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen der Umfeldhemmung an der isolierten, intakten Kaninchennetzhaut zu untersuchen. Das rezeptive Feldzentrum wird durch den erregenden Kontakt zwischen Photorezeptor Þ Bipolarzelle Þ Ganglienzelle erzeugt. Visuelle Stimulation des rezeptiven Feldzentrums erhöht die Entladungsrate (Anzahl der Aktionspotentiale pro Zeiteinheit) der Ganglienzelle. Die Erhöhung der Entladungsrate wird durch die Freisetzung des erregenden Transmitters Glutamat aus präsynaptischen Bipolarzellen bewirkt. Eine Belichtung des Umfeldes hat den entgegengesetzten Effekt: die Entladungsrate der Ganglienzelle wird verringert. Die Umfeldantwort der Ganglienzelle wird durch die laterale Hemmung in der OPL (äußere Synpsenschicht) und der IPL (innere Synapsenschicht) erzeugt. In der OPL wird die Signalübertragung von GABAergen Horizontalzellen moduliert, indem sie Photorezeptoren und/oder Bipolarzellen hemmen. In der IPL modulieren Amakrinzellen, die entweder GABAerg oder glyzinerg sein können, die Signalübertragung, indem sie Bipolarzellen und/oder Ganglienzellen hemmen. Die Entladungsrate von retinalen Ganglienzellen wird bei Belichtung des Umfeldes somit auf zwei Arten verringert: entweder werden präsynaptische Zellen (Photorezeptoren, Bipolarzellen) gehemmt oder die Ganglienzelle wird direkt durch Amakrinzellen gehemmt. Im ersten Fall schütten Bipolarzellen weniger Glutamat aus (indirekte laterale Hemmung), im zweiten Fall wird durch hemmende Neurotransmitter (GABA oder Glyzin) ein Einstrom von Chloridionen in die Dendriten der Ganglienzellen hervorgerufen (direkte laterale Hemmung). Es ist bisher noch unklar, zu welchem Anteil direkte und indirekte laterale Hemmung an der Umfeldantwort beteiligt sind. Weiterhin ist nicht bekannt, welche Neurotransmitterrezeptoren bei der Erzeugung des hemmenden Umfeldes eine Rolle spielen. Um dies zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit lichtinduzierte, synaptische Ströme von retinalen Ganglienzellen an der isolierten, intakten Kaninchenetzhaut gemessen. Dabei wurde die Netzhaut von vorher eingeschläferten Kaninchen freipräpariert und anschließend in einer mit Sauerstoff angereicherten Extrazellulärlösung aufbewahrt. An diesem isolierten, intakten NetzhautPräparat (in vitro Retina) konnten bis zu acht Stunden Lichtantworten gemessen werden. Die lichtinduzierten Ströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der PatchClampTechnik in der Spannungsklemme gemessen. Die Meßkammer mit der flach ausgebreiteten Netzhaut befand sich auf einem Mikroskoptisch. Das Mikroskop war mit einer InfrarotDifferentialinterferenzOptik (NomarskiOptik) ausgestattet und die Mikroelektroden konnten unter Sichtkontrolle mit Hilfe eines Mikromanipulators an die Zellkörper herangefahren werden. Kreisförmige und ringförmige Lichtmuster mit verschiedenen Durchmessern, wurden auf einem Computerbildschirm erzeugt und durch den Mikrsokopkondenser auf den Boden der Meßkammer projiziert. Erregende Ströme retinaler Ganglienzellen konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für Chloridionen eingestellt wurde. Die erregenden Ströme wurden durch Belichtung des Umfeldes stark verringert. Dies wird durch die verminderte Freisetzung von Glutamat durch Bipolarzellen verursacht und ist ein Hinweise auf eine indirekte, laterale Hemmung der Ganglienzelle. Durch die Zugabe des GABARezeptorblockers Picrotoxinin in die Nährlösung (Badapplikation) konnte die Umfeldhemmung der meisten Ganglienzellen nahezu vollständig aufgehoben werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß präsynaptische GABA A und GABA C Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Umfeldhemmung spielen. Direkte hemmende Chloridionenströme konnten isoliert werden, indem das Membranpotential der Zelle auf das Umkehrpotential für erregende Ströme eingestellt wurde. Durch Beleuchtung des Umfeldes wurden Chloridionenströme in Ganglienzellen ausgelöst. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte, laterale Hemmung der Ganglienzelle durch Amakrinzellen, die zusätzlich zur indirekten Hemmung erfolgt. Bei Anwendung der Stromklemme der PatchClampTechnik konnte nachgewiesen werden, daß Chloridionenströme die Entladungsrate der Zelle beeinflussen. Durch die Badapplikation von Picrotoxinin und durch die Überströmung mit dem GABA A Rezeptorhemmer Bicucullin wurden die Chloridionenströme deutlich verringert. Durch den Glyzinrezeptorblocker Strychnin konnten die hemmenden Ströme nur bei wenigen Zellen verringert werden. Dies ist ein Hinweis auf eine direkte Hemmung der Ganglienzelle über GABA A Rezeptoren. In den meisten Ganglienzellen konnten direkte und indirekte Hemmung durch die Badapplikation von Tetrodotoxin verringert werden. Tetrodotoxin hemmt das Entstehen von Aktionspotentialen und das Ergebnis zeigt, daß 'widefield Amakrinzellen, die über Aktionspotentiale kommunizieren zur Umfeldhemmung beitragen. Bisherige Modelle gingen davon aus, daß Interaktionen zwischen Horizontalzellen, Photorezeptoren und Bipolarzellen in der OPL die Hauptursache für die Umfeldhemmung sind. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, daß Interaktionen zwischen Amakrinzellen, Bipolarzellen und Ganglienzellen wesentlich zur Umfeldhemmung beitragen. In der Netzhaut gibt es zwischen 12 und 15 Ganglienzelltypen, die auf unterschiedliche Mustermerkmale wie z. B. Farbe, Kontrast oder Bewegung reagieren. Alle bisher untersuchten Ganglienzelltypen verringern bei einer Reizung des Umfeldes ihre Entladungsrate. Ist bei allen Ganglienzelltypen der Beitrag von Horizontal und Amakrinzellen zur Umfeldhemmung sowie der Anteil von direkter und indirekter lateralen Hemmung gleich? Oder gibt es für jeden Ganglienzelltyp aufgrund seiner physiologischen und morphologischen Ausprägung verschiedene Mechanismen der lateralen Hemmung? Diese Fragen könnten durch die Entwicklung von Pharmaka, welche selektiv Horizontalzellen bzw. Amakrinzellen hemmen, untersucht werden. Die Anwendung dieser Substanzen könnte den Beitrag dieser Zellen zur Umfeldhemmung eines bestimmten Ganglienzelltyps nachweisen. Gleichzeitig könnte die indirekte Hemmung von retinalen Ganglienzellen durch intrazelluläre Applikation von Chloridionenkanalblockern viel genauer als bisher gemessen werden, da auf diese Weise erregende synaptische Ströme besser isoliert werden können. Durch die Kombination dieser beiden Methoden könnte für jeden Ganglienzelltyp der Netzhaut die zellulären und synaptischen Mechanismen der Umfeldhemmung detailliert beschrieben werden.
Der Einfluss von turbulenten Strömungen auf die Photodissoziation von CO in interstellaren Wolken
(2001)
Seit 1988 ist bekannt, dass die Photodissoziation von COMolekülen durch Linienabsorption von UVPhotonen stattfindet. Wie jede Linienabsorption ist damit auch die Photodissoziation von CO abhängig von Geschwindigkeitsfeldern innerhalb des absorbierenden Mediums. DopplerVerschiebung kann die Absorption in einen Frequenzbereich verschieben, in dem sich die lokale Intensität von der Intensität in der Linienmitte wesentlich unterscheidet. Jede Untersuchung, die sich mit der Bildung und Vernichtung von COMolekülen am Rand interstellarer Wolken beschäftigt, muss diese turbulenten Geschwindigkeitsfelder berücksichtigen. Da die Existenz von turbulenten Strömungen in interstellaren Molekülwolken unbestritten ist, wird in Untersuchungen üblicherweise der Dopplerparameter der Gaußschen Profilfunktion um eine Turbulenzgeschwindigkeit erweitert. Diese mikroturbulente Näherung ist die simpelste Möglichkeit zur Berücksichtigung von Turbulenz. In vorangegangenen Arbeiten (Albrecht, M.A., Kegel, W.H. (1987)), (Kegel, W.H., Piehler, G., Albrecht, M.A. (1993)), (Piehler, G., Kegel, W.H. (1995)) ist gezeigt worden, dass die Berücksichtigung eines turbulenten Geschwindigkeitsfeldes mit endlicher Korrelationslänge (Mesoturbulenz) jedoch wesentlich dazu beitragen kann, realistischere Linienprofile zu erhalten. Während in den letzten Jahren einiger Aufwand betrieben wurde, die Berechnung der chemischen und thermischen Struktur einer Molekülwolke zu verfeinern, ist der Modellierung des zugrundegelegten Strahlungstransports weniger Aufmerksamkeit gewidmet worden. Die Ergebnisse unserer Rechnungen zeigen, dass die Berück sichtigung eines mesoturbulenten Strahlungstransports den Verlauf der COHäufigkeit entlang des Sehstrahls wesentlich beeinflussen kann. Zusammengefasst haben wir folgende Ergebnisse erhalten: - Rechnungen mit einem EinzellinienModell zeigen den großen Einfluss von Korrelationslänge und Turbulenzgeschwindigkeit auf den Verlauf der Photodissoziationsrate und damit auch auf die resultierende COHäufigkeit. - Bei Mesoturbulenz werden die absorptionsrelevanten Linien schneller optisch dick als bei reiner Mikroturbulenz. Dadurch kann sich eine stabile Zone großer CODichte in Tiefen bilden, von denen bisher angenommen wurde, sie würden eine zu große UVIntensität aufweisen. - Rechnungen, die das volle UVSpektrum berücksichtigen, zeigen eine geringere Sensitivität der COHäufigkeit gegenüber Variationen der Turbulenzparameter als solche mit nur einer Linie. Trotzdem haben Korrelationslänge und Turbulenzgeschwindigkeit starken Einfluss auf die Tiefe, ab der eine stabile COHäufigkeit erreicht wird. - Im Vergleich zu Rechnungen mit einer parametrisierten Photodissoziationswahrscheinlichkeit fällt im mesoturbulenten Fall z CO wesentlich schneller ab. Das bedeutet, dass in größeren Tiefen der Wolke die Werte für z CO um einige Größenordnungen voneinander abweichen können. Für Größe und Isotopenverhältnis des Wolkenmodells kann das zu einer signifikanten Überschätzung der wahren Werte führen. - Das zugrundegelegte Modell der chemischen Reaktionen weist eine hohe Stabilität gegenüber Veränderungen der Turbulenzparameter auf. Auch wenn die COHäufigkeit davon relativ stark betroffen ist, wirken sich diese Veränderungen nur sehr langsam auf die chemische Gesamtstruktur der Wolke aus. - Die Anwendung unserer Ergebnisse auf Beobachtungen von NGC 2024 zeigen, dass sich die Werte, die man für Dichte und Größe der Region aus den Modellen ermittelt, stark von dem zugrundegelegten Strahlungstransportmodell abhängen. Folgerungen, die aufgrund einer zu einfachen Modellierung gemacht werden, sind somit mit einiger Vorsicht zu betrachten. Es zeigt sich, dass der numerische Aufwand, stochastische Strahlungstransportmodelle zu rechnen, durchaus gerechtfertigt ist. Möchte man die Bildung von CO Molekülen am Rand einer interstellaren Molekülwolke genauer verstehen, muss eine endliche Korrelationslänge berücksichtigt werden. Es macht wenig Sinn, immer detailliertere chemische Modelle zu entwickeln und die wichtigen Effekte mesoturbulenten Strahlungstransports zu vernachlässigen.
In dieser Arbeit werden Darstellungen der Artinschen Zopfgruppen als Gruppen von Automorphismen der Homologie iterativ konstruierter äquivarianter Kettenkomplexe betrachtet. Es werden azyklische Komplexe freier Moduln bzw. freie Auflösungen der ganzen Zahlen für nichtpermutierte Artinsche Zopfgruppen konstruiert, die als iterierte semidirekte Produkte freier Gruppen darstellbar sind. Als Tensorprodukte der freien Auflösungen mit Moduln zu den fraglichen iterierten semidirekten Produkten freier Gruppen erhält man äquivariante Komplexe, deren von Eigenschaften der Koeffizientenmoduln abhängige Homologiegruppen bestimmt werden. Diese Homologiegruppen erlauben Automorphismendarstellungen der (permutierten) Artinschen Zopfgruppe, die gewissermaßen die Artinschen Darstellungen als Automorphismengruppen freier Gruppen iterieren und linearisieren. Insbesondere werden Darstellungen gewonnen, die die bekannten Burau- und Gassner-Darstellungen der Zopfgruppen verallgemeinern und die als Monodromiegruppen verallgemeinerter hypergeometrischer Integrale interpretiert werden können.
In den vergangenen Jahren wurden in der AntisenseTechnologie grundlegende Hürden genommen, die eine Arzneimittelentwicklung auf Nukleinsäurebasis ermöglichen. Hierzu zählt vor allem die Gewährleistung einer ausreichenden metabolischen Stabilität und die Synthese im technischen Maßstab. In zahlreichen klinischen Studien wurde der Wirksamkeitsnachweis am Menschen erbracht. Als sequenzspezifische Therapeutika zeichnen sich Antisense Oligonukleotide im Vergleich zu vielen anderen Wirkstoffen dadurch aus, daß sie spezifisch mit einer RNAZielsequenz hybridisieren, ohne dabei wichtige zelluläre Funktionen zu beeinträchtigen. Neben krankheitsauslösenden Genen können Antisense Oligonukleotide auch virale Gene blockieren und nach Aktivierung der Ribonuklease H hydrolysieren. Das erste Präparat auf Oligonukleotidbasis wurde 1998 zugelassen und hemmt erfolgreich die Vermehrung des Cytomegalievirus. Hepatitis C ist eine Virusinfektion, die momentan nur unzureichend therapiert werden kann. Seit Mitte der neunziger Jahre wird nach geeigneten Antisense Oligonukleotiden und Ribozymen gesucht, um die Heilungschancen bei einer chronischen HCVInfektion zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch experimentelles Screening eine potente Zielsequenz (tS13) im Bereich der internen ribosomalen Angriffsstelle (IRES) und des Startcodons für die Proteinbiosynthese des HCV gefunden (Nukleotide 326342 des HCV Genoms). Hierzu wurde die Sequenz eines bereits bekannten 23mer Antisense Oligonukleotids durch systematisches Verkürzen auf 17 Nukleotide reduziert, ohne in vitro an Inhibitionspotential einzubüßen. Erst weitere Verkürzungen führten zu einer deutlichen Abnahme der Antisense Wirkung. Eine Schwierigkeit bei der therapeutischen Anwendung von polyanionischen Antisense Oligonukleotiden ist deren begrenzte zelluläre Aufnahme. Wie in Kapitel 3 dargelegt, wurden bislang zahlreiche Methoden zur Verbesserung der Membrangängigkeit dieser Wirkstoffklasse entwickelt. Zur Evaluierung eines leberselektiven Transports (engl.: drug targeting) und zur Steigerung der hepatozellulären Aufnahme (engl.: cell uptake) wurde das antiviral wirkende 17mer Antisense Oligonukleotid tS13 mit Biomolekülen wie den Gallensäuren, die im enterohepatischen Kreislauf das Zielorgan Leber passieren, kovalent verknüpft. Die Kupplung erfolgte dabei über die für die zelluläre Aufnahme nicht essentielle 3aHydroxylgruppe der Cholsäure und Taurocholsäure. Die Gallensäuren wurden entsprechend geschützt, in die Phosphoramidite 22a/b und 27a/b überführt und im letzten Kupplungsschritt der Festphasensynthese an das 5
Hitzestress führt bei allen bisher untersuchten Organismen zu einer transienten Umprogrammierung des Transkriptions- und Translations-apparats. Bei diesem auch als Hitzestressantwort bezeichneten Prozess wird vorrangig eine neue Klasse von Proteinen exprimiert, die als Hitzestressproteine (Hsp) bezeichnet werden. Eine Schlüsselrolle in der Signaltransduktionskette der Hitzestressantwort spielen Hitzestresstrans-kriptionsfaktoren (Hsf). Hsf sind hochkonservierte, modular aufgebaute Proteine mit einer N-terminalen DNA-Bindungsdomäne (DBD), einer zentralen Oligomerisierungsdomäne (HR-A/B Region) und einer C-terminalen Aktivatordomäne (AD). Über ihre DBD sind oligomerisierte Hsf in der Lage an hochkonservierte Motive, sogenannte Hitzestresselemente (HSE), in der Promotorregion von Hsp zu binden und deren Transkription zu initiieren. In hitzegestressten Zellen von Lycopersicon peruvianum (Perutomate) können neben den konstitutiv exprimierten Hitzestresstranskriptionsfaktoren A1 und A3 die beiden stressinduzierten Vertreter HsfA2 und B1 nachgewiesen werden. In präinduzierten Zellen befindet sich HsfA2 trotz einer funktionellen Kernimportsequenz (NLS) überwiegend im Zytoplasma. Dieses Verhalten von HsfA2 wurde bisher durch eine konformationsbedingte Maskierung der NLS erklärt. Der Kotransport von HsfA2 in den Zellkern erfolgt in diesem Modell durch eine heterologe Interaktion mit HsfA1. Mit dem Ziel, die für den Transport und die Interaktion mit HsfA1 verantwortlichen Strukturelemente von HsfA2 näher zu untersuchen, wurden verschiedene Tomaten-Hsf sowohl in Tabakprotoplasten, als auch in CHO-K1 Zellen heterolog exprimiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich HsfA2 auch ohne die Interaktion mit HsfA1 im Zellkern anreicherte, wenn der Kernexportrezeptor Crm-1 mit dem Antibiotikum Leptomycin B (LMB) inhibiert wurde. HsfA2 wird demnach permanent zwischen Kern und Zytoplasma hin- und hertransportiert, wobei der Kernexportprozess dominiert. Die für den Export verantwortliche, leucinreiche Kernexportsequenz (NES) konnte am äussersten C-Terminus von HsfA2 identifiziert werden. HsfA2-Mutanten, bei denen dieser Sequenzabschnitt deletiert bzw. die Leucine durch Alanine substituiert wurden, waren überwiegend im Zellkern lokalisiert. Die Fusion der NES von HsfA2 an den ausschliesslich im Zellkern lokalisierten HsfB1 führte zum Export des Fusionsproteins ins Zytoplasma, was durch die Zugabe von LMB wieder umgekehrt wurde. Ferner konnte gezeigt werden, dass für die Interaktion mit HsfA1 und den Kotransport in den Zellkern die HR-A/B Region essentiell ist. Mit Hilfe eines Luciferasereporterassays konnte der Zusammenhang zwischen der Lokalisation von HsfA2 und dessen Transaktivierungspotential in CHO-K1 Zellen demonstriert werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die im Zellkern lokalisierte NES-Mutante eine ca. 20-fach höhere Aktivität im Vergleich zum zytoplasmatisch lokalisierten Wildtyp hatte. Ebenso führte die LMB-bedingte Anreicherung von HsfA2 im Zellkern bereits nach 6 h zu einer messbaren Steigerung der Aktivität. Eine synergistische Aktivitätszunahme konnte, wie auch schon in Tabakprotoplasten beobachtet, bei gleichzeitiger Expression mit HsfA1 gemessen werden. In Hitzestressversuchen (41 °C) konnte gezeigt werden, dass HsfA2 in CHO-K1 Zellen selbst unter dem Einfluss von LMB nicht mehr in den Zellkern importiert wurde. Bei Zellen, die sich unter LMB-Einfluss bei 37°C von dem Hitzestress erholten, kam es jedoch bereits nach 15 min zu einer sichtbaren Translokation von HsfA2 in den Zellkern. Dieses Verhalten lässt Rückschlüsse auf eine mögliche, konformationsbedingte Maskierung der NLS unter Hitzestress zu. Insbesondere da die HsfA2-Mutante, bei der die HR-A/B-Region fehlte, sich auch unter Hitzestress im Zellkern anreicherte. Neben der löslichen Form im Zytoplasma kommt HsfA2 in Tomatenzellen unter Hitzestress auch in einer unlöslichen, strukturgebundenen Form vor. Diese als Hitzestressgranula (HSG) bezeichneten Komplexe bestehen überwiegend aus niedermolekularen (lmw)-Hsp. Es konnte gezeigt werden, dass die Koexpression von lmw-Hsp und HsfA2 unabhängig vom Expressionssystem zur Bildung zytoplasmatischer Aggregate führte, in denen beide Proteine nachweisbar waren. Hierbei konnte sowohl eine klassen- als auch eine artspezifische Interaktion von HsfA2 mit Klasse II lmw-Hsp aus Tomate beobachtet werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die HR-A/B Region für die Interaktion von HsA2 mit lmw-Hsp essentiell ist.
1. Die Arbeit soll den Beitrag von Ionenleitfähigkeiten an der Funktionsweise der Vogelhaarzelle weiter aufklären. 2. Dazu werden zwei Ionenkanalmodulatoren sowohl in die Scala media, wie auch in Scala tympani appliziert. Amilorid ist ein Blocker v.a. von Natriumabhängigen Ionleitfähigkeiten; Diazoxid ist ein Öffner ATPabhängiger Kaliumleitfähigkeiten. 3. Amilorid hat bei Applikation in die Scala media keinen Effekt auf das endocochleäre Potential. Diazoxid senkt das endocochleäre Potential nach Applikation in die Scala media signifikant um 2,42mV ± 2,31. Da Diazoxid auf die Aktivität auditorischer Neurone keinerlei Einfluß hat, muß davon ausgegangen werden, daß Diazoxid das EP durch Beeinflussung anderer Ionkanäle unabhängig von der Haarzelle absenkt. Mögliche Kandidaten sind Ionkanäle im Bereich des Tegmentum vasculosum, das für die Generation des EP mit verantwortlich ist. 4. Eine endolymphatische AmiloridApplikation erhöht frequenzabhängig und dosisabhängig die CAPSchwelle, wobei die Schwellenanhebung mit Anstieg der Frequenz steigt (gemessener Bereich 1252000Hz). Bis zu einer Frequenz von 400Hz hat Amilorid kaum einen Effekt auf das CAP, oberhalb 400Hz steigt die Schwelle mit einem Gradienten von 11 dB/Okt an. 5. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf das CAP. 6. Die endolymphatische Applikation von Amilorid erniedrigt die akustisch evozierte Entladungsrate und erhöht die spontane Entladungsrate afferenter Neurone aus dem Ganglion cochleare. Diese Veränderungen sind abhängig von der charakteristischen Frequenz und der applizierten Menge, wobei der Frequenzbereich der charakteristischen Frequenz der nicht reagierenden Einzelfaserableitungen. zwischen 126632 Hz lag, der der reagierenden zwischen 704 und 1200 Hz. 7. Bei den afferenten Neuronen, bei der die akustisch evozierte Aktivität nach endolymphatischer Applikation von Amilorid ansteigt, kommt es auch zu einer Veränderung der von der evozierten Aktivität abhängigen Parameter Q10dB, Tief und Hochfrequenzflanke und charakteristischer Frequenz. Die endolymphatische AmiloridKonzentration bei diesen Einzelfaserableitungen lag zwischen 91µM und 269 µM. 8. Die charakteristische Frequenz wird durch Amilorid erniedrigt, allerdings kommt dies durch eine stärkere Abnahme der evozierten Rate oberhalb der charakteristischen Frequenz zustande. 9. Die Gruppeneinteilung ist bis auf ein Neuron bei Veränderungen spontaner und akustisch evozierter Entladungsrate gleich. Bei einem kam es zu einem Anstieg der spontanen Entladungsrate, aber nicht zu einer Abnahme der akustisch evozierten Entladungsrate. Dies legt nahe, daß 1. die Veränderungen auf Beeinflussung unterschiedlicher Ionleitfähigkeiten beruht , und 2. die Ionleitfähigkeit, welche für die Veränderung der spontanen Entladungsrate verantwortlich ist, etwas sensibler für Amilorid ist, als jene, welche für die Veränderung der evozierten Entladungsrate verantwortlich ist. 10. Der Anstieg der evozierten Rate steht in guten Einklang mit den Ergebnissen von Jørgensen und Ohmori (1988), die zeigen konnten, daß Amilorid den mechanoelektrischen Transduktionskanal von Vogelhaarzellen mit einem IC 50 von 50µM blockiert. Der Anstieg der spontanen Entladungsrate kann mit einem Block des Transduktionskanals nicht erklärt werden. Es muß also noch eine andere Leitfähigkeit in dem Innenohr der Taube durch Amilorid blockiert werden. 11. Zusammen mit den Ergebnissen anderer Studien legen die Ergebnisse nahe, daß es sich hierbei um eine Ionleitfähigkeit im Bereich der apikalen Membran handeln muß. Mögliche Kandidaten wären Ca 2 Kanäle, welche an Ca 2 abhängigen Prozessen zur Regulierung der Ciliensteifigkeit bzw. Cilienmotilität beteiligt sind. 12. Diazoxid hat bei Applikation in die Scala media keinen Einfluß auf die Aktivität auditorischer Neurone. 13. Bei Applikation in die Scala tympani hat weder Amilorid noch Diazoxid Einfluß auf das CAP.
28 Kinder mit Pierre-Robin-Sequenz, die erstmals im Humangenetischen Institut der Universitätsklink in Frankfurt am Main im Alter von drei Monaten bis acht Jahre untersucht wurden, wurden im Alter von acht bis 16 Jahren nachuntersucht. Die Kinder wurden unterteilt in eine Gruppe mit isolierter und eine Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Sie wurden hinsichtlich ihrer physischen, psychomotorischen, audiologischen und sprachlichen Entwicklung untersucht. Die Gruppen unterschieden sich bezüglich des körperlichen Wachstums, der Häufigkeit von mentaler und sprachlicher Retardierung. Die Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz waren durchschnittlich kleiner und leichter bei Geburt und im Verlauf. 19 % der Kinder mit syndromatischer Form waren kleinwüchsig. Eine mentale Retardierung fand sich nur in der Gruppe mit syndromatischer PierreRobinSequenz, in der 31 % betroffen waren. 8,3 % der Kinder mit isolierter Pierre-Robin-Sequenz waren in ihrer sprachlichen Entwicklung retardiert, während dies bei 38 % der Kinder mit syndromatischer Form der Fall war. Schwere Artikulationsstörungen, die zu einer sehr undeutlichen Aussprache führten, fanden sich bei 17 % der Kinder mit isolierter und bei 29 % der Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz. Zwei Kinder mit syndromatischer PierreRobinSequenz hatten überhaupt keine Expressivsprache entwickelt. Es konnte ein Zusammenhang dieser Unterschiede in der Entwicklung mit der Schwere der respiratorischen und ernährungsbezogenen Probleme in den ersten beiden Lebensjahren gesehen werden. Respiratorische Probleme traten etwas häufiger in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-Robin-Sequenz auf. Gemessen an der Häufigkeit und Dauer der Nahrungssondierung waren die Ernährungsprobleme ebenfalls deutlich ausgeprägter in der Gruppe mit syndromatischer Pierre-RobinSequenz. Eine Schallleitungsschwerhörigkeit fand sich insgesamt bei 39 % der 28 Probanden ohne wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Eine Schallempfindungsschwerhörigkeit trat nur in der Gruppe der Patienten mit syndromatischer PierreRobinSequenz auf. Diese Ergebnisse waren vereinbar mit den Resultaten früherer Untersuchungen, die darauf hin deuteten, dass Kinder mit isolierter PierreRobinSequenz bei optimaler Therapie im Neugeborenen und Säuglingsalter eine gute Prognose bezüglich ihrer physischen und mentalen Entwicklung haben, während bei Vorliegen eines übergeordneten Syndroms häufiger mit Wachstumsdefiziten und mentaler Retardierung zu rechnen ist. Bezüglich der genetischen Beratung läßt sich feststellen, dass das Wiederholungsrisiko bei isolierter Pierre-Robin-Sequenz klein ist.
Wir haben Interaktion in der Kommunikationskomplexität untersucht und dabei die drei Modi probabilistische, (beschränkt) nichtdeterministische und quantenmechanische Kommunikation betrachtet. Bei allen drei Modi haben wir herausgefunden, dass Interaktion für Effzienz oft unerlässlich ist, im nichtdeterministischen Fall gibt es eine Abhängigkeit zwischen dem Einfluss der Interaktion und der erlaubten Anzahl der nichtdeterministischen Ratebits. Abgesehen von dem erreichten besseren Verständnis des Kommunikationsmodells haben wir verschiedene Anwendungen auf andere Berechnungsmodelle beschrieben, bei denen untere Schranken der Kommunikation zu unteren Schranken für andere Ressourcen in diesen Modellen geführt haben. Ein Beispiel eines kommunikations- und interaktionsbeschränkten Modells sind endliche Automaten, welche wir in allen drei Modi untersucht haben. Ein weiteres Beispiel sind Formeln, für die wir eine Verbindung zwischen Einweg Kommunikation und Formellänge herstellen konnten. Diese Verbindung führte zu unteren Schranken für probabilistische, nichtdeterministische und Quanten Formeln. Dabei sind die unteren Schranken für Quanten Formeln und probabilistische Formeln im wesentlichen gleich. Für monotone Schaltkreise haben wir gezeigt, wie nichtdeterministisches Raten die Tiefe drastisch reduzieren kann, und wie eine geringfügige Einschränkung der nichtdeterministischen Ratebits zu einer Tiefenhierarchie führt. Insgesamt lässt sich feststellen, dass die Schwäche interaktionsbeschränkter Kommunikation mathematisch nachvollziehbar ist. Außerdem scheint ein solches Verhalten in der Welt einfacher Berechnungsmodelle häufig aufzutreten. Oder anders gesagt, viele Berechnungsmodelle sind deshalb einfacher zu verstehen, weil sie durch interaktionsbeschränkte Kommunikation analysierbar sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
Der Cytochrom b6f Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I und nimmt damit eine zentrale Rolle in der Photosynthese ein. Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Protokoll für die Präparation des Cytochrom b6f Komplexes aus Spinat ermöglichte eine reproduzierbare Reinigung von hochaktivem Enzym. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den publizierten Daten für den Komplex überein. SDS-PAGE zeigte alle vier großen Untereinheiten sowie eine Bande der kleinen 4 kDa Untereinheiten. Die Präparation ist mit 450 ± 60 Elektronen pro Sekunde 10 - 15 mal aktiver als in bisherigen Veröffentlichungen für Präparationen aus Pflanzenblättern beschrieben und fast doppelt so aktiv wie die besten Präparationen aus Chlamydomonas reinhardtii. Die Zuverlässigkeit des Aktivitätstests konnte durch den Wechsel des Lösungsmittels für den Elektronendonor von Ethanol zu Dimethylsulfoxid erheblich verbessert werden. Die hohe Effizienz der Proteinreinigung und die hohe Aktivität des Komplexes stellen ideale Voraussetzungen für biophysikalische und strukturelle Studien dar. Versuche zur zweidimensionalen Kristallisation des Cytochrom b6f Komplexes erbrachten Kristalle mit verschiedenen Morphologien, die unterschiedlich gut geordnet waren. Eine Projektionsdichtekarte bis zu einer Auflösung von 20 Å von mehrschichtigen Kristallen zeigte strukturelle Übereinstimmungen, aber auch Unterschiede zu dem verwandten Komplex aus der einzelligen Alge C.reinhardtii. H -ATPase Plasmamembran H -ATPasen wandeln chemische Energie (in Form von ATP) in einen elektrochemischen Gradienten um, der als Energielieferant von sekundären Transportproteinen dient. Es ist gelungen, zweidimensionale Kristalle der heterolog exprimierten und mit einem His-tag ausgestatteten Plasmamembran H -ATPase AHA2 aus Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zwei verschiedene Methoden wurden dabei angewandt. Zum einen wurde das Protein wurde in Proteoliposomen rekonstituiert, und die so gewonnenen Vesikelkristalle resultierten in einer Projektionsdichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å. In einer zweiten Methode wurde eine Technik, basierend auf dem Einsatz neu entwickelter, partiell fluorierter und funktionalisierter Lipide, angewandt. Einzelschichten dieser fluorierten Lipide auf der Oberfläche eines Tropfens erwiesen sich auch in Anwesenheit von Detergenz als stabil. Die funktionalisierte Ni2 -NTA-Kopfgruppe der fluorierten Lipide ermöglichte eine Bindung des Proteins über den His-tag. Nach Detergenzentzug bildeten sich in einer Lipiddoppelmembran eingebettete 2D-Kristalle mit einem Durchmesser von bis zu 10 (m, die für die Erstellung einer Projektionsdichtekarte bis 9 Å genutzt wurden. Die beiden elektronenkristallographisch erstellten Projektionskarten waren sehr ähnlich. Sie zeigten drei voneinander abgegrenzte Domänen, die in Zusammenhang mit einer vorliegenden Struktur der verwandten Ca2 -ATPase interpretiert werden konnten. Die Technik der Oberflächenkristallisation eröffnet neue Möglichkeiten für die Kristallisation von Membranproteinen. Kristallisationsexperimente können bei Proteinkonzentrationen von nur 50-150 (g/ml durchgeführt werden und sind für alle Membranproteine, die mit einem His-tag exprimiert werden können, anwendbar. Es wurde ein Homologiemodell der Plasmamembran H -ATPase aus Neurospora crassa in Anlehnung an die atomare Struktur der verwandten Ca2 -ATPase SERCA1 erstellt. Beide Enzyme liegen in unterschiedlichen Konformationen vor, die sie während des Reaktionszyklus durchlaufen. Es konnte gezeigt werden, dass es sich dabei offenbar um die Bewegung ganzer Domänen handelt. Dabei wurde klar, dass in einem solchen Fall schon 3D-Strukturen bei einer mittleren Auflösung von ca. 8 Å, wie sie mit Hilfe der Elektronenkristallographie verhältnismäßig einfach erreicht werden können, viel zum Verstehen von Reaktionszyklen beitragen können, die große Konformationsänderungen beinhalten.
Im Rahmen einer klinische Studie wurden bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf/Halsbereich LymphozytenSubpopulationen phänotypisch und funktionell charakteri- siert sowie deren Aktivierungszustand anhand der Bestimmung des Interleukin2Titers und der Konzentration von löslichem Interleukin2Rezeptor a (sIL2Ra) im Plasma gemessen. Hierbei interessierte der Einfluß des Tumors bzw. der Therapieformen wie Operation, Che mo, Bestrahlungstherapie und kombinierte RadioChemotherapie auf diese immunologischen Parameter. Die Zusammensetzung der Populationen peripherer Blutlymphozyten wird durch die Größe und Malignität des Primärtumors sowie durch Lymphknotenmetastasen beeinflußt. In der An fangsphase, bei einer Tumormalignität G1, ist eine starke Reduzierung der LAKZellaktivität zu sehen, was mit suppressiven Faktoren, wie zum Beipiel ProstaglandinE2, abgesondert von Monozyten, in Verbindung gebracht werden könnte. Der Anteil CD3positiver Zellen ist im G3Stadium sehr stark erniedrigt und deutet auf eine Herunterregulierung der zu dem CD3 Komplex gehörenden eKette hin. Weiterhin war bei den HNOTumorpatienten der Anteil der CD4Lymphozyten auffällig erniedrigt, während die Zahl der doppeltpositiven CD4 CD8 Zellen sowie die HLADRWerte erhöht war. Einen Monat nach einem operativen Eingriff ließ sich eine starke Zunahme der CD25 Expression, besonders auf TLymphozyten erkennen. Die Chemotherapie mit Cisplatin, Fo linsäure, 5FU, Fortecortin eine sogenannte Polychemotherapie bewirkte eine starke Erhö hung der NKZellpopulation und eine höhere Expression des CD25Markers auf NKZellen sowie eine Zunahme der LAKZellfunktion. Die Veränderung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf den Einsatz von Cisplatin und 5FU zurückzuführen. Die Bestrahlungsthe rapie bewirkte eine signifikante Abnahme der TLymphozyten, besonders der CD4T Helferzellen, bei gleichzeitiger Zunahme der CD4 CD8 positiven Zellen. BZellen sind gStrahlen sensitiv, so daß unter Bestrahlung ihr Anteil vermindert wird. Die Erhöhung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf eine Radioresistenz dieser Lymphozytensubpopula tion zurückzuführen. Die RadioChemotherapie beinhaltet drei Zyklen mit einem Zytostatika gemisch: Cisplatin, 5FU, Folinsäure, Dexametason, Rescuvolin und Fortecortin und an schließender Behandlung mit gStrahlen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen deutlich, daß es unter dieser RadioChemotherapie zu einem signifikanten Abfall der CD3 und CD2positiven Zellen, besonders der zytotoxi schen TZellpopulation, sowie zu einer Erhöhung der CD25exprimierenden Zellen kommt. Die Beziehungen der Zellen untereinander sind unter Operation, Betrahlung und Radio Chemotherapie nicht verändert, die Chemotherapie verursacht jedoch vermutlich ein Un gleichgewicht zwischen THelferzellen und Makrophagen bezüglich der Vermehrung von NKZellen. Bei Patienten ohne Therapie kam es zu einer Abnahme der CD3positiven Zellen. Dies unterstützt die Hypothese der Herunterregulierung der eKette des CD3Komplexes unter Tumoreinwirkung. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die alleinige Bestimmung des Interleukin2 Proteins keine Auskunft über die Wirkung des Tumors auf die Sezernierung dieses Peptids bei einer Tumorlokalisation im Gaumen und Zungenbereich gibt. Erst im Verlauf der Erkrankung können Änderungen durch virale Infektionen und der Einfluß verschiedener Therapiemodali täten beobachtet werden. Die Konzentration von sIL2Ra verhielt sich proportional zur Tumorgröße. Dies unterstützt die Hypothese, daß dieser Rezeptor eher vom Tumor abstammt und nicht von den infiltrierten Lymphozyten. Die Konzentration von sIL2Ra im Plasma war abhängig von der Therapieart. Sie erreichte wesentlich höhere Werte bei Tumorpatienten im Vergleich zu den Probanden. Der niedrigste Spiegel bei Patienten fand sich bei Bestrahlungstherapie (Median = 840 U/ml), die höchsten Werte bei Patienten mit Chemotherapie (Median = 1400 U/ml). Infiltrierende CD3 Lymphozyten im Primärtumor, identifiziert mit einen Antikörper gegen die eKetten, sind im Vergleich zu metastasierten Lymphknoten signifikant erniedrigt. Unter suchungen der peripheren Blutlymphozyten bei Patienten mit Primärtumor ergaben eine signi fikante Erhöhung der CD3Populationen bei gleichzeitiger Erniedrigung des Anteils CD45 positiver Zellen. Es bestand für CD45positive Zellen ein signifikanter Zusammenhang zwi schen peripheren Blutlymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten.
Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Vektor für die Gentherapie zu optimieren. Zunächst wurde dazu die HTLV1Integrase im Austausch gegen die HSRV Integrase in HSRV eingebracht. Dieses rekombinante Plasmid war jedoch replikationsdefizient und hatte nach der Transfektion in eukaryonte Zellen keinen Virustiter. Dies führte zu der Überlegung, auch die für die Erkennung des Virus durch die Integrase wichtigen ersten 15 Nukleotide der LTREnden von HSRV an die Sequenz von HTLV1 anzugleichen. Da auch der daraus resultierende Klon keine Infektiösität aufwies, konnte die Replikationsdefizienz eventuell weitreichendere Gründe haben als eine reine Integrationsdefizienz. Ein cisElement am CTerminus der HSRVIntegrase welches zur Stabilisierung und Verpackung der RNA in Partikel wichtige Funktionen hat, wurde daher in dem Klon mit der HTLV1Integrase regeneriert. Dazu wurde eine chimäre Integrase bestehend aus dem Nterminalen und dem Mittelteil der HTLV1Integrase mit dem Cterminalen Teil der HSRV Integrase fusioniert und in das HSRV Provirus mit und ohne die HTLV1LTREnden eingebracht. Da diese Klone ebenfalls nichtinfektiös waren, sollte Expressionsanalyse der rekombinanten Plasmide zur Klärung der Ursache ihrer Replikationsdefizienz beitragen. Als Kontrollen dienten dabei ein HSRVKlon ohne Integrase, ein HSRVKlon mit wiedereingeführter HSRVIntegrase und ein Konstrukt mit den HTLV1LTREnden aber mit der HSRVIntegrase. Die Untersuchung der chimären Klone ergab, daß virale genomische RNA zumindest kurze Zeit nach der Transfektion in den Zellen vorhanden war, aber eventuell nicht in Viruspartikel verpackt wurde, da vor der HTLV1Integrase ein weiteres ca. 114 Nt langes cisElement fehlte. Dieses fehlende cisElement war möglicherweise auch die Ursache für eine gestörte GagProzessierung der Klone in 293TZellen. Da Gag Prozessierung für den Zusammenbau intakter Viruspartikel essentiell ist, konnte hier ein Grund für die Replikationsdefizienz der chimären Klone liegen. Alle weiteren viralen Proteine wurden von den chimären Klonen exprimiert und normal prozessiert. Die virale Protease war also enzymatisch aktiv. Weiterhin wurde die korrekte Aktivität der reversen Transkriptase nachgewiesen. Durch eine Kotransfektion der chimären Plasmide mit dem HTLV1GagProtein sollte das im Preintegrationskompex vorkommende GagProtein für die øTLV1 Integrase ersetzt werden. Auch dieser Versuchsansatz erwies sich als ungeeignet, die Integration bzw. Replikation der chimären Klone zu verbessern. Durch die Einklonierung eines Resistenzgens in die viralen Klone sollten Zellen mit integrierter viraler DNA gezielt selektioniert werden. Das Resistenzgen wurde in drei der viralen Konstrukte eingebracht, in wtpHSRV13, in den Klon mit den HTLV1 LTREnden und der HTLV1Integrase sowie in das virale Plasmid mit den HTLV1 LTREnden und der chimären Integrase. Nach der Einzelzellselektion der mit wt Zeocin transfizierten BHKZellen hatte von sechs Klonen nur einer einen geringen Virustiter, dieser exprimierte als einziger virale Gene. Durch Southernblotanalyse dieser Einzelzellklone konnte die Anzahl der Integrate auf fünf bis acht pro Einzelzellklon ermittelt werden. Die Einzelzellklone aus der Transfektion mit den rekombinanten Klonen besaßen keine Infektiösität. Die Expression der viralen Gene war bei den Einzelzellklonen aus der Transfektion des Klons mit den HTLV1LTR Enden und der HTLV1Integrase nachweisbar.
Erstmals konnte eine zCarotinDesaturase einer höheren Pflanze nach heterologer Expression in E. coli in nativer Form gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Dazu wurde die cDNA der CapsicumZDS in einen Expressionsvektor kloniert, der die ZDS als rekombinantes Polypeptid mit 6 Nterminalen Histidinen exprimierte. Dadurch konnte das Enzym in nur zwei Schritten über eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung und MetallionenAffinitätschromatographie selektiv aus E. coli separiert werden. Die ZDS wurde ohne eine mutmaßliche Transitsequenz als ein Polypeptid von 59 kDa exprimiert. Das pH Optimum der ZDSAktivtität liegt bei 7,2 in der Nähe der rechnerisch ermittelten pIWertes von 7,4. Die ZDS führt zwei Desaturierungsschritte ausgehend von zCarotin zu Lycopin als ein monomeres Protein durch. Unter Verwendung des TwoHybridSystems, einer Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen und einer Gelfiltration der nativen ZDS, konnte gezeigt werden, daß die ZDS als Monomer und als Dimer vorliegen kann. Die Dimerisierung der ZDS ist jedoch für deren enzymatischer Aktivität und für die Durchführung beider Desaturierungsschritte nicht notwendig. Für die Substratcarotinoide zCarotin und Neurosporin, wurden die Km Werte von 8,4 µM und 9,0 µM bestimmt. Die CapsicumZDS zeigt von ihrer Aminosäuresequenz her eine große Ähnlichkeit zu den cyanobakteriellen zCarotinDesaturasen und eine geringere Ähnlichkeit zu den pflanzlichen Phytoendesaturasen. Eine diskutierte phylogenetische Verwandtschaft der zCarotin und Phytoendesaturase aus höheren Pflanzen und Cyanobakterien wird durch die Verwendung des gleichen Kofaktors Plastochinon und durch die gemeinsame Hemmbarkeit mit den zCarotinDesaturaseHemmstoffen J852 und LS80707 unterstützt. Eine Kofaktoruntersuchung ergab, daß Plastochinon sowohl der Kofaktor der ZDS aus Capsicum, als auch der Phytoendesaturasen aus Gentiana lutea (gelber Entian), aus dem Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7942, sowie der z CarotinDesaturase aus Synechocystis sp. PCC 6803 ist. Der Km Wert von Decyl Plastochinon wurde für die CapsicumZDS zu 0,4 µM bestimmt. Der Kofaktor der z CarotinDesaturase Plastochinon, sowie die Entdeckung einer plastidären terminalen Oxidase (Carol et al., 1999) ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Übertragung der bei der Desaturierung von zCarotin gewonnenen Elektronen über Plastochinon auf Sauerstoff, wie es bereits für die pflanzliche Phytoendesaturase postuliert wurde (Carol
Das Chromanol 293B stellt die Leitsubstanz einer möglicherweise neuen Kategorie von KlasseIIIAntiarrhythmika dar. Im Herzen inhibiert es potent und spezifisch den Kaliumkanal I Ks , der an der Repolarisation der Membran bei Ablauf eines Aktionspotentials beteiligt ist. Er ist aus der AlphaUntereinheit KCNQ1 und der BetaUntereinheit MinK aufgebaut. Es bestehen deutliche biophysikalische Unterschiede zwischen den Strömen homomerer KCNQ1 und heteromerer I Ks (KCNQ1/MinK)Kanäle. Die Koexpression mit MinK verändert aber auch die Pharmakologie von KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit trugen zwei unabhängige Lösungsansätze dazu bei, die Interaktion der beiden Untereinheiten molekular besser zu verstehen. Dabei wurden als Methoden die zielgerichtete Mutagenese, die Expression der WildTypProteine und der Mutanten in XenopusOozyten und deren elektrophysiologische Analyse angewendet. Im ersten Teil wurde die Bindungsstelle des I Ks Inhibitors 293B molekular identifiziert, während im zweiten Teil der Mechanismus der Inaktivierung der AlphaUntereinheit KCNQ1 untersucht wurde. In den beiden Ansätzen wurde ausgenutzt, dass die zu KCNQ1 eng verwandten KCNQ2 Kanäle weder sensitiv gegenüber 293B waren noch eine Inaktivierung zeigten. Die Expression von MinKMutanten, die alle veränderbaren Regionen des Proteins abdeckten, ergab, dass keine dieser Mutationen die Affinität des I Ks Kanals gegenüber 293B wesentlich beeinflusste. Das war erstaunlich, da homomere KCNQ1Kanäle durch das Chromanol 293B um den Faktor 45 schwächer zu blockieren sind als I Ks Kanäle und da zusätzlich gezeigt wurde, dass sich auch das Ausmaß der Stereoselektivität von 293B und anderer verwandter I Ks Inhibitoren in Bezug auf KCNQ1 und I Ks stark unterscheidet. Es konnte aus den Ergebnissen indirekt vermutet werden, dass MinK offensichtlich auf allosterische Art die Affinität des Inhibitors erhöht. Um einen Hinweis auf die I Ks Spezifität des Blocks durch 293B auch innerhalb der KCNQ Familie zu erhalten, wurde zunächst die Inhibition der verwandten KCNQ2 und KCNQ3Kanäle getestet, die sich als kaum signifikant erwies. In diesem Zusammenhang wurde auch ein neues Mitglied der KCNQFamilie kloniert, KCNQ5, das schwach sensitiv gegen 293B war, nicht im Herzen vorkommt aber wahrscheinlich zusammen mit KCNQ2/KCNQ3 zum neurona len MStrom beiträgt. Dies ergab Hinweise darauf, dass von anderen KCNQKanälen differente Proteinsequenzen die hohe Sensitivität des KCNQ1Kanals gegenüber 293B determinieren. Die Bindungsstelle an der AlphaUntereinheit KCNQ1 wurde anschließend durch KCNQ1/KCNQ2 Chimären auf die innere Porenregion eingegrenzt. Durch detaillierte Untersuchung mithilfe von Punktmutationen identifizierten wir Aminosäuren in der Transmembranregion S6 (I337) und der Porenschleife H5(V307), deren Austausch gegen die entsprechenden KCNQ2 Aminosäuren die Affinität von 293B zu KCNQ1 sowie zu I Ks Kanälen um den Faktor 420 herabsetzten. Durch Analogiemodellierung mithilfe der bekannten Kristallstruktur des KcsA Kaliumkanals konnte ein 3DModell der KCNQ1Porenregion erstellt werden, aus dem sich ergab, dass die Seitenketten der Aminosäure Isoleucin 337 in das Lumen der inneren Pore gerichtet sind. Aus dem Modell konnte weiterhin das Phenylalanin 340 als in das Lumen gerichtet identifiziert werden. Dieses Ergebnis konnte durch weitere MutageneseExperimente evaluiert werden, aus denen hervorging, dass Veränderungen an dieser und benachbarten Positionen die Sensitivität sowohl von KCNQ1 als auch von I Ks Kanälen gegenüber 293B um den Faktor 10100 verminderten. Das 293BMolekül konnte so in das Modell integriert werden, dass sich attraktive Interaktionen mit diesen beiden Resten (F340 und I337) ausbilden. Die innere Porenregion stellt auch für viele Inhibitoren anderer Kaliumkanäle eine wichtige Determinante für hohe Affinität dar. Die in H5 gelegene Aminosäure V307 schien nach dem Modell nicht an einer 293BInteraktion direkt beteiligt zu sein. Es fiel aber bei der Charakterisierung auf, dass das veränderte Protein nicht mehr inaktivierte. Daher sollte ein Zusammenhang zwischen dem 293B Wirkmechanismus und der intrinsischen KCNQ1Inaktivierung untersucht werden. Es wurden wiederum durch einen Chimärenansatz zunächst die Regionen identifiziert, die für eine KCNQ1Inaktivierung notwendig sind. Anschließend wurde nach punktuellem Austausch von KCNQ1Aminosäuren gegen analoge KCNQ2Reste für eine weitere Position im Transmembransegment S5 (G272) ein Verlust der Inaktivierung festgestellt. Die zweite nicht inaktivierende Mutante G272C war WildTypgleich 293Bempfindlich, woraus sich vermuten ließ, dass die schwache Empfindlichkeit gegenüber 293B und der Verlust der Inaktivierung der KCNQ1Mutante V307L nicht in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse machten aber molekular den Unterschied der KCNQ1Inaktivierung zu den beiden klassischen Inaktivierungsarten von Kaliumkanälen, N und CTyp, deutlich. Zuvor war dies nur anhand unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften gezeigt worden. Das zuvor erstellte KCNQ1 Modell unterstützte die Resultate, da sich in ihm die beiden Regionen S5 und die Porenhelix H5 etwa auf Höhe der beiden Aminosäuren V307 und G272 kreuzen, was eine Interaktion dieser Regionen suggeriert. Zudem ist bei der ein LongQTSyndrom verursachenden KCNQ1Mutation L273F die mutierte Stelle unmittelbar neben dem Valinrest 307 lokalisiert. Diese besonders stark inaktivierende LQT1Mutante erhielt auch unter der Einwirkung von MinK eine nachweisbare Inaktivierung aufrecht. Da die KCNQ1Inaktivierung durch MinKKoexpression normalerweise aufgehoben wird, spricht dies für eine pathophysiologische Relevanz der KCNQ1Inaktivierung.
Die Hämatopoese stellt den blutbildenden Prozeß dar, der den Menschen ein Leben lang mit Blutzellen versorgt und deren Ausgangspunkt eine kleine Zahl hämatopoetischer Stammzellen ist. Diese Stammzellen besitzen einerseits die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind andererseits in der Lage, durch Proliferation und terminale Differenzierung Zellen verschiedener Linien hervorzubringen. Das biologische Hauptmerkmal der Stammzelle ist die Fähigkeit die Hämatopoese zu rekonstituieren, was klinisch bei der Stammzelltransplantation genutzt wird. Überwiegend werden dabei Knochenmark und peripheres Blut als Quelle für Stammzellen genutzt, die abhängig von der Zahl der transplantierten Zellen zur völligen Rekonstitution der Blutbildung führen. Für Patienten ohne passende Spender wurde das Nabelschnurblut als Alternative in Betracht gezogen. Trotz verschiedener Vorteile der Stammzellen aus Nabelschnurblut besteht der Hauptnachteil in der sehr limitierten Zahl der Zellen mit dem erhöhten Risiko eines Transplantatversagens. Aus diesem Grund wird die ex vivo Vermehrung dieser Stammzellen derzeit zunehmend untersucht. Erforderlich sind Bedingungen zur ausreichenden Vermehrung der Zellen unter Erhalt der Stammzelleigen schaften, die die klinische Anwendung möglich machen. Diese Bedingungen waren bisher nicht erfüllt. Hauptziel dieser Arbeit war es demnach Kulturbedingungen für die Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren, die den klinischen Anforderungen einer Transplantation genügen. Dafür wurden sowohl die determinierten Vorläuferzellen untersucht, als auch die Fähigkeit der Stammzelle in vitro Langzeithämatopoese aufrecht zu erhalten und zur Repopulierung der NOD/SCIDMaus. Die Repopulierung ist ein spezifischer Prozeß (Homing), bei dem die Migration der Zellen aus der Blutbahn durch die Endothelzellschicht der Gefäße in die spezialisierten Nischen des Knochenmarks erfolgt. Da für die Amplifikation äußere Stimuli erforderlich sind, welche die biologischen Eigenschaften der Zellen modulieren, wurden die Eigenschaften der expandierten Zellen in verschiedenen in vitro Assays wie CFU und LTCIC untersucht, die derzeit als die besten Verfahren gelten, die hämatopoetische Stammzelle zu detektieren. Zur Untersuchung der Repopulierungsfähigkeit wurde das NOD/SCIDMausmodell etabliert, in dem der Aufbau einer humanen Hämatopoese im murinen Knochenmark gemessen wird, sowie ein neues in vitro Modell entwickelt, das Stromazellsphäroid, mit dessen Hilfe die Migrationsfähigkeit untersucht wurde. Mit der Kombination der auf primitive Stammzellen wirkenden Zytokine SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine gute und ausreichende Vermehrung der ontogenetisch unreifen und der determinierten Progenitorzellen nach Kultivierung der Zellen über 7 Tage. Das beim Einsatz in der ex vivo Expansion umstrittene Zytokin IL3 führte hierbei nicht zum befürchteten Verlust der Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen. Es sorgte vielmehr durch eine starke Vermehrung der Zellen für ein Engraftment der NOD/SCIDMaus, das dem durch frische unmanipulierte Nabelschnurblutzellen vergleichbar war. Von den getesteten Kultursystemen erwies sich die statische Kultivierung im Teflonbeutel als geeignet zur Vermehrung der primitiven Progenitoren, ohne die Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen zu vermindern. Durch die Wahl eines serumfreien, klinisch anwendbaren Mediums gelang somit die Etablierung eines Kultursystems zur optimierten ex vivo Expansion früher Progenitor und Stammzellen aus Nabelschnurblut ohne Verlust der Repopulierungsfähigkeit für die klinische Anwendung. Das Homing in das Knochenmark ist ein selektiver aus mehreren Einzelschritten bestehender Prozeß unter Interaktion der Zellen mit Endothelzellen und dem Knochenmarkstroma, der durch eine Vielzahl verschiedener zusammenwirkender Adhäsionsmoleküle reguliert wird. Weitere Faktoren, die das Homing beeinflussen sind Zytokine oder Chemokine. Diese Stimuli wirken über verschiedene intrazelluläre Signalwege, von denen die RhoProteinfamilie der kleinen GTPasen eine bestimmende Rolle in der Migration zugedacht wird, sowie andere Bestandteile der intrazellulären Signaltransduktion, wie Kinasen und GProteine. Die Migration in das Sphäroidmodell ist ebenso ein selektiver und gerichteter Prozeß, bei dem neben den primären CD34 Zellen aus Nabelschnurblut auch andere humane hämatopoetische Zelllinien eine gerichtete Einwanderung zeigen. Durch Zugabe eines Inhibitors von G Proteinen, Pertussis Toxin (PT), und Hemmung der kleinen GTPasen durch spezifische Toxine aus Clostridien konnte eine reproduzierbare und deutliche Verringerung der Migration in das Sphäroid erreicht werden. Die Migration hämatopoetischer Zellen in das Sphäroid erfolgt also unter Beteiligung der kleinen GTPasen, sowie PT sensitiver GProteine. Blockierungsversuche zeigten unerwarteterweise keine funktionelle Beteiligung des ChemokinRezeptorpaares SDF1/CXCR4 und des Adhäsionsmoleküls VLA4 bei der Migra- tion in das Sphäroid. Welche weiteren Mechanismen für diese Migration bedingend sind erfordert weitergehende Untersuchungen. Durch die Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut mit den Zytokinen SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine ausreichende Vermehrung von frühen und determinierten Progenitorzellen unter Erhalt ihrer Stammzellfähigkeiten, so daß ein klinischer Einsatz möglich wird. Dabei ergab sich durch Untersuchung der Migrationsfähigkeit im Sphäroidmodell, daß beim Homing der Zellen die Aktivierung der kleinen GTPasen und eines Pertussis Toxinsensitiven GProteins beteiligt sind.
Schon kurz nach Änderung der Verordnung über das Leichenwesen und der Einführung des neuen Leichenschauscheines in Hessen am 15.4.1996 traten Schwierigkeiten auf, die zunächst auf die Umstellung zurückgeführt wurden. Nachdem auch einige Monate später die Klagen von vielfältiger Seite (Ärzte, Sanitäter, Bestatter, Kriminalpolizei) nicht nachließen, sollte untersucht werden, ob, warum und in welchem Umfang die Handhabung des neuen Leichenschauscheines solche Schwierigkeiten bereitet. Die Untersuchung basierte zum einen auf der Auswertung der Leichenschauscheinen der Verstorbenen, die im Zentrum der Rechtsmedizin in der Zeit von 1.1.31.3.1997 zur Verfügung standen (264 vertrauliche, 161 nichtvertrauliche Teile der Leichenschauscheine) zum anderen auf Interviews mit dem Standesamt, Gesundheitsamt, Kriminalpolizei, Verwaltung der Universitätsklinik und einem Bestatter. Als Gesamtergebnis kristallisierte sich heraus, dass der Leichenschauschein formale Mängel aufweist. Insbesondere die Angabe des Totauffindens ist mit dem Personenstandsgesetz nicht vereinbar, nach dem grundsätzlich die Todeszeit, bzw. der Todeszeitraum angegeben werden muss. Zum anderen war das Fehlen der Rubrik ''Natürlicher Tod'' einer der wesentlichen Mängel, weil häufig von Ärzten auch bei nichtnatürlichem Tod vergessen wurde, die entsprechende Rubrik zu signieren, so dass ohne Vorliegen des vertraulichen Teils der Standesbeamte von einem natürlichen Tod ausgehen musste. In einem Fall ist erst bei der zweiten Leichenschau im Krematorium der wirkliche Sachverhalt aufgeklärt worden, mit entsprechender Störung des Beerdigungsablaufes. Weiterhin ist der Leichenschauschein sehr unübersichtlich angelegt, indem gleiche Angaben sich an verschiedenen Stellen befinden, was dazu führt, dass sie häufig nicht, unvollständig oder falsch ausgefüllt werden. Auch die praktische Handhabung mit verschiedenen Briefumschlägen ohne eindeutige Kennzeichnung führte dazu, dass z.B. der nichtvertrauliche Teil mit in den für den vertraulichen Teil vorgesehenen Umschlag kurvertiert wurde und damit wiederum ein weiteres Herantreten an die Angehörigen notwendig war. Einer der größten Mängel ist darin zu sehen, dass darauf verzichtet wurde eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie es in anderen Bundesländern üblich ist, einzuführen. Das bedeutet, dass der Notarzt nach dem Einstellen der Wiederbelebungsmaßnahmen solange warten muss, bis sichere Todeszeichen aufgetreten sind. Dieses ist nicht nur unökonomisch, sondern häufig wegen eines neuen Einsatzes auch nicht durchführbar. Als Mangel ist auch das Fehlen der Warnhinweise (''Schrittmacher'') im vertraulichen Teil zu werten. Dadurch liegen wichtige Informationen dem die zweite Leichenschau bei Feuerbestattung durchführenden Arzt nicht vor. Bei dieser Sachlage scheint es unabdingbar eine Änderung des Leichenschauscheines und des Procedere herbeizuführen. Vorstellbar wäre ein einheitliches Formular der vertreibenden Verlage mit Schwärzungen an den Stellen, die von datenschutzrechtlichem Belang sind. Ferner sollten für sämtliche Formularblätter entsprechend gekennzeichnete Briefumschläge zur Verfügung stehen, so dass grundsätzlich bei jeder Leichenöffnung alle Formulare in einen gesonderten Umschlag kommen. Außerdem sollte noch einmal von gesetzgeberischer Seite überdacht werden, ob eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie sie sich in anderen Bundesländern bewährt hat, einzuführen. Letztlich wird auch darüber nachzudenken sein, wie die Qualität der ärztlichen Leichenschau zu verbessern ist. In erster Linie wird es eine Frage bei der Ausbildung der Medizinstudenten sein, die aber zu dieser Zeit die ''Ernsthaftigkeit'' dieser Tätigkeit noch nicht richtig einzuschätzen wissen. Außerdem wird es durch die Reduzierung der Leichenöffnungen und z.T. sehr emotional geführte Rechtsdiskussionen immer schwieriger den Arzt ''in praxi'' auszubilden. Zweifellos ist die Bereitschaft zur Fortbildung bei Ärzten, die die Leichenschau durchführen, später größer, aber hier ist kaum noch eine institutionalisierte, zeitaufwendige Fortbildung möglich. Letztlich muß auch darüber nachgedacht werden, inwieweit nicht vermeidbare Mängel bei der Leichenschau und bei dem Ausfüllen des Leichenschauscheines durch Verhängung von Bußgeldern sanktioniert werden sollte. Schließlich entstehen nicht nur anderen Institutionen (Standes, Gesundheitsamt, statistische Behörden) und Angehörigen durch Mängel bei der Leichenschau erhebliche Beschwernisse und Unkosten. Es kann auch einem Täter bei Verkennung einer Tötung Anlaß zu weiteren entsprechenden Taten geben.
TEIL I Die Bauentwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes in Frankfurt am Main von 1960 bis zur Fertigstellung des Erweiterungsbaus im Jahr 1973 ( bearbeitet von: Thomas Kick ) Die vorliegende Arbeit reiht sich ein in die Gesamtdarstellung der Geschichte des Zahnärztlichen Universitäts- Institutes in Frankfurt am Main. In der Dissertation von Bald-Duch wird ein geschichtlicher Überblick von der Gründung der Heilanstalt Carolinum im Jahre 1890 bis zum Tode von Otto Loos am 1. April 1936 gegeben, die Arbeit von Roeloffs-Nuthmann umfasst die Darstellung des historischen Werdegangs des Zahnärztlichen Institutes in Frankfurt am Main während der nationalsozialistischen Herrschaft und der Nachkriegsjahre bis hin zum Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Carolinum. Diese Dissertation vervollständigt die Dokumentation der Entwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes Carolinum für die Jahre 1960 bis 1986, wobei der Schwerpunkt der Darstellung auf die Bauentwicklung und dabei insbesondere auf die Planung und Errichtung des Neubaus des Zentrums der Zahn-, Mund- und Kiefer- heilkunde Carolinum gelegt wurde. Zu Beginn der sechziger Jahre wurden Verhandlungen zur Übernahme der Städtischen Universitätskliniken und der angeschlossenen Institute in Frankfurt am Main durch das Land Hessen aufgenommen. Davon betroffen war auch das Zahnärztliche Universitäts-Institut Carolinum, das in die Verwaltung der Universität übergehen sollte. Professor Flesch-Thebesius als Vorsitzender des Vorstandes der Freiherr Carl von Rothschild
Bislang ist unklar, warum Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM, Chlorocebus), die in ihrem natürlichen Habitat bis zu 50% mit SIVagm infiziert sind, zeitlebens keine Symptome einer Immundefizienz zeigen, d.h. eine Resistenz gegen AIDSähnliche Symptome besitzen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in einer Studie die Immunantwort SIVagminfizierter AGM nach Immunstimulation mittels Tetanustoxoid untersucht. Ziel dieses Projekts war die Klärung der Frage, ob die Virusreplikation durch Stimulation des Immunsystem und damit einhergehend einer Vermehrung der Zielzellen von SIV, eine Änderung erfährt oder ob diese durch immunologische Kontrollmechanismen konstant bleibt. Untersucht wurde dazu eine Gruppe von vier natürlich SIVagminfizierten AGM, die zwei Jahre nach Basisimmunisierung mit Tetanustoxoid im Abstand von vier Wochen i.m. immunisiert wurden. Der Zeitpunkt der SIVInfektion lag vor der Basisimmunisierung. Wöchentlich fanden Blutentnahmen statt und es wurden immunologische und virologische Parameter bestimmt. Die gemessenen Lymphozytenwerte, die FACSDaten und die Lymphozytenproliferationskapazität ließen nach Tetanustoxoidgabe keine Änderung erkennen. Die Daten gaben keinen Hinweis darauf, daß die exogene Antigenspezifische Stimulation zu einer Proliferation der Gedächtniszellen geführt hätte. Es ist davon auszugehen, daß es während der Basisimmunisierung zu einer Proliferation von CD4 TZellen kam und diese nachfolgend infiziert bzw. eliminiert wurden. Somit waren keine Tetanusspezifischen Gedächtniszellen zum Zeitpunkt der Immunstimulation mehr existent. Um dieses Problem auszuschließen, müssten SIVagmnegative AGM eine Basisimmunisierung erhalten und erst anschließend dürfte eine Infektion mit SIVagm stattfinden. Aufgrund des Versuchsaufbaus kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Immunstimulation auf die Höhe der Virusbelastung Einfluß nimmt. Für das apathogene SIV/Primatensystem konnte im Vergleich mit AIDSsuszeptiblen SIV/PrimatenSystemen zwar keine deutlich stärkere humorale oder zelluläre Immunantwort gefunden werden, jedoch gibt es signifikante Unterschiede. AGM zeigen nur eine geringe Virusbelastung in den Lymphknoten und es konnte bislang in keinem natürlichen Wirt von SIV sog. ''VirusTrapping", daß heißt die Anheftung von Viruspartikeln auf der Oberfläche von Follikulär Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Es wurde auch nie, trotz chronischer Infektion, eine Strukturänderung des lymphatischen Gewebes gefunden. Ein weiterer kurioser Unterschied ist das Fehlen einer Immunantwort gegen natives GagProtein, obwohl es zu einer starken Immunantwort gegen das EnvProtein kommt. In der zweiten durchgeführten Studie im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte, unter der Annahme, daß die obengenannten Phänomene miteinander assoziiert sind, folgende Hypothese untersucht werden: Aufgrund des Fehlens der GagAntikörper kommt es bei AGM nicht wie bei einer HIVInfektion zur Bildung von Immunkomplexen. Dementsprechend können keine Viruspartikel via Fc Rezeptor auf FDC gebunden werden. Nachfolgend findet deshalb auch keine verstärkte Apoptose der FDC bzw. Lyse der germinalen Zentren statt, und die Lymphknotenarchitektur bzw.struktur bleibt intakt. Zunächst sollte deshalb im folgenden Projekt eine humorale Immunantwort gegen das Kernprotein von SIV induziert werden. Nach mehrfacher Immunisierung mit affinitätschromatographisch gereinigtem GagProtein entwickelten alle untersuchten Tiere (Gruppe A) hohe AntikörperTiter. Nachfolgend wurden die Gagimmunisierte Gruppe und eine Kontrollgruppe (Gruppe B) experimentell infiziert. Die Negativkontrollgruppe (Gruppe C) blieb unbehandelt. In regelmäßigen Abständen erfolgten Blutbzw. Lymphknotenentnahmen. Ein wichtiger Teil dieses Projekts war die Etablierung einer quantitativen RTPCR zum Nachweis von SIVagmRNA. Bislang war es nicht möglich, die virale RNA zu quantifizieren und bei der chronischen, benignen SIVagmInfektion von AGM lag lange der Verdacht nahe, daß es aufgrund einer niedrigen Viruslast nicht zum Krankheitsausbruch kommt. Es konnte eine quantitative TaqmanRTPCR etabliert werden, mit der der spezifische Nachweis mit einer Sensitivität von 100 RNAKopien pro ml möglich ist. Die Tiere zeigten Plasmaund Proviruslasten in einer Höhe, die durchaus vergleichbar ist mit der Viruslast HIVinfizierter Menschen bzw. SIVmacinfizierter Rhesusaffen. Es kann somit ausgeschlossen werden, daß eine niedrige Viruslast der Grund für die Apathogenität ist. Die Viruslast in den Lymphknoten wurde immunhistochemisch untersucht. Die zuvor Gag immunisierten Tiere zeigten mehr infizierte Zellen, insbesondere im Bereich der Follikel, als Gruppe B. Diese Daten stimmten mit den Ergebnissen der InsituHybridisierung überein. Auch hier konnte mehr virale RNA in den Follikeln der GruppeA detektiert werden. Zwei der Tiere zeigten Anzeichen von VirusTrapping in den Keimzentren der Lymphknoten. Die histologischen Daten könnten darauf schließen lassen, daß die Existenz von GagAntikörpern auf die Viruslast in lymphatischem Gewebe Einfluß nimmt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Fluorbenzol- und Fluorbenzimidazol- Nukleoside synthetisiert. Mit 1´-Desoxy-1´-(4-fluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 32 handelt es sich um einen zum natürlichen Inosin isosteren Baustein. Die Carbonylsauerstoffe wurden durch Fluoratome und die Stickstoffatome des Sechsringes durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Mit den Bausteinen 1´-Desoxy-1´-(4,6-difluor-1- N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 33 und 1´-Desoxy-1´-benzimidazolyl-beta-D-ribofuranose 37 wurden zwei weitere Benzimidazol-Nukleoside mit zwei Fluoratomen bzw. ohne Fluor synthetisiert. Als isosteren Baustein für das natürliche Uridin wurde 1´-Desoxy-1´-(2,4- difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 synthetisiert. Auch hier wurden die Carbonylsauerstoffe durch Fluoratome und die Stickstoffatome durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Um den Einfluß der Fluorsubstitution untersuchen zu können, wurden noch 1´-Desoxy-1´- (2,4,6-trifluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 86, 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34, 1´-Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35, 1´-Desoxy-1´-(2-fluorphenyl)-beta-D- ribofuranose 36 und 1´-Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38 synthetisiert. Die einfach fluorierten Bausteine wurden so ausgewählt, daß das Fluoratom an jeder möglichen Position des Aromaten einmal vorkommt. Schließlich wurden noch Inosin 31 und 1-Desoxy-D- ribofuranose 39 als abasischer Baustein synthetisiert. Die Fluorbenzimidazole wurden ausgehend von den entsprechenden Fluoracetaniliden dargestellt. Die Glykosylierung erfolgte nach der Silyl-Hilbert-Johnson Reaktion mit anschließender Deacetylierung der Hydroxylfunktionen mit ammoniakalischem Methanol. Für die C-Glykosylierung der C-Nukleoside wurde 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribono-gamma-lacton 85 benötigt. Dies wurde über vier Stufen aus D-Ribose dargestellt. Nach der C-Glykosylierung mit dem entsprechenden Fluorbrombenzol wurde den Nukleosiden die entstandene C1´- Hydroxylfunktion entfernt. Anschließend wurden die C-Nukleoside mit Palladiumhydroxid auf Kohle und Cyclohexen in einer Transfer-Katalyse entschützt. Die Ausnahme bildete 1´- Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38, das mit Bortribromid entschützt wurde. Der abasische Baustein 39 wurde aus 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose 84 durch Dehydroxylierung und anschließender Entschützung gewonnen. Von allen Fluorbenzol-Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorbenzol-Nukleoside mit Ausnahme von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der sich die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 255 pm. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 230 pm ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs C sp² -F...H-C sp² . Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auch in den Kristallstrukturen von 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 und 1´-Desoxy- 1´-(2-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 36 werden Fluor-Wasserstoff-Abstände von 255 pm und damit genau der Summe der van-der-Waals Radien gefunden. Nur die Kristallstruktur von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigt keine F...H Wasserstoffbrücken. Diese Struktur weist auch als einzige eine Fischgräten-Struktur auf. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten und HPLC-Retentionszeiten der einzelnen Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Die entschützten Nukleoside wurden nach Standardmethoden für RNA Bausteine in ihre Phosphoramidite überführt. Dabei stellte sich heraus, daß durch eine starke Wanderungstendenz der TBDMS-Gruppe in Richtung 3´-Hydroxylfunktion bei allen fluormodifizierten Nukleosiden das gewünschte 2´-geschützte Isomer nur in niedrigen Ausbeuten erhalten werden konnte. Es konnte gezeigt werden, daß bei Verwendung der neuen TOM-Schutzgruppe dieses Problem gelöst werden kann. Die erhaltenen Phosphoramiditbausteine wurden mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten in Ribonukleinsäure (RNA) eingebaut. Dazu wurden RNA Stränge aus zwölf Nukleotiden mit einer Modifikation in der Mitte synthetisiert und aufgereinigt. Um festzustellen, ob die modifizierten Bausteine Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen ausbilden oder nicht, wurden sie mit allen vier natürlichen Basen gepaart und die erhaltenen 12mer RNA Duplexe mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt und die thermodynamischen Daten errechnet. Dabei stellte sich heraus, daß mehrere der modifizierten Nukleoside kaum zwischen den natürlichen Nukleosiden differenzieren, d.h. das die erhaltenen Schmelzpunkte der RNA Duplexe sich kaum unterscheiden egal mit welcher natürlichen Base die modifizierten Basen gepaart sind. Als beste universelle Basen mit der geringsten Differenzierung und den geringsten Stabilitätsverlusten des resultierenden RNA Duplex haben sich 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose (B) und 1´-Desoxy-1´-(4,6- difluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose (E) herausgestellt. Für weitere Untersuchungen wurden die modifizierten Nukleoside gegeneinander und mit dem abasischen Baustein gepaart. Aus den erhaltenen Daten wurden die Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechselwirkung aller modifizierten Nukleoside bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß ein Einbau einer modifizierten Nukleobase die RNA-Doppelhelix durch fehlende Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen und durch geringere Solvatation destabilisiert. In Gegenzug wird die RNA-Doppelhelix durch verstärkte Basenstapelungswechselwirkungen der modifizierten Nukleobasen stabilisiert. Über alle Effekte betrachtet wird die Doppelhelix durch den Einbau einer der untersuchten Nukleoside destabilisiert. Letztendlich wurden Basenpaare aus zwei modifizierten Nukleotiden gebildet, und zwar immer aus einer Purin analogen und einer Pyrimidin analogen Nukleobase (z.B. 4- Fluorbenzimidazol (D) und 2,4-Difluorbenzol (B)). Aus den berechneten Beiträgen für Solvatation und Basenstapelungswechselwirkungen konnten die erwartenden Schmelzpunkte und freien Enthalpien (betaG 0 ) für diese Basenpaare errechnet werden. Im Falle des Benzimidazol (O)-Benzol (M) Basenpaares war dieser Wert mit dem gemessenen fast identisch (±0,1°C). Für das 4-Fluorbenzimidazol-(D)-2,4-Difluorbenzol-(B) und das 4,6- Difluorbenzimidazol-(E)-2,4-Difluorbenzol-(B) Basenpaar sind die gemessenen Werte allerdings um 0,6°C (0,4 kcal/mol) bzw. 0,9°C (0,6 kcal/mol) höher als die errechneten. Da sich diese Basenpaare von dem Benzimidazol-(O)-Benzol-(M) Basenpaar nur durch die Fluoratome unterscheiden, muß diese Stabilisierung der RNA Duplexe durch Wechselwirkungen des Fluors zustande kommen. Bei dieser Wechselwirkung zwischen zwei modifizierten Nukleobasen könnte es sich um F...H-Wasserstoffbrücken handeln, wie sie auch schon in den Kristallen von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 und 1´- Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribo-furanose 30 nachgewiesen werden konnten. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet ausgehend von den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse werden folgende Untersuchungen angeregt: - Messung von Fluor-NMR-Spektren zur Untersuchung, ob es sich bei den ermittelten Duplex stabilisierenden Kräften um F...H Wasserstoffbrücken handelt. - Verifizierung der ermittelten Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechsel- wirkungen durch Einbau der modifizierten Nukleoside in RNA einer anderen Sequenz. - Synthese der Triphosphate der fluormodifizierten Nukleoside mit enzymatischen Einbauversuchen. - Einbau der als universellen Basen erkannten Nukleoside in Ribozyme mit Test der Enzymselektivität und Enzymaktivität.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die initialen Bewegungsparameter von Ionen bei matrixunterstützter Laserdesorption zu bestimmen, um mit deren Kenntnis das Verständnis des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI zu verbessern. Die Etablierung einer Meßmethode der initialen Geschwindigkeit von Analytionen sowie die Überprüfung verschiedener experimenteller Parameter führten zur Bestimmung einer großen Zahl von Meßwerten der Startgeschwindigkeit von Ionen unterschiedlicher Masse, Ladung und Substanzklasse bei verschiedenen Matrizes und Präparationsbedingungen (siehe Kapitel 5 und 7). Durch Vergleich dieser Meßwerte ist eine Charakterisierung des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI möglich. Aufbauend auf diesen Untersuchungen der Startgeschwindigkeit von Ionen wurde ein Desorptions/Ionisationmodell für MALDI entwickelt (siehe Kapitel 6 und 8). Aus der festen Matrix/Analytpräparation werden durch den Laserimpuls oberhalb einer kritischen Laserbestrahlung geladene Bruchstücke ("Cluster") freigesetzt. Aus diesen Clustern resultiert nach Abdampfen von ungeladenenen Teilchen, wie zum Beispiel Matrixmolekülen, die Freisetzung von Ionen in der Gasphase. Hierbei kann das Modell der Clusterbildung sehr gut mit dem Desorptionsmodell nach Zhigilei (siehe Kapitel 2.4.1.5) verknüpft werden [Zhi97]. Die Cluster verschiedener Größe werden in der sich ausdehnenden Teilchenwolke transportiert. Sie bewegen sich mit der initialen Geschwindigkeit der expandierenden Teilchenwolke. Dieser Vorgang kann mit dem "Mitgerissen werden" der Biomoleküle (entrainment) [Bea91] bei MALDI korreliert werden: So wird beispielsweise beobachtet, daß die mittlere initiale Geschwindigkeit v 0 der Analytmoleküle im Mittel nie höher ist als die der Matrixmoleküle. Die Schwellbestrahlungsabhängigkeit der Ionisation kann weiterhin mit der Schwellbestrahlung der Ablation, d.h. der kollektiven Ablation von großen Partikeln aus der Matrix/Analytpräparation, wie sie von Zhigilei in molekulardynamischen Simulationen gefunden wurde, verknüpft werden. Desorption und Ionisation sind somit nicht getrennt voneinander zu betrachten, da während der Desorption die Freisetzung von Ionen erfolgt. Wenn Peptide und Proteine aus Clustern stammen, besitzen die freigesetzten Biomolekülionen die gleiche mittlere Analytionengeschwindigkeit wie die Matrixneutralen [Dre94]. Für kleine Oligosaccharide werden niedrigere Startgeschwindigkeiten detektiert als für Peptide und Proteine. Das kann darauf zurückgeführt werden, daß diese Ionen nicht als vorgeformte Ionen aus Clustern freigesetzt werden. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten neutralen Oligosaccharide kationisiert und (im wesentlichen) nicht protoniert im MALDIMassenspektrum auftreten und bei höheren Verzögerungszeiten eine verstärkte Kationisierung von Oligosacchariden zu beobachten ist, werden diese Teilchen voraussichtlich nach der Desorption in der Gasphase ionisiert (siehe Kapitel 7 und 8). Da Oligosaccharide in die Matrix DHB eingebaut werden, jedoch Kationen zur Ionisation nicht in den Matrixkristallen zur Verfügung stehen, ist anzunehmen, daß neutrale Oligosaccharide aus Clustern mit der gleichen Startgeschwindigkeit wie Peptide und Proteine in der desorbierten Teilchenwolke vorkommen; ihre Ionisation und damit ihre Detektion ist aufgrund der fehlenden Ladung jedoch nicht möglich. Die Ergebnisse der Startgeschwindigkeit von Ionen bei verschiedenen Präparationen verdeutlichen, daß Gasphasenionisation einer der möglichen Wege der Ionisation neben der Freisetzung von Analytionen aus geladenen Clustern ist. Da auch für Peptide und Proteine Kationisierung in der Gasphase auftreten kann, lassen sich auch langsame Molekülionenspezies experimentell feststellen, was mehrere initiale Geschwindigkeits komponenten und damit auch ein Ionensignal mit unterschiedlichen Komponenten der Startgeschwindigkeit zur Folge hat. Weiterhin sollte auch unterhalb der Schwelle des Analytionennachweises (und damit der kollektiven Ablationsschwelle gemäß dem breathing sphereModell) bei MALDI aufgrund von Verdampfung einzelner Moleküle gefolgt von Ionisation in der Gasphase ein Ionensignal feststellbar sein. Die beobachtete mittlere Startgeschwindigkeit von Analytionen wäre somit eine Mischung aus schnellen, aus Clustern stammenden, und aus langsamen, in der Gasphase ionisierten Teilchen. Eine Komponente kann als prompt ionisierte Komponente mit im wesentlichen massenunabhängiger, konstanter (hoher) initialer Geschwindigkeit verstanden werden. Die zweite Komponente kann durch verzögert auftretende Gasphasenionisation innerhalb des expandierenden Materials erklärt werden, wobei die Analytionen eine geringere Startgeschwindigkeit zeigen. Zusammenfassend (siehe Kapitel 8) wird eine kollektive Ablation von Partikeln und vorgeformten Ionen beim MALDIDesorptionsprozeß gefolgt von Sekundärreaktionen innerhalb der dichten Teilchenwolke in der Gasphase in der selvedgeRegion durch Ionen Molekülreaktionen vorgeschlagen, wie es bereits bei dem precursorModell für Sekundärionenmassenspektrometrie formuliert wurde [Sun88], [Pac85], [Ben83]. Bezogen auf die Auswahl potentieller Matrizes besitzt das Modell nach wie vor nur eine geringe "Voraussagekraft": Ob eine Substanz als Matrix geeignet ist oder ob sie einen hohen bzw. geringen Grad an metastabiler Fragmentierung für zum Beispiel Peptide oder Proteine zeigt, kann weiterhin nur experimentell bestimmt werden, wobei jedoch eine Charakterisierung mit Hilfe der Startgeschwindigkeit möglich ist. Der Zusammenhang eines ClusterDesorptions/Ionisationsmodells mit molekulardynamischen Simulationen nach Zhigilei ermöglicht jedoch eine Beschreibung vieler experimenteller Ergebnisse bei MALDI. Weiterführende Experimente sollen die Verifikation des "ClusterModells" der Ionisation zum Ziel haben. Hier ist insbesondere die Untersuchung des Ladungszustandes von Analytmolekülen in festen Matrix/Analytpräparationen von Bedeutung. Weitere Untersuchungen zur Spektrenqualität bei Matrizes, die keinen Einbau der Analytmoleküle in die Matrixkristalle zeigen, sowie eine eingehende Untersuchung der verschiedenen alternativen Präparationstechniken aus Kapitel 7 sind hierbei geplant.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Methoden für die hochauflösende NMR Spektroskopie entwickelt, um damit native und denaturierte Proteine charakterisieren zu können. Neue Mess- und Anwendungsmethoden für dipolare Kopplungen bilden den Schwerpunkt der Doktorarbeit. Durch die Verwendung von flüssigkristallinen Medien ist es in NMR in Lösung möglich geworden dipolare Kopplungen zu bestimmen. Durch die Projektionen der einzelnen so bestimmten Vektoren auf andere Vektoren im Protein, welche beliebig weit entfernt sein können, kann weitreichende Orientierungsinformationen für die Strukturrechnung von Biomakromolekülen genutzt werden. Dies ist an den Beispielen Ubiquitin, Triggerfaktor und Raffinose in der Arbeit dargestellt. Durch diese Orientierungsinformation kann man auch Teile von Proteinen, wie zum Beispiel Domänen, gegeneinander ausrichten oder die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen nutzen um eine 3D Homologiesuche durchzuführen. Auch dies ist in der Arbeit beschrieben. Die neuen Messmethoden erlauben erstmals die Bestimmung von 1H-1H dipolaren Kopplungen mit Größe und Vorzeichen (JHH-NOESY) und von allen drei dipolaren Kopplungen in einer Seitenkettenmethylgruppe (SPITZE-HSQC). Ein weiterer wichtiger Punkt war die Extraktion dynamischer Parameter aus dipolaren Kopplungen. Der Vektor, der die wechselwirkenden Dipole verbindet, wird von der Dynamik des Proteins beeinflusst. Dadurch ist eine Analyse der Dynamik auf einer Zeitskala bis ca. 10ms möglich (bisher nur bis in den Bereich von ns). Besonders µs Dynamik, welche vorher nicht mittels NMR Methoden sichtbar, kann so dargestellt werden. Aus den dipolaren Kopplungen, welche in 11 verschiedenen Orientierungsmedien gemessen wurden, konnten modellfreie dipolare Ordnungsparameter extrahiert werden. Erstmals konnte zwischen axialsymmetrischen und anisotropen Bewegungen der NH Vektoren unterschieden werden. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass Ubiquitin auf einer Zeitskala oberhalb der Korrelationszeit ähnlich viel Bewegung zeigt wie unterhalb der Korrelationszeit. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 für Bewegungen bis zur Korrelationszeit auf 0.6 für alle Bewegungszeiten. Auch sieht man, dass viele Bewegungen bis zu 60% Anisotropie beinhalten. TOCSY-Sequenzen sind wichtige Bausteine für Moleküle jeder Größenordnung. Hierfür wurden neue adiabatische TOCSY Sequenzen entwickelt, welche TOCSY Spektroskopie bei allen Magnetfeldern mit höherer Intensität erlauben. Wichtig ist auch noch die viel größere Robustheit gegen B1-Inhomogenitäten und Pulsmisskalibrierung. Dipolare TOCSY Sequenzen (MOCCA) erlauben besseren Transfer mittels den zuvor schon erwähnten dipolaren Kopplungen. Durch die Analyse denaturierter Proteine wollte man ein besseres Verständnis dieses Zustandes erzielen. Hierfür wurden Kopplungskonstanten, kreuzkorrelierte und autokorrelierte Raten und chemische Verschiebungen gemessen und mit einem Modell, dem sogenannten Random Coil Modell verglichen. Mit Hilfe dieser experimentellen Daten sieht man erstmals direkt, dass Proteine im denaturiertem Zustand den Winkel zwischen 60° ( -Helix) und 120° ( -Faltblatt) absuchen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen, nicht isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Ziel ist die Aufklärung der Struktur und der biologisch relevanten Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Konkret wird die strukturelle Aufklärung der zweiten KunitzDomäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), TFPI2 beschrieben. Dieses Molekül spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung (Kapitel 2.2) in Säugetieren, in dem es bei kleinsten Verletzungen die Gerinnung unterbindet und so die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des betroffenen Bezirks aufrecht erhält (Kapitel 2.3). Die untersuchte zweite Domäne des TFPI lagert sich direkt und spezifisch an ein zentrales Molekül der Gerinnungskaskade, den Faktor Xa, an. Neben dieser bio logischen Funktion trägt die Entdeckung des TFPI dazu bei, die strikte Trennung der Gerinnung in zwei voneinander unabhängige Reaktionswege bis zur Bildung des Fibrinpolymers aufzuheben. Zur Bestimmung der Struktur des unmarkierten Proteins wurden NMRSpektren aufgenommen. Neben den im Kapitel 3 beschriebenen Standardexperimenten wur den im Rahmen der Untersuchungen das TACSYExperiment in neuer Art und Weise genutzt (Kapitel 4.2), da die Probe ein ungünstige Relaxationseigenschaften auf wies. Mit dem entwickelten Experimenten ist ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Kopplungskonstanten in nichtmarkierten Molekülen nun auch in solchen Proben möglich, da die Güte der abgelesenen Konstanten nicht mehr von der Signalbreite beeinflußt wird. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurde ein neues Experiment zur Bestim mung von 3 J(HNH)Kopplungskonstanten entwickelt. Das SIAMTACSY (Kapitel 4.3), ermöglicht die Bestimmung der Kopplungskonstanten nach der DISCOMe thode, für die bislang die Aufnahme von wenigstens zwei Spektren mit unter schiedlichen Methoden nötig war, mit nur einem einzigen Spektrum. Beide Methoden, SIAM--TACSY als auch die in dieser Arbeit näher beschriebene Me thode, umgehen die Notwendigkeit der Aufnahme verschiedener Spektren mit un terschiedlichen Pulssequenzen und Aufnahmebedingungen. Während SIAM--TACSY mit nur einem Experiment auskommt, dessen Daten durch unterschiedliches Post-Processing alle Kopplungskonstanten liefern, müssen mit der in Kapitel 4.2.2 be schriebenen Methode mehrere Spektren desselben Typs aufgenommen werden. Im Verlauf der Arbeit wurden die Resonanzen von 52 von 58 Aminosäuren eindeu tig und vollständig zugeordnet (Kapitel 3.4). Die Spektren liefern die für die Struk turrechnungen notwendigen Parameter (Kapitel 5). Die berechnete Struktur basiert auf 762 DistanzRestraints, 20 DihedralWinkel des ProteinRückgrats und 15 Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Parameter wurden zunächst in Distance-Geometry-Berechnungen (Kapitel 6.2) eingesetzt. Zur Verfeinerung der Struktur wurde in den späteren Rechnungen das SimulatedAnnealingVerfahren (Kapitel 6.1) genutzt. In einem iterativen Ver fahren werden die gewonnenen Strukturen -- es wurden immer 100 Strukturen gleichzeitig aus einem Parametersatz berechnet -- analysiert und die korrigierten und überprüften Parameter wieder in die Berechnungen eingesetzt (Kapitel 6.3). Die Struktur der zweiten Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor ist durch dieses Verfahren sehr gut definiert, was sich in den Werten der Standardabwei chung für die 10 besten Strukturen für den Backbone (1,4 Å) niederschlägt (Kapitel 6.4). Die so bestimmte Struktur beweist die Annahme, daß es sich bei der zweiten Do mäne des TFPI auch strukturell um einen typischen KunitzInhibitor (Kapitel 2.1) handelt, was durch punktuelle Mutationen im Bereich der reactive site bereits funktionell bewiesen war. Die Stabilität der ProteaseInhibitoren gegenüber Verdau und Entfaltung begründet sich in der kompakten Struktur, die durch 3 Disul fidbrücken stabilisiert wird. Die sechs stets 1 gleichweit voneinander in der Sequenz entfernten Cysteine verbinden N und CTerminus (Cys5 -- Cys55 in der BPTI Numerierung), stabilisieren die reactive site (Cys14 -- Cys38) und binden das zentrale Faltblatt an den Rest des Moleküls. Die für KunitzInhibitoren typische Struktur ist im untersuchten Protein bewahrt; weniger gut definiert ist die in eini gen Inhibitoren dieses Typs zu findenden N-terminale AlphaHelix, sie ist in den Struk turen des TFPI2 lediglich angedeutet. Ein Vergleich der Struktur des TFPI2, so wie es in dieser Arbeit untersucht wurde, und der Struktur eines Homologen findet in Kapitel 6.4.3 statt. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß die strukturelle Untersuchung des kleinen, un markierten Proteins erfolgreich durchgeführt werden kann. Die Struktur des phar makologisch interessanten Moleküls sollte ein Hilfsmittel bei der Auffindung von neuen, den körpereigenen ähnlichen und damit besser verträglichen Gerinnungs inhibitoren sein. Die neuen NMRMethoden bieten ein innovatives Werkzeug zur Gewinnung von skalaren Kopplungskonstanten mit hoher Effizienz und unter Umgehung der Probleme, die in COSYSpektren mit hohen Linienbreiten auftreten.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Obwohl die Kristallstrukturen der CytochromcOxidase aus RinderherzMitochondrien und dem Bodenbakterium P. denitrificans bekannt sind und die Funktionsweise des Enzyms mit Hilfe zahlreicher Methoden bereits intensiv untersucht wurde, wird nach wie vor kontrovers diskutiert, an welcher Stelle im katalytischen Zyklus wieviele Protonen aufgenommen bzw. gepumpt werden und über welchen der beiden Protoneneintrittspfade dies geschieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diesen Fragestellungen mit Hilfe von elektrischen Messungen nachzugehen, um dann ein genaueres Bild von der mechanistischen Funktionsweise des Enzyms zu erhalten. Hierzu wurden Teilschritte des katalytischen Zyklus der CytochromcOxidase aus P. denitrificans genauer untersucht. Dies gelang durch Spannungsmessungen an der schwarzen Lipidmembran mit Ru II (2,2'bipyridyl) 3 Cl 2 (Rubpy) als lichtinduzierbarem Einelektronendonor. Es konnte gezeigt werden, daß ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O nach Lichtanregung ein Elektron von Rubpy auf die Oxidase übertragen und anschließend vom CuA zum Häm a mit einer Zeitkonstanten von » 20 µs transportiert wird. Zeitaufgelöste spektroskopi sche Messungen deuten darauf hin, daß das Elektron auf dem Häm a verbleibt. Die Reduktion dieses Kofaktors führt zu einer Protonenaufnahme über den KWeg mit einer Zeitkonstanten von » 175 µs. Nimmt man an, daß sich Häm a in der Mitte des Dielektrikums befindet (Hinkle und Mitchell, 1970), so deuten die relativen Amplituden der beiden Phasen an, daß etwa 0.8 Protonen aufgenommen werden, in sehr guter Übereinstimmung mit (Capitanio et al., 2000). Aus MehrfachblitzExperimenten unter anaeroben Bedingungen, ausgehend vom OZustand, konnten erste Erkenntnisse über den E ® R Übergang gewonnen werden, nämlich daß hierbei ein Prozeß mit einer Zeitkonstanten von ca. 1.1 ms auftritt und daß sowohl K als auch DWeg an diesem Teilschritt des katalytischen Zyklus beteiligt sind. Da mit der MehrfachblitzMethode aber immer ein Gemisch aus verschiedenen Zuständen entsteht, war es nicht möglich, quantitative Aussagen über die Zahl der transportierten Ladungen zu treffen. Aus diesem Grund wurde eine Möglichkeit gesucht, den EZustand in hoher Ausbeute mit ausreichender Stabilität herzustellen, um dann ein Elektron zu übertragen. Dies gelang durch Darstellung des OxoferrylZustandes F mit Hilfe von H 2 O 2 und anschließende Zweielektronenreduktion durch CO. Die Übertragung von einem Elektron auf den so gebildeten EZustand lieferte 3 Phasen im Spannungssignal mit Zeitkonstanten von » 25 µs, » 200 µs und » 1.5 ms. Die relativen Amplituden dieser Phasen und die Ergebnisse von K und DWegMutanten legen nahe, daß nach Aufnahme des 2. Elektrons vermutlich ein Proton über den KWeg aufgenommen und anschließend 1 Proton über den DWeg gepumpt wird. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, daß bereits während des reduktiven Teils (O ® R) des katalytischen Zyklus ein Proton von der intrazellulären zur extrazellulären Seite transportiert wird und zwar ohne daß unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion stattgefunden haben muß. Erste Experimente zum P ® F Übergang lassen sich so deuten, daß mit Aufnahme des 3. Elektrons ein Proton zum binuklearen Zentrum transportiert und mindestens 1, wenn nicht gar 2 Protonen durch das Enzym gepumpt werden. Hier sind noch weitere Experimente nötig, um die genaue Zahl der transportierten Ladungen und die für die einzelnen Protonenbewegungen verwendeten Protoneneintrittspfade zu bestimmen. Messungen zum F ® O Übergang schließlich zeigten, daß nach dem CuA ® Häm a Elektro nentransfer mit einer Zeitkonstanten von ca. 25 µs vermutlich 1 Proton über den DWeg bis zu den Hämen transportiert (t » 270 µs) und anschließend ein Proton ebenfalls über den DWeg gepumpt wird (t » 1.5 ms). Aus den gewonnenen Daten wurde ein neuer Mechanismus für die Sauerstoffreduktion in der ParacoccusCOX entwickelt. Dieser beruht auf dem von Mitchell und Rich postulierten Elektroneutralitätsprinzip (Mitchell und Rich, 1994) und ist stark an das von Michel vorgeschlagene Modell (Michel, 1998; Michel, 1999) angelehnt. Zur Klärung der Fragen, ob sich bakterielles und RinderzEnzym eventuell in ihrem Mechanismus unterscheiden oder ob nicht eventuell ein Proton während des O ® E Übergangs gepumpt wird (allerdings nur, wenn unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion durchlaufen wurde), sind u.a. noch intensivere Untersuchungen des P ® F Teilschrittes notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 2 verschiedene Kobaltkomplexe auf ihre Eignung als lichtinduzierbare Sauerstoffdonatoren (cagedSauerstoff) für die COX untersucht. Hierbei stellte sich heraus, daß beide Verbindungen ungeeignet sind, da sie entweder instabil sind ((µsuperoxo)bis[pentaammincobalt(III)]) oder Nebenreaktionen mit dem Protein eingehen ((µperoxo)(µhydroxo)bis[bis(bipyridyl)cobalt(III)]). Abschließend wurde der Einfluß von Zn 2 Ionen auf elektrogene Schritte im katalytischen Zyklus genauer erforscht. Es wurde deutlich, daß Zn 2 bakterielle COX von beiden Seiten inhibieren kann, wobei die Bindestelle(n) auf der intrazellulären Seite im Gegensatz zur extrazellulären Seite hochaffin ist/sind. Die elektrischen Messungen deuten darauf hin, daß hierbei sowohl D als auch KWeg blockiert werden, wobei die exakte Position der Metallbindestelle(n) noch zu klären ist.
Zur Untersuchung der Zusammensetzung und Diversität von Bambusameisengemeinschaften (Hymenoptera, Formicidae) sowie ausgewählten Nischenparametern der beteiligten Ameisenarten, wurden auf dem Gelände des Gombak Field Studies Centre (University Malaya, Selangor, Westmalaysia) fünf Haine von Riesenbambusarten (Gigantochloa scortechinii, G. thoii, Bambusoidea) gefällt und abgesammelt. Es wurden Hinweise auf deterministische oder stochastische Strukturierungsmechanismen der Ameisengemeinschaften gesucht. Hierzu wurden verschiedene Fragestellungen anhand der Multiplen Regression untersucht. Zusätzlich wurden Stichproben von Bambusschößlingen und jungen Bambushalmen hinsichtlich der Nutzungsweise und Besiedlung durch Ameisen studiert. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Auswertung auf Hainebene, d. h. der Bambusameisenzönosen als Ganzes betrachtet, vorgestellt. 1. In fünf Bambushainen wurden bisher 66 nistende Ameisenarten aus 21 Gattungen und 6 Unterfamilien identifiziert. Die drei gattungs
Molekulare Charakterisierung und immunologischer Nachweis von porcinen endogenen Retroviren (PERV)
(2001)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Apolipoproteine des Liquors untersucht, um bestehende Zusammenhänge nachzuweisen, die eventuell später bei der Diagnose von Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das ApoE aller Proben wurde phänotypisiert. Die Konzentrationen des ApoJ und Apo(a) wurden mit Hilfe selbst- bzw. in der Arbeitsgruppe entwickelter ELISAs bestimmt. Durch Kombination der existierenden ELISAs konnte der von Borghini et al. 1995 beschriebene LpE-Partikel und ein bisher nicht bekannter Apolipoprotein-Partikel aus Apo(a) und ApoE nachgewiesen werden. Die relative Konzentration dieses Apo(a)/E- und des ApoJ/E-Partikels wurde bestimmt. Mit Hilfe der Kreuzimmunelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die Apolipoproteine Bestandteil eines Partikels sind. Aufgrund der gefundenen Informationen wurde die These postuliert, daß es sich bei diesen Partikeln um einen gemeinsamen Partikel aus ApoE, ApoJ und Apo(a) handelt. Detaillierte Daten über den Aufbau und die Zusammensetzung des Partikels konnten bisher nicht gewonnen werden. Im Liquor wurden die Konzentrationen von ApoE, Apo(a) und ApoJ gemessen. Diese Konzentrationen wurden in Zusammenhang zu dem ApoE-Phänotyp der entsprechenden Probe gesetzt. Wo möglich wurde ApoE und Apo(a) auch im Serum der entsprechenden Patienten bestimmt. Auch diese Konzentrationen wurden in Beziehung zu ihrem ApoE-Phänotyp gesetzt. Zuletzt wurden für die Apolipoproteine E und (a) die Liquor- und Serumkonzentration in Beziehung zueinander gesetzt. Außer für das ApoE und den ApoJ/E-Partikel konnte für keines der untersuchten Apolipoproteine weder im Liquor noch im Serum ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration des Apolipoproteins und dem ApoE-Phänotyp gefunden werden. Zusätzlich zu den Apolipoproteinen des Liquors wurde in Zusammenarbeit mit der Universität Dresden das Tau-Protein gemessen. Die Ergebnisse bestätigen die diagnostische Wertigkeit der Bestimmung von Protein Tau bei degenerativen Erkrankungen des ZNS. Eine Differenzierung zwischen verschiedenen degenerativen Erkrankungen des ZNS ist jedoch nicht möglich. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersuchte die Rolle des ApoE im Gehirn. Dabei zeigte sich, daß die Synthese des ApoE durch die Astrozyten ein sehr komplexer Vorgang sein muß. Eine weitere Untersuchung des ApoE wies die stärkere Glykolisierung im Liquor im Vergleich zum Serum nach.
Die immer länger werdende Verweildauer der türkischen Migranten und die bis vor einigen Jahren ständig ansteigende Anzahl nachgeholter älterer Kinder deuteten schon seit Mitte der achtziger Jahre darauf hin, daß die aufgrund des Anwerbevertrages nach Deutschland eingereisten türkischen Arbeitskräfte nicht mehr zurückkehren werden. Die Hessische Schule reagiert darauf, indem sie die Ziele des MU veränderte und als ein wesentliches Ziel neben der Sprachen und Wissensvermittlung über die Kultur des Herkunftslandes auch das Verstehen der eigenen Situation im Einwanderungsland, die Erschließung des eigenen Umfeldes und die Fähigkeit, darin zu handeln, angibt. (s.a. Kap.IV, 2.) Einer so bedeutsamen Aufgabe gerecht zu werden, ist nur dann möglich, wenn sowohl der Muttersprache der Kinder, als auch dem Lernbereich überhaupt, von Seiten der Administration, den Institutionen und der darin Handelnden, also Schülern und Lehrern, Bedeutung und Wert beigemessen werden und sie Teil der Hessischen Schule sind. Kinder ausländischer Eltern wachsen in der Regel zweisprachig auf. Zweisprachig zu sein, ist ein Faktum, das für das Individuum einen hohen Wert darstellt. In Deutschland wird Zweisprachigkeit nicht immer als etwas Positives gesehen. (Selbst dann nicht, wenn es um eine im eigenen Land gesprochene Sprache geht, wie z.B. das Ostfriesische. Obwohl das Ostfriesische in Ostfriesland die dominierende Sprache ist, sprechen die Eltern mit den Kindern, die in die Schule kommen sollen, zunächst Hochdeutsch, um ihnen den Schulanfang zu erleichtern.) Das Ansehen einer Sprache ist weitgehend davon abhängig, welches 'Prestige' die Sprache hat, aber auch welches soziales Prestige ihre Sprecher haben. Türkisch steht in der Sprachenhierarchie nicht besonders hoch, es gilt als Gastarbeitersprache, ebenso wie das Wort 'Türke' noch immer den typischen 'Gastarbeiter' assoziiert. Dabei wird nicht zur Kenntnis genommen, daß die Zahl derjenigen, die dem Mittelstand zuzurechnen und zu Arbeitgebern auch für Deutsche oder andere Nationen geworden sind, ständig im Steigen begriffen ist. (s.a.Kap.VII, 5.3) Alle Muttersprachlehrer in Hessen sind seit 1970 aus dem Zuwandererpotential eingestellt worden, seit 1972 gibt es keine 'Regierungslehrer' mehr. Der Muttersprachliche Unterricht gewinnt an Wert, wenn seine Bedeutung nicht in Frage gestellt und seine Erteilung als 'normal' angesehen wird. Es war daher wichtig zu erfahren, welchen Wert ihm die Interviewten beimessen. Bei allen Interviewten hat der Muttersprachenunterricht Türkisch einen hohen Stellenwert. Die Anzahl der Schüler, die ihn in Hessen besuchen, übersteigt 70% und liegt damit höher, als in jedem anderen deutschen Bundesland und auch EUStaat. Diese hohe Teilnehmerzahl würde nicht erreicht werden, wenn die Türkei den Unterricht in eigener Verantwortung durchführen müßte, wie es zeitweise im HKM überlegt wird. Die Türkei ist an einer stark nationalbewußten Ethnie in Deutschland interessiert, da diese leichter zu kontrollieren und zu reglementieren ist, und auch weiterhin mit einem Geldtransfer zu rechnen ist. Die türkische Ethnie, so wie der Erziehungsattaché (s.a. Kap.VII, 1.1) sie sich vorstellt, würde Sitten und Bräuche bewahren und durch die soziale Kontrolle würde weniger Zündstoff für die Türkei entstehen. Viele Ereignisse, die die Türkei beunruhigen, haben ihren Ursprung in oder erhalten Unterstützung aus Deutschland. (z.B. das Selbstbewußtsein, das die Kurden und andere Minderheiten entwickelt haben, das Sichbekennen der Aleviten und anderer religiöser Gruppen und das Wiedererwachen unterschiedlicher muslimischer Glaubensrichtungen.) In einer Zeit der Globalisierung und des immer lauter werdenden Rufens nach einem frühen Angebot von Fremdsprachenunterricht, möglichst schon in der Grundschule, ist die Zweisprachigkeit der Kinder ausländischer Eltern neben dem Einfluß, den die Herkunftssprache bei der Identitätsfindung hat, auch eine ökonomische Ressource, die nicht ungenutzt bleiben sollte. Zweisprachigkeit darf allerdings nicht zu einer 'doppelten Halbsprachigkeit' führen, daher müssen die zu erreichenden Ziele in den einzelnen Jahrgängen, klar zu erkennen, die Lehrer kompetent sein, und der Unterricht nicht zur 'Kuschelecke' der Schüler werden. Da der Muttersprachliche Unterricht eine so wichtige Aufgabe hat, muß man sich der Ziele bewußt sein, die vorgegeben werden müssen bei Schülern, die vermehrt deutsche Staatsbürger sein werden. Es kann dann nicht mehr so unterrichtet werden, als sei die Türkei die 'Heimat'. Sie kann nur noch Herkunftsland sein, während das Aufnahmeland zur Heimat werden muß, wenn es das noch nicht ist. Dabei sollen die Bindungen zu dem Teil der Familie, der in der Türkei geblieben ist, erhalten bleiben. Schon jetzt haben die meisten Grundschulkinder ihre Großeltern nicht mehr in der Türkei, sondern in Deutschland. Für die zukünftigen Generationen wird die Türkei zwar immer noch das Land ihrer Herkunft, ein Traumland oder Ferienland sein, aber kaum mehr. Türkische Eltern halten den Besuch des MU für erforderlich, da sie befürchten, daß mit dem Verlorengehen der Sprache auch der Familienzusammenhalt leiden würde, daß Sitten und Gebräuche, auf die sie großen Wert legen, verloren gehen könnten. Sie befürchten, daß durch den Besuch der Schule die Kinder einem gewissen Akkulturationsdruck ausgesetzt sind und daher mehr oder weniger Kulturmuster der Mehrheitsgesellschaft übernehmen. Aus diesem Grunde setzten sich vor allem türkische Mütter für die Einrichtung des Türkischunterrichts auch an Schulen ein, an denen es noch keinen Unterricht gab. (Heute würde es die Aufgabe des Türkischen Elternvereins sein, der sich seit ungefähr vier Jahren gebildet hat.) Diese Sorge führt aber auch dazu, daß türkische Eltern, der zweiten Generation ihre Kinder noch so sozialisieren, wie auch sie selbst sozialisiert worden sind. (s.a. Kap. IV) Sie machen aber insoweit Zugeständnisse, als sie es dulden, daß die Kinder untereinander Deutsch sprechen. Die gleichen Argumente, wie sie von den Eltern für ein Festhalten am MU genannt werden, gelten auch für die Lehrer. Zum einen sind sie selber Eltern und haben damit die gleichen Ängste wie diese, zum anderen ist es ihr Beruf, die Sprache zu lehren und ihrer Meinung nach, die nationale türkische Kultur und damit die entsprechenden Sitten und Bräuche zu vermitteln. Ihre Interessensphäre ist die Erhaltung des Istzustands. Obwohl sie sich bewußt sind, daß nur wenige Schüler in die Türkei zurückkehren werden, vermitteln sie Inhalte in der Regel so, wie sie es gelernt haben und es für die Türkei vielleicht heute noch stimmig ist, jedoch hier nicht ungeprüft weiter gegeben werden sollte. Kultur und Bräuche sind nicht statisch, sondern wandeln sich und passen sich den Gegebenheiten an. "Die Kultur von Migranten unterscheidet sich also von der Kultur des Herkunftslandes, Migranten vollziehen eine kulturelle Transformation, die insgesamt auf die Flexibilität und Veränderbarkeit kultureller Ori entierung hinweist." (Sting,1995: 127) Nur ein einziger Lehrer stellt die Überlegung an, ob es nicht wichtiger sei, sich ab der siebenten Klasse, auf die Sprache Deutsch zu konzentrieren. Wenn Türkisch unbedingt weiter gelernt werden soll, dann im Fremdsprachenunterricht. Während der Erhalt von Sprache, Sitten und Bräuchen immer wieder angesprochen wird, wird die Religion, die bei in der Fremde wohnenden Ethnien meist einen hohen Stellenwert erhält, nur am Rande erwähnt. Nur wenige Lehrer setzen sich für einen Religionsunterricht in der Muttersprache ein, die meisten sind der Meinung, daß man diesen Unterricht auf Deutsch erteilen sollte. Das kann darauf hindeuten, daß man den Unannehmlichkeiten aus dem Wege gehen will, die man beim Erteilen Religionsunterricht in den Vorbereitungsklassen hatte. Denn obwohl der Koran die Grundlage des Glaubens aller Muslime ist, haben doch die verschiedenen sunnitischen Moscheenvereine ihre eigene Ausprägung. Für Aleviten käme ein sunnitischer Religionsunterricht sowieso nicht in Frage. Die Ablehnung des Erteilens könnte aber auch in der laizistischkemalistischen Lehrerausbildung begründet sein, deren Auftrag es ist, die Nation als verbindendes Element darzustellen und nicht den Glauben wie im Osmanischen Reich. (S.a. Schiffbauer, 2000, 47ff) Die Studentin Nurgül stellte erstaunt fest, daß im Muttersprachlichen Unterricht Religionsbücher ausgeteilt wurden. Die hohe Wertschätzung und die Unverzichtbarkeit, die auch auf deutscher Seite der Muttersprache Türkisch zugestanden wird, hat nicht dazu geführt, den MU wie ein 'normales' Fach zu behandeln. Den Schulleitern ist es bisher nur selten gelungen, den Unterricht so in die Stundentafel zu integrieren, daß er nicht als Anhängsel oder gar als eigenständige Schule empfunden wird. Schulleiter und Kollegien haben es auch nicht erreicht, dem türkischen Lehrer das Gefühl von Zweitrangigkeit zu nehmen. Am besten ist die Einbindung der Lehrer noch in den Grundschulen gelungen, wenn versucht wird, den Unterricht der ersten beiden Schuljahre in den Vormittag zu legen. Aber schon im dritten und vierten Jahrgang wandert er in der Regel wieder in den Nachmittag. Es gibt auch immer noch Schulen, in denen nicht einmal die Raumfrage so gelöst worden ist, daß türkische Lehrer sich nicht diskriminiert fühlen müssen. (s.a. Kap. VIII, 5.4) Wiederum ist es die Grundschule, deren Schulleiter die meisten Kenntnisse über die Inhalte haben, die im MU vermittelt werden, z. T. weil an einigen Schulen das Projekt KOALA durchgeführt wird, z.T. durch die Beschwerden von Eltern über die vermittel ten Inhalte. Selbst da, wo deutsche Lehrer zu den am Vormittag unterrichtenden türkischen Kollegen ein freundschaftliches Verhalten entwickelt haben, kennen eher die türkischen Lehrer die im Regelunterricht durchgenommen Inhalte, als umgekehrt. Dabei wäre für beide Lehrergruppen die Informationsbeschaffung mit wenig Mühe verbunden, da es für jedes Fach Rahmenpläne gibt und jeder Lehrer, auch der türkische, daraus den Stoffverteilungsplan in deutscher Sprache für das laufende Schuljahr erstellen muß. Beide Lehrergruppen würden die Effizienz des Unterrichts steigern können und mehr von einander erfahren, was zum Abbau von Vorurteilen und zur besseren Einsicht in die Vorhaben des anderen führen würde und vielleicht zu gemeinsamen Projekten. Aufgrund der Rahmen und Stoffverteilungspläne müßten aber eigentlich auch die Schulleiter wissen, was im MU gelehrt wird, denn sie erhalten diese Pläne. Man braucht also nicht erst bei Prüfungen zu erfahren, daß die Inhalte sehr national sind und somit nicht unserem Verständnis von Unterricht entsprechen. Die meisten Schulen werden zwar von einer Vielzahl ausländischer Nationalitäten besucht, in der Grundschule im Ostend sind es über hundert, nicht alle erhalten aber Muttersprachlichen Unterricht. Nach dem Zerfall von Jugoslawien dürften es inzwischen fünfzehn verschiedene Nationen sein, die Muttersprachlichen Unterricht als Fach erhalten. (Den anderen Ethnien werden nur die Räume zur Verfügung gestellt, für den Unterricht hat die eigene 'community' zu sorgen.) Das heißt, die Klassenlehrerin müßte zu so vielen Muttersprachlehrern Kontakt aufnehmen, wie sie Kinder aus den Anwerbeländern in ihrer Klasse hat. Daher kennt zwar jeder Klassenlehrer die Fachlehrer, die Lehrer des Muttersprachenunterrichts sind an Schulen, die keine Stammschulen sind, aber nur wenig bekannt. Ich habe mit Lehrern des Regelunterrichts gesprochen, die nicht wußten, ob es an ihrer Schule überhaupt Muttersprachenunterricht gibt. Man sieht die Lehrer höchstens bei den Notenkonferenzen, die zweimal im Jahr stattfinden. Dabei sind die Noten des MU versetzungsrelevant, d.h. sie tragen zur Versetzung des Schülers bei. Muttersprachlehrer hingegen unterrichten wiederum mehrere Klassen an verschiedenen Schulen und kennen daher auch nicht alle Klassenlehrer. Die Interviews mit den vierundzwanzig Schülern und Studenten zum Muttersprachlichen Unterricht ergibt, daß die meisten Schüler den Unterricht wie ein Fach unter anderen empfinden, ein bißchen unbequemer, weil er am Nachmittag stattfindet und in einer anderen Schule, aber oft mit dem Vorteil, keine Aufgaben machen zu müssen. Nur die Realschulgruppe empfindet die Atmosphäre des MU anders und angenehmer als diejenige im Regelunterricht. Sie rechnet dies nicht nur der Tatsache zu, daß der MU nur von Schülern gleicher Nationalität und Mentalität besucht wird, sondern findet, daß auch die Gruppengröße dabei eine Rolle spielt. Die interviewten Schüler sind sich dessen bewußt, daß sie, allein aufgrund der anders verlaufenden Familiensozialisation, einen beträchtlichen Anteil mehr an Leistungen erbringen müssen als die anderen Schüler, um den Anforderungen der Schule gerecht zu werden. Es ist ihnen aber auch bewußt, daß sie der sozialen Kontrolle, gleich ob sie von der Familie, den Verwandten oder der eigenen Ethnie ausgeübt wird, am besten durch eine gute Bildung begegnen können. Eine gute Bildung und Ausbildung macht sie in ihrem Verhalten freier und sicherer und die Kontrollorgane toleranter. Sie können leichter selbst bestimmen, was sie tun und wie sie handeln wollen. Eine entscheidende Rolle spielt im Leben eines jeden Kindes der Schulanfang, der daher auch ein Schwerpunkt meiner Befragung war. In jeder Gesellschaft besteht das Leben eines Individuums aus verschiedenen zeitlichen Abschnitten, die durchlaufen werden. Die Übergänge von einem Lebensabschnitt zum anderen werden von besonderen Riten begleitet. Sie kennzeichnen das Verlassen der einen Gruppe, eine Zeit der Diffusion und die Aufnahme in die neue Gruppe. So werden aus den Kindergartenkindern nach dem fünften Lebensjahr die Vorschulkinder, denen besondere Rechte eingeräumt werden. In dieser Zeit dürfen sie schon einmal allein und ohne Aufsicht in einem Raum spielen und besuchen besondere Kurse, an denen die jüngeren Kinder nicht teilnehmen dürfen. Aus den Vorschulkindern werden die Schulkinder, die mit einer Schultüte begrüßt, langsam an das Leben in der Schulgruppe gewöhnt werden. (s.a. v. Gennep,1986) Schulanfänger müssen die eigenen Vorstellungen mit den Ansprüchen, Erwartungen und Forderungen des Lehrers und der gleichaltrigen Gruppe in Einklang bringen. (Petillon, 1984: 3) Die Erfahrung der Außenbestimmung durch eine neue Zeiteinteilung, neue Anforderungen an Konzentration und Feinmotorik ist zwar für alle neu, für Kinder aber, die aus Familien mit anderen Sozialisationsvorstellungen und ohne Kindergartenerfahrung in die Schule kommen, besonders bedeutend. Ich nahm daher an, daß in dieser Phase der Muttersprachliche Unterricht bei der Integration besonders hilfreich sein würde, was nur von ganz wenigen Schülern bejaht wurde.. Obwohl die Gymnasialschüler berichten, daß die türkische Familie nicht auf die Schule vorbereiten würde, sprechen nur zwei Schüler davon, daß sie den MU in dieser Zeit als hilfreich empfunden hätten. Fatime erinnert sich daran, ihn als beschützend und warm, Mohammed als integrierend und anerkennend empfunden zu haben. Die anderen können sich an nichts Besonderes erinnern. Die meisten haben den MU von Anfang an besucht und halten ihn eher für diejenigen türkischen Kinder wichtig, die erst kurz vor Schulbeginn nach Deutschland kommen. Kinder, die in der Türkei mit der Schule begonnen haben und hier die Klasse wiederholen mußten, weil sie kein Deutsch konnten, empfanden diese Maßnahme als diskriminierend. Diejenigen, die hier aufgewachsen sind, halten den Besuch eines Kindergartens für sich persönlich, aber auch für die anderen türkischen Kinder für wesentlich und bringen ihren Schulerfolg damit in Zusammenhang. Dabei erwähnen sie auch die Vorklasse, die bei fehlendem Besuch des Kindergartens, wegen der späten Einreise, besucht werden sollte. (Leider halten türkische Eltern oft nicht viel vom Kindergarten und noch weniger von der Vorklasse. (s.a. Kap. II, 2.5) und wehren sich dagegen. Eine wichtige Funktion haben die im MU vermittelten Inhalte. Vielen Probanden sind neben Liedern und Spielen die gemeinsamen Feiern in Erinnerung geblieben. Es werden vor allem die nationalen türkischen Feste begangen, obwohl im Rahmenplan für die Grundschule nur die religiösen Feiertage: das Opferfest (Kurban Bayrami) und das Zuckerfest (Seker oder Ramazan Bayrami) und als nationaler Feiertag der 23. April, das Kinderfest, vorgesehen sind. Bei den nationalen Feiern haben sich die Eltern sehr engagiert, sowohl die Eltern als auch Schüler erwähnen dies in ihren Interviews. Man schmückte die Klasse und richtete eine AtatürkEcke ein mit Bildern, Sprüchen und Fähnchen. Eine türkische Lehrerin bedauert, daß jetzt an den Feiertagen für die Kinder schulfrei ist und man nicht mehr zusammen feiern kann. Weil die Eltern arbeiten, verlieren die Tage für die Kinder viel von ihrer Bedeutung. An die folgenden nationalen Feiertage erinnern sich alle: An den 23. April, die Eröffnung der Nationalversammlung, diesen Tag hat Atatürk den Kindern zugedacht, den 19. Mai, den Beginn des Widerstands gegen Engländer, Franzosen, Italiener und Griechen und den 29. Oktober, den Tag, an dem die Republik ausgerufen wurde. Analysiert man den Inhalt der Interviews, so stößt man immer wieder auf folgende Aussagen: Wir haben die Geschichte der Republik Türkei kennengelernt (milli tarih) mit den Befreiungskämpfen, den nationalen Feiertagen, die daraus resultieren, die Reformen Atatürks, seine Aussprüche, die Nationalhymne, den Schülereid (s. Fußnote 26) und zwar von der ersten Klasse an. Selbst die Achtung, die dem Lehrer gezollt wird, wird durch die nationale türkische Erziehung verstärkt, denn die Lehrer stehen anstelle von Atatürk, dem Oberlehrer der Nation. Die interviewten, aber auch andere türkische Lehrer, mit denen ich gesprochen habe, unterrichten diese Inhalte ohne zu überlegen, daß sie Schüler unterrichten, deren Eltern zum Teil schon nicht mehr in der Türkei geboren sind und die wahrscheinlich nicht mehr in der Türkei leben werden. Die Lehrer nehmen es den Schulleitern übel, wenn diese sie darauf hinweisen, daß keine Fahne und kein Atatürkbild aufgehängt werden soll, weil dies nicht gewollt und Ähnliches in der Regelklasse auch nicht praktiziert wird. Der Politologiestudent weiß, daß die Deutschen die Verehrung von Atatürk als Personenkult abtun, er versteht es jedoch als etwas anderes und ist stolz auf die türkische Geschichte, die auch ein Teil seiner Geschichte ist und mit der er sich identifiziert, obwohl er, von den Ferien abgesehen, sein Leben in Deutschland verbracht hat. Ähnlich drücken es auch die Realschüler aus, die ebenso stolz auf ihre nationale Geschichte und das türkische Militär sind. Der Student meint zudem, daß deutsche und türkische Lehrer voneinander lernen können. Vor allem sollen die deutschen Lehrer die Achtung der Schüler einfordern, die auch den türkischen Lehrern entgegengebracht wird. Sie hätten ebenso ein Recht darauf, denn sie geben ihr Wissen den Schülern und dafür schulden ihnen die Schüler 'Achtung'. Die Achtung, die die Schüler ihren türkischen Lehrern entgegenbringen, indem sie sich diszipliniert verhalten, fällt der Lehrerin der Integrierten Gesamtschule wie auch dem Realschulrektor auf, der von einem sehr ordentlichen Unterricht spricht und damit auch einen störungsfreien meint. Wie unterschiedlich auch der Unterricht von den einzelnen Schülern empfunden wurde, alle sagen, daß sie ohne ihn nicht ein so gutes Türkisch sprechen und schreiben würden. Das Türkisch, das zu Hause gesprochen wird, beschränkt sich im wesentlichen auf die Alltagssprache und ist dazu oft ein Dialekt. Der Politologiestudent bedauert, daß es ihm trotz MU nicht möglich ist, die Zeitung ohne Wörterbuch zu lesen, und daß er nicht in die neuere Literatur eingeführt worden ist. In der Sekundarstufe I wird kaum zeitgenössische Literatur vermittelt, weil sie nicht mehr unkritisch ist und daher in die türkischen Schulbücher der Oberstufe nur selten Eingang gefunden hat. Bis in den achtziger Jahren sagt Sprache auch etwas über die politische Richtung aus, der man angehört. Wer von den Lehrern als links und progressiv gelten will benutzt vorwiegend den vom 'Türk Dil Kurumu' erarbeiteten Wortschatz, während die Konservativen sich auch der osmanischen Wörter bedienen. So gibt es oft lang anhaltende Streitigkeiten, welches Wort in die Unterrichtsmaterialien Eingang finden soll. Die politischen Richtungskämpfe, die sich in der Türkei abspielten, reichten also bis in den Muttersprachlichen Unterricht in Hessen. Heute gebrauchen die meisten Türken und damit auch die türkischen Lehrer die Sprache viel unbekümmerter und lassen sowohl das eine als auch das andere Wort gelten. Da vor allem die Zeitungen wieder osmanische Wörter verwenden, werden die Angehörigen der jüngeren Schülergeneration sie auch wieder lernen. Den älteren Schülergenerationen aber sind sie nicht so geläufig. Auffallend ist, daß die Schüler nur ganz selten den Ausdruck Muttersprachlicher Unterricht benutzen und eher vom Fach Türkisch spreche, die Gymnasialschüler sogar von der 'Fremdsprache' Türkisch, für die sie genauso hart arbeiten müssen, wie für jede andere Fremdsprache. In den Augen der Schüler hat der Muttersprachliche Unterricht Türkisch den gleichen Stellenwert wie jede andere Fremdsprache. Die IGS Lehrerin spricht davon, daß der MU an Wert gewonnen habe, seitdem der Modellversuch 'Türkisch anstelle der zweiten Fremdsprache' an ihrer Schule eingerichtet wurde. Die Frage, ob im MU auch die Situation der türkischen Eltern und ihrer Kinder in Deutschland angesprochen worden ist, wird nur von einer einzigen Schülerin bejaht. Sie sagt, daß ihr MULehrer auch Vergleiche zwischen der Türkei und Deutschland gezogen habe. Türkische Lehrer meinen, daß es schwierig sei, die hiesigen türkischen Kinder zu unterrichten, weil sie aus den unterschiedlichsten Gegenden der Türkei stammen und damit auch unterschiedliche Sitten und Gebräuche mitbrächten. Sie sprechen aber nicht davon, daß sie im Unterricht auch die hiesigen Sitten und Gebräuche thematisiert haben. Eine Ausnahme bildet dabei der Nikolauskult. Der Hlg. Nikolaus, der im vierten Jahrhundert Bischof von Myra, dem heutigen Demre (Türkei) war, schlägt eine Brücke zwischen der Türkei und dem Christentum und nimmt so heute eine Art Alibifunktion im MU für die deutschen Feste wahr. Dabei gäbe es keine Schwierigkeiten, türkischen Schülern auch andere deutsche Feste vom Koran her zu erklären. Den Berichten der interviewten Lehrer und Schüler zufolge kann darauf geschlossen werden, daß die eingangs zitierte Aufgabenstellung des MU, die Erschließung des Umfeldes, in dem die Schüler leben, das Verstehen der eigenen Situation und die Fähigkeit darin zu handeln, nur ansatzweise oder wenig beachtet wird. Ein weiterer Punkt, der über die Integration Auskunft geben kann, ist die Frage nach Freunden und Freundinnen der Probanden. Nur eine einzige Probandin hat noch und alleinigen Kontakt zu den Mitschülerinnen des MU. Eine andere steht in lockerem Kontakt zu einer ebenfalls studierenden Mitschülerin aus dem MU, wobei die Tatsache, daß beide das Abitur gemacht haben und sie zusammen zum Gymnasium fuhren, eine wesentliche Rolle spielen dürfte. Alle anderen haben keine Verbindung mehr zu ihren früheren Schulkameraden des Muttersprachlichen Unterrichts. Selbst die beiden Brüder, die den MU noch besuchen, haben außerhalb des Unterrichts keinen Kontakt diesen Mitschülern. Aus dem Rahmen fallen nur die Realschüler, sie haben wesentlich mehr Kontakt untereinander, zu ihren türkischen Mitschülern und anderen türkischen Jugendlichen als die anderen Interviewten. Zwei Mädchen haben fast nur türkische Freundinnen, eines bewußt, da sie sich von ihnen am besten verstanden glaubt, während das andere meint, daß es sich 'so' ergibt. Zwei andere dagegen sprechen von 'besten' Freundinnen, die keine Türkinnen sind und die sie schon vom Kindergarten und von der Schule her kennen. Die Interviews haben gezeigt, daß eine Integration der Probanden in die Hessische Schule, zwar unterschiedlich, aber im allgemeinen erfolgt ist. Dies ist allerdings nicht ein besonderes Verdienst des Muttersprachlichen Unterrichts. Am sichtbarsten wird die Integration bei den Gymnasialschülern und Studenten. Der Grad von Integration läßt sich auch aus den Kurzfragebögen erkennen. Von den sechzehn Schülern beider Gruppen bezeichnen sich vierzehn als Türken aus Deutschland, nur zwei bezeichnen sich nur als Türken. Beide Gruppen fühlen sich in ihrer Klasse und Schule wohl. Dabei ist die Aussage der Gymnasialschüler höher zu bewerten als die de Realschüler, da sie aus drei verschiedenen Schulen kommen. Acht von neun Schülern wollen ihre Ausbildung in Deutschland machen, nur einer in der Türkei. Wobei noch zu bedenken ist, daß eine Ausbildung, z.B. ein Studium in der Türkei kürzer und billiger ist. Durch die Neuregelung des Staatsangehörigkeitsrechtes zum 1.1.2000 erhalten alle in Deutschland geborenen ausländischen Kinder zu der Staatsangehörigkeit ihrer Eltern auch die deutsche bis zu ihrer eigenen Entscheidung für eine der beiden, spätestens im 23. Lebensjahr. Bis dahin sind sie Deutschtürken oder türkische Deutsche. Das heißt, in sechs Jahren kommen die Kinder türkischer Eltern, als Deutsche in unsere Schulen. Kann dann der MU oder das Fach Türkisch, von allen als notwendig angesehen und auch gewünscht, in der gleichen Art und unter den gleichen Bedingungen unterrichtet werden wie bisher? Wenn dem nicht so ist, muß damit begonnen werden, Lehrer mit einer anderen Ausbildung einzustellen, bzw. diejenigen, bei denen es möglich ist, weiterzubilden. Die Veränderung der Einstellungspraxis ist bereits überfällig. Zu Beginn der neunziger Jahre, aber spätestens bei Einrichtung des Modellversuchs 'Türkisch anstelle der zweiten Fremdsprache' hätten nur noch türkische Lehrer mit einer Universitätsausbildung eingestellt werden dürfen. Die Lehrer, die das alte Grundschullehrerdiplom der Türkei haben, können in Deutschland nicht an der Universität weitergebildet werden, da ihre Gesamtausbildungszeit kürzer ist, als hier die Zeit bis zum Abitur. Türkische Lehrer mit Universitätsausbildung dagegen könnten ein Zusatzstudium absolvieren. Für die deutschen Schulanfänger türkischer Herkunft braucht man Lehrer, mit einer Ausbildung, die derjenigen der Lehrer im Regelunterricht entspricht, d.h. daß sie mindestens für zwei Fächer ausgebildet sein müssen. Ein Lehrer, der zwei Fächer studiert hat, braucht nicht mehr an verschiedene Schulen zu gehen, da er außer Türkisch das zweite Fach in den Regelklassen unterrichten kann. Die Situation für eine entsprechende Lehrereinstellung ist in der nächsten Zeit recht gut, da im Laufe von zehn Jahren der größte Teil der bis 1980 eingestellten Lehrer in Rente geht. Die Fachberaterin für den MU Türkisch verlangt, daß für das Fach Türkisch gut Deutsch sprechende Lehrer, nach Möglichkeit mit einem Studienabschluß einer deutschen Universität, einzustellen sind. Es gibt bereits jetzt Lehrer und Diplompädagogen türkischer Herkunft, die zweisprachig sind. Beide Gruppen brauchten nur ein relativ kurzes Zusatzstudium, um den oben genannten Bedingungen zu entsprechen. Daneben gibt es seit 1998 die Absolventen der Gesamthochschule Essen, die ein entsprechendes Lehrerstudium mit dem Fach Türkisch durchlaufen haben. Schon jetzt gibt es eine Anzahl von Schulen, die, bedingt durch die Globalisierung, der Forderung nach früher Zweisprachigkeit durch Einführung nach Frühenglisch oder Frühfranzösisch nachgekommen sind. Im Laufe der Zeit wird die Einführung sicherlich flächendeckend erfolgen. In der Grundschule könnte dann die Sprache Türkisch entsprechend dem erteilten Frühenglisch oder Frühfranzösisch im Stundenplan stehen. Lehrerin B. sagt: "Warum sollen diese Kinder Frühenglisch lernen, wenn sie doch schon eine andere Sprache mitbringen". Der Ministerialrat spricht davon, daß die fremde Herkunftssprache auch einen ökonomischen Wert habe, man muß also nur den vorhandenen Wert nutzen. In den Ballungsgebieten ist Frühtürkisch, das die mitgebrachten Sprachkenntnisse berücksichtigt, anstelle des bisherigen MU durchaus denkbar. Unter Umständen muß man dabei auch eine Art Mittelpunktschulen einplanen. An diesen Schulen könnte mit der Alphabetisierung z. B. nach dem KOALAModell (s.a. Kap.VII, 2.) gearbeitet werden. In der Sekundarstufe sollte man schon jetzt überlegen, in welcher Weise auch der Computer für den Muttersprachlichen Unterricht zu nutzen ist. Gerade in Gegenden, in denen nur wenige türkische Kinder wohnen, bietet sich sein Einsatz an. Die in Hessen vorgeschriebene Sprachenfolge, daß Englisch, wenn nicht erste, so doch mindestens zweite Fremdsprache sein muß, wird durch das Frühtürkisch nicht tangiert, denn als nächste Fremdsprache müßte dann Englisch gelernt werden. Es wäre gut, wenn die Institution Schule auf dem Gebiet der Einbeziehung der Minderheitensprache Türkisch feste Vorstellungen hätte, ehe alle Schüler türkischer Abstammung bei Schuleintritt die deutsche Staatsangehörigkeit besitzen. Die dargelegten Überlegungen haben den Vorteil, daß Türkisch als ein den anderen Fächern gleichwertiges Fach der Hessischen Schule angesehen würde, in den Stundenplan integriert und nicht mehr Anhängsel oder Schule des Herkunftslandes. Die Lehrer wären hessische Lehrer, was sie formal schon seit fast 30 Jahren sind, in Deutschland ausgebildet, im Kollegium integriert und als gleichwertig akzeptiert. Mit einem Unterricht in der genannten Form würde der Sprache Türkisch, deren Sprecher zu der größten Minderheit in Deutschland zählen, der Raum und die Bedeutung zuerkannt, die ihr aufgrund ihrer Größe zustehen. Es gibt auch keinen Zweifel daran, daß die Zahl der Einwohner türkischer Abstammung in den nächsten Jahren, vielleicht Jahrzehnten, allein aufgrund der heutigen demographischen Daten noch steigen wird. Wie schon erwähnt, reisen jedes Jahr 30.000 türkische Ehepartner in Deutschland ein, ist die Geburtenrate höher und die Anzahl der jüngeren Frauen im reproduktiven Alter prozentual größer als bei der deutschen Bevölkerung. Mit einem Unterricht, der sich an die Rahmenrichtlinien hält und mit Hilfe der in diesem Sinne ausgebildeten Lehrer werden die Deutschtürken nicht nur von den Verdiensten ihrer Vorfahren in der Türkei erfahren, sondern auch von denen ihrer Elterngeneration, die, sei es als Arbeitnehmer, Arbeitgeber, Künstler, Schriftsteller oder Politiker hierher gekommen sind. Es sollen junge Menschen heranwachsen, die sich "nicht vom türkischen Ministerpräsidenten erklären lassen, wen wir in Deutschland wählen sollen oder nicht". (Özdemir, 1999: 13). Sie werden "Bürgerpflichten und Grundstrukturen und Prinzipien wahrnehmen (Wahlrecht, Zivildienst, Wehrdienst). Erst wenn sich der Einzelne als Teil der Gesellschaft empfindet, können sie angemessen ihren Beitrag leisten."
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ausgewählte Gruppen der Dekapoden (brachyure Krabben, Einsiedler und Porzellankrebse) des PersischArabischen Golfes und des Golfes von Oman taxo nomischfaunistisch zu erfassen, eine Abschätzung des Artenreichtums und der Faunenzusam mensetzung vorzunehmen und die zoogeographischen Beziehungen innerhalb der Golfregion und zu anderen Teilen des westlichen Indischen Ozeans zu analysieren. Die Dekapodenfauna der Golfregion war -- im Gegensatz zur sehr viel besser untersuchten des Roten Meeres -- bislang Gegenstand vergleichsweise weniger wissenschaftlicher Arbeiten, und der faunistischtaxonomische Kenntnisstand stellte sich als entsprechend lückenhaft dar. Dies erwies sich einerseits als Problem bei der Beurteilung des Zustands von Lebensgemeinschaften und Folgeschäden nach der Ölkatastrophe von 1991, andererseits als Hindernis für Faunen vergleiche und zoogeographische Studien. Um vor allem die bislang wenig bearbeiteten eulitoralen Lebensräume wie Watten und Man groven, aber auch Korallenriffe, intensiv zu beproben, wurden Sammelreisen in verschiedene Teile des PersischArabischen Golfes und den Golf von Oman durchgeführt. Daneben wurde umfangreiches Museumsmaterial der bedeutenden Sammlungen aus der Golfregion taxonomisch untersucht, mit Material aus anderen Regionen verglichen und neu bewertet. Insgesamt konnte für den PersischArabischen Golf das Vorkommen von 188 Arten brachy urer Krabben, 20 Pagurideen (Einsiedlerkrebse) und 18 Porcellaniden (Porzellankrebse) eindeutig belegt werden; 43 Arten (37 Brachyuren, 4 Pagurideen und 2 Porcellaniden) wurden erstmals für den Golf nachgewiesen. Bei 11 dieser Neunachweise handelt es sich um bislang unbeschriebene Arten. Ein faunistischer Vergleich zu anderen Teilen des Indischen Ozeans zeigt, daß der Golf für die untersuchten Taxa insgesamt deutlich artenärmer als das Rote Meer oder die ostafrikanische Küste ist. Dies ist vor allem auf die geringere Ausdehnung und schlechtere Entwicklung von Korallenriffen sowie das Fehlen von Tiefwasserhabitaten, aber auch auf das Vorherrschen extre mer ökologischer Bedingungen in weiten Teilen des Golfes zurückzuführen. Zwischen verschie denen systematischen und ökologischen Gruppen bestehen allerdings große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums. Während hartboden und korallenassoziierte Gruppen im Golf deutlich unterrepräsentiert sind, findet sich bei weichbodenbewohnenden Taxa eine vergleichs weise artenreiche Fauna. Besonders auffallend ist dabei der Artenreichtum der eulitoralen Ocypodidae, die mit 23 Arten im Golf eine weitaus höhere Artendiversität erreichen als im Roten Meer oder an der ostafrikanischen Küste und gemeinsam mit den ebenfalls vorwiegend in der Gezeitenzone leben den Grapsiden einen Schwerpunkt der Arbeit bildeten. Innerhalb der Golfregion zeigten sich für diese Familien große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums und der Faunenzusammen setzung. Die Wattgebiete und Mangroven des nördlichen und des südöstlichen PersischArabi schen Golfes sowie des Golfes von Oman fallen dabei durch ihre sehr diverse Fauna auf. Stark verarmt ist dagegen die eulitorale Fauna des südwestlichen und westlichen Teils des Persisch Arabischen Golfes. Der Grund für diese Verarmung ist dabei vor allem im hohen Salzgehalt des küstennahen Wasserkörpers zu sehen. Die Ergebnisse der faunistischtaxonomischen Auswertungen ermöglichten eine zoogeogra phische Analyse, bei der die Dekapodenfauna sowohl auf ihre Homogenität innerhalb der Golf region, als auch auf ihre Beziehungen zu der aus anderen Teilen des Indischen Ozeans untersucht wurde. Hierzu wurden Endemismusraten und Verbreitungsmuster der aus dem Golf nachgewie senen Arten betrachtet sowie Faunenähnlichkeiten mit Hilfe multivariater statistischer Methoden analysiert. Zoogeographisch stellt sich die Dekapodenfauna der Golfregion als Mischung unterschied licher zoogeographischer Elemente dar. Dies reflektiert die Lage des Golfes am Übergang zwischen westlichem Indischen Ozean und indischer bzw. indomalaiischer Region. Die Endemis musraten liegen bei 6 % für Porcellaniden, 7 % für Brachyuren und rund 10 % für Pagurideen. Für keine der Gruppen läßt sich daraus eine Begründung für eine eigene Faunenprovinz oder ein Endemismuszentrum ableiten. Neben den Endemiten beinhaltet die Fauna Arten unterschied licher geographischer Beziehungen. Den größten Anteil stellen weit verbreitete Arten, die je nach Gruppe zwischen der Hälfte und zwei Dritteln der im Golf vorkommenden Arten ausmachen. Für die Einsiedlerkrebse sind daneben vor allem Arten aus dem Roten Meer und dem Golf von Aden von Bedeutung, was auf eine enge Beziehung der Pagurideenfauna zu diesen Gebieten hin weist. Dagegen sind für die Brachyuren indopakistanische und indomalaiische Arten von weit aus größerer Bedeutung, was eine größere Ähnlichkeit der Krabbenfauna zu der Pakistans und Indiens andeutet. Innerhalb der Golfregion ergaben sich für die Brachyurenfauna, insbesondere für Ocypodi den, deutliche Unterschiede hinsichtlich der zoogeographischen Beziehungen. Während der von östlichen Faunenelementen dominierte nördliche und östliche Golf kaum westliche Faunen elemente aufweist, stellen diese im südlichen Golf und vor allem im westlichen Teil des Golfes von Oman einen erheblichen Anteil an der Gesamtfauna. Getrennt werden diese beiden Gebiete durch die Bereiche des südlichen und westlichen Golfes, in denen die extrem hohen Salzgehalte eine wirksame Verbreitungsbarriere darstellen. Zumindest für einige Taxa ist demnach die Golf region nicht als einheitliche faunistischzoogeographische Region zu betrachten. Während der nördliche und östliche Teil des PersischArabischen Golfes zoogeographisch eng mit Pakistan verbunden sind, zeigen sein südlicher Teil und der westliche Golf von Oman engere Beziehungen zum Golf von Aden und dem Roten Meer. Aufgrund der vergleichsweise guten Dokumentation der Faunenzusammensetzung in ver schiedenen Teilen des Indischen Ozeans ließ sich für Ocypodiden und Grapsiden ein überregio naler Faunenvergleich mit Hilfe multivariater Analysenmethoden durchführen und eine zoogeo graphische Unterteilung des Indischen Ozeans vornehmen. Innerhalb des westlichen Teils des Indischen Ozeans lassen sich dabei drei Regionen aufgrund ihrer Faunenähnlichkeit voneinander abgrenzen. Dies sind -- eine ost/südostafrikanische Region, die von der Nordostküste Südafrikas bis nach Somalia reicht -- eine west/südarabische Region bestehend aus Rotem Meer, Golf von Aden, der südarabi schen Küste und dem westlichen Golf von Oman, die auch in den südöstlichen Persisch Arabischen Golf hineinzieht -- eine ostarabischpakistanische oder iranischpakistanische Region, die den nördlichen und östlichen Teil des PersischArabischen Golfes, den östlichen Golf von Oman sowie Pakistan und Nordwestindien umfaßt Hinsichtlich der Besiedlungsgeschichte des PersischArabischen Golfes zeigen die Ergebnisse, daß eine Besiedlung durch eulitorale Krabben zum größten Teil von der indischen Seite aus entlang der iranischen Küste stattgefunden haben muß, während später eingewanderte westliche Elemente aufgrund der massiven Salinitätsbarriere und der Strömungsverhältnisse auf den süd östlichsten Teil beschränkt blieben. Vor allem die Gezeitenzonen des PersischArabischen Golfes weisen teilweise sehr diverse Lebensgemeinschaften auf, deren Artenzusammensetzung in ihrer Mischung unterschiedlicher zoogeographischer Elemente einzigartig ist und den Einfluß verschiedener Wasserkörper auf den Golf anzeigt. Für die Ocypodiden führt dies zu einer hohen regionalen oder gammaDiversität sowie einer über reine Artendiversität hinausgehenden Diversität der Lebensgemeinschaften. Während sich die Folgen des Golfkriegs als weniger gravierend als ursprünglich befürchtet erwiesen haben, könnten Habitatzerstörung und schleichende Verschmutzung die Lebensgemein schaften des PersischArabischen Golfes irreparabel schädigen.
Zyklotronresonanzen von Ionen im hochfrequenz-modulierten magnetisch fokussierten Elektronenstrahl
(2000)
Ein Prototyp einer Kombination aus Penningfalle und EBIS/T wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt. Dazu wurde ein Standard NMRMagnet erfolgreich so umgebaut, daß er in Bezug auf Vakuum, Temperatur und Temperaturbeständigkeit den Erfordernissen einer EBIS/T als Ionenfalle entspricht. Diese Apparatur ermöglicht nun die Untersuchung der in der EBIS/T erzeugten Ionen mit den Methoden der 'Fallenphysik'. Die Anregung der Ionen in der Falle wurde hier erstmals durch Hochfrequenzmodulation des Elektronenstroms über die Wehneltelektrode der Elektronenkanone durchgeführt. Messungen haben gezeigt, daß man in der EBIS/T erzeugte Ionen selektiv nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung mit der Modulation in Resonanz bringen kann, bis sie den Elektronenstrahl verlassen. Die Ionen besitzen auch im dichten Elektronenstrahl eine charakteristische Eigenfrequenz, die zwar von der Raumladung in der Falle abhängt, mit der jedoch trotzdem eine Resonanzanregung durchgeführt werden kann. Im Experiment bestätigte sich die Vorhersage für die Mindestdauer der Anregung in der Größenordnung von Mikrosekunden und für Relaxionszeiten der kohärenten Ionenbewegungen im Bereich von Millisekunden, was eine grundsätzliche Voraussetzung für eine resonante Separation verschiedener Ionensorten darstellt. Die auftretenden Eigenfrequenzen der unterschiedlichen Ionen lassen sich theoretisch und im Einklang mit numerischen Simulationen beschreiben. Die Anregung der Eigenfrequenzen von Ionen über den Elektronenstrahl funktioniert bis zu so hohen Ionendichten, wie sie in einer EBIS vorkommen. Ionenmanipulationen, wie man sie von den Penningfallen her kennt, lassen sich auf ein Ionenensemble mit bis zu 10 10 Ionen pro cm 3 übertragen. Die gemessenen Verschiebungen der Eigenfrequenzen gegenüber der Zyklotronfrequenz geben darüber hinaus Aufschluß über den Kompensationsgrad des Elektronenstrahls in der EBIS/T und können damit als wichtiges Diagnosehilfsmittel für die Optimierung von ElektronenstrahlIonenquellen verwendet werden. Läßt man die Resonanzanregung kontinuierlich einwirken, so tritt überraschenderweise eine Erhöhung des Anteils an hochgeladenen Ionen in der EBIS/T auf. Darüberhinaus konnte experimentell gezeigt werden, daß die hochgeladenen Ionen auf der Achse des Elektronenstrahls konzentriert werden, während niedrig geladene Ionenen dort verschwinden und bevorzugt den äußeren Strahlbereich bevölkern. Die Erklärung dafür ist, daß durch kontinuierliches Entfernen dieser niedrig geladenen Ionen aus dem Elektronenstrahl eine vollständige Kompensation der Raumladung des Elektronenstrahls verhindert wird. Dadurch lassen sich Ionen in der Ionenquelle über einen längeren Zeitraum züchten. Vorteilhafterweise drängt die Anregung über eine Modulation des Elektronenstrahls im Gegensatz zu der normalen Dipolanregung bevorzugt niedrig geladenen Ionen, mit größerer Aufenthaltswahrscheinlichkeit am Rand, aus dem Elektronenstrahl. Dies führt zu einer verstärkten CoulombKühlung der hochgeladenen Ionen und konzentriert diese in der Mitte des Strahls, wo die Anregung fast unwirksam ist. Diese Kühlkraft wirkt als Zusammenspiel der attraktiven radialen Kraft des nicht vollständig raumladungskompensierten Elektronenstrahls und der Coulombstöße der Ionen untereinander. Durch diese Methode der Kühlung der Ionen untereinander können verstärkt Ionen hoher Ladungszustände in der Ionenquelle konzentriert werden. Der Vorgang der Kühlung durch Coulombstöße konnte mit einem Modell beschrieben werden, bei dem die thermische Verteilung aller Ionen im Elektronenstrahl einer Boltzmann Verteilung folgt. Das Modell benutzt vier Kräfte: die magnetische Kraft, die elektrische Haltekraft des Elektronenstrahls, die periodische elektrische Anregungskraft und die Reibung der Ionen proportional zu ihrer Geschwindigkeit und ihres Ladungszustandes bzw. die Stöße der Ionen untereinander. Die Resonanzanregung im Raumladungspotential sowie die Aufenthaltsverteilung der Ionen im Elektronenstrahl konnten damit dargestellt werden. Für Präzisionsexperimente an hochgeladenen Ionen bietet sich die Kombination aus einer EBIS/T mit integrierter Penningfalle an. Die Experimente haben gezeigt, daß es möglich ist, Ionenspektren mit einem eingekoppelten Wechselfeld in dem Ionisationsraum der EBIS/T zu separieren und zu reinigen. Für die Zukunft wünscht man sich aber eine größere Effektivität für das vollständige Entfernen bestimmter Ionensorten. Dies kann man erreichen, indem man den Elektronenstrahl noch dichter mit der Ionisationsröhre umschließt. Durch die kontinuierliche Resonanzanregung profitiert man von einer längeren Einschlußzeit für die stufenweise Ionisierung zu höheren Ladungszuständen und/oder eröffnet ElektronenstrahlIonenquellen neue Einsatzmöglichkeiten unter schlechteren Vakuumbedingungen. Die verstärkte Kühlung und Zentrierung der Ionen auf der Achse während dieses Betriebsmodus verbessert die Emmitanz von ElektronenstrahlIonenquellen. Für die Zukunft kann man sich eine EBIS mit moduliertem Elektronenstrahl auch im Strahlweg niederenergetischer hochgeladener Ionen zum Verbessern deren Emittanz vorstellen. Die im Elektronenstrahl erzeugten und sich selbst kühlenden Ionen wirken durch Coulombstöße als Kühlmedium ohne die Gefahr der Umladung wie bei gasgefüllten hfQuadrupolen.
Für Elektronenstrahlionenquellen sind die Stromdichte und die Energie die ausschlag gebenden Größen zum Erreichen hoher Ladungszustände. Herkömmliche EBIS/T verwenden ein externes magnetisches Feld zur Kompression des Elektronenstrahls. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine ''magnetfeldfreie" EBIS/T realisiert, mit der die Selbstkompression eines teilrelativistischen Elektronenstrahls nachgewiesen werden konnte, womit ein vielversprechender Meilenstein auf dem Weg zu einer SuperEBIS/T mit Energien im Bereich von 300 - 500 keV erreicht wurde. Es wurde eine Apparatur aufgebaut, die es ermöglichte, einen Elektronenstrahl unter verschiedenen Winkeln in die Ionenfalle einzuschießen. Durch numerische Simulationen wurde die Elektronenkanone mit dem Ziel einer möglichst kleinen rückwärtig projizierten Kathode optimiert, um die fokussierbare Stromdichte zu erhöhen. Um sphärische Aberrationen des abbildenden Linsensystems zu korrigieren, wurde die Driftstrecke zwischen Elektronenkanone und Ionenfalle mit ''clearing" Elektroden versehen, die es ermöglichten, einen definierten Kompensationsgrad im Elektronenstrahl einzustellen. Im Anschluß an den Kollektor wurden die Ionen mit einem Sektormagneten analysiert. Zunächst wurde experimentell bestätigt, daß sich sphärische Aberrationen korrigieren lassen, wenn der Elektronenstrahl im Bereich des Linsensystems gezielt partiell kompensiert wird. Mit dem nichtlinearen Kompensationsgrad konnte die defokussierende Kraft der Raumladung gerade so angepaßt werden, daß sie die radial zunehmende Fokussierung der Linse (sphärische Aberration) korrigiert. ''clearing" Elektroden sorgten dafür, daß im Außenbereich des Elektronenstrahls gebildete Ionen den Strahl verließen. Nur der innere Bereich konnte nach Maßgabe der Potentialdifferenz kompensieren. Messungen der Verlustströme an den Elektroden der Ionenfalle zeigten, daß nur mit dieser Kompensation der Elektronenstrahl bei hohen Strahlströmen durch die Ionenfalle transportiert werden konnte. Bei kontinuierlicher Ionenextraktion konnte bei Erhöhung des Gasdrucks in der Ionenquelle ein überproportionales Ansteigen des Ionenstroms gemessen werden. Mit der Annahme konstanter Stromdichte sollte der Ionenstrom lediglich linear steigen. Zusammen mit der gleichzeitigen Reduktion der Verlustströme auf die Fallenelektroden war dies ein erster Hinweis für die Erhöhung der Stromdichte durch zunehmende Kompensation der elektronischen Raumladung im Fallenbereich. Eine genaueres Bild über die Entwicklung der Stromdichte wurde aus Spektren abgeleitet, die bei gepulster Extraktion aufgenommen wurden. In einer Elektronenstrahlionenquelle werden Ionen durch sukzessive Ionisation gebildet. Die Ladungszustandsverteilung der gebildeten Ionen ist proportional zur Dichte der ionisierenden Elektronen und zur Einschlußzeit, der die Ionen dem Elektronenbeschuß ausgesetzt sind. Bei konstanter Stromdichte erreichen aufeinanderfolgende Ladungszustände maximale relative Häufigkeit ungefähr bei einer Verdopplung der Einschlußzeit. Die aufgenommenen Spektren wichen deutlich von diesem Schema ab. Anstelle einer regulären Ladungszustandsentwicklung wiesen die Spektren nach 20ms Einschlußzeit zwei Verteilungen auf. Die erste Verteilung hatte ein Maximum bei Ar 2 , während die zweite ihr Maximum bei Ar 8 hatte. Die höher geladene Verteilung war mit dem Auftreten hoher Ladungszustände bis Ar 12 verbunden. Bei einer weiteren Erhöhung der Einschlußzeit ging die niedrig geladene Verteilung in die hoch geladene über, bis bei 160ms nur noch ein hoch geladenes Spektrum vorhanden war. Ein Vergleich mit Modellrechnungen ergab für niedrig geladene Ionen (3Acm 2 für Ar 2 bei 20ms Einschluß) eine geringe Stromdichte und einen kontinuierlichen Übergang zu hohen Stromdichten (300Acm 2 für Ar 12 bei 20ms Einschluß) bei hoch geladenen Ionen. Aufgrund des ''evaporative cooling" sammeln sich hoch geladene Ionen in der Mitte des Elektronenstrahls. Da der Elektronenstrahl von innen nach außen kompensiert, setzt die Selbstkompression innen ein und führt dort zu hohen Stromdichten. Man erhält eine während der Einschlußzeit variierende Stromdichteverteilung im Elektronenstrahl. Eine Aussage über die Häufigkeitsverteilung der Stromdichtewerte gelang über die Wichtung der berechneten Stromdichte mit der Menge an ionischer Ladung, die in den Ladungszuständen vorhanden war. Mit diesen Werten konnten mittlere Stromdichtewerte für den Elektronenstrahl berechnet werden. Es wurde die mittlere Stromdichte für den gesamten Elektronenstrahl und für die beiden Ladungszustandsverteilungen berechnet. Dabei begann die mittlere Stromdichte des Elektronenstrahls mit der Stromdichte der niedrig geladenen Verteilung (13Acm 2 ; 5ms) und ging bei Erhöhung der Einschlußzeit in die mittlere Stromdichte der hoch geladenen Verteilung über (110Acm 2 ; 80ms). Das Maximum der mittleren Stromdichte für die hoch geladene Verteilung lag bei 170Acm 2 für 40ms Einschlußzeit. Nachdem der Elektronenstrahl bei 40ms kompensiert wurde, sanken die mittleren Stromdichten. Dies lag an der nun dominierenden Heizung durch Coulombstöße der Strahlelektronen an den eingeschlossenen Ionen, wodurch deren Ausbeute verringert wurde. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit numerischen Integrationen der Randstrahlgleichung. Dazu wurden Berechnungen für verschiedene Kompensationsgrade und Elektronenstrahlemittanzen durchgeführt. Für Emittanzwerte um 2×10 3 cm mrad ergab sich eine gute Übereinstimmung mit den gemessenen Stromdichten. Die Rechnungen bestätigten, daß die Emittanz und der Einschuß des Elektronenstrahls in die Ionenfalle die kritischen Größen sind, um eine Selbstkompression des Elektronenstrahls bei einer Energie von 22keV und 30mA Strahlstrom beobachten zu können. Die in dieser Arbeit untersuchte Selbstkompression des Elektronenstrahls kann genutzt werden, um bei einer XEBIS/T mit Elektronenstrahlenergien größer als 200keV deutlich höhere Stromdichten zu erzielen, als bei heute üblichen EBIS/T. Sie eignet sich deshalb besonders für die Erzeugung höchst geladener schwerer Ionen, weil die angewandte Technik bei kommerziellen ElektronenstrahlSchweißanlagen industriell ausgereift ist, wohingegen die herkömmlichen EBIS/T weltweit (Livermore, Dubna, Tokio, Freiburg) die gesetzten Erwartungen hinsichtlich der erreichbaren Elektronenenergien bisher verfehlen. Auch für den stets problematischen Einschuß niedrig geladener Ionen, die außerhalb der EBIS/T erzeugt werden, kann die Selbstkompression genutzt werden. Der Elektronenstrahl weist zu Beginn der Ionisierung einen großen Durchmesser auf, wodurch der Einschuß in den Strahl erleichtert wird. Während der Höherionisierung der eingefangenen Ionen komprimiert sich der Elektronenstrahl zu der zum Erreichen höchster Ladungszustände notwendigen Stromdichte dann von selbst.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Die vorliegende Arbeit gliederte sich in 3 Teilbereiche. Der erste Teilbereich beschäftigte sich mit der antiviralen in vitro Wirkung von EDDS (Ethylendiamindinbernsteinsäure), sowie mit der Wirkung von EDDS, DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) und DFO (Desferrioxamin) im Tiermodell. EDDS zeigte in vitro eine vielversprechende Wirkung gegenüber verschiedenen HCMV Stämmen. Hierunter befanden sich GCV und HPMPCresistente Stämme. Dies ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, da die Therapie von HCMVbedingten Erkrankungen mit hohen Nebenwirkungen verbunden ist und zudem durch vermehrtes Auftreten von Resistenzen gegenüber den etablierten Therapeutika GCV, HPMPC und Foscarnet erschwert wird. Die invitroDaten legen einen ähnlichen antiviralen Wirkmechanismus des EDDS verglichen mit DTPA nahe. Diese Ähnlichkeit wird durch die enge strukturelle Verwandschaft der Stoffe noch unterstrichen. Im Mausmodell zeigte jedoch keiner der 3 untersuchten Chelatoren eine erfolgversprechende protektive Wirkung gegenüber MCMVInfektionen. Damit wurden vorangegangene Untersuchungen im Rattenmodell bestätigt. Trotz vielversprechender anderslautender Ergebnisse, die auf eine invivoWirkung von DFO gegenüber CMVInfektionen hinwiesen, scheint damit der Einsatz der Chelatoren aufgrund ihrer sehr kurzen Halbwertszeit im Körper stark limitiert. Der zweite Teil der Dissertation befaßt sich mit der Entwicklung und Untersuchung von peptidischen Wirkstoffträgersystemen für DTPA. Hierbei ließen sich reproduzierbar lösliche HSADTPA und GelBDTPAKonjugate, sowie HSADTPA und GelBDTPANP herstellen. Die antivirale und die antitumorale Wirkung dieser Konjugate wurde in vitro untersucht. Da für die antitumorale Wirkung von DTPA bisher keine Daten vorlagen, wurde zunächst die Cytotoxizität in einer NBZellinie und in 3 BrustkrebsZellinien bestimmt. Als Vergleich dienten HFF. Es zeigte sich, daß DTPA in unterschiedlichen Konzentrationen gegenüber den untersuchten Zellinien cytotoxisch war, eine Tumorspezifität konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die Cytotoxizität und die antivirale Wirkung des DTPA wurden in vitro durch Bindung an die unterschiedlichen peptidischen Trägersysteme deutlich erhöht. Dies führte jedoch nicht zu einer Erhöhung der therapeutischen Breite, da HFF in gleichem Maße stärker geschädigt wurden. Trotzdem bieten die Trägersystem Zubereitungen im Hinblick auf eine invivoAnwendung einige Vorteile. Es könnten geringere Mengen DTPA eingesetzt werden, was eine verringerte Ausschwemmung von Metallionen zur Folge hätte. Neben einer verlängerten Zirkulationszeit im Organismus könnte die veränderte Körperverteilung zu Verbesserungen führen. Im Falle der antitumoralen Anwendung wäre dies eine Anreicherung im Tumor aufgrund des EPREffektes. Für die antivirale Anwendung wären die Anreicherung in entzündeten Geweben, sowie die Anreicherung in Monozyten und Makrophagen von großem Interesse, da diesen Zellen ein entscheidender Anteil an dem durch CMV verursachten Multiorganbefall zugerechnet wird. Trotzdem bedarf der invivoEinsatz einer eingehenden Evaluierung und erscheint aufgrund der geringen therapeutische Breite insbesondere im Hinblick auf die Therapie von Tumoren stark eingeschränkt. Bezüglich des cytotoxischen Mechanismus weist die Wirkung der DTPAKonjugate darauf hin, daß DTPA den Zellzyklus und die Virusreplikation durch Wechselwirkung mit der Zellmembran und dadurch Veränderung der Signaltransduktion beeinflußt. Da eine geringere DTPAMenge größere Effekte verursacht, erscheint es unwahrscheinlich, daß die Komplexierung von Metallionen für die Wirkungen verantwortlich war. Im dritten Teil dieser Dissertation wurde eine PLANPTrägersystem für das antitumoral wirksame Enzym BSRNase entwickelt. BSRNase zeigte in vitro und bei intratumoraler Applikation sehr vielversprechende, selektive antitumorale Effekte gegenüber proliferierenden und ruhenden Tumorzellen. Die systemische Applikation war jedoch nicht erfolgreich. Dieses Scheitern wurde auf hohe Antigenität, kurze Halbwertszeit der Substanz im Körper und auf eine ungenügende Körperverteilung zurückgeführt. NP sind geeignet die Zirkulation im Körper zu verlängern und reichern sich in Tumoren aufgrund des EPREffektes an. PLANP wurden ausgewählt, da sie BSRNase in ausreichendem Maß binden und da PLA ein bioabbaubares und bioverträgliches Material ist. In vitro unterschied sich die nanopartikuläre Zubereitung bei der Wirkung gegenüber normalen, Lymphom und Leukämiezellen nicht. Beide BSRNaseZubereitungen induzierten Apoptose in parentalen und chemoresistenten Krebszellen. Normale Zellen wurden nicht in ihrer Viabilität beeinträchtigt. Die aspermatogenen und antiembryonalen Wirkungen von BSRNaseZubereitungen weisen auf ihre antitumoralen Eigenschaften hin. In diesen beiden Testsystemen übertraf die nanopartikuläre Zubereitung die Wirkung der BSRNaseLösung. InvivoVersuche müssen nun den tatsächlichen Stellenwert der BSRNasePLANP zeigen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Porcinen Endogenen Retroviren (PERV) erstmals ausführlich biochemisch und biologisch charakterisiert sowie ihr Wirtsspektrum und ihre Expression in vitro näher analysiert. Es wurden sensitive immunologische Nachweismethoden entwickelt, die in experimentellen, präklinischen und ersten klinischen Studien zur Xenotransplantation angewandt wurden. Die Charakterisierung der Viren ergab, daß es sich um TypCRetroviren handelt, wobei ein Teil der Partikel nicht gereift ist. In hoch gereinigten Viruspräparationen aus Überständen produzierender porciner und PERVinfizierter, humaner Zellen konnten alle Strukturproteine identifiziert werden. Dazu wurden neben Elektrophoresen Western BlotAnalysen eingesetzt, wobei kreuzreaktive Antiseren gegen verwandte Viren und neu entwickelte, erstmals gegen PERVProteine gerichtete Antiseren benutzt wurden. Bei der Untersuchung der biologischen Eigenschaften wurde gezeigt, daß PERV in vitro ein mit anderen Retroviren vergleichbares immunsuppressives Potential besitzt. Mit diesen neuen Antiseren und den hoch gereinigten Viruspräparationen wurden sehr sensitive Western BlotVerfahren sowie ELISAs auf der Basis synthetischer Peptide als Nachweissysteme etabliert und validiert. Zuerst wurden Seren gesunder Blutspender mit diesen Tests untersucht. Dann wurden Seren von Schlachtern und von Patienten nach Xenotransplantationen getestet. Erstmals wurden auch Seren von Pavianen, denen u.a. auch ganze Schweineorganen transplantiert wurden und die eine profunde, für zukünftige Anwendungen typische, pharmakologische Immunsuppression erhielten, auf Antikörper gegen PERV untersucht. Bei Seren einiger Patienten und gesunder Blutspendern wurden zwar Kreuzreaktionen mit viralen Proteinen gefunden, es lagen aber keinerlei Anzeichen für eine PERVInfektion vor. Um das Wirtspektrum von PERV zu analysieren, wurden Zellinien und erstmals auch primäre Zellen verschiedener Spezies einschließlich Ratte und Maus mit PERV inokuliert. Dabei wurden erstmals Hinweise auf die Suszeptibilität von humanen Blutzellen erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mitogenstimulierte porcine PBMC PERV freisetzen können, wobei alle drei Subtypen der Hüllproteine nachgewiesen wurden. Eine nähere Analyse ergab daß verschiedene Schweinerassen aber auch einzelne Individuen der gleichen Rasse unterschiedliche Mengen an Virus freisetzen. Unter bestimmten Stimulationsbedingungen wurde PERV von adhärenten Zellen produziert, die nicht näher charakterisiert werden konnten. Eine endgültige Beurteilung des Infektionsrisikos bei Xenotransplantationen ist nach Abschluß dieser Studie noch nicht möglich. Mit der Charakterisierung von PERV und den immunologischen Nachweismethoden wurden die Voraussetzung für die Analyse weiterer experimenteller und klinischer Xenotransplantationen gelegt.
Molekulare Systematik und Phylogeographie der Formengruppe Ancylus fluviatilis O. F. Müller 1774
(2001)
Ziel dieser Dissertation war es, die genetische Variation innerhalb der Formengruppe Ancylus fluviatilis (Gastropoda: Basommatophora) zu untersuchen, und eine auf molekula ren Markern basierende Phylogenie zu erstellen. Die phylogenetischen Untersuchungen beinhalteten auch die Stellung der Familie Ancylidae innerhalb der Basommatophora. Außerdem wurde die geographische Verteilung der genetischen Variation untersucht und die phylogeographischen Prozesse, die zu dieser Verteilung geführt haben, analysiert. Die gefundene genetische Konstitution wurde im Zusammenhang mit bereits vorhandenen Daten über chromosomale und fortpflanzungsbiologische Besonderheiten von A. fluviatilis diskutiert. Für 147 Individuen aus 62 Populationen des gesamten Verbreitungsgebiets von A. fluviatilis wurden mitochondriale 16S rDNASequenzen ermittelt. Es konnten 67 Haplotypen unterschieden werden. Die Haplotypen zeigen eine große genetische Diversität innerhalb der Formengruppe (bis zu 8.2% paarweise Sequenzdivergenz). Es lassen sich neun genetisch stark divergente Linien unterscheiden. In einer Population konnten dynamische dinukleotide Mikrosatelliten in der mtDNASequenz nachgewiesen werden, die eine Längenvariation von vier bis achtfachem Grundmuster aufweisen. Als wahr scheinlicher Mechanismus für diese Längenvariation wird "slippedstrandmispairing" angenommen. Mit Hilfe von nukleären RAPDMarkern wurde die genetische Trennung der mitochon drialen Linien bei syntop vorkommenden Linien auch auf nukleärer Ebene nachgewiesen. Die Formengruppe A. fluviatilis setzt sich somit aus einem Komplex reproduktiv isolierter Linien zusammen. Im Zusammenhang mit der bereits nachgewiesenen allotetraploiden Konstitution zumindest einer Linie und der resultierenden hohen Selbstbefruchtungsrate sind sowohl sympatrische als auch allopatrische Diversifizierungsereignisse für die Differenzierung der Linien verantwortlich. Drei der neun genetischen Linien sind geographisch weitverbreitet und kommen zum Teil syntop vor. Phylogeographische Analysen anhand von "nested clades" zeigten, daß isolation by distance zwar das Grundmuster für die Verbreitung von A. fluviatilis darstellt, daß dieses aber durch Expansionsereignisse, die die Besiedlung über weite Distanzen einschließen, überlagert sein kann. Zeitliche Abschätzungen ergaben für die Formengruppe A. fluviatilis ein Alter von mindestens 20 Millionen Jahren. Die rezent vorkommenden Linien sind schätzungsweise zwischen 8 und 14 Millionen Jahren alt. Für die phylogenetischen Untersuchungen innerhalb der Basommatophora wurde die 16S rDNA von weiteren Gattungen sequenziert. Die resultierende molekulare Phylogenie belegt die monophyletische Entstehung der Formengruppe A. fluviatilis sowie eine gemeinsame Abstammung der Gattungen Ferrissia und Ancylus. Die Familie Ancylidae bildet eine Schwestergruppe zur Familie Planorbidae und läßt sich somit nicht aus dieser ableiten. Die Gattung Burnupia zeigt sich als nahe verwandt zur Gattung Acroloxus (Familie Acroloxidae) und gehört somit nicht, wie bisher angenommen, zu den Ancylidae.
Short tandem repeat (STR) Loci sind ideale Marker für gerichtliche und abstammungs genetische DNAUntersuchungen. Sie bestehen aus sich wiederholenden 26 bp langen Einheiten und sind über das gesamte menschliche Genom verteilt. Aufgrund ihrer geringen Allellängen (100600 bp) lassen sich STRs leicht mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizieren. In der vorliegenden Arbeit sind fünf STRPolymorphismen der Loci D11S488, D18S51, D19S246, HUMFIBRA (FGA) und HUMVWFA31/A auf ihre Populationsgenetik und Sequenzstruktur hin untersucht worden. Die Daten wurden anhand genomischer DNA von 100 gesunden, unverwandten kaukasischen Blutspendern aus der Region Hessen gewonnen. Über ein 6 %iges denaturierendes Polyacrylamidgel wurden die PCRProdukte aufgetrennt und unter Gebrauch fluoreszenzmarkierter Primer mit einem 373A DNASequenzer analysiert. Der Locus D11S488 ist durch eine zusammengesetzte Repeatregion (compound repeat) von AAAG und GAAG Blöcken gekennzeichnet. Mit einer Variationsmöglichkeit an vier unter schiedlichen Positionen kam es zum Auftreten von Mikroheterogenitäten in Allelen gleicher Länge. 29 verschiedene Allele wurden gefunden, die basierend auf ihrer Gesamtrepeatanzahl (YAAG) 2641 (242 bp302 bp), in 15 Allelklassen gruppiert wurden. Bei D19S246 (TGTA und TCTA) liegt ebenfalls ein compound repeat vor. Mikroheterogenitäten führten in 11 Allelgruppen (182230 bp) zu 17 unterschiedlichen Allelen. Der Locus D18S51 (AGAA) ist ein STRPolymorphismus mit einer einfachen Repeatstruktur (simple repeat). 12 unter schiedliche Allele wurden beobachtet, die alle einen regelmäßigen Tetranukleotidrepeat aufwiesen. Die Allelspanne reichte von Allel 11 mit 278 bp bis Allel 22 mit 322 bp. Ebenfalls ein einfacher Repeat bestimmt das HUMFIBRA System (TCTT). Eines der beobachteten 10 Allele differierte allerdings um nur 2 bp. Zusammen mit dem compound repeat HUMVWFA31/A (8 Allele) sind alle untersuchten Marker multiplexfähig. Ein ausgeprägter Polymorphismus der individuellen Loci, die dem HardyWeinberg Equilibrium folgen, sowie eine Übereinstimmungswahrscheinlichkeit (pM) der Merkmale zwischen unverwandten Personen von 3 x 10 7 machen eine Analyse dieser fünf TetranukleotidMarker zu einer sinnvollen Ergänzung in der Bearbeitung abstammungs genetischer Fragestellungen.
Die doppelblinde Pilotstudie ''Wirksamkeit und Verträglichkeit einer Enzym oder Vitamin ATherapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf/Halsbereich" wurde in Zusammenarbeit mit der HNOKlinik in dem Zeitraum von Oktober 1994 bis Juni 1996 mit 25 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen und 15 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Den Patienten wurde neben der konventionellen Therapie entweder VitaminA (Retinolpalmitat, 150,000 IE/d), die Enzympräparation (proteolytische Gesamtaktivität 20,880 F.I.P.E/d) oder Placebo zugeteilt. In regelmäßigen Abständen wurde das Allgemeinbefinden/ Nebenwirkungen protokolliert, Blutbild und Leberwerte bestimmt, die peripheren Lymphozyten phänotypisiert und die NK LAK, bzw. LAKZellAktivität gemessen. Zur Auswertung gelangten 16 Patienten. Statistisch signifikant war eine Erhöhung der CD2 und CD3Werte der EnzymGruppe (41 Messungen) gegenüber den Patienten der Gruppen VitaminA (18 Messungen), Placebo (12 Messungen) und den Ausgangswerten der Patienten (25 Messungen). Auch im Verlauf konnte die Erhöhung der CD3Werte bei der Enzymgruppe gegenüber den anderen Patientengruppen bestätigt werden. Der Anteil der TZellen im peripheren Blut lag im Bereich der gesunden Kontrollen. Um die Wirkungen der Prüfmedikationen auf Leukozyten (PBL, PMNL, Monozyten) in vitro zu untersuchen, wurde ein Panel durchflußzytometrischer Tests entwickelt, bzw. etabliert, die die Messung der Funktionen NKZellaktivität, LAKAktivität, ADCC, Phagozytose und Sauerstoffradikalbildung ermöglichten bzw. vereinfachten. Die untersuchte Enzympräparation enthielt Papain, Trypsin und Chymotrypsin im Verhältnis 2,5:1:1. In vitroVersuche ergaben eine dosisabhängige Stimulierung der NK, NKLAK, CTL bzw. LAKAktivität und der ADCC durch NKZellen durch die Enzympräparation. Es war möglich, die Lymphozyten mehrfach zu stimulieren, eine Enzymdauergabe, bzw. hohe Enzymdosen führten zu einem Aktivitätsrückgang. Die Enzymmischung verbesserte die Phagozytose und den oxidativen Burst bei PMNL und erhöhte die CD18 und CD54 bzw. erniedrigte die CD16Expression auf PMNL. Mit alltransRetinsäure bzw. Retinol konnten die Lymphozytenaktivitäten in vitro mit den gewählten Versuchsbedingungen kaum beeinflußt werden, Änderungen konnten meist 48h bis 72h nach Zugabe beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Beobachtungen zu VitaminAWirkungen auf PMNL waren nicht möglich, da diese nur maximal 24h kultiviert werden konnten.
In der Betrachtung dieser Arbeit werden hauptsächlich die vier Geistesgestalten der ersten Hälfte des 18. Jahrhunderts, nämlich G. W. LEIBNIZ, JOHANN BERNOULLI (I), DANIEL BERNOULLI, und LEONHARD EULER in ihrem Verhältnis zur Gravitation bzw. zu NEW TONS Gravitationstheorie gewürdigt. Die herangezogenen Arbeiten wurden von mir aus dem Lateinischen bzw. dem Französischen übersetzt. Es wird dargestellt, daß sowohl LEIBNIZ als auch JOHANN BERNOULLI Darstellungen gegeben haben, die beanspruchen, die gesamte Himmelsmechanik zu erklären. DANIEL BERNOULLI wird hauptsächlich in bezug auf seine Konkurrenz mit dem Vater in seiner Preisschrift betrachtet, und EULER liefert neben einer fulminanten Kritik an der fehlenden Ursachenerklärung NEWTONS eine Version von Gravitationserklärung, von der er später wieder Abstand nehmen mußte. Allen kontinentalen Gelehrten ist gemeinsam, daß sie auf einer nahwirkenden Ursache als Erklärung der Gravitation bestehen und sich damit deutlich von ISAAC NEWTON absetzen. Fast gemeinsam allerdings ist ihnen auch die Achtung vor NEWTON, insbesondere dadurch, daß sie (bis auf LEIBNIZ) dessen Ergebnisse aus den principia durchaus verwenden. Sie sind nur mit dessen ''Fernwirkungstheorie" nicht einverstanden. LEIBNIZ hebt sich insofernhin ab, als er in seiner Arbeit sich nicht mit der NEWTONS aus einandersetzt, sondern sein eigenes Konzept verfolgt. Er kannte NEWTONS Arbeit nicht und publizierte seine Version ziemlich bald nach Erscheinen der principia. Dabei benutzt er seine neu entwickelte Analysis und leitet aus Prämissen, die er angibt, die Eigenschaften der Plane tenbewegung ab. Zur Erklärung der Schwere dient ihm ein schon von HUYGENS angegebe nes Modell der Schwereerzeugung durch Rückstoß und Verdrängung im Wirbel. Die Plane tenbewegung wird dann bei ihm durch Zentrifugalbewegung und ''parazentrische" Rückstoßbewegung in radialer Richtung und durch ''harmonische" Kreisbewegung in tangentialer Richtung infinitesimal zusammengesetzt. JOHANN BERNOULLI erfindet eine eigene ''Himmelsphysik", indem er nach eigener Äuße rung das Beste aus beiden System, dem von DESCARTES und dem NEWTONS, zusammen führt. Bei ihm wird alles aus Stößen und nach den Stoßgesetzen erklärt. Die gesamte Spekulation verwendet subtile Materie des ersten Elementes, die durch eine Art Siedevorgang aus dem Zentralgestirn (jeweils) austritt, durch Stöße und Anlagerungen im Laufe der Zeit zur Materie des zweiten Elementes verdichtet wird und schließlich als ''Zentralstrom" zurückgestoßen, auf jeden Himmelskörper einwirkend, für alle Phänomene verantwortlich gemacht wird. Seine Spekulationen sind großartig formuliert und aus Alltagsbildern wie Sieden, Destillationen, Weihrauch Wahrnehmung, Lichtausbreitung, Schneelawinen, Flammruß Erscheinungen und ähnlichem entnommen. Seine von der Pariser Akademie preisgekrönte Arbeit teilte sich den Preis mit der Arbeit sei nes Sohnes DANIEL BERNOULLI, der sich aber darauf beschränkt, die spezielle Fragestel lung der Preisaufgabe zu bearbeiten und dabei nur erkennen läßt, was er von den Ursachen der anderen Himmelserscheinungen denkt. Während sein Vater sich als strenger CARTESI ANER gibt und die Preisaufgabe nur dadurch bewältigen kann, daß er sich den Erdglobus als langgestrecktes Ellipsoid, im tragenden Medium schwimmend, vorstellt, benutzt Daniel die Vorstellung einer sich überall erstreckenden Sonnenatmosphäre, um deren Einwirkung für seine Lösung nutzbar zu machen. Aus seinen Bemerkungen über NEWTON und über Wirbel theorien schimmert schon durch, daß er sich als Anhänger NEWTONS eher verstehen kann, denn als Anhänger der Wirbeltheorien. Bei LEONHARD EULER handelt es sich vermutlich um den Menschen, der die Physik, ins besondere die Mechanik, im 19. Jahrhundert am meisten beeinflußt hat. Zwei Schriften von ihm werden betrachtet, von denen die erste anonym erschien und erst 1996 ihrem Verfasser sicher zugeordnet werden konnte. Nach meiner Übersetzung hier und dem Vergleich mit einer posthumen Arbeit, ''Handreichungen zur Naturlehre", kann diese jetzt sicher datiert werden als zu Beginn der vierziger Jahre des 18. Jahrhunderts entstanden. Die anonyme Arbeit, ''De causa gravitatis" enthält in komprimierter Form eine fundamentale Kritik der Fernwirkungs theorie NEWTONS mit zum Teil sehr plastischen Beispielen der Ablehnung dieser Theorie. Daran anschließend wird der Aetherdruck, der in der Nähe der Planetenoberfläche geringer als weiter draußen sei, als Ursache der Gravitation vorgestellt. Es wird sogar eine Formel für die Druckverteilung angegeben. In der zweiten betrachteten Arbeit EULERS zeigt sich, daß LEONHARD EULER von der Erklärung der Ursache der Schwere Abstand nimmt. Allerdings beharrt er darauf, daß eine solche, mechanische Ursache existieren müsse und sie vermutlich im Aether zu suchen sei. Solche Vorsicht erschien ihm angeraten, nachdem LE SAGE ihm gezeigt hatte, daß der Aether als Erklärung für alle Phänomene der Optik, des Elektromagnetismus und der Mecha nik nicht herangezogen werden konnte. So kam es denn dazu, daß man NEWTONS Gesetze zum Rechnen gerne benutzte, seine Wei gerung, Gravitation als Masseeigenschaft zu definieren, einfach nicht mehr zur Kenntnis nahm und LEONHARD EULER folgte, der wohl der erste war, der aus der Definition NEW TONS, Kraft sei die Änderung der ''quantitas motus", die Formulierung Kraft sei gleich Mas se mal Beschleunigung machte. Es brauchte auf dem Kontinent fast ein ganzes Jahrhundert seit NEWTONS Arbeit, bevor, auf diese Art abgeändert, NEWTON als Säule der neuen Wis senschaft ''Physik" installiert war. Es wird mit dieser Arbeit gezeigt, daß die Modellbildung, die Vermittlung einer Vorstellung, auch für die ausgewiesene Elite der Wissenschaft einen hohen Stellenwert hatte. Das Funktionieren eines mathematischen Modells ist zwar wichtig und als Mittel der Arbeit unabdingbar, aber erst ein befriedigendes, vorstellbares, und damit mechanisches, Modell sichert ein Phä nomen als ''verstanden" ab. Unsere Probleme heute mögen zwar andere sein, in dieser Hin sicht aber hat sich die Wissenschaft auch heute noch nicht gewandelt und wird sich auch nicht wandeln. Es bleibt also bei der Frage: ''Was ist ein befriedigendes Modell?"
Membranproteine der renalen Bürstensaumzellen spielen eine wichtige Rolle beim Transport von organischen Kationen in der Niere. Mit der ersten Klonierung eines Transporters für organische Kationen wurden die Grundlagen für eine Aufklärung der Transportvorgänge auf molekularer Ebene gelegt. Der Transportmechanismus und die physiologische Funktion des in den Plasmamembranen von Niere und Gehirn exprimierten Transporters für organische Kationen 2 (OCT2) werden zur Zeit -- teilweise kontrovers -- diskutiert. In dieser Dissertation wurde der aus der Rattenniere klonierte elektrogene Transporter für organische Kationen rOCT2 nach heterologer Expression in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis mit elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Zur Anwendung kam neben der konventionellen ZweiElektrodenSpannungsklemme vor allem die ''giant patch clamp"Technik. Als neue Methode speziell für Transstimulationsexperimente bei geklemmtem Membranpotenzial wurde die amperometrische Spannungsklemme entwickelt, mit der ein Ausstrom von Dopamin aus vorinkubierten Oozyten mittels Oxidation an einer CarbonfaserElektrode bei gleichzeitiger Aufzeichnung des elektrischen Transmembranstromes gemessen werden kann. Die Kontrolle der physiologischen Salzlösungen beiderseits der Membran in ''patch clamp" Experimenten erlaubte eine leichte Unterscheidung wechselwirkender Substanzen in Substrate wie: Cholin, Dopamin, Tetramethylammonium und Tetraethylammonium und Hemmstoffe wie: Chinin und Tetrabutylammonium (TBA). Anhand von substratinduzierten elektrischen Ausströmen konnten erstmalig für einen Transporter für organische Kationen apparente Substrataffinitäten von der zytoplasmatischen Seite bestimmt werden. Sie liegen in derselben Größenordnung wie zuvor auf der extrazellulären Seite bestimmte Affinitäten. Der schon früher vorgeschlagene elektrogene Ausstrom von Substrat auch gegen ein negatives Membranpotenzial wurde damit bestätigt. Es wurde eine Hemmung rOCT2vermittelter Ströme durch Schwermetalle und durch Isobutylmethylxanthin gefunden. Die zytoplasmatische Zugabe der Inhibitoren TBA und Chinin hemmte sowohl substratinduzierte Einwärts als auch Auswärtsströme. Die Inhibierung der Auswärtsströme erfolgte dabei kompetitiv. Von der extrazellulären Seite aus hemmte Chinin im Gegensatz zu TBA Einwärtsströme nichtkompetitiv, was auf eine Transinhibierung nach einer unspezifischen Membranpassage des Chinins hindeutet. Die Analyse von StromSpannungskennlinien zeigte, dass die maximalen Transportraten und apparenten Affinitäten der Substrate spannungsabhängig sind. Umkehrpotenziale, die in Anwesenheit von Substrat beiderseits der Membran gemessen wurden, lagen bei den durch die Nernstgleichung vorhergesagten Werten. Dieses Ergebnis identifiziert das elektrochemische Potenzial als treibende Kraft für den Transport von organischen Kationen bei neutralem pH und schließt die Existenz eines elektroneutralen OrganischeKationen/ProtonenAustauschmodus aus. Die rOCT2spezifische Leitfähigkeit war bei sättigenden Konzentrationen von organischen Kationen beiderseits der Membran im Vergleich zu halbsättigenden reduziert. Diese Beobachtung ist mit einem zyklischen Transportmodell erklärbar, bei dem der Transporter nach erfolgtem Transport eines organischen Kations entweder als leerer Transporter oder mit einem auf der anderen Seite gebundenen Kation in seine Ausgangstellung zurückkehren kann, wobei die Translokation der Bindungsdomäne jeweils mit einer Konformationsänderung des Transporters einhergeht. Der Austausch von organischen Kationen erfolgt dabei elektroneutral. Einen weiteren Beleg für einen elektroneutralen Austauschmodus für organische Kationen liefern amperometrische Messungen an reversibel mit Dopamin beladbaren Oozyten. Es konnte ein rOCT2vermittelter, durch Chinin hemmbarer Dopaminausstrom gemessen werden, der in Abhängigkeit des Membranpotenzials durch extrazelluläres Cholin entweder transstimulierbar oder transinhibierbar war. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen belegen, dass rOCT2 als basolateral lokalisierter Transporter hervorragend dazu geeignet ist, mit der vom elektrochemischen Potenzial getriebenen Substrataufnahme in die Bürstensaumzellen den ersten Schritt der Sekretion von organischen Kationen durch die Niere zu leisten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass rOCT2 bei einem ausreichenden Konzentrationsgradienten von Cholin bei der physiologisch bedeutsamen Reabsorption von Cholin beteiligt sein könnte, indem dieses gegen das negative Membranpotenzial, womöglich im Austausch gegen ein anderes organisches Kation, transportiert wird. Zeitaufgelöste Messungen mit Substrat oder Spannungssprüngen sowie Bindungs und Transportstudien nach gezielter Mutagenese könnten zukünftig einer weiteren Aufklärung des Transportmechanismus dienen. Einige die Charakterisierung von rOCT2 in ''inside out"Patchen betreffende Ergebnisse dieser Dissertation wurden bereits im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht und auf internationalen Konferenzen präsentiert. Andere Ergebnisse sind Teil einer vom American Journal of Physiology zur Veröffentlichung angenommenen Arbeit und eine weitere Veröffentlichung ist in Vorbereitung.
Einen vielversprechenden Ansatz auf dem Gebiet der Entwicklung kolloidaler Arzneiträgersysteme stellen die proteinbasierten Nanopartikel dar, da sie biodegradierbar und nicht toxisch sind und eine Reihe möglicher Angriffspunkte zur kovalenten Bindung von Arzneistoffen und zur Oberflächenmodifikation aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Herstellungsprozeß von HSANanopartikeln und sein Einfluß auf die physikochemischen Eigenschaften des resultierenden Partikelsystems evaluiert. Durch Oberflächenmodifikation wurde eine Kopplung von Proteinen mittels bifunktionaler Crosslinker ermöglicht und die zelladhäsiven Eigenschaften des Trägersystems vermindert. Durch Kopplung funktioneller Proteine wurden die ersten Schritte in Richtung eines ligandenvermittelten DrugTargetings unternommen. Evaluierung des Herstellungsprozesses und Charakterisierung des resultierenden partikulären Systems Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses von HSANanopartikeln ergab eine Abhängigkeit der Partikelgröße und der Partikelanzahl vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Die Quervernetzung des resultierenden Systems beeinflußte die Anzahl der freien Aminogruppen an der Partikeloberfläche: Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto weniger Aminogruppen waren nachweisbar. Die Härtung der Partikel durch Einwirkung hoher Temperaturen führte ebenfalls zu stabilen Partikeln. Die Anzahl der verfügbaren Aminogruppen lag im Vergleich zu den Glutaraldeydquervernetzten höher. Die Art und das Ausmaß der Quervernetzung hatten keinerlei Einfluß auf die mittlere Partikelgröße. Das Zetapotential dagegen zeigte eine Tendenz, mit steigender Quervernetzung negativer zu werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Aminogruppen an der Oberfläche von GelatineA und BNanopartikeln verdeutlichte, daß HSANanopartikel signifikant mehr freie Aminogruppen an der Partikeloberfläche, und damit mehr Angriffspunkte zur kovalenten Kopplung und Oberflächenmodifikation aufweisen, als GelatineNanopartikel, wobei Gelatine ANanopartikel mehr als doppelt so viele Aminogruppen an der Oberfläche besitzen als Gelatine BPartikel. Die höchsten Aminogruppenzahlen zeigten die hitzedenaturierten HSANanopartikel. Einführung von Sulfhydrylgruppen an die Partikeloberfläche Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs Methoden zur Einführung von Thiolgruppen auf die Oberfläche von HSANanopartikeln evaluiert. Die effektivste Methode ergab sich aus der Kopplung von Cystamin mit dem Kopplungsreagenz EDC, gefolgt von einer reduktiven Spaltung der Cystamindisulfidbindungen und der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Bedauerlicherweise zeigte diese Partikelpräparation die höchste Toxizität der untersuchten Zubereitungen in der Zellkultur. Die Kopplung von LCystein mit EDC war aufgrund unerwünschter Nebenreaktionen wesentlich weniger effektiv. Die einfachste Art, Thiolgruppen einzuführen, war die reduktive Spaltung der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Doch Bindungsexperimente zeigten, daß diese Thiolgruppen zwar mit Ellmans Reagenz nachweisbar waren, aber zu Bindungszwecken wahrscheinlich aus sterischen Gründen nur in untergeordnetem Maße zur Verfügung standen. Die Verwendung von 2Iminothiolan (Trauts Reagenz) war eine im Vergleich zur Cystamin/EDCMethode einfache und leicht zu handhabende Methode zur Einführung von SHGruppen, allerdings mit relativ geringer Effizienz. Das Quenchen freier Glutaraldehydreste an der Partikeloberfläche mit Cystamin führte zu einem sehr niedrigen SHGruppengehalt, mit LCystein waren so gut wie keine Thiolgruppen nach der Umsetzung nachweisbar. Die SHGruppen wurden bei einer Lagerung bei 4°C mit einer Halbwertszeit von 28,2 Tagen abgebaut, unabhängig von der Art der SHGruppeneinführung. Die Reaktivität der SHGruppen dagegen nahm wesentlich schneller ab als ihre Nachweisbarkeit: Bereits am dritten Tag nach der SHGruppeneinführung lag die Bindungsrate von mit SHreaktiven Crosslinkern aktivierten Proteinen um 2030 % niedriger, verglichen mit dem ersten Tag. Durch Veränderung der Reaktionsparameter konnte bei allen Methoden die Anzahl der eingeführten Thiolgruppen kontrolliert werden. Durch die Einführung der SHGruppen zeigten die Nanopartikel eine deutlich höhere Mukoadhäsion. Oberflächenmodifikationen Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSANanopartikel war zum einen eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Arzneistoffe wie DNA über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der Partikel mit EDC allein oder mit EDC und Cystamin bzw. Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials in den positiven Bereich. Durch Veränderung der Cholamin bzw. Cystaminkonzentration war die Verschiebung des Zetapotentials steuerbar. Gleiches galt für die Umsetzung der Gelatine APartikel, allerdings waren hier deutlich geringere Konzentrationen zur Erlangung der gleichen positiven Zetapotentiale notwendig. Zum anderen sollte durch die Modifikation der Partikeloberfläche ein verändertes Verhalten hinsichtlich der Zelladhäsion der Partikel erzielt werden. Es zeigte sich eine verstärkte Zelladhäsion nach der Einführung weiterer Aminogruppen und nach der Einführung lipophiler Gruppen. Eine verminderte Zelladhäsion wurde durch eine Maskierung der Aminogruppen erreicht. Die besten Ergebnisse erbrachte hierbei die Umsetzung der HSANanopartikel mit Jodessigsäure. Bindung funktioneller Proteine Um zu überprüfen, ob funktionelle Proteine an das evaluierte Trägersystem unter Erhalt der Funktionalität gebunden werden können, wurden zunächst Enzyme über den bifunktionalen Crosslinker SulfoMBS kovalent gekoppelt. Analysen der Bindungsrate und der tatsächlichen enzymatischen Aktivität differierten zwar, doch ist dies wohl auf eine noch nicht hinreichend optimierte Analytik zurückzuführen. Eine enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase und der bGalaktosidase war nach der Bindung an das Trägersystem eindeutig nachweisbar. Als weiteres funktionelles Protein wurde das Avidinderivat NeutrAvidin(TM) gewählt und mit SulfoMBS an Gelatine ANanopartikel gekoppelt. Durch die Bindung biotinylierter Antikörper konnte der Erhalt der Funktionalität des gebunden NeutrAvidins(TM) gezeigt werden. Die Konjugation eines biotinylierten, humanen CD3 Antikörpers an das NeutrAvidin(TM)konjugierte Partikelsystem führte zu einer selektiven Bindung des Trägersystems an primäre humane Lymphozyten. Auch eine Aufnahme des Trägersystems in die Zellen konnte gezeigt werden. Die Experimente zum Antikörpervermittelten Targeting konnten mit HSANanopartikeln nicht reproduziert werden, da HSAPartikel eine so starke Zelladhäsion zeigten, daß ein Targeting aufgrund des Antikörpers nicht mehr ersichtlich war. Erste Versuche mit oberflächenmodifizierten HSAPräparationen, wie beispielsweise einer Jodessigsäure Umsetzung, führten zu einer deutlich verminderten Zelladhäsion. Weitergehende Experimente zur Evaluierung dieses Effektes sind für die Weiterentwicklung dieses Trägersystems entscheidend.
Bedingt durch den demographischen Wandel in der Bevölkerung erlangen gerontologische Themen immer zentralere Bedeutung. Die Thematik des Dekubitus in der häuslichen Pflege ist durch ihren Bevölkerungsbezug und die Multidisziplinarität der Problemstellung dabei ein wichtiges Praxisfeld. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in drei Teile: 1. Zur Anleitung häuslich Pflegender ist ein Ratgeber für pflegende Angehörige entstanden und wird im Schlüter Verlag, Hannover veröffentlicht. 2. Durch die Befragung möglichst repräsentativer Stichproben von niedergelassenen Allgemeinärzten und praktischen Ärzten werden Maßnahmen zu Prävention, Diagnostik und Therapie des Dekubitus in der allgemeinärztlichen Versorgung erfaßt. Alle vertragsärztlich tätigen Allgemeinmediziner und Praktischen Ärzte der Modellregion Stadt und Landkreis Offenbach (mittelgroße Stadt in Hessen, die die hessische Grundgesamtheit widerspiegelt) werden 1993 (N=165) (Dissertation Silke Nowack) und 1998 (N=196) in ein schriftliches postalisches Interview mit 21 überwiegend offenen Fragen in 2 Wellen einbezogen. Die Antworterquote von jeweils 35% (n=58/69) ist im Vergleich zu anderen Studien in dieser schwierigen Befragtengruppe zufriedenstellend, aber vermutlich zugunsten der am Thema Interessierten verzerrt. Der Vergleich der Datenprofile 1993 und 1998 läßt auf eine weitgehend gleiche Antwortergruppe schließen. Die Ergebnisse können allerdings nur zu Tendenzaussagen herangezogen werden. Von den Allgemeinmedizinern und praktischen Ärzten werden 1993 und 1998 durchschnittlich 4 bis 5 Patienten mit Dekubitus jeweils in Alten und Pflegeheimen und zu Hause betreut (Median = 3). Der Altersgipfel der Patienten liegt bei 71 bis über 80 Jahren. Als Grunderkrankung spielen allgemeine Schwäche und Kachexie sowie der cerebrale Insult, als Begleiterkrankung der Diabetes mellitus die führende Rolle. Während 1993 in erster Linie Felle als Antidekubitushilfsmittel genannt werden, treten diese in der Befragung 1998 in den Hintergrund. Antidekubitusmatratzen werden 1998 am häufigsten genannt (1993: 29 von 58 Ärzten; 1998: 42 von 69 Ärzten, Unterschiede nicht signifikant). Zur Prävention und Behandlung von Druckgeschwüren gibt es zahlreiche Literatur. Ein durchgehend positiver Effekt von Publikationen, Fortbildungen oder den beiden deutschsprachigen Leitlinien auf die tatsächliche Versorgung von Patienten mit Dekubitus im allgemeinärztlichen Bereich im Vergleich von 1993 zu 1998 wird in den vorliegenden Daten allerdings nicht sichtbar. So ist z.B. die Auswahl der von den Hausärzten eingesetzten Lokaltherapeutika und lokalen Maßnahmen polypragmatisch, manchmal konfus und aktionistisch und nicht an den wenigen vorhandenen, in ihrem Nutzen belegten Konzepten orientiert. Im Verordnungsbereich der Dermatika ist ein großes Einsparpotential vorhanden, das zugunsten moderner feuchter Wundverbände zu mobilisieren wäre, wie das Verordnungsverhalten der Vertragsärzte zeigt. Von 1992 zu 1997 weisen die Daten des GKVArzneimittelindex zwar einen Rücklauf der Verordnung von Lokalantibiotika auf, er spiegelt sich aber nicht im Antwortverhalten der hier Befragten wider. Zu beobachten ist weiterhin ein deutlicher Anstieg von allgemeinärztlichen Nennungen bei diagnostischen Maßnahmen im Jahre 1998, von denen einige keinen Stellenwert im Umgang mit Dekubituspatienten haben. 3. Von Mai bis August 1998 werden offene, themenzentrierte, leitfadengestützte, mündliche Interviews mit durch Zufallsstichprobe ermittelten 10 pflegenden Angehörigen (9 Frauen, 1 Mann) von Dekubituspatienten aus Stadt und Landkreis Darmstadt geführt und anhand von Tonbandprotokollen in einem Mehrstufenverfahren ausgewertet. Die Interviews finden im häuslichen Umfeld der pflegenden Angehörigen, in Abwesenheit der Patienten, statt. Die Befragung der pflegenden Angehörigen ergibt als durchschnittliches Lebensalter der Pflegebedürftigen 75 Jahre (Median 79 Jahre), Pflegebedürftigkeit besteht seit durchschnittlich 6 Jahren (Median 3,5 Jahre). Die Dauer der Dekubituserkrankung beträgt durchschnittlich 3 Jahre (Median 2 Jahre). Auch in dieser Befragtengruppe unterstreichen polypragmatische und obsolete Behandlungsmethoden die Forderung nach klaren und einheitlichen Konzepten in der Dekubitusprävention und --therapie. Die Pflegenden sind in der Mehrzahl Töchter/Schwiegertöchter. Soziale und emotionale Belastungssituationen werden thematisiert. Aggressive Verhaltensweisen legen 8 von 10 Befragten dar. Selbsthilfegruppen, Gesprächskreise für pflegende Angehörige oder psychologische Betreuung werden von den pflegenden Angehörigen nicht als Entlastungsmöglichkeit geschätzt und genutzt. Gründe für das Pflegeengagement sind gesellschaftliche Normierung, rollenimmanentes Verhalten, der Generationenvertrag sowie der Gedanke, das Leben des Betroffenen durch die häusliche Pflege erleichtern und verlängern zu können. Mit Einführung der Pflegeversicherung wurde die finanzielle Unterstützung häuslich Pflegender verbessert, die Pflegekompetenz bleibt allerdings weiterhin bei allen befragten Angehörigen autodidaktisch erworben. Häusliche Krankenpflegekurse der Krankenkassen werden nicht besucht, so daß von Seiten der Pflegeversicherung eine Attraktivitätssteigerung der Kurse oder eine eventuelle Einführung einer Teilnahmepflicht wünschenswert ist. Zur systematischen Verhütung und Behandlung eines Dekubitus im hausärztlichen Bereich ist die Entwicklung und Verbreitung einer Leitlinie, entsprechend der amerikanischen Guideline der Agency for Health Care Policy and Research anzustreben. Dem Hausarzt als zentraler Koordinationsstelle zwischen Patient und Pflegenden obliegt ferner die Aufgabe auch auf die Gesundheit der Pflegeperson zu achten, um Überlastungssituationen rechtzeitig diagnostizieren und therapieren zu können.
Osteoarthrose ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die in einem schleichenden Prozeß zur Zerstörung des Knorpels in den gewichttragenden Gelenken insbesondere der Hüfte und des Knies führt. Chronische Behinderungen sind die Folge. Die hohe Prävalenz in der vorwiegend älteren Bevölkerung hat zur Bezeichnung als Volkskrankheit geführt. Die genauen Ursachen der Osteoarthrose sind weitgehend unbekannt, jedoch wird davon ausgegangen, daß eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen anabolen und katabolen Prozessen, die am normalen Knorpelmetabolismus beteiligt sind, zugunsten des Katabolismus stattfindet. Ein Charakteristikum der Krankheit ist die verstärkte Degradation des Proteoglykans Aggrekan, einem der Hauptbestandteile der Knorpelmatrix. Dafür verantwortlich ist besonders im frühen Krankheitsstadium die Enzymaktivität ''Aggrekanase", in späteren Phasen sind auch verschiedene MatrixMetalloproteasen (MMPs) beteiligt. Die Enzymaktivität Aggrekanase blieb lange Zeit unentdeckt und wurde unter den Mitgliedern der MMPFamilie vermutet. Jedoch weisen MMPs und Aggrekanase eine unterschiedliche Spezifität für Aggrekan auf, da MMPs die interglobuläre Domäne des Aggrekans bevorzugt zwischen N 341 und F 342 spalten (MMPSchnittstelle), Aggrekanase dagegen nur zwischen E 373 und A 374 (Aggrekanase Schnittstelle). Daß es sich bei MMPs und Aggrekanase um distinkte Aktivitäten handelt, zeigt die jüngste Klonierung zweier Aggrekanasen, die der Familie der ADAMTSProteasen angehören. Trotz der Identifikation dieser zwei Aggrekanasen, die über eine Metalloprotease, Disintegrin und ThrombospondinDomäne verfügen, sind viele EnzymCharakteristika noch ungeklärt, und auch die Frage, welches dieser beiden Enzyme oder welches noch unentdeckte Enzym in der Pathophysiologie der Osteoarthrose die bedeutendste Rolle spielt, ist noch offen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung der noch weitgehend ungeklärten Substratspezifität der Aggrekanase. Besonderes Interesse bestand in der Frage, welche minimalen Anforderungen ein Substrat erfüllen muß, um von Aggrekanase als solches akzeptiert zu werden, da Hinweise existieren, daß kurze Peptide, die die Schnittstelle in nativem Aggrekan repräsentieren, nicht als AggrekanaseSubstrat erkannt und gespalten werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß tatsächlich Sequenzbereiche des Aggrekans distal zur AggrekanaseSchnittstelle für eine effiziente Spaltung durch Aggrekanase notwendig sind. Durch Mutations und Deletionsstudien mit einem funktionalen rekombinanten Substrat, das die gesamte interglobuläre Domäne des Aggrekans mit der AggrekanaseSchnittstelle beinhaltet, wird gezeigt, daß die Substratregion der MMPSchnittstelle, insbesondere deren N terminale Hälfte, wichtig ist für eine effiziente Spaltung an der AggrekanaseSchnittstelle 32 Aminosäuren weiter Cterminal. Dieses Ergebnis weist auf die Möglichkeit hin, Aggrekanase trete über eine zweite, von der eigentlichen Schnittstelle distinkten Interaktionsstelle mit dem Substrat in Wechselwirkung. Diese Substratspezifität ist in verschiedenen zellulären und nicht zellulären sowie rekombinanten AggrekanaseSystemen reproduzierbar und somit für Aggrekanase charakteristisch. Die membrangebundene MMP14, die unter bestimmten Bedingungen in der Lage ist, eine Proteolyse der AggrekanaseSchnittstelle zu erzeugen, teilt diese Eigenschaft nicht und ist deshalb als Kandidat für die pathologische Aggrekanase Aktivität unwahrscheinlich. Desweiteren wurde die Rolle der Substratglykosylierung für die Degradation durch Aggrekanase untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß die N und OGlykosylierungen des rekombinanten Substrats dessen Spaltung durch Aggrekanase negativ beeinflussen. Einen zusätzlichen Aspekt der AggrekanaseCharakterisierung stellt die Inhibition der Enzymaktivität durch das Mukopolysaccharid Heparin dar. Heparin bindet vermutlich an Enzymdomänen außerhalb der katalytischen Domäne und hemmt so die für eine effiziente Spaltung nötigen Interaktionen zwischen diesen Domänen und dem Substrat. Die Charakterisierung der Enzymaktivität Aggrekanase, die in dieser Arbeit beschrieben ist, führt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Aggrekan Degradation und kann zur Entwicklung neuer Ansätze zur Inhibition des Enzyms im Zuge der Osteoarthrosebekämpfung beitragen.
In den bislang veröffentlichten literaturwissenschaftlichen Arbeiten zum Geldmotiv dominiert zumeist das "Entfremdungsparadigma". Das Geld wird aus soziologischer und philosophischer Perspektive als ein Motor des sozialen Wandels betrachtet, durch den soziale Beziehungen entfremdet, entmenschlicht und versachlicht werden. Bei der Lektüre dieser Arbeiten hat man zumeist den Eindruck, dass das Geld als eine Macht erscheint, die ihre Gestalt im Verlauf des 19. Jahrhunderts nicht verändert hat, die zwar scharf kritisiert worden ist, jedoch nicht im geringsten hat "gebrochen" werden können. Die vorliegende Arbeit geht hingegen davon aus, dass in literarisch gestalteten Geldmotiven nicht nur ein Aufbegehren gegen das Geld gestaltet ist, sondern dass Schriftsteller mit literarischen Werken auch an sozialen Kämpfen um die Aneignung von Geld und um den Wandel seiner Zirkulationsrichtung partizipiert haben. Während des 19. Jahrhunderts entfaltet sich ein Prozeß, der als Desillusionierung des utopischen Liberalismus bezeichnen wird. Unter "utopischer Liberalismus" wird die sich im 18. Jahrhundert formierende Doktrin verstanden, nach der es genüge, das Geld aus seinen feudalen Fesseln zu befreien, um eine sich selbst regulierenden ökonomische und soziale Prosperitätsbewegung in Gang zu setzen. Man schreibt dem ohne Schranken unreguliert zirkulierenden Geld eine soziale Harmonie herstellende gesellschaftsverändernde Kraft zu. Geld erscheint als die Verkörperung der Vernunft. Die in der vorliegenden Arbeit behandelten Autoren und Werke (Balzac, Daumier, Jarry, Vallès, Zola und andere) stellen im 19. Jahrhundert diese Sicht auf das Geld in Frage. Sie stellen dar, welche Auswirkungen die deregulierte Geldzirkulation im 19. Jahrhundert hat. Sie greifen Reformvorschläge ihrer Zeitgenossen auf, die Konzepte zu einer Regulierung der Geldzirkulation entworfen haben und sie entwickeln diese in literarischen Texten weiter. Die Wirtschaftsgeschichte Frankreichs zeigt, dass diese Gegenentwürfe einer Regulierung des Geldes erfolgreich gewesen sind. Die Geldzirkulationsspäre, die Finanzwelt und damit auch das Geld haben ihre Form im 19. Jahrhundert verändert. In der Restauration ist das unproduktive Geldkapital, das vor allem in Staatsrenten angelegt wird, die das politische und ökonomische Leben bestimmende Form des Geldes. Die Gewinne der Kapitalanleger und der Haute Banque, die die Staatsrenten profitabel verwaltet, werden finanziert, indem das Restaurationsregime und auch die Julimonarchie stetig sich verteuernde Steuern auf Konsumgüter erhebt. Den Schaden tragen das produzierende Bürgertum und die unteren Bevölkerungsschichten. Zwischen dem Beginn der Julimonarchie und der Blütephase des Second Empire gelingt es dem industriellen Bürgertum jedoch, die Geldzirkulation in ihrem Interesse zu regulieren. In der Dritten Republik führt dieser Wandel der Geldzirkulation zu einer Überakkumulation von Profiten, die dann in die Epoche des französischen Kapitalexports mündet. Frankreich wird zum Weltbankier, exportiert Geldkapital und importiert ausländische Staatsanleihen mit häufig sehr unsicherer Wertdeckung. Geld wird mehr und mehr zu einem auch fiktiven Wertzeichen. In der Arbeit wird in den unterschiedlichen sozial- und wirtschaftsgeschichtlichen Epochen exemplarisch belegt, welche konkreten Stellungnahmen zur Frage einer notwendigen Regulierung der Macht des Geldes in der Literatur zu finden sind.
Das neue Medium Fernsehen und die soziale Klasse der Arbeiter bis Mitte der 1970er Jahre: Zuwendung, Bedeutung und Auswirkungen Die Nachkriegszeit nach dem Ende des Zweiten Weltkrieges 1945 bis Mitte der 1970er Jahre stellt sich in der Rückschau der Historiker als das ''Goldene Zeitalter" (Hobsbawm) dar. Es ist geprägt von einem ungewöhnlichen wirtschaftlichen Aufschwung, von Vollbeschäftigung und einem zunehmenden Wohlstand auch für Angehörige der sozialen Klasse der Arbeiter. Mit der Ölkrise von 1973 geht diese Zeit der Prosperität zu Ende, es folgen Jahrzehnte der wirtschaftlichen Krise und zunehmend der Umbau der Weltökonomie unter dem Begriff der ''Globalisierung". In dieses ''Goldene Zeitalter" fällt der Aufstieg und die massenhafte Verbreitung eines neuen Mediums des Fernsehens. Innerhalb weniger Jahre erwerben Millionen von Haushalten in den meisten Industrieländern ein Empfangsgerät und spätestens Mitte der 1970er Jahre ist die Vollversorgung erreicht. Ab den 1980er Jahren wandeln sich aufgrund technologischer und ordnungspolitischer Neuerungen die Mediensysteme ein Wandel, dem epochale Qualität zugeschrieben wird. Das neue Medium Fernsehen zeichnet sich durch eine Reihe von sozial relevanten Eigenschaften aus, die es z.B. mit dem Rundfunk teilt und die es z.B. vom Kinofilm unterscheidet: Es ist rezipierbar in der Privatheit der eigenen Wohnung, es ist im Prinzip ständig verfügbar und die Zugangskosten sind nach Anschaffung eines Empfangsgerätes gering. Das neue Medium Fernsehen zeichnet sich aber vor allem mit Meyrowitz durch die Veränderung des Zugangs zu Wissen (hier umfassend verstanden als all die Inhalte menschlichen Denkens) aus. Es führt vormals getrennte Informationswelten zusammen und überwindet somit soziale Barrieren, die bislang den Zugang zu Wissen bzw. Orten verhindert haben. Für die unterprivilegierten Klassen bedeutet dies auch den virtuellen Zugang zu Lebenswelten sozialer Klassen, die ih nen bisher aufgrund ihrer sozialen Lage weitgehend verschlossen blieben. Fernsehen überwindet so virtuell soziale Grenzen. Die Angehörigen von unterprivilegierten Klassen sind es vor allem auch, in deren Leben das Fernsehen eine bedeutende Rolle einnimmt. Die ''Fernsehbedürftigen (Glick/Levy) konzentrieren sich in den mittleren und unteren Regionen des Bourdieuschen Sozialraumes, gemessen an Ausstattung mit ökonomischem und kulturellem Kapital. Differenziert man Fernsehzuwendung unter dem Aspekt der sozialen Lage und der Verortung im Bourdieuschen Sozialraum, so ergibt sich für den Untersuchungszeitraum folgendes Bild: Die ersten Besitzer von Fernsehgeräten in der Anfangsphase des Mediums rekrutieren sich vor allem aus den höheren Regionen des sozialen Raumes. Sie verfügen über ein hohes Einkommen und über hohe Bildung. Nach dieser Anfangsphase verbreitet sich das Fernsehen rasch in den Haushalten von Angestellten und Arbeitern und wird zu einem Massenkonsumgut. Das Einkommen ist bis zur Vollversorgung der Haushalte ein Maß für die Ausstattung mit einem Fernsehgerät. Je geringer das Einkommen, desto geringer der Anteil der Gerätebesitzer. Die meisten Gerätebesitzer finden sich in mittleren und höheren Einkommenslagen. Ab einer gewissen Einkommenshöhe jedoch stagniert der Besitz an Fernsehge räten. Eine Reihe von DetailStudien, die neben dem Einkommen auch Bildung berücksichtigen respektive auf Schichtungsmodelle abheben, zeigen eine inverse Beziehung zwischen hohem sozioökonomischen Status und dem Besitz eines Fernsehgerätes. Wurde das Medium zum Massenkonsumgut, so setzte sich in jenem Segment der Gesellschaft, das sowohl über hohes ökonomisches Kapital als auch hohes kulturelles Kapital verfügte, ein Distinktionsprozess ein, Fernsehen wurde als Zeichen für schlechten Geschmack empfunden. Auf der anderen Seite weist eine Abnahme des Gerätebesitzes mit sinkendem Einkommen nicht unbedingt auf eine geringere Fernsehbedürftigkeit hin: Fernsehen wurde in der Anfangsphase des Mediums von vielen Nichtgerätebesitzern auch in öffentlichen Räumen (Gaststätten) oder bei Freunden und Verwandten rezipiert. Bezüglich der Arbeiterhaushalte in der Bundesrepublik zeigt sich, dass sie ab 1962 geringfügig besser mit Empfangsgeräten ausgestattet sind als Angestelltenhaushalte. Dies gilt auch für untere Einkommen. Dieser Versorgungsgrad stellt für Arbeiter jedoch eine Ausnahme dar: Ansonsten sind sie hinsichtlich der Ausstattung mit langlebigen Gebrauchsgütern schlechter gestellt als Angestelltenhaushalte. Die täglich verbrachte Zeit vor dem Fernseher korrespondiert mit der sozialen Lage: Arbeiter sehen mehr fern als Angestellte. Die Einstellung zum Medium Fernsehen korrespondiert ebenfalls mit der sozialen Lage: Einer geringen Ausstattung mit ökonomischem und kulturellem Kapital entspricht eine eher bejahenden Einstellung, ein hoher sozioökonomischer Status entspricht eher einer kritischen Einstellung. Arbeiter bevorzugen mehr populäre Sendungen. In der Mehrzahl dieser Sendungen kommen Arbeiter als Protagonisten und ihre Lebenswelt kaum vor. Diese Befunde lassen sich sich als eine klassenspezifische Fernsehzuwendung der Arbeiter intepretieren: In der Bundesrepublik sind die Arbeiterhaushalte ab 1962 quer durch alle Einkommensgruppen besser mit Fernsehgeräten ausgestattet als z.B. Angestelltenhaushalte, dafür aber stellen Arbeiter die Anschaffung anderer langlebiger Gebrauchsgüter zurück. Die subjektiv hohe Bedeutung des Fernsehens für Arbeiter scheint in dieser Wahl auf. Arbeiter nutzen auch das Fernsehen zeitlich mehr als Angestellte und sie stehen dem Medium positiver gegenüber. Die Lebensbedingungen der Arbeiter sind im Untersuchungszeitraum von Grenzen bestimmt, die um das zentrale Moment der Lohnarbeit herum gruppiert, den Raum der Lebensmöglichkeiten auf ein spezifisches Maß reduzieren. Dieses Maß äußert sich als eine im Vergleich zu Angestellten, Beamten und Selbständigen mindere Ausstattung mit Ressourcen, mit Kapitalarten im Sinne Bourdieus. So ist ein generelles Merkmal der Lebensbedingungen der Angehörigen der sozialen Klasse der Arbeiter die Minderausstattung mit Wissen. Der Zugang zu formaler höherer Schulbildung ist durch ''unsichtbare" Klassenschranken erschwert. Dazu zählen neben geringen finanziellen Ressourcen auch eine ''soziale und affektive Distanz" zur bürgerlichen Welt jenseits der eigenen Arbeiterexistenz, die kaum bekannt ist und in der der Arbeiterhabitus sich als Hemmnis erweist. So bleibt der Zugang zu höherer Schulbildung, in der Bundesrepublik zumindest bis zur Öffnung des Bildungssystems Ende der 1960er Jahre, nur wenigen vorbehalten. Arbeiterkinder an den Universitäten sind die Außnahme von der Regel und sie sind Grenzgänger zwischen zwei sozialen Welten: ''Die eine seiner Welten ist tot, und doch ist er ohnmächtig, die andere zu gewinnen..." Ein weiteres Merkmal der Arbeiterexistenz ist die Verortung der Arbeiter im physischen Raum als Widerspiegelung der Verortung im sozialen Raum. Die von den Arbeitern sich selbst zugeschriebene soziale Position des ''unten" findet seine Entsprechung in der Positionierung innerhalb der räumlichen Struktur der Produktion: Unten das ist konkret auch die Fabrikhalle, über die sich die Verwaltungsetagen erheben. In der Topographie des öffentlichen Raumes sind die Arbeiter an bestimmte Orte gebunden: Das Arbeiterviertel, Wohnungen des sozialen Wohnungsbaus, bestimmten Freizeiteinrichtungen wie das Fußballstation etc. Diese habituelle und gesellschaftlich konstituierte Gebundenheit läßt den Arbeiter selten aus seinem Verkehrskreis heraus und in gleichgestellten Kontak mit Angehörigen anderer sozialer Klassen treten. In der privaten Sphäre ist die Aneignungsmöglichkeit von Raum durch die finanziellen Ressourcen bestimmt: Arbeiterhaushalte sind, was Wohnfläche und Wohnungsausstattung betrifft, am häufigsten unterversorgt, Arbeiter wohnen in beengteren Verhältnissen. Neben diese spezifische Aneignungsmöglichkeit von Raum tritt die spezifische Aneignungsmöglichkeit von frei verfügbarer Lebenszeit. Die Ausgestaltung und das Maß dieser frei verfügbaren Zeit ist untrennbar gekoppelt an die Bedingungen der Lohnarbeit und dieses ''Reich des Notwendigen" strahlt aus auf die ''Freizeit". Die Arbeitsbedingungen sind gekennzeichnet durch einen Mangel an Autonomie und Selbstbestimmung, die körperliche Arbeit steht im Vordergrund und bringt Belastungen durch Lärm, Staub, Hitze etc. mit sich. Akkord und Schichtarbeit ist weitverbreitet und Arbeiterfrauen sind der Doppelbelastung von Berufstätigkeit und Haushalt ausgesetzt. Trotz aller Arbeitszeitverkürzung bleibt Zeit für Arbeiter und vor allem für Arbeiterfrauen eine knappe Ressource. Die Freizeit ist vor allem geprägt durch ein spezifisches Regenerationsbedürfnis, in dem die Wiederherstellung der Arbeitskraft einen deutlich höheren Stellenwert einnimmt als bei Angehörigen anderer Berufsgruppen. Diese Charakteristika der Arbeiterexistenz bleiben im wesentlichen bis in die 1970er Jahre hinein bestehen, auch wenn sich im ''Goldenen Zeitalter" die Lebensbedingungen der Arbeiter im Vergleich zur Vorkriegszeit deutlich verbessert haben. Auf der Folie dieser Lebensbedingungen lässt sich die Bedeutung der spezifischen Fernsehzuwendung der Arbeiter rekonstruieren. Fernsehen öffnet zum einen (medial) die Grenzen einer sozialen Klasse, in deren Lebenszusammenhang soziale Grenzen eine alltägliche Erfahrung darstellen und diese schwer zu überwinden sind. Fernsehen zeigt die Welt jenseits der eigenen Arbeiterexistenz und überwindet die Perspektive des ''unten", überwindet das Eingeschlossensein in den eigenen Verkehrskreis und den beschränkten (Erfahrungs)Horizont des Arbeiterviertels und der beengten Wohnung. Der Gebrauchswert von Fernsehen für Arbeiter ist so bedingt durch das Bedürfnis, wenn schon nicht die eigene soziale Lage überwinden zu können, so doch zumindest Anteil an der Welt jenseits der eigenen sozialen Grenzen zu nehmen. Der Gebrauchswert von Fernsehen ergibt sich dann aus seiner Eigenschaft als Medium, den Zugang zu Wissen zu ermöglichen und diese Eigenschaft gewinnt in Hinsicht auf den beschränkten Wissenszugang von Arbeitern eine klassenspezifische Relevanz. Via Bildschirm öffnet sich der Blick auf die Welt jenseits der eigenen sozialen Grenzen und ermöglicht damit die Kompensation von auch subjektiv so empfundenen Einschränkungen der Welterfahrung und Weltaneignung. Verbunden mit diesem Gebrauchswert und im Grunde auch nur für analytische Zwecke zu trennen ist zum anderen der Gebrauchswert des Fernsehens für Arbeiter im Kontext ihrer spezifischen Regenerationsbedürfnisse. Die soziale relevanten Eigenschaften des Fernsehens wie die Plazierung innerhalb der privaten Sphäre der Wohnung, die Verfügbarkeit und die geringen Kosten ergänzen sich durch den ''Fluß der Bil der" (Kracauer) und bieten so ein Medium, das ohne zusätzliche weitere Verausgabung wie Ortswechsel oder soziokulturelle Anstrengungen nach den Belastungen der Produktionsarbeit Entspannung und Erholung bietet. Als Äquivalent zu passiven Tätigkeiten auf niedrigem Aktivitätsniveau wie Dösen oder AusdemFensterSchauen fügt es sich optimal in die Regenerationsbedürfnisse von Arbeitern innerhalb der ''Freizeit" ein. Und der kollektiven Erfahrung einer sozialen Lage, die zwischen Fabrik und Familie, zwischen Produktion und Reproduktion wenig Spielraum für Weltaneignung lässt, entspricht die Zuwendung zu den Produkten der Kulturindustrie, die den Glanz einer vielfältigeren Welt jenseits von Betriebstoren und Wohnküchen anbieten. Arbeiter lassen sich kaum für sogenannte ''Arbeiterfilme" begeistern, die Verdoppelung ihrer tagtäglich erlebten Erfahrungswelt auf dem Bildschirm hat für sie keinen Gebrauchswert. Dem entspricht vielmehr, was schon Hofmannsthal über das Kino der Stummfilmzeit schrieb: Die Suche nach Lebensessenz, nach Bildern, die einem das Leben schuldig bleibt. Für die Angehörigen der sozialen Klasse der Arbeiter lassen sich die Gebrauchswerte von Fernsehen in Bezug auf das Mediennutzungsschema als zu dem kompensatorischen Pol hinneigen interpretieren. Was die soziale Lage und die ihr eingschriebenen sozialen Grenzen an Handlungsmöglichkeiten mindert, erfährt virtuelle Kompensation durch das Medium. Auf diesem Hintergrund wird auch verständlich, warum geht die Frage nach den Auswirkungen dieser spezifischen Fernsehzuwendung durch Arbeiter all das rezipierte Wissen z.B. über die Praktiken der Angehörigen anderer sozialer Klassen sich nicht in den Praktiken der Arbeiter niederschlagen. Denn dieses Wissen, dessen Gebrauchswert aus einer anderen sozialen Realität mit anderen Bedürfnissystemen entspringt, macht innerhalb der klassenspezifischen Handlungsmöglichkeiten der Arbeiter und ihrer Bedürfnissysteme schlicht keinen Sinn der Handlungspol bleibt sozusagen blockiert. Der Arbeiterhabitus bleibt wie empirische Studien aus den 1960er Jahren zeigen auch angesichts eines wachsenden, bis dahin nicht gekannten Wohlstandes des ''Goldenen Zeitalters" und auch angesichts der Rezeption von FernsehWissen, wie zu ergänzen ist, bestehen. Die These von der ''Verbürgerlichung der Arbeiterklasse", auch unter dem Einfluss des Fernsehens wie sie in den 1960er Jahren formuliert wurde, war nicht haltbar, von einer Verbürgerlichung im Sinne der Übernahme von Werten, Praktiken und Einstellungen der Mittelklasse konnte keine Rede sein. Arbeiter gingen auch nicht auf in einer großen Masse der Lohnabhängigen, sondern blieben eine unterscheidbare Großgruppe innerhalb einer Gesellschaft, die sehr wohl soziale Unterschiede kannte und von einer ''Nivellierten Gesellschaft" noch weit entfernt war und ist. Allerdings aber setzte zeitgleich mit der Verbreitung des Fernsehens ein Prozess der Privatisierung der Arbeiter ein, der sich im Rückzug auf die private Sphäre das Heim und die Familie äußerte und in der wesentliche Kompensationsmöglichkeiten für die Zumutungen aus der Arbeitswelt gesucht als auch wesentliche Identitätsbedürfnisse in diese Sphäre verlagert wurden. Diese Bindung des Arbeiters an das Heim ist nicht zuletzt den sozial relevanten Eigenschaften des Mediums Fernsehen zuzuschreiben, das innerhalb der ''eigenen vier Wände" die oben angeführten Gebrauchswertansprüche erfüllte. Das Wohnzimmer in den Arbeiterhaushalten und der darin zentral plazierte Fernsehapparat sind ein Symbol für diese neue Privatheit, die durch die Auflösung ehemals proletarischer Wohn und Nachbarschaftsverhältnisse bestärkt wird. Innerhalb dieser privaten Sphäre öffnen sich auch die relativ autonomen Handlungsmöglichkeiten des Arbeiters lassen sich Gebrauchswertansprüche an das Fernsehwissen der handlungsorientierten Funktion zuschreiben in den Bereichen des Körpers, des Konsums, der Familie und ihnen entspricht die Rezeption populärer Sendung vom Sport über Heimwerkertipps bis hin zur Darstellung menschlicher Schicksale. Von einer ideologischen Intergration der Arbeiter durch Fernsehen kann, zumindest was den Habitus anbetrifft, nicht gesprochen werden. Arbeiter bleiben Arbeiter und übernehmen nicht die Werte und Praktiken der Mittelklassen. Die medienzentrierte und ideologiethematisierende Sicht etwa des materialistischen Ansatzes als auch der frühen cultural studies aber auch die Thesen von einer ''nivellierenden" Wirkung des Fernsehens unterschätzen die Macht materieller Strukturen. Für die Integration der sozialen Klasse der Arbeiter in die Nachkriegsgesellschaft spielen die materiellen Verbesserungen der Lebensverhältnisse im ''goldenen Zeitalter" des Klassenkompromisses (relative Vollbeschäftigung über längere Zeiträume hinweg, erhöhtes Lohnniveau über der Schwelle der Existenzerhaltung, soziale Absicherung, schließlich vermehrte Bildungschancen etc.) eine ungleich größere Rolle als die ideologische Integration durch Massenmedien wie dem Fernsehen. Die Dominanz der materiellen Strukturen zeigt auch der Vergleich der möglichen Auswirkungen der Umwälzung des WissensZuganges durch Fernsehen in den beiden deutschen Staaten. Gegeben, dass mit Meyrowitz und somit auch weitgehend unabhängig von den Inhalten, dem Fernsehen in der DDR und in der Bundesrepublik der gleiche Effekt in Bezug auf einen veränderten WissensZugang zuzuschreiben ist, entwickeln sich die Sozialstrukturen der beiden deutschen Staaten unterschiedlich. Während in der Bundesrepublik die Zahl der Arbeiter abnimmt und sich die soziale Klasse in Teilen modernisiert, zeichnet sich die Sozialstruktur der DDR durch einen nach wie vor hohen Anteil an Arbeitern aus. Die ''pluralistische Klassengesellschaft" der Bundesrepublik zeichnet sich gegenüber der ''blockierten Klassengesellschaft" der DDR durch einen ab den 1960er Jahren stattfindenden Modernisierungsprozess bzw. der ''Öffnung des sozialen Raumes" aus. Diese Öffnung des sozialen Raumes meint u.a. auch eine Modernisierung der Erwerbsstruktur, in dessen Verlauf Berufe zunehmen, zu deren Ausübung ein vermehrter Erwerb von Bildung bzw. kulturellem Kapital erforderlich ist. Von den neuen Bildungs und Berufschancen profitieren vor allem die Kinder der (Fach)Arbeiter und unteren Angestellten. Während in der Bundesrepublik durch die Öffnung des sozialen Raumes Handlungsmöglichkeiten entstehen, in denen das FernsehWissen in kulturelles Kapital gewandelt werden konnte, ist die Sozialstruktur der DDR dadurch gekennzeichnet, dass aufgrund des unterbliebenen Modernisierungsprozesses die Entwicklung hin zu modernisierten Fraktionen der einzelnen Klassen und zu einer modernisierten Mitte unterblieb. FernsehWissen blieb somit aufgrund fehlender Handlungsmöglichkeiten auf der materiellen Ebene ohne Bedeutung. Während in der Bundesrepublik sich Kinder aus Arbeiterhaushalten durch Wechsel in andere Berufspositionen auch in andere Positionen des sozialen Raumes begeben konnten, die soziale Klasse der Arbeiter rein zahlenmäßig schrumpfte und sich in Teilen modernisierte und sich das Fernseh-Wissen sozialstrukturell als prinzipielle Unterstützung dieses Bildungsaufstieges niederschlagen konnte, blieb in der DDR die soziale Klasse der Arbeiter bzw. der Anteil der Bevölkerung mit Arbeiterhabitus als Indikator für eine blockierte Klassengesellschaft vergleichsweise groß. Die Auswirkungen von FernsehWissen zeigen sich somit abhängig von der Eröffnung von Handlungsmöglichkeiten auf der materiellen Ebene hier: die Öffnung des sozialen Raumes in der Bundesrepublik seit den 1960er Jahren und lassen sich als eine Verstärkung von Entwicklungstendenzen des sozialstrukturellen Wandels interpretieren.
Schemaevolution in objektorientierten Datenbanksystemen auf der Basis von Versionierungskonzepten
(2000)
Gegenstand dieses Kapitels ist zunächst die Zusammenfassung der in dieser Arbeit erreichten Ergebnisse im Hinblick auf die ursprüngliche Zielsetzung, also die Unterstützung von Schema evolution in objektorientierten Datenbanksystemen. Anschließend folgen Überlegungen, welche der erzielten Ergebnisse zur Lösung von Problemen in anderen Arbeitsbereichen herangezogen werden können und auf welche Weise dies geschehen kann. Die Arbeit schlie?t mit einem Ausblick auf weitere Arbeiten im von uns bearbeiteten Themengebiet. Erreichte Ziele Ausgangspunkt unserer Arbeit war die Beobachtung, dass die Evolution von Datenbankschema ta, welche zur Anpassung an sich ändernde funktionale und nichtfunktionale Anforderungen 130 der Diskurswelt benötigt wird, durch die gegenwärtig verfügbaren Modelle und Systeme nicht adäquat unterstützt wird. Wir stellten daraufhin die Hypothese auf, dass ein Modell auf der Basis der Versionierung von Schemata mit einer entsprechenden Abbildung der Änderungen auf die Objektebene dies leisten kann. Wir konnten in dieser Abhandlung zeigen, dass das nach diesen Gesichtspunkten entworfene COASTModell die daran gestellten Erwartungen erfüllt und Sche maänderungen in Gegenwart existierender Objekte und Applikationen erfolgreich realisierbar sind. Die einzelnen Arbeitsschritte und Ergebnisse ergaben sich dabei wie folgt: - Problemanalyse und grober Modellentwurf: Die Notwendigkeit einer Unterstützung für Schemaevolutionsprozesse ergab sich aus der Beobachtung, dass vor allem moderne An wendungsbereiche eine flexible Anpassung an ständig veränderliche Umstände erfordern. Während des Betriebs einer Datenbank aufkommende Änderungsanforderungen lassen sich zur Entwurfszeit nicht vorhersehen und sind im Rahmen fest vorgegebener Datenbanksche mata nur schwerlich adäquat umsetzbar. Wir konnten in diesem Zusammenhang bei den vorhandenen Systemen zur Unterstützung der Schemaevolution das Fehlen einer Berück sichtigung im Betrieb beøndlicher Datenbankapplikationen feststellen. Gleichzeitig blieben Anforderungen an flexibel koppelbare Datenbankzustände für verschiedene Schemaausprä gungen bisher unberücksichtigt. Das an dieser Stelle grob skizzierte Modell zur Lösung des Problems beruhte folgerichtig auf dem Einsatz von Versionierungskonzepten auf der Ebene der Datenbankschemata. Solche Versionierungskonzepte hatten ihre Fähigkeiten zur Unterstützung von Evolutionsprozessen insbesondere auch im Zusammenhang mit Entwurfsaufgaben bereits zuvor sowohl auf der Ebene kompletter Datenbanken als auch auf der einzelner Objekte nachgewiesen. - Untersuchung bestehender Lösungsansätze: Wir konnten für das Lösungsmodell vier ele mentare Aspekte identiøzieren: Durchführung von Änderungen auf Schemaebene unter Verwendung von Versionierungskonzepten, Erzeugung und Verwaltung der Abhängigkeits beziehungen zwischen den Schemaversionen, Abbildung der Änderungen auf die Objekt ebene sowie flexible Konzepte zur Steuerung und Durchführung der Objektpropagation. Da kein Modell existierte, das all diese Punkte berücksichtigt, mussten wir uns in der Literatur recherche auf Ansätze beschränken, die sich mit einzelnen Aspekten unserer Aufgabenstel lung befassen. Aus dieser Perspektive stellt sich unser Modell zu einem Teil als Integration früherer Arbeiten dar. Zum anderen Teil beruht unser Modell in den grundlegenden Aspek ten der Behandlung von Ableitungsbeziehungen sowie der Steuerung und Durchführung der Objektpropagation auf gänzlich neuen Ansätzen. Die wesentliche Erkenntnis dieses Arbeitsschrittes ist somit die Feststellung, dass einerseits verschiedene Konzepte bestehen der Ansätze übernommen werden konnten, obwohl keine Arbeit alle Anforderungen an unser Modell erfüllte, und andererseits einige Aspekte bislang nahezu vollständig ignoriert wurden. - Detaillierte Modellbildung: Aufgrund der Erkenntnisse über bestehende Arbeiten entwarfen wir in diesem Arbeitsschritt COAST als Modell zur Durchführung von Schemaänderun gen in Anwesenheit von Objekten und Applikationen. Grundbestandteile unseres Ansatzes sind die Schemaversionen, die vergleichbar einer Konøgurationsverwaltung semantisch in Zusammenhang stehende Klassenversionen zu konsistenten Teilstrukturen zusammenset zen. Für die Durchführung von Schemaänderungen haben wir zwei grundsätzlich verschiedene Wege analysiert und resultierende Konsequenzen studiert. Dem internen Ansatz folgend wird eine von dem jeweiligen Einsatzgebiet des Systems unabhängige, fest vorgegebene und konzeptionell vollständige Taxonomie von Schemaänderungsprimitiven bereitgestellt, de ren Semantik a priori bekannt ist und demzufolge bei allen weiteren Schritten auf Schema und Objektebene berücksichtigt werden kann. Der externe Ansatz, als Alternative, erlaubt die Durchführung applikationsspezifischer Schemaänderungen und erhöht damit die Flexi bilität. Der Prozess des Einbringens extern erstellter Schemaversionen in das System kann dabei in vielfältiger Weise unterstützt werden. Bemerkenswerterweise fanden sich die auf Schemaebene angewandten Konzepte analog auf Instanzenebene wieder und zwar bei den Objektversionen, deren Zusammenhang sich in Form von Propagationsgraphen widerspiegelt ähnlich den Ableitungsbeziehungen auf Sche maebene. Die Steuerung der Objektpropagation sowohl zum Zeitpunkt der Schemaände rung als auch später, als Reaktion auf verändernde Datenbankzugrioee ist im behandelten Umfeld mit Sicherheit einzigartig. - Validierung des Modells: Aussagen zur Tauglichkeit des Modells im Hinblick auf seine Kon zeptionsziele konnten wir durch eine Evaluierung anhand unserer sehr detailliert beschrie benen Vorgaben erhalten. Damit ist gleichzeitig ein Vergleich mit bisherigen Lösungswegen insgesamt und mit einzelnen Vertretern davon gegeben. Die Evaluierung konnte in allen Aspekten belegen, dass das COASTModell zur Unterstützung von Schemaänderungen in Benutzung befindlicher Datenbanksysteme gut geeignet ist. Wir möchten an dieser Stelle nochmals betonen, dass COAST in vielerlei Hinsicht einfach erweitert werden kann und im Vergleich zu bisherigen Systemen durch erheblich flexiblere Möglichkeiten der Einflussnahme und eine verbesserte Tauglichkeit ausgezeichnet wird. Zu nächst sind sowohl die hier vorgestellte Schemaänderungstaxonomie als auch die damit ver bundene Propagationssprache vielfältig um komplexe Operationen erweiterbar. Weiterhin kann die Menge verwendbarer Propagationsflags insbesondere mit Blick auf das Verhalten bei komplexen Schemaänderungen hin ergänzt werden. Aber bereits die hier dargestell ten Möglichkeiten der Propagationssteuerung decken das gesamte Spektrum von isolierten Schemaversionen am einen Ende bis hin zur kompletten Propagation am anderen Ende ab. In Erweiterung der Konzepte auf der Basis von Sichtenmechanismen können durch die Objektversionierung beliebige Änderungen des Datenbankzustandes durchgeführt wer den. Damit wird ein erheblicher Beitrag für die Transparenz der Schemaevolution für die Applikationsentwickler geleistet. Die für die Tauglichkeit wichtigste Eigenschaft besteht zweifelsfrei in der Möglichkeit, be stehende Applikationen auch noch nach der Durchführung von Schemaänderungen ohne Anpassung weiterverwenden zu können. Damit erweitert sich der Einsatzbereich von Sche maänderungen auf sehr große, komponentenbasierte Systeme auf der Basis zahlreicher Einzelapplikationen. - Hinweise für den Datenbankentwurf: Um den Schemaversionierungmechanismus adäquat einsetzen zu können, erweisen sich Aussagen über den Schemaänderungsprozess als notwen dig. Daher haben wir diesen Prozess systematisch in Teilschritte zerlegt, die nacheinander betrachtet werden können. Bereits während der Modellbildung haben wir dort, wo sich ei nem Schemaentwickler Alternativen im Umgang mit COAST bieten, diese aufgezeigt und ihre jeweiligen Konsequenzen untersucht. Im Ergebnis resultiert für den Schemaentwick ler im Vergleich zu unversionierten Systemen ein zusätzlicher Spezifikationsaufwand. Dies ist jedoch für die Erreichung unserer Ziele unvermeidbar und der Gesamtaufwand für die Durchführung einer Schemaänderung reduziert sich dem Versionierungskonzept folgend er heblich, nicht zuletzt, weil aus der Sicht der Applikationsentwickler die volle Transparenz gewährleistet wird. - Realisierungsbetrachtungen: Um Erkenntnisse über den Realisierungsaufwand sowie die zu erwartenden Leistungsmerkmale zu erhalten, haben wir zweierlei Ansätze für eine pro totypische Realisierung untersucht. Zum einen haben wir einen Schemaversionierungsme chanismus als Aufsatz auf dem kommerziellen Objektdatenbanksystem O 2 implementiert. Auch wenn sich dies konzeptionell als möglich erwiesen hat, so haben sich dort an mehre ren Stellen erhebliche Einbußen bezüglich der Transparenz gezeigt [Wöh96]. Daher haben wir uns verstärkt mit dem zweiten, deutlich aufwendigeren Weg beschäftigt: die Eigenent wicklung eines kompletten, objektorientierten Datenbankmanagementsystems, bei dem die Konzepte von COAST transparent und von Anfang an im Kern integriert werden konnten. Die Realisierung der verzögerten Propagation kann bei realistischen Zugriffsprofilen mit einer gewissen Lokalität bezüglich der Schemaversionen größenordnungsmäßig mit unver sionierten Systemen vergleichbare Laufzeiten erreichen. Konzeptionell bedingt muss zwar ein größerer Platzbedarf als bei einem statischen System (ohne Schemaänderungen) in Kauf genommen werden. Im Vergleich zu anderen Konzepten der Schemaevolution, etwa den Ansätzen auf der Basis von isolierten Datenbanken oder mit materialisierten Sichten tritt aber kein Mehraufwand auf. In all diesen Varianten wird, ähnlich wie bei Puffern absichtlich Platz zugunsten einer erhöhten Zugriffsgeschwindigkeit investiert. Je ähnlicher sich verschiedene Schemaversionen sind und je intensiver die Propagation zwischen ihnen demnach ausfällt, desto besser sind die Voraussetzungen für platzsparende Mechanismen auf der Basis von mehreren Schemaversionen gemeinsam genutzter Objektversionen. In die sem Zusammenhang konnten wir eine Reihe von Verbesserungsmöglichkeiten identifizieren, die den COASTPrototyp Systemen auf der Basis von Sichtenmechanismen gleichstellen würden. Übertragbarkeit der Ergebnisse Die Tragfähigkeit der Konzepte des COASTModells für die Unterstützung evolutionärer Sche maänderungen haben wir erfolgreich belegen können. Im folgenden sprechen wir noch einige Möglichkeiten an, die in dieser Abhandlung gewonnenen Erkenntnisse auch im Zusammenhang mit anderen Konzepten einzusetzen. - Abschnitt 2.2 hatte allgemeine Versionierungskonzepte vorgestellt, wie sie typischerweise auf Objekte angewendet werden, um deren inhaltliche Evolution abzubilden. Wir haben dieselben Konzepte in der vorliegenden Arbeit auf Schemata als Instanzen der Metaebene angewendet, um deren evolutionäre Entwicklung zu unterstützen. Dabei hat sich die Ver wendung versionierter Datenbankobjekte ebenfalls als sehr hilfreich erwiesen. Die Versio nen eines Objektes bei der Schemaversionierung repräsentieren ein Objekt in verschiedenen Datentypen. Von Situationen abgesehen, in denen das Modifikationsflag abgeschaltet ist und Änderungen daher gewollt nicht propagiert werden, repräsentieren die Versionen eines Objektes denselben logischen Objektwert. Damit unterscheiden sich die hier verwendeten Objektversionen von denen der klassischen Objektversionierung. Letztere stellen nämlich verschiedene logische Objektwerte dar, die allerdings alle demselben Datentyp entsprechen. Die vorangegangene, vergleichende Betrachtung zeigt einerseits, dass die beiden Formen der Versionierung unterschiedliche Ziele verfolgen, und andererseits legt sie die Vermutung nahe, dass es sich um orthogonale und damit gewinnbringend kombinierbare Ansätze han delt. Verschiedene Typen zur Darstellung desselben logischen Objektwertes hier stehen verschiedenen Objektwerten desselben Typs dort gegenüber. Tatsächlich lässt sich unser Ansatz um Mechanismen zur Objektversionierung erweitern, indem jede unserer Objektversionen nun durch verschiedene klassische Objektversionen ersetzt wird. Damit entsteht ein zweidimensionaler Raum von Objektversionen: entlang der einen Dimension liegt jeweils ein logischer Objektwert in verschiedenen Typen, entlang der anderen Dimension liegen jeweils verschiedene logische Zustände eines Objektes, die durch denselben Typ repräsentiert werden. Um die Kombination der beiden Versionierungskonzepte zu erreichen, sind allerdings noch einige Fragen näher zu untersuchen. Diese beschäftigen sich beispielsweise mit dem Zu sammenhang zwischen den Objektversionen entlang der beiden Dimensionen und mit der Propagation versionierter Objekte. Hier ist beispielsweise zu klären, ob alle, oder wenn nicht welche der logischen Objektwerte eines Objektes in andere Schemaversionen zu pro pagieren sind. Schließlich bietet die Realisierung des integrierten Gesamtkonzeptes zahl reiche Ansatzpunkte für technische Optimierungen und erfordert diese auch, um sowohl den Zeitaufwand für die Propagation als auch den Platzbedarf für die Speicherung der zweidimensional versionierten Objekte zu reduzieren. - Wir waren in der Literaturrecherche auf das Sichtenkonzept als Grundlage zur Simulati on von Schemaänderungen eingegangen und hatten dabei einige Deøzite bei der Lösung der hier betrachteten Aufgabenstellung identiøziert. Dies impliziert jedoch keine Aussa ge über die Tragfähigkeit von Sichten in dem Umfeld, für das sie ursprünglich konzipiert worden waren. Aufgrund der mit COAST erzielten Transparenz, die eine Schemaversion nach außen hin wie ein Schema eines unversionierten Systems erscheinen läßt, kann ein Sichtenkonzept auf dem COASTModell aufgesetzt werden. Konzeptionelle Schwierigkei ten sind durch die Kombination von Sichten und Schemaversionen nicht zu erwarten: Beim Ableiten neuer Schemaversionen können auf den Vorgängern definierte Sichten bei Bedarf mitintegriert werden und das Anlegen, Ändern und Löschen von Sichten kann durch die Primitive des Sichtenmechanismus erfolgen. In einem beide Konzepte integrierenden System kann entsprechend der gestellten Anforderungen entschieden werden, ob diese besser durch Anlegen einer neuen Sicht oder durch Ableiten einer neuen Schemaversion erfüllt werden. - Einen Schritt über die Integration eines separaten Sichtensystems hinaus geht die Über legung, ob Sichten nicht sogar durch Schemaversionen simuliert werden können. Damit wäre dann auch eine vollständig homogene Integration beider Konzepte in einem System erreicht. Um diese Überlegung zu verfolgen, betrachten wir die konzeptionellen Kompo nenten eines Sichtensystems und analysieren kurz, wie diese auf die Konzepte von COAST abgebildet werden können. Die für den Schemaentwickler zu verwendende Schnittstelle eines Sichtensystems ist durch die Sichtendefinitionssprache gegeben. Die dort zur Verfügung stehenden Konstrukte die nen zunächst der Definition des Sichtschemas und sind insoweit durch die Primitive der COASTODL abgedeckt. Darüber hinaus bestimmt eine Sichtendefinition die Extension der Sichtklassen durch Angabe je einer Anfrage, wobei das Ergebnis dieser Anfrage dem Schema der definierten Sichtklasse entsprechen muss bzw. dieses implizit erst bestimmt. Um diesen Teil eines Sichtenkonzeptes zu simulieren, sind in COAST zwei Erweiterungen not wendig. Zum einen wird eine Anfragesprache benötigt. Diese wäre für die Vervollständigung von COAST sowieso erforderlich und könnte sich konzeptionell sehr stark an bestehenden objektorientierten Anfragesprachen orientieren. Ein Anfragesystem muss zu jeder Anfrage zunächst das Schema ihres Resultates ermitteln und dieses könnte dann mit den Primiti ven der COASTODL erstellt werden. Daraufhin muss das Anfragesystem die eigentliche Durchführung der Anfrage auf der Datenbank erledigen. Dies beschreibt gleichzeitig die zweite in COAST erforderliche Erweiterung. Für die Durchführung der Anfrage und ins besondere der darin ggf. enthaltenen Selektion von Objekten müsste eine entsprechende Erweiterung der Propagationssprache von COAST vorgenommen werden. Änderungen von Objekten in Sichtklassen sind aufgrund des Sichtenänderungsproblems i.Allg. nicht durchführbar, da in der Sichtendefinitionssprache keine Möglichkeit besteht, die Auswirkungen einer solchen Änderung auf die Objekte des Basisschemas zu spezifi zieren. Daher bieten einige Konzepte Erweiterungen an, die man in COAST durch Ver wendung von Rückwärtskonvertierungsfunktionen bereits hat. Durch die Vorwärts und Rückwärtskonvertierungsfunktionen können beide Richtungen von Abbildungen zwischen (simuliertem) Basisschema und (simuliertem) Sichtschema sogar homogen durch dasselbe Konzept spezifiziert werden. Die Propagationsflags wären zur Simulation alle eingeschaltet und durch die Verwendung der verzögerten Propagationsmechanismen von COAST liefert die Simulation von Sich ten durch Schemaversionen zusätzlich ein optimiertes Konzept der Materialisierung von Sichten. - Das Konzept der direkten Schemaevolution hatte sich bei der Anwendung in dem hier beschriebenen Einsatzgebiet als zu restriktiv erwiesen. Nichtsdestotrotz kann die direkte Schemaevolution in Einzelfällen für die Durchführung von Schemaänderungen genügen, insbesondere solange noch keine Applikationen für eine Schemaversion implementiert sind. Folgerichtig können Situationen entstehen, wo selbst eingefrorene Schemaversionen noch in eingeschränktem Umfang änderbar wären, auch wenn dies i.Allg. nicht der Fall ist. Daher haben wir eine Kombination der direkten Schemaänderung mit dem Versionierungsansatz auf der Basis des Datenmodells von O 2 untersucht [FL96] (siehe Abschnitt 5.4.2). Dort konnten wir durch eine Klassiøkation der Schemaänderungsprimitive feststellen, ob den im Einzelfall gegebenen Umständen zufolge die Ableitung einer neuen Schemaversion erfor derlich ist oder nicht. Auf diesem Wege kann die Zahl entstehender Schemaversionen und damit auch der sich ergebende Verwaltungsaufwand reduziert werden. - Die in Datenbanksystemen benötigten Änderungsoperationen lassen sich drei elementaren Kategorien zuordnen:
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden konformationelle und strukturelle Eigenschaften Biomolekülen Hilfe NMRspektroskopischen und biochemischen Methoden, sowie Synthese Liganden untersucht. Kapitel wurde das Verhalten beiden Hauptkonformere des Dolastatin Gegenwart Tubulin untersucht. wurden sechs neuartige Dolastatin 10Derivate synthetisiert, welche TubulinPolymerisation unterschiedlich inhibieren. Das Protein Tubulin wurde sowohl die vitroBindungsstudien auch für NMR spektroskopischen Experimente isoliert. Verbindungen 35b repräsentieren jeweils und das transKonformer des Dolastatin 10, wobei erstere einen stärke inhibitorischen Effekt der TubulinPolymerisation das lineare Dolastatin Derivat zeigte. Daraus kann man schließen, cisKonformation Dola statin Inhibition der TubulinPolymerisation verantwortlich ist. Durch diese neue Erkenntnis können Dolastatin 10Derivate, welche dem cisKonformer Dolastatin entsprechen, synthetisiert werden und potentielle Krebstherapeutika Anwendung finden. einem zweiten Ansatz wurde das Nmarkierte lineare Dolastatin 10Derivat heteronuclearen zweidimensionalen NMRExperimenten in Gegenwart von DEAE MAPTubulin untersucht. Durch Bestimmung der Korrelationszeiten Konformer Verbindung Gegenwart DEAE und MAPTubulin den beiden Dimensionen gekoppelten 1 H 15 NHSQCSpektren konnte gezeigt werden, cisKonformer von schnellen Austausch gebundenen Form befindet. Gegenwart DEAETubulin stellt man einen erhöhten cisGehalt von fest, welcher auf eine schwache Bindung des Liganden hindeutet. Falle MAP Tubulins der Anteil cisKonformers von Vergleich freien Verbin dung nahezu unverändert. Durch erhöhte Korrelationszeit des cisKonformers Gegenwart von MAPTubulin kann man eine zusätzliche Wechselwirkung mit MAPs annehmen, welche eventuell Bindung betaUntereinheit des Tubulins verstärkt. Außerdem könnte die Wechselwirkung der MAPs mit dem Tubulin durch den Liganden gestört werden. Bei den entsprechenden Messungen mit Cmarkiertem Colchicin in Gegenwart DEAE und MAPTubulin konnte ebenfalls schneller Austausch Liganden gebundenen Form nachgewiesen werden. Hierbei wurde aber kein unterschiedliches Verhalten bei beiden TubulinSorten festgestellt. Die Bindungsstelle Colchicin betaUntereinheit Tubulins unterscheidet sich der Dola statin (Abb. 2.12). Deshalb kann man zusätzliche Wechselwirkungen MAPs ausschließen. Versuche zum Einsatz Vanadat Übergangszustandanalogon Phosphat Spaltreaktion des Hammerhead Ribozyms wurden in Kapitel beschrieben. Zunächst wurden experimentellen Rahmenbedingungen Komplexbildung Vanadat 1,2cisDiolen der Ribose einfachen Nucleosiden und Nucleotiden getestet. konnte gezeigt werden, daß freie Phosphatgruppen Komplexierung Vanadats dem 1,2cisDiol Ribose verhindern. Allerdings stört die Anwesenheit Phosphosäurediestern nicht gewünschte Komplexbildung. Diese Erkenntnisse wurden bei verschiedenen RNAKonstrukten Hammerhead Ribozyms berück sichtigt. Durch Einführung von desoxyRibose den 3'terminalen Nucleosiden konnte Komplexbildung Vanadat den Fällen beobachtet werden, denen erwarten war, wenn sich das Vanadat anstelle Phosphates nach dem A17 Hammerhead Ribozym befindet. konnte gezeigt werden, daß Vanadat Über gangszustandsanalogon Phosphat bei Spaltung Hammerhead Ribozyms gesetzt werden könnte. Bestimmung dreidimensionalen Struktur des Membranproteins Phospholamban CDCl 3 /CD 3 wurde Kapitel 4 beschrieben. Hierbei wurden homo nuclearen zweidimensionalen Spektren gewonnenen Abstandsinformationen NOE Daten Dihedralwinkel aus Kopplungskonstanten verwendet, die Struktur Phospholambans Lösung zu gewinnen. Phospholamban besteht aus zwei alphahelikalen Regionen (Val4Ser16 und Pro21Val49), die über einen betaturn (Typ verbunden sind. Die turnRegion weist eine hohe Flexibilität auf, welche wichtig seine biolo gische Wirkung sein könnte. So könnte hier Annäherung von Enzymen Proteinkinasen oder der ATPase erleichtert werden.
1. Die Membran des SR besitzt mehrere unterscheidbare Transportsysteme für organische und anorganische Anionen. Diese Transportsysteme lassen sich durch Anionenfluxmessungen mit der FilterassayMethode und durch Einzelkanalmessungen mit der Planarmembrantechnik charakterisieren. Der Vergleich der mit beiden Methoden ermittelten Daten ergibt, dass der 35 SO 4 2 Flux unter Standardbedingungen durch den als BCl (Big Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanal bewerkstelligt wird und eine Steigerung der Effluxrate im Vesikelfluxexperiment auf die zusätzliche Aktivierung des als SCl (Small Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanals zurückzuführen ist. 2. Neben Chlorid und Sulfat werden auch andere organische und anorganische Anionen wie Jodid, Pyrophosphat, Oxalat und Nukleotide transportiert. 3. Der stärkste Hemmstoff von 35 SO 4 2 und NukleotidTransport ist der PurinozeptorAntagonist Suramin mit einer I 50 von 0.91.16 µM. 4. Eine Stimulation des 35 SO 4 2 Transports kann durch die Kationen Calcium, Magnesium und Cholin erreicht werden. Ebenso wirken Hemmstoffe des RyR wie Ryanodin und Atractylosid stimulierend bzw. aktivierend. 5. 35 SO 4 2 Influx und Efflux werden durch Nukleotide unterschiedlich beeinflusst. Der Efflux wird in Abhängigkeit von Nukleotidbase, Anzahl der Phosphatreste und der Ladung gehemmt. Unter Magnesiumeinwirkung ist der Hemmeffekt verstärkt und auch das als nicht hydrolysierbar geltende ATP Analogon AMPPNP wirkt inhibierend. Der maximale 35 SO 4 2 Influx hingegen ist in Anwesenheit von ATP erhöht. Die ATPAnaloga AMPPNP und AMP PCP zeigen diesen stimulierenden Effekt nicht. 6. ATP und GTP werden in Anwesenheit von SRProtein schnell ab und umgebaut. Dieser Umbau lässt sich durch Magnesium und verschiedene Hemmstoffe des Anionenfluxes beeinflussen. 7. Der Eintransport von Nukleotiden in das Lumen des SR lässt sich durch Hemmstoffe des Anionenfluxes inhibieren. Die zusätzliche Hemmbarkeit durch Atractylosid, einen Inhibitor des mitochondrialen ATP/ADP Translokators (AAT), impliziert die Möglichkeit einer Beteiligung dieses Transportproteins am Nukleotidtransport. 8. Inhibitoren der Ca 2 ATPase hemmen auch den Anionenflux. Die Vermittlung des Anionentransports durch die Ca 2 ATPase selbst sowie die Hemmung des Ca 2 Eintransports aufgrund der Inhibition der Anionenkanäle sind ausgeschlossen. Vesikel mit rekonstituierter Ca 2 ATPase weisen keinen Anionen transport auf, obwohl der Ca 2 Eintransport durch Anionenkanalhemmstoffe wie Suramin, DIDS und PPANS inhibiert werden kann. 9. Beim Anionenflux eingesetzt zeigen Aktivatoren und Inhibitoren des Ca 2 ReleaseKanals gegenläufige Effekte. Der Ca 2 ReleaseKanal ist nicht der Vermittler des Anionentransports. Anionentransporter sind im RyRfreien longitudinalen SR ebenso häufig wie in den RyRreichen terminalen SR Zisternen.
Organisation und Steuerung des Treiberameisenverhaltens südostasiatischer Ponerinen der Gattung Leptogenys Treiberameisen zeichnen sich durch eine einzigartige Kombination aus Wanderverhalten (häufige Umzüge) und koordinierter Massenjagd (kollektive Raubzüge) aus. Obwohl allgemein angenommen wird, daß die Kommunikation dieser Ameisen zu einem bedeutenden Teil durch Spurpheromone erfolgt, sind bisher in den drei Unterfamilien Ecitoninae, Dorylinae und Aenictinae nur wenige Drüsen bekannt, die derartige Pheromone produzieren. Welche Rolle einzelne Pheromonkomponenten bei der Koordination des komplexen Schwarmverhaltens spielen, wurde bislang noch nicht untersucht. In der Gattung Leptogenys gibt es ein weites Spektrum verschiedener Ökotypen, u.a. auch Arten, die echtes Treiberameisenverhalten zeigen. Bei sieben malaiischen Leptogenys-Arten wurde die Koordination des kollektiven Verhaltens auf Basis der Kommunikation zwischen den Einzelindividuen untersucht. Bei allen Arten wurden mehrere Spurpheromone entdeckt, die in den Gift- und in den Pygidialdrüsen lokalisiert waren. Ökologisch verschiedene Arten wiesen Unterschiede im Kommunikationssystem auf. Die Koordination des Treiberameisenverhaltens von L. distinguenda wurde besonders ausführlich untersucht. Diese Art besitzt ein Mehr-Komponenten-Signalsystem, bei dem die einzelnen Pheromone multiple Funktionen erfüllen. Die Pygidialdrüse enthält eine Pheromonkomponente, die ca. 20 min lang gute Spurfolge bewirkt. Sie dient der Orientierung einzelner Individuen und damit dem Koloniezusammenhalt. Aufgrund konzentrationsabhängiger Spurfolge und durch Modulation der Spurkonzentration kann eine langsame Rekrutierung auf neues Territorium mit diesem Pheromon koordiniert werden. Die Giftdrüse enthält zwei Pheromone. Eine sehr flüchtige Substanz (4-Methyl-3-Heptanon) bewirkt nur 1-2 min lang eine außerordentlich starke Attraktion sowie Erregung, Beschleunigung der Fortbewegung und Aggressivität. Mit dieser Komponente werden Beuterekrutierungen koordiniert. Die starke Wirkung kann das Verhalten zahlreicher Tiere und auf diese Weise sogar die Vorstoßrichtung ganzer Raubzüge beeinflussen. Aufgrund der extremen Flüchtigkeit des Pheromons ist dieser Einfluß jedoch nur momentan, so daß die Raubzugformation außerordentlich dynamisch ist. Eine zweite Komponente der Giftdrüse bewirkt bis zu 5 min lang gute Spurfolge ohne Erregung. Diese Substanz dient ebenfalls dem Koloniezusammenhalt. In den chemischen Spuren können Komponenten gemischt und der Informationsgehalt dadurch variiert werden. Zudem reagieren einzelne Tiere je nach Motivation nur auf bestimmte Komponenten, was situationsspezifisches Verhalten ermöglicht. Beute eintragende Arbeiterinnen folgen selektiv einer Komponente der Pygidialdrüse und ignorieren Komponenten der Giftdrüse. Auf diese Weise steuern sie gezielt das Nest an. In ähnlicher Weise fungieren beim Nestumzug hoch konzentrierte Spuren aus Pygidialdrüsensekret als Leitlinie zum neuen Nest. Umziehende Tiere meiden zudem sehr empfindlich das Sekret der Giftdrüse. Auf diese Weise werden Raubzugspuren klar unterschieden und nicht betreten, so daß beide für Treiberameisen charakteristischen Verhaltensweisen synchron ausgeführt werden können. Der Nestumzug wird mit einem distinkten, mechanischen Signal ausgelöst. Im Notfall kann ein Umzug oder Raubzug mit einer spezifischen Alarmsubstanz aus der Mandibeldrüse abrupt beendet werden. Dies ist z.B. von Bedeutung, wenn sich artgleiche Kolonien begegnen. Das Kommunikationssytem von L. distinguenda zeigt, wie komplexes Verhalten mit einem minimalen Satz an Signalen koordiniert werden kann. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit reicht ein einziges Pheromon bei weitem nicht aus, um treiberameisentypisches Verhalten zu realisieren. Treiberameisen sind besonders reich an Myrmekophilen. Die Integration dieser Ameisengäste vor allem in das Kommunikationssystem ihrer Wirte wurde in der vorliegenden Arbeit ebenfalls untersucht. Dabei wurden unterschiedliche Strategien vorgefunden, mit denen Myrmekophile den häufigen Umzügen ihrer Wirtskolonie folgen. Ein Teil der Arten läßt sich von den Ameisen auf der Brut aufsitzend in das neue Nest tragen. Diese Arten reagieren i.d.R. nicht auf die Pheromonspuren der Ameisen. Ein anderer Teil ist in der Lage, den Pheromonspuren aktiv zu folgen. Diese Fähigkeit ist erstmalig bei einer Spinne (Gamasomorpha maschwitzi) nachgewiesen worden. Einen besonders bemerkenswerten Gast stellt die neu beschriebene Lungenschnecke Allopeas myrmecophilos dar. Sie sondert selektiv bei Kontakt mit L. distinguenda ein spezifisches Attraktionssekret ab, welches die Ameisen dazu veranlaßt, die Schnecke mit den Mandibeln aufzunehmen und ins Nest zu tragen. A. myrmecophilos ist der erste nachgewiesene Fall eines Myrmekophilen aus dem Stamm der Mollusken.
g/d TLymphozyten stellen beim Menschen ca. 15% der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten. Die physiologische Funktion der g/d TZellpopulation ist ungeklärt. Auf grund ihrer Akkumulation in mukosalen Oberflächen scheinen sie eine Komponente der ''ersten Verteidigungslinie" zu bilden. Das d TZell Rezeptor (TCR) Repertoire gesunder Erwachsener ist oligoklonal, streng individuenspezifisch und zeitlich stabil. Zudem besteht eine charakteristische Kompartimentierung, d.h. im Intestinum liegt ein anderes d TCRRepertoire vor als im peripheren Blut. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das intestinale d TCRRepertoire einer entwicklungsabhängi gen Dynamik unterliegt. Hierzu wurde die Diversität der antigenbindenden (CDR3) Domäne intestinaler dKettentranskripte von Feten, Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen mittels denaturierender PAGE und DNASequenzierung molekular biologisch analysiert. Unsere Studien dokumentieren, daß im Verlauf der Reifung vom Fetus zum adulten Individuum gravierende Veränderungen stattfinden. Das fetale d TCRRepertoire ist stark eingeschränkt und zeichnet sich durch niedrige Komplexität der dKettentrans kripte aus was darauf beruht, daß innerhalb der CDR3Domänen kaum matrizen unabhängige ''N"Nukleotide existieren und zudem homologieabhängige Rekombina tionsereignisse stattfinden. Die Tatsache, daß verschiedene Feten teilweise identi sche dKettentranskripte exprimieren kann jedoch nicht allein auf obige Mechanis men zurückgeführt werden. Somit bleibt unklar, ob das fetale d TCRRepertoire vorprogrammiert ist oder Selektionsprozessen unterliegt. Im Gegensatz zu Feten ist das d TCRRepertoire Neugeborener polyklonal. Wie bei Erwachsenen weisen die CDR3Domänen ihrer dKettentranskripte zahlreiche ''N"Nukleotide auf. Da das d TCRRepertoire bereits im Alter von 14 17 Jahren starke Einschränkungen seiner Diversität zeigt und mit demjenigen siebzigjähriger Personen vergleichbar ist wird angenommen, daß die klonalen Expansionen eine Folge kontinuierlicher Selektions prozesse darstellen, die z.B. durch HSP verwandte Eigenantigene vermittelt werden. Vergleichbar dem Intestinaltrakt bildet auch die Haut eine bedeutende Grenzfläche des Organismus zu seiner Umgebung. Möglicherweise spielen kutane g/d TZellen ebenfalls eine Rolle im Rahmen einer ''ersten Verteidigungslinie". Wir wiesen anhand gesunder Erwachsener nach, daß das kutane d TCRRepertoire analog zum Intesti num oligoklonal ist und sich signifikant vom peripheren d TCRRepertoire unter scheidet. Da in multiplen Hautbiopsien identische dKettentranskripte gefunden wer den, sind dominante g/d TZellklone offenbar weiträumig in der Haut verteilt. Weiterhin wurde untersucht, ob spezifisch aktivierte g/d TLymphozyten an der Patho genese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt sind. Im Fall der ange nommenen antigenvermittelten Aktivierung müßten klonale Expansionen einzelner g/d TZellpopulationen zu charakteristischen Verschiebungen des d TCRRepertoires innerhalb entzündlich veränderter Darmareale führen. Vergleichende Analysen der läsionalen und nichtläsionalen Darmabschnitte von M.CrohnPatienten lassen jedoch keine krankheitsassoziierten Repertoireverschiebungen erkennen. Vielmehr weisen entzündliche und nichtentzündliche Areale nahezu identische d TCRRepertoires auf. Da dies auch im Fall der bakteriell verursachten Divertikulitis gilt, werden g/d TLym phozyten vermutlich generell indirekt oder über TCRunabhängige Mechanismen (z.B. Zytokine) aktiviert. Alternativ wird eine Erkennung streßinduzierbarer Eigenanti gene durch intestinale g/d TZellen diskutiert. Beide Vorgänge würden zu keiner Beeinflussung des d TCRRepertoires führen und in Einklang mit den nachgewiese nen Expansionen einzelner weniger Rezeptorspezifitäten stehen. Da vermutlich auch die BLymphozyten der intestinalen Lamina propria an der ''ers ten Verteidigungslinie" beteiligt sind nahmen wir an, daß die Ig H Transkripte IgA bzw. IgM exprimierender BZellen ebenfalls Einschränkungen ihres Rezeptor Repertoires aufweisen. Wir fanden, daß die kleinen V H 5, V H 6 und V H 7Familien intestinaler B Zellen oligoklonale Expansionen zeigen, während das Repertoire der dominierenden V H Familien deutlich diverser ausfällt. Durch Subklonierung lassen sich jedoch bei sämtlichen VH Familien klonal verwandte IgATranskripte in weit voneinander ent fernten Darmabschnitten identifizieren. Zudem stellen ~ 75% aller Basensubstitutio nen stille Mutationen dar oder führen zum Ersatz durch Aminosäuren vergleichbarer Eigenschaften, was auf einen starken Selektionsdruck schließen läßt. Da kaum Hin weise auf Isotypwechsel vorliegen, stellen intestinale IgM und IgAImmunozyten ver mutlich divergente Zellinien dar. Das V H Repertoire peripherer BZellen ist stark limitiert, wobei kaum Überlappungen mit intestinalen IgVH Repertoires bestehen. Aufgrund der partiellen Einschränkung des V H Repertoires ist anzunehmen, daß Teile der humoralen Immunabwehr konservierte Antigene erkennen, wobei es sich im Gegensatz zu TZellen wahrscheinlich nicht um Eigenantigene, sondern um Oberflächenstrukturen symbiontischer Mikroorganismen handelt. Unsere Resultate zeigen, daß die Begrenzung des Rezeptor Repertoires ein Charak teristikum von B und TLymphozyten darstellt. Übereinstimmend hiermit wurden von anderen Arbeitsgruppen klonale Expansionen auch bei a/b TZellen nachgewiesen. Vermutlich wird die Expansion einzelner Zellklone durch permanente Wechselwirkun gen mit ''Schlüsselantigenen" induziert, wobei es sich um invariante Fremdantigene oder konservierte Eigenantigene handeln dürfte.
In der vorliegenden Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur des CaM/C20W Komplexes mit Hilfe von heteronuklearer, mehrdimensionaler NMRSpektroskopie ermittelt. Der stabile CaM/C20WKomplex mit einer Bindungskonstanten KD = 11 nM besteht aus dem Protein CaM und dem Peptid C20W. CaM, ein kleines, saures Protein (16,7 kDa), das in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und hantelförmig mit zwei Domänen aufgebaut ist, übermittelt die Signalwirkung von Calciumionen an eine Reihe von Zielenzymen. Durch die Bindung von CaM an die Plasmamembran Ca 2 ATPase wird das Calciumsignal wieder beendet. Das Peptid C20W entspricht dem Nterminalen Teil der CalmodulinBindungsdomäne der Ca 2 ATPase. Röntgenkleinwinkelstreu experimente an dem CaM/C20WKomplex führten zu der Vermutung, daß das Peptid C20W nur an die Cterminale Domäne von CaM bindet und damit einen unterschiedlichen Bindungsmodus im Gegensatz zu den bekannten Calmodulin bindenden Peptiden zeigt. Zur Strukturbestimmung des CaM/C20WKomplexes wurde eine Probe aus 13 C, 15 Nmarkiertem CaM und unmarkiertem C20W verwendet. Diese unterschiedliche Markierungsweise erlaubt die Unterscheidung beider Komponenten in den NMR Spektren. Für CaM wurden eine Serie von heteronuklearen, dreidimensionalen Tripelresonanzexperimente aufgenommen, die zunächst die Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats und dann auch der der Seitenketten erlaubte. Spezielle NMR Experimente wurden für die Zuordnung der neun Methionine durchgeführt, die bei der Bindung des Peptids eine wichtige Rolle spielen. Durch die Auswertung von NOESY Spektren wurden 1645 Abstandsrestraints für CaM ermittelt, die sich in 794 intraresiduale, 387 sequentielle, 311 mittelreichweitige und 153 langreichweitige restraints aufteilen. Durch die Bestimmung der Temperaturkoeffizienten der Amidprotonen konnten 52 Wasserstoffbrücken von CaM zugeordnet werden. Durch doppeltgefilterte, homonukleare Korrelationsexperimente, bei denen die Protonen resonanzen von 13 C, 15 Nmarkiertem CaM unterdrückt werden, konnten die Resonanzen des unmarkierten Peptids C20W zugeordnet werden. Es wurden 163 NOE restraints ermittelt, wobei 102 intraresidual, 32 sequentiell und 29 mittelreichweitig waren. Schließlich konnten mit Hilfe eines halbgefilterten NOESYExperiments 49 intermolekulare NOE's zwischen CaM und C20W zugeordnet werden. Außerdem wurden neben den Abstandsrestraints für CaM 129 Dihedralwinkelrestraints ermittelt. Die gesamte Zuordnung des CaM/C20WKomplexes wurde in der Datenbank BioMagResBank mit der Nummer 4284 abgelegt (http://www.bmrb.wisc.edu/). Die experimentell gewonnenen restraints wurden in einer MoleküldynamikRechnung mit einem simulated annealingProtokoll verwendet, wobei insgesamt 200 Strukturen berechnet wurden. Die 26 energieärmsten Strukturen wurden als repräsentativ ausgewählt und in der Brookhaven Protein Datenbank mit dem PDB IDCode 1CFF abgelegt (http://www.rcsb.org/). Die 26 Strukturen weisen für die Nterminale Domäne einen RMSDWert von 0.75 Å über die Proteinrückgratatome und für die Cterminale Domäne zusammen mit dem Peptid C20W einen RMSDWert von 0.53 Å über die Proteinrückgratatome auf. Die hohe Konvergenz der Strukturen und gute Werte bei der RamachandranStatistik (73.7% in den erlaubten Bereichen) sprechen für eine gute Qualität der ermittelten Strukturen. Die ermittelte Struktur des CaM/C20WKomplexes zeigte einen neuartigen Bindungsmodus des Peptids. C20W bindet nur an die Cterminale Domäne von CaM, die Nterminale Domäne ist nicht in der Bindung involviert. Diese Struktur steht damit im Gegensatz zu den bisher bekannten CaM/PeptidKomplexen, bei denen das Peptid von beiden Domänen gebunden wird und ein globulärer Komplex entsteht. Der Bindungsmodus des C20Ws wurde zum einen durch chemische Verschiebungs differenzen der Amidprotonen und der Methionine ermittelt. Zum anderen konnten ausgehend von C20W intermolekulare NOE's nur zur Cterminalen Domäne von CaM zugeordnet werden. Die Sekundärstruktur von CaM ändert sich durch die Bindung des Peptids kaum. Beide Domänen, die zueinander homolog sind, bestehen aus vier alphaHelices und einem kurzen antiparallelen betaFaltblatt. Verbunden sind beide Domänen durch eine flexiblen Linkerbereich, wobei die Domänen zueinander keine Orientierung zeigen, da keine NOE's zwischen den Domänen gefunden wurden. Der ungewöhnliche Bindungsmodus des Peptids C20W steht im Einklang mit der Tatsache, daß die Plasmamembran Ca 2 ATPase bereits durch die Cterminale Domäne von CaM aktiviert werden kann. Der CaM/C20WKomplex läßt sich daher als Schnappschuß auf dem Weg der vollständigen Aktivierung der Ca 2 ATPase durch CaM verstehen. Die Ergebnisse der NMRspektroskopischen Untersuchung des CaM/C20WKomplexes wurden in (1999) Biochemistry 38, 1232012332 veröffentlicht. Die Publikation ist im Anhang (Kapitel 6.9) beigefügt. Um die Orientierung der Domänen des CaM/C20WKomplexes zueinander zu untersuchen, sind weiterführende Experimente geplant. Hierzu sollen Messungen an einem CaM/C20WKomplex unternommen werden, der am NTerminus des Peptids einen paramagnetischen Marker trägt, wobei dipolare Kopplungen und Pseudo kontaktshifts ermittelt werden sollen. Weiterhin sind ähnliche Untersuchungen an einem CaM/C20WKomplex geplant, der am NTerminus von CaM einen paramagnetischen Marker trägt. Mit diesen Experimenten sollte es gelingen, die Frage der Domänen orientierung zu klären.
Das TumorSuppressorGen wt1 (Wilms Tumor Gen) kodiert ein ZinkFinger DNA bindendes Protein mit vorwiegend Transkriptionshemmenden Eigenschaften. Da wt1 Expression auch in leukämischen Blasten von Patienten mit akuten Leukämien nachgewiesen werden konnte, war das Ziel der Arbeit, das Expressionsmuster von wt1 mRNA in Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) mittels der PolymeraseKettenreaktion (PCR) zu untersuchen. Dabei war die Expressionsstärke visuell in negativ (), schwach positiv ( ), mittelgradig positiv ( ) und stark positiv ( ) zu unterteilen. Die Ergebnisse, in ausgesuchten Fällen durch eine kompetitive PCR validiert, sollten mit FABKlassifikation, Karyotyp, OberflächenmarkerExpression, Alter, Geschlecht und klinischem Verlauf verglichen werden, um eine Aussage über die Bedeutung der wt1 Expression für Prognose, Verlaufskontrolle und das Erkennen von Minimal Residual Disease (MRD) zu treffen. Es wurden insgesamt mehr als 500 Proben von Patienten (mononukleäre Zellen (MC) aus Knochenmark (KM) und peripherem Blut (PB)) untersucht. Davon wurden insgesamt 129 Patienten bei Erstdiagnose und 32 Patienten bei 1. Rezidiv untersucht. Bei 77 Patienten konnte die wt1 Expression im Verlauf untersucht werden. wt1 mRNA fand sich bei 124 von 161 (77%) der Patienten bei Erstdiagnose und 1.Rezidiv. Die wt1 Expression war unabhängig vom Alter, vorhergehendem myelodysplastischem Syndrom (MDS), Geschlecht und FABSubtyp mit Ausnahme einer signifikant niedrigeren wt1 Expressionshäufigkeit in FAB M5 Leukämien von nur 40% (P=0,0025). Es fand sich keine Korrelation zwischen wt1 mRNA Expressionsstärke und den durch den Karyotyp definierten prognostischen Gruppen. Die Ansprechrate auf Therapie war zwar umso höher, je niedriger die wt1 Expression lag; es fand sich jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den ExpressionsGruppen. Patienten mit hoher wt1 mRNA Expression ( , ) zeigten eine deutlich schlechtere Gesamt Überlebenswahrscheinlichkeit (OS) als solche mit niedriger Expression (, ). Das 3Jahres OS für alle neu diagnostizierten AMLPatienten lag bei 13% bei starker und 38% bei schwacher wt1 Expression (P=0,038); bei Patienten mit de novo AML bei 12% und 43% (P=0,014). Der Unterschied war bei der Patientengruppe unter 60 Jahren noch stärker ausgeprägt. Im Verlauf ließ sich bei allen Patienten, die eine komplette Remission (CR) erreichten, keine wt1 Transkripte mehr nachweisen. Bei Rezidiv trat in den meisten Fällen erneut erhöhte wt1 Expression auf. In einigen Fällen ging dies dem klinischen Befund eines Rezidivs voraus. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß wt1 von der Mehrzahl der AMLPatienten exprimiert wird und mittels PCR nachgewiesen werden kann, ein von Karyotyp und Alter unabhängiger prognostischer Faktor ist und sich mit Einschränkung zur Verlaufskontrolle und Detektion von MRD anbietet.
Das Applikationssystem Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein innovatives System für die Applikation von Pharmaka während elektrophysiologischer Experimente entwickelt und getestet. Das AchtkanalApplikationssystem eignet sich hervorragend für Experimente an Hirnschnitten und kann durch folgende Eigenschaften charakterisiert werden: - Das System ist durch die Verwendung von DruckluftVentilen nahezu frei von elektromagnetischen Störfeldern. - Aufgrund der geringen Dimensionen der Applikationspipette (Spitzendurchmesser = 250 µM) können gezielt unterschiedliche Regionen einer Zellkultur oder eines Hirnschnittes beeinflusst werden. - Die geringen Dimensionen des Systems ermöglichen einen kostengünstigen Betrieb, da nur kleine Mengen an Pharmaka benötigt werden. - Das System schaltet exakt und zuverlässig. Alle 8 Kanäle schalten in guter Übereinstimmung, und zwischen den einzelnen Kanälen kann dank eines zentralen Spülkanals akkurat und sicher gewechselt werden. - Mit dem System können Substanzen auf zwei Arten appliziert werden. Es besteht zum einen die Möglichkeit der sogenannten SpitzenApplikation. Die SpitzenApplikation eignet sich besonders für Experimente an Zellkulturen, isolierten Zellen oder Membranstücken, und zeichnet sich bei dieser Art der Anwendung durch einen schnellen Konzentrationsaufbau (< 1 s) aus. Weiterhin können Substanzen mittels der sogenannten PulsApplikation appliziert werden. Die PulsApplikation bietet einerseits den Vorteil einer kontinuierlichen Applikation ohne Druckschwankungen, und ermöglicht andererseits die schnell aufeinanderfolgende Applikation mehrerer Substanzen. Demgemäß eignet sich die PulsApplikation hervorragend für Experimente an Hirnschnitten. Ionotrope GlutamatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war eine tiefergehende Beschreibung der ionotropen, nonNMDARezeptoren bei Neuronen der LSO des auditorischen Hirnstammes der Ratte. Im Vergleich hierzu wurden entsprechende Untersuchungen auch an MNTBNeuronen durchgeführt. Von besonderem Interesse war dabei der Nachweis funktioneller Kainat Rezeptoren. Im Gegensatz zu RNA oder ProteinNachweisen einzelner Rezeptor Untereinheiten wurden funktionelle Rezeptoren elektrophysiologisch, mit Hilfe der Patch ClampTechnik, charakterisiert. Mit Hilfe von spezifischen Agonisten, Antagonisten und Modulatoren konnten folgende Sachverhalte nachgewiesen werden: - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle AMPARezeptoren. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR2 ist Bestandteil von AMPARezeptoren bei LSONeuronen. - Funktionelle AMPARezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Abschnitt der Entwicklung ist die Größe der AMPA Rezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere. - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle KainatRezeptoren. - Im Hinblick auf die KainatRezeptoren gibt es jeweils zwei Klassen von LSO bzw. MNTBNeuronen. LSONeurone lassen sich in eine Klasse, die sich durch schnelle KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, und eine Klasse, die sich durch langsame KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, unterteilen. Den beiden Klassen liegen sehr wahrscheinlich unterschiedliche Rezeptordichten und / oder Unterschiede in der Untereinheitenzusammensetzung zugrunde. MNTBNeurone lassen sich in Zellen, die KainatRezeptoren besitzen, und Zellen, die diesen Typ von Rezeptor nicht besitzen, unterscheiden. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR5 ist Bestandteil von KainatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen. - Funktionelle KainatRezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Zeitraum ist die Größe der KainatRezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere.
Das Apolipoprotein (Apo) B100 ist der wesentliche Proteinbestandteil der Low Density Li poproteine (LDL). Es spielt als Ligand bei der rezeptorvermittelten Aufnahme der LDL aus dem zirkulierenden Blut in die Leber und andere periphere Gewebe eine wichtige Rolle. Erhöhte Plasmakonzentrationen der LDL gelten als unabhängiger Risikofaktor in der Genese der Koronaren Herzkrankheit (KHK). Eine gestörte Interaktion des LDLRezeptors mit seinem Liganden Apo B100 vermindert die Endozytose der im Blut befindlichen LDL und kann damit eine primäre Hyperlipoproteinämie (HLP) des Typ IIa verursachen. Die Rezeptorbindungsregion des Apo B100, dessen Primärstruktur 4536 Aminosäuren um fasst, ist im carboxyterminalen Bereich des Moleküls lokalisiert. Im Gegensatz zu einer Viel zahl bekannter LDLRezeptormutationen wurden lediglich drei Mutationen am Apo B100 bekannt, die als Auslöser der Typ IIa HLP in Frage kommen. Diese werden in der Literatur als Familiär Defektes Apo B100 (FDB) beschrieben. Bei allen drei FDBVarianten (FDB 3500Q , FDB 3500W , FDB 3531C ) liegen Punktmutationen innerhalb des Exons 26 des Apo B100 Gens vor. In der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, weitere, bisher unbekannte Punktmutationen am Apo B100, die als Ursache bindungsdefekter LDL in Frage kommen, zu finden und zu charakterisieren. Die zunächst durchgeführte Sequenzierung der genomischen DNA einer Pa tientin mit bindungsdefekten LDL, die negativ für FDB war, zeigte keine Abweichungen von der WildtypDNASequenz im Bereich der Rezeptorbindungsregion. Es wurde daraufhin eine genetische ScreeningStrategie für bindungsdefekte Apo B100 entwickelt, die für die Analyse größerer Probenmengen geeignet erschien. Hierzu wurden zunächst parallel zwei Verfahren, der singlestrand conformation polymorphism (SSCP) und die Temperatur Gradienten Gel E lektrophorese (TGGE) getestet. Letztere erwies sich als geeignete Methode. Ein Kollektiv von 297 Typ IIa HLPPatienten, deren LDLCholesterin > 1,55 g/L und Trigly zeridKonzentrationen <2,0 g/l waren, wurde zusammengestellt. Die Blutproben stammten von nicht miteinander verwandten, im Rhein/MainGebiet ansässigen Personen kaukasischer Abstammung. Ein DNA Bereich von 2,8 Kilobasenpaaren korrespondierend zu den Aminosäureresten 3131 3837 und 42694498 des Apo B100 wurde in einzelnen Abschnitten amplifiziert und mit He teroduplexTGGE analysiert. Es wurden neun Substitutionen identifiziert. Diese waren: FDB 3500Q , FDB 3500W , L3350L, Q3405E, R3611Q, I4287V, N4311S, A4454T, und T4457M. Bei 21 Personen (7,1%) wurde FDB 3500Q nachgewiesen. Dies entspricht nach Extrapolation auf die Gesamtbevölkerung einer Mutationshäufigkeit von 1,4% in unserer Region. Es konnte festgestellt werden, dass bei allen Merkmalsträgern die R3500Q Mutation mit einem einheitli chen Haplotypen kosegregiert, so dass eine stammesgeschichtliche Verwandtschaft der Muta tionsträger belegt ist. FDB 3500W wurde bei zwei HLPPatienten diagnostiziert. Dies war insofern überraschend, da diese Mutation zuvor lediglich bei einer Person kaukasischer Abstammung in Großbritannien gefunden worden war. Beide R3500W Mutationen waren mit unterschiedlichen, bisher unbe kannten Haplotypen assoziiert. LDL der beiden heterozygoten Merkmalsträger für FDB 3500W zeigten in einem an normalen humanen Fibroblasten durchgeführten Bindungsassay eine deut lich verminderte Rezeptorbindungsaffinität, jedoch lag diese etwas höher als die der LDL ei ner FDB 3500Q heterozygoten Person. Es ist daher anzunehmen, dass der Austausch eines Argi nins durch Tryptophan an Position 3500 einen geringeren Bindungsverlust der LDL bewirkt als der Austausch von Arginin zu Glutamin. Zwei der in der TGGE identifizierten Punktmutationen stellten bekannte Apo B100 Poly morphismen (MspI 3611 und N4311S) dar, eine weitere stille Mutation an Kodon L3350L wur de bei drei Personen festgestellt. Daneben fand sich ein Merkmalsträger mit einer Punktmuta tion an Kodon 4457 (T4457M). Zwei zuvor beschriebene Substitutionen, Q3405E und A4454T, traten mit einer Prävalenz von 1,3%, bzw. 6,4% im untersuchten Kollektiv auf. LDL eines heterozygoten Merkmalträgers für Q3405E hatten normale Bindungsaffinität an LDL Rezeptoren, zeigten jedoch eine signifikant erniedrigte Internalisation und Degradation im in vitroBindungstest. Schliesslich wurde eine bisher unbekannte Mutation des Apo B100 am Aminosäurerest I4287V, die mit einer Allelfrequenz von 1% im untersuchten Kollektiv auf trat, funktionell überprüft. Dabei zeigte sich sowohl im Fibroblasten Bindungsassay als auch in einem zweiten in vitroTestverfahren, dem U937 Zellen Wachstumsassay keine Assoziati on der I4287V Mutation mit bindungsdefekten LDL in der Familie einer heterozygoten Merkmalsträgerin. Eine funktionelle Relevanz dieses Aminosäureaustausches ist daher un wahrscheinlich. An einem Tryptophanrest an Position 4369 des Apo B100, der bei der Formation der dreidi mensionalen Struktur des Proteins mit Arginin 3500 interagiert, wurden Nukleotidveränderun gen zunächst durch gezielte Mutagenese des Kodon 4369 erzeugt, um sicherzustellen, dass diese Mutationen durch TGGE nachweisbar sind. Nachfolgend wurde bei den Typ IIa HLP Patienten nach Mutationen an dieser Position gesucht. Es konnte festgestellt werden, dass im untersuchten Kollektiv keine Punktmutationen am Aminosäurerest 4369 existierten. Die Vermutung, dass weitere klinisch relevante Apo B100 Mutationen mit einem dem FDB konformen Merkmalsbild bei Typ IIa HLPPatienten vorhanden sind, konnte nicht bestätigt werden. Andererseits wurde eine überraschend hohe Prävalenz (1:72) des FDB 3500Q im Rhein/Main Gebiet festgestellt. Aufgrund der gemeinsamen Abstammung aller Merkmalsträ ger und der hohen Mutationsfrequenz in dieser Region ist es denkbar, dass sich die vermutlich vor ca. 6000 Jahren datierte FounderMutation in diesem Teil Deutschlands ereignete. Da es offensichtlich auch, zwar seltener auftretende, Fälle des FDB 3500W in der hier untersuch ten Region gibt, sind AnalyseMethoden, wie etwa die TGGE, die sich als ein hochsensibles Nachweisverfahren multipler Punktmutationen erwies, bei der differentialdiagnostischen Ab klärung von Fettstoffwechselstörungen solchen Methoden vorzuziehen, die nur auf die Substi tution FDB 3500Q testen.
Die Atherosklerose ist eine chronischentzündliche Erkrankung der Blutgefäße, die nach der "responsetoinjury"Hypothese durch die Verletzung des Endothels initiiert wird. Dabei führt die Aktivierung von Endothelzellen durch verschiedene proatherosklerotische Faktoren, wie z.B. das Komplementsystem oder das CD40 System, zur "Endotheldysfunktion". In den betroffenen Bereichen des Gefäßes entstehen frühe atherosklerotische Läsionen, die durch veränderte Adhäsivität und Permeabilität des Endothels zur Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Entzündungszellen und somit zum Fortschreiten der inflammatorischen Reaktion und zur Progression der Atherosklerose führen. Die laminare Schubspannung des fließenden Blutes (Shear Stress) ist einer der wichtigsten endogenen atheroprotektiven Faktoren im kardiovaskulären System. Dagegen sind Störungen der lokalen Hämodynamik im Blutgefäß mit endothelialer Dysfunktion und dem Auftreten von atherosklerotischen Läsionen assoziiert. Zur Identifizierung atheroprotektiver Mechanismen wurde die Shear Stressregulierte Genexpression in Endothelzellen mittels ''Atlas cDNA Expression Array" im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Von den 55 Shear Stressinduzierten Genen, wurde die Expression der potentiell antiinflammatorischen Proteine Clusterin und TRAF3 und der möglichen Mechanotransduktoren Integrin alpha5 und Integrin ß1 analysiert und die Bedeutung für die Funktion von Endothelzellen untersucht. Shear StressExposition erhöhte spezifisch die Expression des KomplementInhibitors Clusterin. Zusätzlich inhibierte Shear Stress, über die erhöhte Clusterin Expression, die Komplementinduzierte Expression der proinflammatorischen Chemokine MCP1 (''Monocyte chemoattractant protein1") und Interleukin8, die Monozyten und Leukozyten anlocken und die Entzündungsreaktion der Endothelzellen vorantreiben. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß Shear Stress die Expression des inhibitorischen Proteins TRAF3 (''tumor necrosis factor receptorassociated factor 3"), das an der CD40Signalkaskade beteiligt ist, erhöht. Im Gegensatz dazu, wurden weder die homologen Proteine TRAF2 und TRAF5, noch der CD40 Rezeptor oder CD40 Ligand durch Shear Stress reguliert. Sowohl Shear Stress als auch TRAF3 hemmen die CD40induzierte Expression des proinflammatorischen Proteins MCP1 und des prothrombotischen Proteins "Tissue Factor". Entgegen den Erwartungen lokalisierte TRAF3, das urprünglich als Rezeptorassoziiertes Adapterprotein identifiziert wurde, hauptsächlich im Zellkern. Demzufolge könnte TRAF3 eine inhibitorische Funktion im Zellkern ausüben, indem es beispielsweise die Translokation von MAPKinasen oder die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA beeinflußt. Die Umsetzung von mechanischen Kräften in biochemische Signale im Zytoplasma ist Voraussetzung für den protektiven Effekt von Shear Stress auf Endothelzellen. Als Mechanotransduktoren sind Integrine von zentraler Bedeutung, da sie eine Verbindung zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix herstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß Shear Stress die Expression der IntegrinUntereinheiten alpha5 und ß1, die zusammen den FibronektinRezeptor bilden, erhöht. Dabei konnte die Beteiligung von Stickstoffmonoxid (NO) und Wachstumsfaktoren, die durch Shear StressExposition freigesetzt werden und die Expression von Integrinen stimulieren, ausgeschlossen werden. Andere Integrine, wie z.B. der LamininRezeptor alpha6ß4, wurden durch Shear Stress nicht reguliert. Als physiologische Relevanz der Shear Stressinduzierten Integrin Expression wurde die Adhäsion von Endothelzellen erhöht. Weiterhin induzierte die Präexposition von Endothelzellen mit Shear Stress die Adhäsionsinduzierte Aktivierung der MAPKinase ERK1/2, die wichtige Überlebenssignale in Endothelzellen vermittelt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Shear Stress die Expression der antiinflammatorischen Proteine Clusterin und TRAF3 sowie der Mechanotransduktoren Integrin alpha5 und ß1 erhöht. Die Hemmung der Komplement und CD40induzierten Aktivierung von Endothelzellen durch Shear Stress ist von Bedeutung, um sowohl der Initiation als auch der Progression der Atherosklerose entgegen zu wirken. Die Shear Stressinduzierte Adhäsion, die über die Stimulation der Expression des FibronektinRezeptors alpha5ß1 vermittelt wird, ist eine wichtige Voraussetzung für die Mechanotransduktion von Shear Stress und das Überleben von Endothelzellen. Die Identifizierung und Aufklärung atheroprotektiver Mechanismen, die durch die laminare Schubspannung des Blutes aktiviert werden, könnten dazu beitragen, die Integrität des Endothels und die Funktionalität der Blutgefäße im Rahmen der Atherosklerose zu schützen.
In dieser Arbeit konnten die initialen Befunde bezüglich der potenten Serotoninaufnahmehemmung durch Johanniskrautextrakt mittels Radiorezeptorassay Methoden bestätigt werden. Es wurde gezeigt, daß die Phloroglucinole Hyperforin und Adhyperforin größtenteils für die Inhibierung der Serotoninaufnahme in Maushirn Synaptosomen verantwortlich sind. Die halbmaximalen Hemmkonstanten sind für beide Inhaltsstoffe identisch und liegen bei ca. 400 nM. Dagegen konnte nur bei einer weiteren relevanten Inhaltsstoffgruppe aus Hypericum perforatum, nämlich den OPCs, eine Hemmung der Serotoninaufnahme in Synaptosomen festgestellt werden. Wichtige Befunde konnten durch Ermittlung der Serotoninaufnahme in humanen Thrombozyten gewonnen werden. Vergleichende Untersuchungen von verschiedenen klassischen Antidepressiva und von Hyperforin an der Serotoninaufnahme in Thrombozyten und Synaptosomen zeigten jeweils identische halbmaximale Hemmkonstanten in beiden Systemen. Zum einen wurde durch diese Experimente erstmals eine Beeinflussung der Serotoninaufnahme durch Hyperforin in humanen Zellen nachgewiesen, und zum anderen konnte dadurch bestätigt werden, daß Thrombozyten als ein peripheres Modell der Serotoninaufnahme verwendet werden können. Eine nähere Charakterisierung des molekularen Wirkungsmechanismus der Serotoninaufnahmehemmung durch Hyperforin in Synaptosomen lieferte Hinweise darauf, daß Hyperforin einen von den klassischen Antidepressiva unterschiedlichen Mechanismus aufweist. Im Gegensatz zu den bekannten Antidepressiva zeigt Hyperforin nichtkompetitive Eigenschaften am Transportermolekül. Unterstützt wird diese Vermutung durch weitergehende Untersuchungen, bei denen die direkte Interaktion von Johanniskrautextrakt und Hyperforin mit SERT1 durch Ermittlung der Paroxetinbindung an Maushirnmembranen bestimmt wurde. Auch hier zeigt Hyperforin einen andersartigen Einfluß. Sämtliche klassischen Antidepressiva weisen eine sehr gute Korrelation zwischen der Hemmung der Paroxetinbindung und der Inhibition der Serotoninaufnahme mit nahezu identischen IC 50 Werten auf. Dagegen hat weder Johanniskrautextrakt noch Hyperforin einen erwähnenswerten Einfluß auf die Paroxetinbindung, was darauf schließen läßt, daß beide Substanzen nicht durch eine direkte Bindung an die Substratbindungsstelle des Serotonintransporters die Inhibition der Serotoninaufnahme induzieren. Ausgehend von diesen Befunden wurden weitere Parameter untersucht, welche für die Regulation der Serotoninaufnahme verantwortlich sind. Die wichtigste treibende Kraft für die Aktivierung und Aufrechterhaltung des Serotonintransportes ist der an der Plasmamembran bestehende Natriumgradient, so daß sich die weiteren Untersuchungen vor allem mit der Ermittlung der intrazellulären Natriumkonzentration nach Hyperforinzugabe befaßten. Während der SSRI Citalopram keinen Einfluß auf die intrazelluläre Natriumkonzentration in Thrombozyten ausübt, führt Hyperforin in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise zu einer Erhöhung der intrazellulären Natriumkonzentration. Aufgrund dieser hyperforininduzierten Beeinflussung von [Na ] i und der daraus resultierenden Erniedrigung des Natriumgradienten an der Plasmamembran, läßt sich nicht nur die Hemmung der Serotoninaufnahme, sondern auch die Inhibierung der Aufnahme von Noradrenalin, Dopamin, GABA und LGlutamat erklären. Um die Ursache des Natriuminfluxes in das Thrombozytenzytosol zu ermitteln, wurden Vergleichssubstanzen herangezogen, die bekanntermaßen ebenfalls zu einer Erhöhung von [Na ] i führen. Da durch diese Vergleichssubstanzen auch andere intrazelluläre Ionenkonzentrationen beeinflußt werden, wurden die Effekte von Hyperforin mittels Fluoreszenzspektroskopie auf diese Ionenkonzentrationen zusätzlich untersucht. Hyperforin verursacht in höheren Konzentrationen (10 µM) eine gravierende Erhöhung von [Ca 2 ] i und eine biphasische Beeinflussung des zytosolischen pHWertes mit initialer Ansäuerung und sekundärer Alkalisie rung des Zytosols. Es handelt sich hierbei größtenteils um einen Kalziuminflux aus dem Außenmedium und in geringerem Maße um eine Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern. Niedrigere Hyperforinkonzentrationen von 0,33 µM führen zu einer konstanten intrazellulären Acidifizierung und einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Eine Beteiligung des NHE kann weitgehend ausgeschlossen werden, da der pHEffekt nicht natriumabhängig ist. Die sekundäre Alkalisierung , die nach Zugabe von höheren Hyperforinkonzentrationen (10 µM) beobachtet wird, deutet auf die Aktivierung eines Mechanismus hin, der für die Aufrechterhaltung des intrazellulären pHWertes verantwortlich ist. Ein potentieller Kandidat könnte der natriumunabhängige Cl/HCO 3 Exchanger sein. Die Beeinflussung der [Na ] i und des pH i scheinen voneinander unabhängige Prozesse zu sein. Der Einstrom von Natrium und Kalziumionen läßt sich vermutlich über nichtselektive Kationenkanäle erklären, da beide hyperforininduzierten Effekte durch SK
Charakterisierung intrazellulärer Bindepartner von metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe III
(2001)
Die Aminosäure Glutamat ist der maßgebliche exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem, und glutamaterge Synapsen sind weit über das ganze Hirn ver breitet. Neben den Ionenkanalgekoppelten (ionotropen) Glutamatrezeptoren (iGluRs) aktiviert Glutamat auch prä und postsynaptische metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs), die über trimere GProteine und nachgeschalteten Signalkaskaden Einfluss auf die Signalverarbeitung in der Synapse nehmen können (Pin und Duvoisin, 1995). Diesen Rezeptoren werden Aufgaben bei verschiedenen Formen neuronaler Plastizität und Neurotoxizität zugeschrieben (Pizzi et al., 1993; Pin und Duvoisin, 1995; Pekh letski et al., 1996; Pizzi et al., 1996a; Bushell et al., 1997; Maiese et al., 2000; Sabel haus et al., 2000). Zur Zeit sind acht verschiedene mGluRs zuzüglich ihrer Spleißvarian ten bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, Struktur und pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden (Nakanishi, 1992; Pin et al., 1993). Mitglieder der Gruppe III mGluRs sind spezifisch an der aktiven Zone der Präsy napse lokalisiert und dort an der Regulation der Neurotransmission beteiligt (Shigemoto et al., 1996; Ottersen und Landsend, 1997). Die Mechanismen, die zur spezifischen Lo kalisation führen, konnten bislang noch nicht aufgezeigt werden. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Ca 2 abhängige Interaktion von Calmodulin (CaM) mit mGluR7a durch Kopräzipitationsstudien gezeigt. Die CaMBindung ist dabei von phy siologischer Relevanz für die Aktivierung des Rezeptors (O'Connor et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde nach neuen Interaktionspartnern für die Gruppe III mGluRs gesucht, um so weitere Aufschlüsse über die präsynaptische Verankerung und Regulati on dieser Rezeptorgruppe zu gewinnen. In einem ZweiHybridScreen konnten dabei die Proteine PxF und SGT, beides Genprodukte unbekannter Funktion, als zwei mögliche Interaktionspartner für mGluR4b identifiziert werden. Die Natur dieser Interaktionen konnte im Verlauf dieser Arbeit nicht genauer bestimmt werden und bleibt somit Gegenstand weiterer Untersuchungen. In einem parallelem Ansatz wurde die Interaktion von mGluR7a mit CaM näher untersucht. Dabei konnte ein hochkonservierter Bereich in allen Gruppe III mGluRs mit Ausnahme von mGluR4b und mGluR6 identifiziert werden, der eine Konsensussequenz zur CaMBindung (1510Motiv) enthält. Neben der CaMBindung konnte für diesen Bereich in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Michael Freissmuth auch eine Interaktion mit Gbetagamma nachgewiesen werden. Die GbetagammaBindung an den Rezeptor wird durch Ca 2 abhängige Aktivierung von CaM gehemmt. Es wird daher ein Modell zur dualen Aktivierung von Gruppe III mGluRs vorgeschlagen, welches mögliche Mecha nismen zur negativen Rückkopplung der Glutamatfreisetzung aufzeigt. Zusätzlich wurde eine mögliche Regulation der Gruppe III mGluRs durch PKC Phosphorylierung untersucht. Dabei konnte die in vitroPhosphorylierung eines einzel nen Restes (S862) im intrazellulären CTerminus von mGluR7a nachgewiesen werden, welche zur Hemmung der CaMBindung führte. Aufgrund dieser Daten wird ein erwei tertes Modell formuliert, in dem die Hemmung der Ca 2 /CaMabhängigen Aktivierung der GProteinsignalkaskade durch Phosphorylierung von mGluR7a eine übergeordnete Regulation des Rezeptors darstellt. Da die Gruppe III mGluRs bei Aktivierung zu einer Selbsthemmung der Neuro transmission führen (Pin und Duvoisin, 1995; Takahashi et al., 1996), stellt deren Ca 2 /CaMregulierte Aktivierung und die zusätzliche Regulation durch Phosphorylie rung eine Möglichkeit der Regulation von Lernprozessen dar.
Die Vesikel des sarcoplasmatischen Reticulums (SR) der Skelettmuskulatur von Kaninchen enthalten neben Kanälen hoher (big chloride channel') und geringer (small chloride channel') Leitfähigkeit auch der äußeren Mitochondrienmembran bekannten voltagedependent anionselective channel' (VDAC). Der Kanal konnte mittels Immunodetektion Vesikeln heavy' und light' nachgewiesen, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt nach der Spaltung Bromcyan teilsequenziert werden. Die Partialsequenzen beiden erhaltenen Fragmente stimmen Isoform 1 VDAC dem CorneaEndothel Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) sowie aus dem Mitochondrium überein. Jedoch weist Kanal unterschiedliche Eigenschaften auf. zeigt Gegensatz dem mitochondrialen VDAC keine Affinität dem AnionenkanalInhibitor SITS bildet SRMembran keine Komplexe anderen Proteinen Bekannte Effektoren mitochondrialen VDAC wie NADH, DCCD antiVDAC Antikörper zeigen SulfatEffluxExperimenten entweder keine oder eine gegensätzliche Wirkung, was einen weiteren Hinweis unterschiedliche Regulationsfaktoren gibt. Die fehlenden Transporteigenschaften des rekonstituierten Kanals unter SulfatEfflux Bedingungen machen seine Beteiligung Sulfattransport und somit Transport SR sehr unwahrscheinlich. Vielmehr scheint den Transport von Nucleotiden, besonders ATP, SRLumen vermitteln. Allerdings weist auch hohe Affinitäten einem speziell synthetisierten GTPAnalogon auf könnte deshalb dem bekannten Eintransport von GTP in SRVesikel beteiligt sein. Nucleotide werden SRLumen Phos phorylierung verschiedener Proteine Sarcalumenin, HCP (histidinerich protein') und Calsequestrin benötigt, neben ihrer Funktion Speicher auch der Regulation Release beteiligt sind. den Vesikeln sarcoplasmatischen Reticulums existieren mindestens zwei Proteine, durch Immunodetektion Affinitätsmarkierung mit einem radioaktiv markierten GTPAnalogon nachgewiesen wurden. greifen regulierend in den Anionentransport SR ein, Antikörper gegen G Untereinheit dieser Proteine den Sulfattransport hemmen. Diese Wirkung scheint allerdings direkt erfolgen nicht über second messenger'. Einen weiteren Hinweis GProteinvermittelte Regulation Anionentransports stellt sehr effiziente Hemmung des SulfatEfflux SRVesikeln durch Suramin verschiedene Arbeitskreis synthetisierte Suraminderivate Ein Analogon, spezifisch GProteingekoppelten Ionenkanälen (P2Y Purinoceptoren) Wechselwirkung und bindet eine alpha Untereinheit der SRVesikel. Ein weiteres Derivat, SB 22, zeigt ebenfalls Affinität zu dieser G alpha Untereinheit sowie zu einem anderen Protein (40 kDa) und der Ca ATPase. ATPase keine Transport eigenschaften für Sulfat aufweist, muß die hemmende Wirkung auf den Anionentransport entweder durch Modifikation einer Galpha Untereinheit oder Zeit noch nicht näher charakterisierten Proteins erfolgen. Der VDAC zeigt Suraminderivaten gegenüber inert und kommt deshalb nicht Sulfattransporter des sarcoplasmatischen Reticulums Frage.
Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter Der plasmamembranständige Serotonintransporter SERT terminiert die Neurotransmission an serotonergen Synapsen durch den schnellen Rücktransport des Neurotransmitters Serotonin (5HT) in die Präsynapse. Neben seinem präsynaptischen Vorkommen wird der SERT auch axonal in Varikositäten immundetektiert. Der Substrattransport selbst unterliegt der Kontrolle des Ca 2 /CaM, des Stickoxid (NO) und des Proteinkinase C (PKC) Signaltransduktionsweges. Letzterer bestimmt die Oberflächenverfügbarkeit des SERT durch dessen Sequestrierung. Die Regulation der Lokalisation und des Substrattransports des SERT sollte durch assoziierte Proteine erzielt werden. Da bislang jedoch keine interagierenden Proteine des SERT bekannt waren, sollten in dieser Arbeit mit Hilfe des HefeZweiHybridSystems zytoplasmatische Interaktionspartner des SERT identifiziert werden. Erste Untersuchungen an heterolog exprimierten Deletionsmutanten der Termini des SERT ergaben, daß diese zytoplasmatischen Domänen für die Funktion des Proteins unabdingbar sind. Im folgenden wurde daher mit dem Carboxyterminus des SERT eine hirnspezifische cDNABibliothek der neugeborenen Ratte durchsucht. Es wurden vier cDNAKlone isoliert, die für putative Interaktionspartner des SERT kodierten. Die Relevanz dieser genetisch nachgewiesenen Interaktionen wurde biochemisch mittels affinitätschromatographischer Studien untersucht, während immunzytochemische Analysen die Interaktionen durch die Umverteilung oder durch die Colokalisation der coexprimierten Proteine in vivo validierte. Pharmakologische Untersuchungen sollten darüberhinaus Aufschluß über den regulatorischen Einfluß der Interaktion auf die Transportfunktion des SERT geben. Nach diesen Aspekten wurden zwei der putativen Interaktionspartner näher untersucht. Der erste untersuchte cDNAKlon kodierte für die ßUntereinheit der intrazellulären Acetylhydrolase des "plateletactivating factor" (ßPAFAH). Affinitätschromatographisch wurde die Interaktion durch die Präzipitation der eukaryotisch überexprimierten ß Untereinheit an einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein des SERTCT bestätigt. Die immunzytochemische Analyse zeigte nach der Coexpression der ßPAFAH und dem SERT eine Umlokalisierung des zytoplasmatischen Proteins an Bereiche plasmamembranständiger SERTImmunreaktivität. Durch Wiederaufnahmestudien wurde kein Effekt der ßPAFAH auf die Transportfunktion des SERT ermittelt, weshalb die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion vorerst unklar bleibt. Der zweite Klon kodierte für das Rattenspezifische Homolog des myristoylierten Alanin reichen Proteinkinase CSubstrats (MacMARCKS). Der biochemische Nachweis einer Interaktion konnte hier nicht erbracht werden. Dagegen zeigte die immunzytochemische Analyse eine Colokalisation von MacMARCKS und SERT in diskreten Bereichen der Plasmamembran. Hinweise auf die physiologische Bedeutung konnten durch die pharmakologische Analyse gewonnen werden. So induzierte die Coexpression von MacMARCKS und SERT eine Abnahme der maximalen Transportrate (Vmax) um 29,6 ± 18,6 % (n = 3) im Vergleich zu GFPexprimierenden Kontrollzellen. Die Stimulierung der PKC erzielte dagegen kaum eine weitere Reduktion der Vmax im Gegensatz zu den Kontrollzellen, während die Behandlung der Zellen mit einem PKCInhibitor zum Angleich der Vmax der Konrollzellen und der MacMARCKSexprimierenden Zellen führte. Daraus wurde gefolgert, daß MacMARCKS an der Regulation der Transportfunktion des SERT durch dessen Sequestrierung beteiligt ist. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Interaktionspartner des SERTCT identifiziert, deren mögliche Funktionen in der Regulation der intrazellulären 5HT Konzentration einerseits bzw. der Regulation der Transportfunktion des SERT andererseits liegen könnten.