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Im Rahmen einer klinische Studie wurden bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf/Halsbereich LymphozytenSubpopulationen phänotypisch und funktionell charakteri- siert sowie deren Aktivierungszustand anhand der Bestimmung des Interleukin2Titers und der Konzentration von löslichem Interleukin2Rezeptor a (sIL2Ra) im Plasma gemessen. Hierbei interessierte der Einfluß des Tumors bzw. der Therapieformen wie Operation, Che mo, Bestrahlungstherapie und kombinierte RadioChemotherapie auf diese immunologischen Parameter. Die Zusammensetzung der Populationen peripherer Blutlymphozyten wird durch die Größe und Malignität des Primärtumors sowie durch Lymphknotenmetastasen beeinflußt. In der An fangsphase, bei einer Tumormalignität G1, ist eine starke Reduzierung der LAKZellaktivität zu sehen, was mit suppressiven Faktoren, wie zum Beipiel ProstaglandinE2, abgesondert von Monozyten, in Verbindung gebracht werden könnte. Der Anteil CD3positiver Zellen ist im G3Stadium sehr stark erniedrigt und deutet auf eine Herunterregulierung der zu dem CD3 Komplex gehörenden eKette hin. Weiterhin war bei den HNOTumorpatienten der Anteil der CD4Lymphozyten auffällig erniedrigt, während die Zahl der doppeltpositiven CD4 CD8 Zellen sowie die HLADRWerte erhöht war. Einen Monat nach einem operativen Eingriff ließ sich eine starke Zunahme der CD25 Expression, besonders auf TLymphozyten erkennen. Die Chemotherapie mit Cisplatin, Fo linsäure, 5FU, Fortecortin eine sogenannte Polychemotherapie bewirkte eine starke Erhö hung der NKZellpopulation und eine höhere Expression des CD25Markers auf NKZellen sowie eine Zunahme der LAKZellfunktion. Die Veränderung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf den Einsatz von Cisplatin und 5FU zurückzuführen. Die Bestrahlungsthe rapie bewirkte eine signifikante Abnahme der TLymphozyten, besonders der CD4T Helferzellen, bei gleichzeitiger Zunahme der CD4 CD8 positiven Zellen. BZellen sind gStrahlen sensitiv, so daß unter Bestrahlung ihr Anteil vermindert wird. Die Erhöhung der NKZellpopulation ist wahrscheinlich auf eine Radioresistenz dieser Lymphozytensubpopula tion zurückzuführen. Die RadioChemotherapie beinhaltet drei Zyklen mit einem Zytostatika gemisch: Cisplatin, 5FU, Folinsäure, Dexametason, Rescuvolin und Fortecortin und an schließender Behandlung mit gStrahlen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen deutlich, daß es unter dieser RadioChemotherapie zu einem signifikanten Abfall der CD3 und CD2positiven Zellen, besonders der zytotoxi schen TZellpopulation, sowie zu einer Erhöhung der CD25exprimierenden Zellen kommt. Die Beziehungen der Zellen untereinander sind unter Operation, Betrahlung und Radio Chemotherapie nicht verändert, die Chemotherapie verursacht jedoch vermutlich ein Un gleichgewicht zwischen THelferzellen und Makrophagen bezüglich der Vermehrung von NKZellen. Bei Patienten ohne Therapie kam es zu einer Abnahme der CD3positiven Zellen. Dies unterstützt die Hypothese der Herunterregulierung der eKette des CD3Komplexes unter Tumoreinwirkung. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die alleinige Bestimmung des Interleukin2 Proteins keine Auskunft über die Wirkung des Tumors auf die Sezernierung dieses Peptids bei einer Tumorlokalisation im Gaumen und Zungenbereich gibt. Erst im Verlauf der Erkrankung können Änderungen durch virale Infektionen und der Einfluß verschiedener Therapiemodali täten beobachtet werden. Die Konzentration von sIL2Ra verhielt sich proportional zur Tumorgröße. Dies unterstützt die Hypothese, daß dieser Rezeptor eher vom Tumor abstammt und nicht von den infiltrierten Lymphozyten. Die Konzentration von sIL2Ra im Plasma war abhängig von der Therapieart. Sie erreichte wesentlich höhere Werte bei Tumorpatienten im Vergleich zu den Probanden. Der niedrigste Spiegel bei Patienten fand sich bei Bestrahlungstherapie (Median = 840 U/ml), die höchsten Werte bei Patienten mit Chemotherapie (Median = 1400 U/ml). Infiltrierende CD3 Lymphozyten im Primärtumor, identifiziert mit einen Antikörper gegen die eKetten, sind im Vergleich zu metastasierten Lymphknoten signifikant erniedrigt. Unter suchungen der peripheren Blutlymphozyten bei Patienten mit Primärtumor ergaben eine signi fikante Erhöhung der CD3Populationen bei gleichzeitiger Erniedrigung des Anteils CD45 positiver Zellen. Es bestand für CD45positive Zellen ein signifikanter Zusammenhang zwi schen peripheren Blutlymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten.
Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Vektor für die Gentherapie zu optimieren. Zunächst wurde dazu die HTLV1Integrase im Austausch gegen die HSRV Integrase in HSRV eingebracht. Dieses rekombinante Plasmid war jedoch replikationsdefizient und hatte nach der Transfektion in eukaryonte Zellen keinen Virustiter. Dies führte zu der Überlegung, auch die für die Erkennung des Virus durch die Integrase wichtigen ersten 15 Nukleotide der LTREnden von HSRV an die Sequenz von HTLV1 anzugleichen. Da auch der daraus resultierende Klon keine Infektiösität aufwies, konnte die Replikationsdefizienz eventuell weitreichendere Gründe haben als eine reine Integrationsdefizienz. Ein cisElement am CTerminus der HSRVIntegrase welches zur Stabilisierung und Verpackung der RNA in Partikel wichtige Funktionen hat, wurde daher in dem Klon mit der HTLV1Integrase regeneriert. Dazu wurde eine chimäre Integrase bestehend aus dem Nterminalen und dem Mittelteil der HTLV1Integrase mit dem Cterminalen Teil der HSRV Integrase fusioniert und in das HSRV Provirus mit und ohne die HTLV1LTREnden eingebracht. Da diese Klone ebenfalls nichtinfektiös waren, sollte Expressionsanalyse der rekombinanten Plasmide zur Klärung der Ursache ihrer Replikationsdefizienz beitragen. Als Kontrollen dienten dabei ein HSRVKlon ohne Integrase, ein HSRVKlon mit wiedereingeführter HSRVIntegrase und ein Konstrukt mit den HTLV1LTREnden aber mit der HSRVIntegrase. Die Untersuchung der chimären Klone ergab, daß virale genomische RNA zumindest kurze Zeit nach der Transfektion in den Zellen vorhanden war, aber eventuell nicht in Viruspartikel verpackt wurde, da vor der HTLV1Integrase ein weiteres ca. 114 Nt langes cisElement fehlte. Dieses fehlende cisElement war möglicherweise auch die Ursache für eine gestörte GagProzessierung der Klone in 293TZellen. Da Gag Prozessierung für den Zusammenbau intakter Viruspartikel essentiell ist, konnte hier ein Grund für die Replikationsdefizienz der chimären Klone liegen. Alle weiteren viralen Proteine wurden von den chimären Klonen exprimiert und normal prozessiert. Die virale Protease war also enzymatisch aktiv. Weiterhin wurde die korrekte Aktivität der reversen Transkriptase nachgewiesen. Durch eine Kotransfektion der chimären Plasmide mit dem HTLV1GagProtein sollte das im Preintegrationskompex vorkommende GagProtein für die øTLV1 Integrase ersetzt werden. Auch dieser Versuchsansatz erwies sich als ungeeignet, die Integration bzw. Replikation der chimären Klone zu verbessern. Durch die Einklonierung eines Resistenzgens in die viralen Klone sollten Zellen mit integrierter viraler DNA gezielt selektioniert werden. Das Resistenzgen wurde in drei der viralen Konstrukte eingebracht, in wtpHSRV13, in den Klon mit den HTLV1 LTREnden und der HTLV1Integrase sowie in das virale Plasmid mit den HTLV1 LTREnden und der chimären Integrase. Nach der Einzelzellselektion der mit wt Zeocin transfizierten BHKZellen hatte von sechs Klonen nur einer einen geringen Virustiter, dieser exprimierte als einziger virale Gene. Durch Southernblotanalyse dieser Einzelzellklone konnte die Anzahl der Integrate auf fünf bis acht pro Einzelzellklon ermittelt werden. Die Einzelzellklone aus der Transfektion mit den rekombinanten Klonen besaßen keine Infektiösität. Die Expression der viralen Gene war bei den Einzelzellklonen aus der Transfektion des Klons mit den HTLV1LTR Enden und der HTLV1Integrase nachweisbar.
Erstmals konnte eine zCarotinDesaturase einer höheren Pflanze nach heterologer Expression in E. coli in nativer Form gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Dazu wurde die cDNA der CapsicumZDS in einen Expressionsvektor kloniert, der die ZDS als rekombinantes Polypeptid mit 6 Nterminalen Histidinen exprimierte. Dadurch konnte das Enzym in nur zwei Schritten über eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung und MetallionenAffinitätschromatographie selektiv aus E. coli separiert werden. Die ZDS wurde ohne eine mutmaßliche Transitsequenz als ein Polypeptid von 59 kDa exprimiert. Das pH Optimum der ZDSAktivtität liegt bei 7,2 in der Nähe der rechnerisch ermittelten pIWertes von 7,4. Die ZDS führt zwei Desaturierungsschritte ausgehend von zCarotin zu Lycopin als ein monomeres Protein durch. Unter Verwendung des TwoHybridSystems, einer Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen und einer Gelfiltration der nativen ZDS, konnte gezeigt werden, daß die ZDS als Monomer und als Dimer vorliegen kann. Die Dimerisierung der ZDS ist jedoch für deren enzymatischer Aktivität und für die Durchführung beider Desaturierungsschritte nicht notwendig. Für die Substratcarotinoide zCarotin und Neurosporin, wurden die Km Werte von 8,4 µM und 9,0 µM bestimmt. Die CapsicumZDS zeigt von ihrer Aminosäuresequenz her eine große Ähnlichkeit zu den cyanobakteriellen zCarotinDesaturasen und eine geringere Ähnlichkeit zu den pflanzlichen Phytoendesaturasen. Eine diskutierte phylogenetische Verwandtschaft der zCarotin und Phytoendesaturase aus höheren Pflanzen und Cyanobakterien wird durch die Verwendung des gleichen Kofaktors Plastochinon und durch die gemeinsame Hemmbarkeit mit den zCarotinDesaturaseHemmstoffen J852 und LS80707 unterstützt. Eine Kofaktoruntersuchung ergab, daß Plastochinon sowohl der Kofaktor der ZDS aus Capsicum, als auch der Phytoendesaturasen aus Gentiana lutea (gelber Entian), aus dem Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7942, sowie der z CarotinDesaturase aus Synechocystis sp. PCC 6803 ist. Der Km Wert von Decyl Plastochinon wurde für die CapsicumZDS zu 0,4 µM bestimmt. Der Kofaktor der z CarotinDesaturase Plastochinon, sowie die Entdeckung einer plastidären terminalen Oxidase (Carol et al., 1999) ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Übertragung der bei der Desaturierung von zCarotin gewonnenen Elektronen über Plastochinon auf Sauerstoff, wie es bereits für die pflanzliche Phytoendesaturase postuliert wurde (Carol
Das Chromanol 293B stellt die Leitsubstanz einer möglicherweise neuen Kategorie von KlasseIIIAntiarrhythmika dar. Im Herzen inhibiert es potent und spezifisch den Kaliumkanal I Ks , der an der Repolarisation der Membran bei Ablauf eines Aktionspotentials beteiligt ist. Er ist aus der AlphaUntereinheit KCNQ1 und der BetaUntereinheit MinK aufgebaut. Es bestehen deutliche biophysikalische Unterschiede zwischen den Strömen homomerer KCNQ1 und heteromerer I Ks (KCNQ1/MinK)Kanäle. Die Koexpression mit MinK verändert aber auch die Pharmakologie von KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit trugen zwei unabhängige Lösungsansätze dazu bei, die Interaktion der beiden Untereinheiten molekular besser zu verstehen. Dabei wurden als Methoden die zielgerichtete Mutagenese, die Expression der WildTypProteine und der Mutanten in XenopusOozyten und deren elektrophysiologische Analyse angewendet. Im ersten Teil wurde die Bindungsstelle des I Ks Inhibitors 293B molekular identifiziert, während im zweiten Teil der Mechanismus der Inaktivierung der AlphaUntereinheit KCNQ1 untersucht wurde. In den beiden Ansätzen wurde ausgenutzt, dass die zu KCNQ1 eng verwandten KCNQ2 Kanäle weder sensitiv gegenüber 293B waren noch eine Inaktivierung zeigten. Die Expression von MinKMutanten, die alle veränderbaren Regionen des Proteins abdeckten, ergab, dass keine dieser Mutationen die Affinität des I Ks Kanals gegenüber 293B wesentlich beeinflusste. Das war erstaunlich, da homomere KCNQ1Kanäle durch das Chromanol 293B um den Faktor 45 schwächer zu blockieren sind als I Ks Kanäle und da zusätzlich gezeigt wurde, dass sich auch das Ausmaß der Stereoselektivität von 293B und anderer verwandter I Ks Inhibitoren in Bezug auf KCNQ1 und I Ks stark unterscheidet. Es konnte aus den Ergebnissen indirekt vermutet werden, dass MinK offensichtlich auf allosterische Art die Affinität des Inhibitors erhöht. Um einen Hinweis auf die I Ks Spezifität des Blocks durch 293B auch innerhalb der KCNQ Familie zu erhalten, wurde zunächst die Inhibition der verwandten KCNQ2 und KCNQ3Kanäle getestet, die sich als kaum signifikant erwies. In diesem Zusammenhang wurde auch ein neues Mitglied der KCNQFamilie kloniert, KCNQ5, das schwach sensitiv gegen 293B war, nicht im Herzen vorkommt aber wahrscheinlich zusammen mit KCNQ2/KCNQ3 zum neurona len MStrom beiträgt. Dies ergab Hinweise darauf, dass von anderen KCNQKanälen differente Proteinsequenzen die hohe Sensitivität des KCNQ1Kanals gegenüber 293B determinieren. Die Bindungsstelle an der AlphaUntereinheit KCNQ1 wurde anschließend durch KCNQ1/KCNQ2 Chimären auf die innere Porenregion eingegrenzt. Durch detaillierte Untersuchung mithilfe von Punktmutationen identifizierten wir Aminosäuren in der Transmembranregion S6 (I337) und der Porenschleife H5(V307), deren Austausch gegen die entsprechenden KCNQ2 Aminosäuren die Affinität von 293B zu KCNQ1 sowie zu I Ks Kanälen um den Faktor 420 herabsetzten. Durch Analogiemodellierung mithilfe der bekannten Kristallstruktur des KcsA Kaliumkanals konnte ein 3DModell der KCNQ1Porenregion erstellt werden, aus dem sich ergab, dass die Seitenketten der Aminosäure Isoleucin 337 in das Lumen der inneren Pore gerichtet sind. Aus dem Modell konnte weiterhin das Phenylalanin 340 als in das Lumen gerichtet identifiziert werden. Dieses Ergebnis konnte durch weitere MutageneseExperimente evaluiert werden, aus denen hervorging, dass Veränderungen an dieser und benachbarten Positionen die Sensitivität sowohl von KCNQ1 als auch von I Ks Kanälen gegenüber 293B um den Faktor 10100 verminderten. Das 293BMolekül konnte so in das Modell integriert werden, dass sich attraktive Interaktionen mit diesen beiden Resten (F340 und I337) ausbilden. Die innere Porenregion stellt auch für viele Inhibitoren anderer Kaliumkanäle eine wichtige Determinante für hohe Affinität dar. Die in H5 gelegene Aminosäure V307 schien nach dem Modell nicht an einer 293BInteraktion direkt beteiligt zu sein. Es fiel aber bei der Charakterisierung auf, dass das veränderte Protein nicht mehr inaktivierte. Daher sollte ein Zusammenhang zwischen dem 293B Wirkmechanismus und der intrinsischen KCNQ1Inaktivierung untersucht werden. Es wurden wiederum durch einen Chimärenansatz zunächst die Regionen identifiziert, die für eine KCNQ1Inaktivierung notwendig sind. Anschließend wurde nach punktuellem Austausch von KCNQ1Aminosäuren gegen analoge KCNQ2Reste für eine weitere Position im Transmembransegment S5 (G272) ein Verlust der Inaktivierung festgestellt. Die zweite nicht inaktivierende Mutante G272C war WildTypgleich 293Bempfindlich, woraus sich vermuten ließ, dass die schwache Empfindlichkeit gegenüber 293B und der Verlust der Inaktivierung der KCNQ1Mutante V307L nicht in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse machten aber molekular den Unterschied der KCNQ1Inaktivierung zu den beiden klassischen Inaktivierungsarten von Kaliumkanälen, N und CTyp, deutlich. Zuvor war dies nur anhand unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften gezeigt worden. Das zuvor erstellte KCNQ1 Modell unterstützte die Resultate, da sich in ihm die beiden Regionen S5 und die Porenhelix H5 etwa auf Höhe der beiden Aminosäuren V307 und G272 kreuzen, was eine Interaktion dieser Regionen suggeriert. Zudem ist bei der ein LongQTSyndrom verursachenden KCNQ1Mutation L273F die mutierte Stelle unmittelbar neben dem Valinrest 307 lokalisiert. Diese besonders stark inaktivierende LQT1Mutante erhielt auch unter der Einwirkung von MinK eine nachweisbare Inaktivierung aufrecht. Da die KCNQ1Inaktivierung durch MinKKoexpression normalerweise aufgehoben wird, spricht dies für eine pathophysiologische Relevanz der KCNQ1Inaktivierung.
Die Hämatopoese stellt den blutbildenden Prozeß dar, der den Menschen ein Leben lang mit Blutzellen versorgt und deren Ausgangspunkt eine kleine Zahl hämatopoetischer Stammzellen ist. Diese Stammzellen besitzen einerseits die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind andererseits in der Lage, durch Proliferation und terminale Differenzierung Zellen verschiedener Linien hervorzubringen. Das biologische Hauptmerkmal der Stammzelle ist die Fähigkeit die Hämatopoese zu rekonstituieren, was klinisch bei der Stammzelltransplantation genutzt wird. Überwiegend werden dabei Knochenmark und peripheres Blut als Quelle für Stammzellen genutzt, die abhängig von der Zahl der transplantierten Zellen zur völligen Rekonstitution der Blutbildung führen. Für Patienten ohne passende Spender wurde das Nabelschnurblut als Alternative in Betracht gezogen. Trotz verschiedener Vorteile der Stammzellen aus Nabelschnurblut besteht der Hauptnachteil in der sehr limitierten Zahl der Zellen mit dem erhöhten Risiko eines Transplantatversagens. Aus diesem Grund wird die ex vivo Vermehrung dieser Stammzellen derzeit zunehmend untersucht. Erforderlich sind Bedingungen zur ausreichenden Vermehrung der Zellen unter Erhalt der Stammzelleigen schaften, die die klinische Anwendung möglich machen. Diese Bedingungen waren bisher nicht erfüllt. Hauptziel dieser Arbeit war es demnach Kulturbedingungen für die Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren, die den klinischen Anforderungen einer Transplantation genügen. Dafür wurden sowohl die determinierten Vorläuferzellen untersucht, als auch die Fähigkeit der Stammzelle in vitro Langzeithämatopoese aufrecht zu erhalten und zur Repopulierung der NOD/SCIDMaus. Die Repopulierung ist ein spezifischer Prozeß (Homing), bei dem die Migration der Zellen aus der Blutbahn durch die Endothelzellschicht der Gefäße in die spezialisierten Nischen des Knochenmarks erfolgt. Da für die Amplifikation äußere Stimuli erforderlich sind, welche die biologischen Eigenschaften der Zellen modulieren, wurden die Eigenschaften der expandierten Zellen in verschiedenen in vitro Assays wie CFU und LTCIC untersucht, die derzeit als die besten Verfahren gelten, die hämatopoetische Stammzelle zu detektieren. Zur Untersuchung der Repopulierungsfähigkeit wurde das NOD/SCIDMausmodell etabliert, in dem der Aufbau einer humanen Hämatopoese im murinen Knochenmark gemessen wird, sowie ein neues in vitro Modell entwickelt, das Stromazellsphäroid, mit dessen Hilfe die Migrationsfähigkeit untersucht wurde. Mit der Kombination der auf primitive Stammzellen wirkenden Zytokine SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine gute und ausreichende Vermehrung der ontogenetisch unreifen und der determinierten Progenitorzellen nach Kultivierung der Zellen über 7 Tage. Das beim Einsatz in der ex vivo Expansion umstrittene Zytokin IL3 führte hierbei nicht zum befürchteten Verlust der Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen. Es sorgte vielmehr durch eine starke Vermehrung der Zellen für ein Engraftment der NOD/SCIDMaus, das dem durch frische unmanipulierte Nabelschnurblutzellen vergleichbar war. Von den getesteten Kultursystemen erwies sich die statische Kultivierung im Teflonbeutel als geeignet zur Vermehrung der primitiven Progenitoren, ohne die Repopulierungsfähigkeit der expandierten Zellen zu vermindern. Durch die Wahl eines serumfreien, klinisch anwendbaren Mediums gelang somit die Etablierung eines Kultursystems zur optimierten ex vivo Expansion früher Progenitor und Stammzellen aus Nabelschnurblut ohne Verlust der Repopulierungsfähigkeit für die klinische Anwendung. Das Homing in das Knochenmark ist ein selektiver aus mehreren Einzelschritten bestehender Prozeß unter Interaktion der Zellen mit Endothelzellen und dem Knochenmarkstroma, der durch eine Vielzahl verschiedener zusammenwirkender Adhäsionsmoleküle reguliert wird. Weitere Faktoren, die das Homing beeinflussen sind Zytokine oder Chemokine. Diese Stimuli wirken über verschiedene intrazelluläre Signalwege, von denen die RhoProteinfamilie der kleinen GTPasen eine bestimmende Rolle in der Migration zugedacht wird, sowie andere Bestandteile der intrazellulären Signaltransduktion, wie Kinasen und GProteine. Die Migration in das Sphäroidmodell ist ebenso ein selektiver und gerichteter Prozeß, bei dem neben den primären CD34 Zellen aus Nabelschnurblut auch andere humane hämatopoetische Zelllinien eine gerichtete Einwanderung zeigen. Durch Zugabe eines Inhibitors von G Proteinen, Pertussis Toxin (PT), und Hemmung der kleinen GTPasen durch spezifische Toxine aus Clostridien konnte eine reproduzierbare und deutliche Verringerung der Migration in das Sphäroid erreicht werden. Die Migration hämatopoetischer Zellen in das Sphäroid erfolgt also unter Beteiligung der kleinen GTPasen, sowie PT sensitiver GProteine. Blockierungsversuche zeigten unerwarteterweise keine funktionelle Beteiligung des ChemokinRezeptorpaares SDF1/CXCR4 und des Adhäsionsmoleküls VLA4 bei der Migra- tion in das Sphäroid. Welche weiteren Mechanismen für diese Migration bedingend sind erfordert weitergehende Untersuchungen. Durch die Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut mit den Zytokinen SCF, FL, TPO und IL3 gelang eine ausreichende Vermehrung von frühen und determinierten Progenitorzellen unter Erhalt ihrer Stammzellfähigkeiten, so daß ein klinischer Einsatz möglich wird. Dabei ergab sich durch Untersuchung der Migrationsfähigkeit im Sphäroidmodell, daß beim Homing der Zellen die Aktivierung der kleinen GTPasen und eines Pertussis Toxinsensitiven GProteins beteiligt sind.
Schon kurz nach Änderung der Verordnung über das Leichenwesen und der Einführung des neuen Leichenschauscheines in Hessen am 15.4.1996 traten Schwierigkeiten auf, die zunächst auf die Umstellung zurückgeführt wurden. Nachdem auch einige Monate später die Klagen von vielfältiger Seite (Ärzte, Sanitäter, Bestatter, Kriminalpolizei) nicht nachließen, sollte untersucht werden, ob, warum und in welchem Umfang die Handhabung des neuen Leichenschauscheines solche Schwierigkeiten bereitet. Die Untersuchung basierte zum einen auf der Auswertung der Leichenschauscheinen der Verstorbenen, die im Zentrum der Rechtsmedizin in der Zeit von 1.1.31.3.1997 zur Verfügung standen (264 vertrauliche, 161 nichtvertrauliche Teile der Leichenschauscheine) zum anderen auf Interviews mit dem Standesamt, Gesundheitsamt, Kriminalpolizei, Verwaltung der Universitätsklinik und einem Bestatter. Als Gesamtergebnis kristallisierte sich heraus, dass der Leichenschauschein formale Mängel aufweist. Insbesondere die Angabe des Totauffindens ist mit dem Personenstandsgesetz nicht vereinbar, nach dem grundsätzlich die Todeszeit, bzw. der Todeszeitraum angegeben werden muss. Zum anderen war das Fehlen der Rubrik ''Natürlicher Tod'' einer der wesentlichen Mängel, weil häufig von Ärzten auch bei nichtnatürlichem Tod vergessen wurde, die entsprechende Rubrik zu signieren, so dass ohne Vorliegen des vertraulichen Teils der Standesbeamte von einem natürlichen Tod ausgehen musste. In einem Fall ist erst bei der zweiten Leichenschau im Krematorium der wirkliche Sachverhalt aufgeklärt worden, mit entsprechender Störung des Beerdigungsablaufes. Weiterhin ist der Leichenschauschein sehr unübersichtlich angelegt, indem gleiche Angaben sich an verschiedenen Stellen befinden, was dazu führt, dass sie häufig nicht, unvollständig oder falsch ausgefüllt werden. Auch die praktische Handhabung mit verschiedenen Briefumschlägen ohne eindeutige Kennzeichnung führte dazu, dass z.B. der nichtvertrauliche Teil mit in den für den vertraulichen Teil vorgesehenen Umschlag kurvertiert wurde und damit wiederum ein weiteres Herantreten an die Angehörigen notwendig war. Einer der größten Mängel ist darin zu sehen, dass darauf verzichtet wurde eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie es in anderen Bundesländern üblich ist, einzuführen. Das bedeutet, dass der Notarzt nach dem Einstellen der Wiederbelebungsmaßnahmen solange warten muss, bis sichere Todeszeichen aufgetreten sind. Dieses ist nicht nur unökonomisch, sondern häufig wegen eines neuen Einsatzes auch nicht durchführbar. Als Mangel ist auch das Fehlen der Warnhinweise (''Schrittmacher'') im vertraulichen Teil zu werten. Dadurch liegen wichtige Informationen dem die zweite Leichenschau bei Feuerbestattung durchführenden Arzt nicht vor. Bei dieser Sachlage scheint es unabdingbar eine Änderung des Leichenschauscheines und des Procedere herbeizuführen. Vorstellbar wäre ein einheitliches Formular der vertreibenden Verlage mit Schwärzungen an den Stellen, die von datenschutzrechtlichem Belang sind. Ferner sollten für sämtliche Formularblätter entsprechend gekennzeichnete Briefumschläge zur Verfügung stehen, so dass grundsätzlich bei jeder Leichenöffnung alle Formulare in einen gesonderten Umschlag kommen. Außerdem sollte noch einmal von gesetzgeberischer Seite überdacht werden, ob eine ''Vorläufige Todesbescheinigung'', wie sie sich in anderen Bundesländern bewährt hat, einzuführen. Letztlich wird auch darüber nachzudenken sein, wie die Qualität der ärztlichen Leichenschau zu verbessern ist. In erster Linie wird es eine Frage bei der Ausbildung der Medizinstudenten sein, die aber zu dieser Zeit die ''Ernsthaftigkeit'' dieser Tätigkeit noch nicht richtig einzuschätzen wissen. Außerdem wird es durch die Reduzierung der Leichenöffnungen und z.T. sehr emotional geführte Rechtsdiskussionen immer schwieriger den Arzt ''in praxi'' auszubilden. Zweifellos ist die Bereitschaft zur Fortbildung bei Ärzten, die die Leichenschau durchführen, später größer, aber hier ist kaum noch eine institutionalisierte, zeitaufwendige Fortbildung möglich. Letztlich muß auch darüber nachgedacht werden, inwieweit nicht vermeidbare Mängel bei der Leichenschau und bei dem Ausfüllen des Leichenschauscheines durch Verhängung von Bußgeldern sanktioniert werden sollte. Schließlich entstehen nicht nur anderen Institutionen (Standes, Gesundheitsamt, statistische Behörden) und Angehörigen durch Mängel bei der Leichenschau erhebliche Beschwernisse und Unkosten. Es kann auch einem Täter bei Verkennung einer Tötung Anlaß zu weiteren entsprechenden Taten geben.
TEIL I Die Bauentwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes in Frankfurt am Main von 1960 bis zur Fertigstellung des Erweiterungsbaus im Jahr 1973 ( bearbeitet von: Thomas Kick ) Die vorliegende Arbeit reiht sich ein in die Gesamtdarstellung der Geschichte des Zahnärztlichen Universitäts- Institutes in Frankfurt am Main. In der Dissertation von Bald-Duch wird ein geschichtlicher Überblick von der Gründung der Heilanstalt Carolinum im Jahre 1890 bis zum Tode von Otto Loos am 1. April 1936 gegeben, die Arbeit von Roeloffs-Nuthmann umfasst die Darstellung des historischen Werdegangs des Zahnärztlichen Institutes in Frankfurt am Main während der nationalsozialistischen Herrschaft und der Nachkriegsjahre bis hin zum Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Carolinum. Diese Dissertation vervollständigt die Dokumentation der Entwicklung des Zahnärztlichen Universitäts-Institutes Carolinum für die Jahre 1960 bis 1986, wobei der Schwerpunkt der Darstellung auf die Bauentwicklung und dabei insbesondere auf die Planung und Errichtung des Neubaus des Zentrums der Zahn-, Mund- und Kiefer- heilkunde Carolinum gelegt wurde. Zu Beginn der sechziger Jahre wurden Verhandlungen zur Übernahme der Städtischen Universitätskliniken und der angeschlossenen Institute in Frankfurt am Main durch das Land Hessen aufgenommen. Davon betroffen war auch das Zahnärztliche Universitäts-Institut Carolinum, das in die Verwaltung der Universität übergehen sollte. Professor Flesch-Thebesius als Vorsitzender des Vorstandes der Freiherr Carl von Rothschild
Bislang ist unklar, warum Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM, Chlorocebus), die in ihrem natürlichen Habitat bis zu 50% mit SIVagm infiziert sind, zeitlebens keine Symptome einer Immundefizienz zeigen, d.h. eine Resistenz gegen AIDSähnliche Symptome besitzen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in einer Studie die Immunantwort SIVagminfizierter AGM nach Immunstimulation mittels Tetanustoxoid untersucht. Ziel dieses Projekts war die Klärung der Frage, ob die Virusreplikation durch Stimulation des Immunsystem und damit einhergehend einer Vermehrung der Zielzellen von SIV, eine Änderung erfährt oder ob diese durch immunologische Kontrollmechanismen konstant bleibt. Untersucht wurde dazu eine Gruppe von vier natürlich SIVagminfizierten AGM, die zwei Jahre nach Basisimmunisierung mit Tetanustoxoid im Abstand von vier Wochen i.m. immunisiert wurden. Der Zeitpunkt der SIVInfektion lag vor der Basisimmunisierung. Wöchentlich fanden Blutentnahmen statt und es wurden immunologische und virologische Parameter bestimmt. Die gemessenen Lymphozytenwerte, die FACSDaten und die Lymphozytenproliferationskapazität ließen nach Tetanustoxoidgabe keine Änderung erkennen. Die Daten gaben keinen Hinweis darauf, daß die exogene Antigenspezifische Stimulation zu einer Proliferation der Gedächtniszellen geführt hätte. Es ist davon auszugehen, daß es während der Basisimmunisierung zu einer Proliferation von CD4 TZellen kam und diese nachfolgend infiziert bzw. eliminiert wurden. Somit waren keine Tetanusspezifischen Gedächtniszellen zum Zeitpunkt der Immunstimulation mehr existent. Um dieses Problem auszuschließen, müssten SIVagmnegative AGM eine Basisimmunisierung erhalten und erst anschließend dürfte eine Infektion mit SIVagm stattfinden. Aufgrund des Versuchsaufbaus kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Immunstimulation auf die Höhe der Virusbelastung Einfluß nimmt. Für das apathogene SIV/Primatensystem konnte im Vergleich mit AIDSsuszeptiblen SIV/PrimatenSystemen zwar keine deutlich stärkere humorale oder zelluläre Immunantwort gefunden werden, jedoch gibt es signifikante Unterschiede. AGM zeigen nur eine geringe Virusbelastung in den Lymphknoten und es konnte bislang in keinem natürlichen Wirt von SIV sog. ''VirusTrapping", daß heißt die Anheftung von Viruspartikeln auf der Oberfläche von Follikulär Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Es wurde auch nie, trotz chronischer Infektion, eine Strukturänderung des lymphatischen Gewebes gefunden. Ein weiterer kurioser Unterschied ist das Fehlen einer Immunantwort gegen natives GagProtein, obwohl es zu einer starken Immunantwort gegen das EnvProtein kommt. In der zweiten durchgeführten Studie im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte, unter der Annahme, daß die obengenannten Phänomene miteinander assoziiert sind, folgende Hypothese untersucht werden: Aufgrund des Fehlens der GagAntikörper kommt es bei AGM nicht wie bei einer HIVInfektion zur Bildung von Immunkomplexen. Dementsprechend können keine Viruspartikel via Fc Rezeptor auf FDC gebunden werden. Nachfolgend findet deshalb auch keine verstärkte Apoptose der FDC bzw. Lyse der germinalen Zentren statt, und die Lymphknotenarchitektur bzw.struktur bleibt intakt. Zunächst sollte deshalb im folgenden Projekt eine humorale Immunantwort gegen das Kernprotein von SIV induziert werden. Nach mehrfacher Immunisierung mit affinitätschromatographisch gereinigtem GagProtein entwickelten alle untersuchten Tiere (Gruppe A) hohe AntikörperTiter. Nachfolgend wurden die Gagimmunisierte Gruppe und eine Kontrollgruppe (Gruppe B) experimentell infiziert. Die Negativkontrollgruppe (Gruppe C) blieb unbehandelt. In regelmäßigen Abständen erfolgten Blutbzw. Lymphknotenentnahmen. Ein wichtiger Teil dieses Projekts war die Etablierung einer quantitativen RTPCR zum Nachweis von SIVagmRNA. Bislang war es nicht möglich, die virale RNA zu quantifizieren und bei der chronischen, benignen SIVagmInfektion von AGM lag lange der Verdacht nahe, daß es aufgrund einer niedrigen Viruslast nicht zum Krankheitsausbruch kommt. Es konnte eine quantitative TaqmanRTPCR etabliert werden, mit der der spezifische Nachweis mit einer Sensitivität von 100 RNAKopien pro ml möglich ist. Die Tiere zeigten Plasmaund Proviruslasten in einer Höhe, die durchaus vergleichbar ist mit der Viruslast HIVinfizierter Menschen bzw. SIVmacinfizierter Rhesusaffen. Es kann somit ausgeschlossen werden, daß eine niedrige Viruslast der Grund für die Apathogenität ist. Die Viruslast in den Lymphknoten wurde immunhistochemisch untersucht. Die zuvor Gag immunisierten Tiere zeigten mehr infizierte Zellen, insbesondere im Bereich der Follikel, als Gruppe B. Diese Daten stimmten mit den Ergebnissen der InsituHybridisierung überein. Auch hier konnte mehr virale RNA in den Follikeln der GruppeA detektiert werden. Zwei der Tiere zeigten Anzeichen von VirusTrapping in den Keimzentren der Lymphknoten. Die histologischen Daten könnten darauf schließen lassen, daß die Existenz von GagAntikörpern auf die Viruslast in lymphatischem Gewebe Einfluß nimmt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Fluorbenzol- und Fluorbenzimidazol- Nukleoside synthetisiert. Mit 1´-Desoxy-1´-(4-fluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 32 handelt es sich um einen zum natürlichen Inosin isosteren Baustein. Die Carbonylsauerstoffe wurden durch Fluoratome und die Stickstoffatome des Sechsringes durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Mit den Bausteinen 1´-Desoxy-1´-(4,6-difluor-1- N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose 33 und 1´-Desoxy-1´-benzimidazolyl-beta-D-ribofuranose 37 wurden zwei weitere Benzimidazol-Nukleoside mit zwei Fluoratomen bzw. ohne Fluor synthetisiert. Als isosteren Baustein für das natürliche Uridin wurde 1´-Desoxy-1´-(2,4- difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 synthetisiert. Auch hier wurden die Carbonylsauerstoffe durch Fluoratome und die Stickstoffatome durch sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome ersetzt. Um den Einfluß der Fluorsubstitution untersuchen zu können, wurden noch 1´-Desoxy-1´- (2,4,6-trifluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 86, 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34, 1´-Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35, 1´-Desoxy-1´-(2-fluorphenyl)-beta-D- ribofuranose 36 und 1´-Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38 synthetisiert. Die einfach fluorierten Bausteine wurden so ausgewählt, daß das Fluoratom an jeder möglichen Position des Aromaten einmal vorkommt. Schließlich wurden noch Inosin 31 und 1-Desoxy-D- ribofuranose 39 als abasischer Baustein synthetisiert. Die Fluorbenzimidazole wurden ausgehend von den entsprechenden Fluoracetaniliden dargestellt. Die Glykosylierung erfolgte nach der Silyl-Hilbert-Johnson Reaktion mit anschließender Deacetylierung der Hydroxylfunktionen mit ammoniakalischem Methanol. Für die C-Glykosylierung der C-Nukleoside wurde 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribono-gamma-lacton 85 benötigt. Dies wurde über vier Stufen aus D-Ribose dargestellt. Nach der C-Glykosylierung mit dem entsprechenden Fluorbrombenzol wurde den Nukleosiden die entstandene C1´- Hydroxylfunktion entfernt. Anschließend wurden die C-Nukleoside mit Palladiumhydroxid auf Kohle und Cyclohexen in einer Transfer-Katalyse entschützt. Die Ausnahme bildete 1´- Desoxy-1´-phenyl-beta-D-ribofuranose 38, das mit Bortribromid entschützt wurde. Der abasische Baustein 39 wurde aus 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose 84 durch Dehydroxylierung und anschließender Entschützung gewonnen. Von allen Fluorbenzol-Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorbenzol-Nukleoside mit Ausnahme von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der sich die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 255 pm. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 230 pm ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs C sp² -F...H-C sp² . Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auch in den Kristallstrukturen von 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 30 und 1´-Desoxy- 1´-(2-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 36 werden Fluor-Wasserstoff-Abstände von 255 pm und damit genau der Summe der van-der-Waals Radien gefunden. Nur die Kristallstruktur von 1´- Desoxy-1´-(3-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 35 zeigt keine F...H Wasserstoffbrücken. Diese Struktur weist auch als einzige eine Fischgräten-Struktur auf. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten und HPLC-Retentionszeiten der einzelnen Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Die entschützten Nukleoside wurden nach Standardmethoden für RNA Bausteine in ihre Phosphoramidite überführt. Dabei stellte sich heraus, daß durch eine starke Wanderungstendenz der TBDMS-Gruppe in Richtung 3´-Hydroxylfunktion bei allen fluormodifizierten Nukleosiden das gewünschte 2´-geschützte Isomer nur in niedrigen Ausbeuten erhalten werden konnte. Es konnte gezeigt werden, daß bei Verwendung der neuen TOM-Schutzgruppe dieses Problem gelöst werden kann. Die erhaltenen Phosphoramiditbausteine wurden mittels der Phosphoramiditmethode an einem Syntheseautomaten in Ribonukleinsäure (RNA) eingebaut. Dazu wurden RNA Stränge aus zwölf Nukleotiden mit einer Modifikation in der Mitte synthetisiert und aufgereinigt. Um festzustellen, ob die modifizierten Bausteine Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen ausbilden oder nicht, wurden sie mit allen vier natürlichen Basen gepaart und die erhaltenen 12mer RNA Duplexe mittels UV- und CD-Spektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt und die thermodynamischen Daten errechnet. Dabei stellte sich heraus, daß mehrere der modifizierten Nukleoside kaum zwischen den natürlichen Nukleosiden differenzieren, d.h. das die erhaltenen Schmelzpunkte der RNA Duplexe sich kaum unterscheiden egal mit welcher natürlichen Base die modifizierten Basen gepaart sind. Als beste universelle Basen mit der geringsten Differenzierung und den geringsten Stabilitätsverlusten des resultierenden RNA Duplex haben sich 1´-Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribofuranose (B) und 1´-Desoxy-1´-(4,6- difluor-1-N-benzimidazolyl)-beta-D-ribofuranose (E) herausgestellt. Für weitere Untersuchungen wurden die modifizierten Nukleoside gegeneinander und mit dem abasischen Baustein gepaart. Aus den erhaltenen Daten wurden die Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechselwirkung aller modifizierten Nukleoside bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß ein Einbau einer modifizierten Nukleobase die RNA-Doppelhelix durch fehlende Wasserstoffbrücken zu den natürlichen Nukleobasen und durch geringere Solvatation destabilisiert. In Gegenzug wird die RNA-Doppelhelix durch verstärkte Basenstapelungswechselwirkungen der modifizierten Nukleobasen stabilisiert. Über alle Effekte betrachtet wird die Doppelhelix durch den Einbau einer der untersuchten Nukleoside destabilisiert. Letztendlich wurden Basenpaare aus zwei modifizierten Nukleotiden gebildet, und zwar immer aus einer Purin analogen und einer Pyrimidin analogen Nukleobase (z.B. 4- Fluorbenzimidazol (D) und 2,4-Difluorbenzol (B)). Aus den berechneten Beiträgen für Solvatation und Basenstapelungswechselwirkungen konnten die erwartenden Schmelzpunkte und freien Enthalpien (betaG 0 ) für diese Basenpaare errechnet werden. Im Falle des Benzimidazol (O)-Benzol (M) Basenpaares war dieser Wert mit dem gemessenen fast identisch (±0,1°C). Für das 4-Fluorbenzimidazol-(D)-2,4-Difluorbenzol-(B) und das 4,6- Difluorbenzimidazol-(E)-2,4-Difluorbenzol-(B) Basenpaar sind die gemessenen Werte allerdings um 0,6°C (0,4 kcal/mol) bzw. 0,9°C (0,6 kcal/mol) höher als die errechneten. Da sich diese Basenpaare von dem Benzimidazol-(O)-Benzol-(M) Basenpaar nur durch die Fluoratome unterscheiden, muß diese Stabilisierung der RNA Duplexe durch Wechselwirkungen des Fluors zustande kommen. Bei dieser Wechselwirkung zwischen zwei modifizierten Nukleobasen könnte es sich um F...H-Wasserstoffbrücken handeln, wie sie auch schon in den Kristallen von 1´-Desoxy-1´-(4-fluorphenyl)-beta-D-ribofuranose 34 und 1´- Desoxy-1´-(2,4-difluorphenyl)-beta-D-ribo-furanose 30 nachgewiesen werden konnten. Als Ausblick für zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet ausgehend von den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse werden folgende Untersuchungen angeregt: - Messung von Fluor-NMR-Spektren zur Untersuchung, ob es sich bei den ermittelten Duplex stabilisierenden Kräften um F...H Wasserstoffbrücken handelt. - Verifizierung der ermittelten Beiträge der Solvatation und der Basenstapelungswechsel- wirkungen durch Einbau der modifizierten Nukleoside in RNA einer anderen Sequenz. - Synthese der Triphosphate der fluormodifizierten Nukleoside mit enzymatischen Einbauversuchen. - Einbau der als universellen Basen erkannten Nukleoside in Ribozyme mit Test der Enzymselektivität und Enzymaktivität.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die initialen Bewegungsparameter von Ionen bei matrixunterstützter Laserdesorption zu bestimmen, um mit deren Kenntnis das Verständnis des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI zu verbessern. Die Etablierung einer Meßmethode der initialen Geschwindigkeit von Analytionen sowie die Überprüfung verschiedener experimenteller Parameter führten zur Bestimmung einer großen Zahl von Meßwerten der Startgeschwindigkeit von Ionen unterschiedlicher Masse, Ladung und Substanzklasse bei verschiedenen Matrizes und Präparationsbedingungen (siehe Kapitel 5 und 7). Durch Vergleich dieser Meßwerte ist eine Charakterisierung des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI möglich. Aufbauend auf diesen Untersuchungen der Startgeschwindigkeit von Ionen wurde ein Desorptions/Ionisationmodell für MALDI entwickelt (siehe Kapitel 6 und 8). Aus der festen Matrix/Analytpräparation werden durch den Laserimpuls oberhalb einer kritischen Laserbestrahlung geladene Bruchstücke ("Cluster") freigesetzt. Aus diesen Clustern resultiert nach Abdampfen von ungeladenenen Teilchen, wie zum Beispiel Matrixmolekülen, die Freisetzung von Ionen in der Gasphase. Hierbei kann das Modell der Clusterbildung sehr gut mit dem Desorptionsmodell nach Zhigilei (siehe Kapitel 2.4.1.5) verknüpft werden [Zhi97]. Die Cluster verschiedener Größe werden in der sich ausdehnenden Teilchenwolke transportiert. Sie bewegen sich mit der initialen Geschwindigkeit der expandierenden Teilchenwolke. Dieser Vorgang kann mit dem "Mitgerissen werden" der Biomoleküle (entrainment) [Bea91] bei MALDI korreliert werden: So wird beispielsweise beobachtet, daß die mittlere initiale Geschwindigkeit v 0 der Analytmoleküle im Mittel nie höher ist als die der Matrixmoleküle. Die Schwellbestrahlungsabhängigkeit der Ionisation kann weiterhin mit der Schwellbestrahlung der Ablation, d.h. der kollektiven Ablation von großen Partikeln aus der Matrix/Analytpräparation, wie sie von Zhigilei in molekulardynamischen Simulationen gefunden wurde, verknüpft werden. Desorption und Ionisation sind somit nicht getrennt voneinander zu betrachten, da während der Desorption die Freisetzung von Ionen erfolgt. Wenn Peptide und Proteine aus Clustern stammen, besitzen die freigesetzten Biomolekülionen die gleiche mittlere Analytionengeschwindigkeit wie die Matrixneutralen [Dre94]. Für kleine Oligosaccharide werden niedrigere Startgeschwindigkeiten detektiert als für Peptide und Proteine. Das kann darauf zurückgeführt werden, daß diese Ionen nicht als vorgeformte Ionen aus Clustern freigesetzt werden. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten neutralen Oligosaccharide kationisiert und (im wesentlichen) nicht protoniert im MALDIMassenspektrum auftreten und bei höheren Verzögerungszeiten eine verstärkte Kationisierung von Oligosacchariden zu beobachten ist, werden diese Teilchen voraussichtlich nach der Desorption in der Gasphase ionisiert (siehe Kapitel 7 und 8). Da Oligosaccharide in die Matrix DHB eingebaut werden, jedoch Kationen zur Ionisation nicht in den Matrixkristallen zur Verfügung stehen, ist anzunehmen, daß neutrale Oligosaccharide aus Clustern mit der gleichen Startgeschwindigkeit wie Peptide und Proteine in der desorbierten Teilchenwolke vorkommen; ihre Ionisation und damit ihre Detektion ist aufgrund der fehlenden Ladung jedoch nicht möglich. Die Ergebnisse der Startgeschwindigkeit von Ionen bei verschiedenen Präparationen verdeutlichen, daß Gasphasenionisation einer der möglichen Wege der Ionisation neben der Freisetzung von Analytionen aus geladenen Clustern ist. Da auch für Peptide und Proteine Kationisierung in der Gasphase auftreten kann, lassen sich auch langsame Molekülionenspezies experimentell feststellen, was mehrere initiale Geschwindigkeits komponenten und damit auch ein Ionensignal mit unterschiedlichen Komponenten der Startgeschwindigkeit zur Folge hat. Weiterhin sollte auch unterhalb der Schwelle des Analytionennachweises (und damit der kollektiven Ablationsschwelle gemäß dem breathing sphereModell) bei MALDI aufgrund von Verdampfung einzelner Moleküle gefolgt von Ionisation in der Gasphase ein Ionensignal feststellbar sein. Die beobachtete mittlere Startgeschwindigkeit von Analytionen wäre somit eine Mischung aus schnellen, aus Clustern stammenden, und aus langsamen, in der Gasphase ionisierten Teilchen. Eine Komponente kann als prompt ionisierte Komponente mit im wesentlichen massenunabhängiger, konstanter (hoher) initialer Geschwindigkeit verstanden werden. Die zweite Komponente kann durch verzögert auftretende Gasphasenionisation innerhalb des expandierenden Materials erklärt werden, wobei die Analytionen eine geringere Startgeschwindigkeit zeigen. Zusammenfassend (siehe Kapitel 8) wird eine kollektive Ablation von Partikeln und vorgeformten Ionen beim MALDIDesorptionsprozeß gefolgt von Sekundärreaktionen innerhalb der dichten Teilchenwolke in der Gasphase in der selvedgeRegion durch Ionen Molekülreaktionen vorgeschlagen, wie es bereits bei dem precursorModell für Sekundärionenmassenspektrometrie formuliert wurde [Sun88], [Pac85], [Ben83]. Bezogen auf die Auswahl potentieller Matrizes besitzt das Modell nach wie vor nur eine geringe "Voraussagekraft": Ob eine Substanz als Matrix geeignet ist oder ob sie einen hohen bzw. geringen Grad an metastabiler Fragmentierung für zum Beispiel Peptide oder Proteine zeigt, kann weiterhin nur experimentell bestimmt werden, wobei jedoch eine Charakterisierung mit Hilfe der Startgeschwindigkeit möglich ist. Der Zusammenhang eines ClusterDesorptions/Ionisationsmodells mit molekulardynamischen Simulationen nach Zhigilei ermöglicht jedoch eine Beschreibung vieler experimenteller Ergebnisse bei MALDI. Weiterführende Experimente sollen die Verifikation des "ClusterModells" der Ionisation zum Ziel haben. Hier ist insbesondere die Untersuchung des Ladungszustandes von Analytmolekülen in festen Matrix/Analytpräparationen von Bedeutung. Weitere Untersuchungen zur Spektrenqualität bei Matrizes, die keinen Einbau der Analytmoleküle in die Matrixkristalle zeigen, sowie eine eingehende Untersuchung der verschiedenen alternativen Präparationstechniken aus Kapitel 7 sind hierbei geplant.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Methoden für die hochauflösende NMR Spektroskopie entwickelt, um damit native und denaturierte Proteine charakterisieren zu können. Neue Mess- und Anwendungsmethoden für dipolare Kopplungen bilden den Schwerpunkt der Doktorarbeit. Durch die Verwendung von flüssigkristallinen Medien ist es in NMR in Lösung möglich geworden dipolare Kopplungen zu bestimmen. Durch die Projektionen der einzelnen so bestimmten Vektoren auf andere Vektoren im Protein, welche beliebig weit entfernt sein können, kann weitreichende Orientierungsinformationen für die Strukturrechnung von Biomakromolekülen genutzt werden. Dies ist an den Beispielen Ubiquitin, Triggerfaktor und Raffinose in der Arbeit dargestellt. Durch diese Orientierungsinformation kann man auch Teile von Proteinen, wie zum Beispiel Domänen, gegeneinander ausrichten oder die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen nutzen um eine 3D Homologiesuche durchzuführen. Auch dies ist in der Arbeit beschrieben. Die neuen Messmethoden erlauben erstmals die Bestimmung von 1H-1H dipolaren Kopplungen mit Größe und Vorzeichen (JHH-NOESY) und von allen drei dipolaren Kopplungen in einer Seitenkettenmethylgruppe (SPITZE-HSQC). Ein weiterer wichtiger Punkt war die Extraktion dynamischer Parameter aus dipolaren Kopplungen. Der Vektor, der die wechselwirkenden Dipole verbindet, wird von der Dynamik des Proteins beeinflusst. Dadurch ist eine Analyse der Dynamik auf einer Zeitskala bis ca. 10ms möglich (bisher nur bis in den Bereich von ns). Besonders µs Dynamik, welche vorher nicht mittels NMR Methoden sichtbar, kann so dargestellt werden. Aus den dipolaren Kopplungen, welche in 11 verschiedenen Orientierungsmedien gemessen wurden, konnten modellfreie dipolare Ordnungsparameter extrahiert werden. Erstmals konnte zwischen axialsymmetrischen und anisotropen Bewegungen der NH Vektoren unterschieden werden. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass Ubiquitin auf einer Zeitskala oberhalb der Korrelationszeit ähnlich viel Bewegung zeigt wie unterhalb der Korrelationszeit. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 für Bewegungen bis zur Korrelationszeit auf 0.6 für alle Bewegungszeiten. Auch sieht man, dass viele Bewegungen bis zu 60% Anisotropie beinhalten. TOCSY-Sequenzen sind wichtige Bausteine für Moleküle jeder Größenordnung. Hierfür wurden neue adiabatische TOCSY Sequenzen entwickelt, welche TOCSY Spektroskopie bei allen Magnetfeldern mit höherer Intensität erlauben. Wichtig ist auch noch die viel größere Robustheit gegen B1-Inhomogenitäten und Pulsmisskalibrierung. Dipolare TOCSY Sequenzen (MOCCA) erlauben besseren Transfer mittels den zuvor schon erwähnten dipolaren Kopplungen. Durch die Analyse denaturierter Proteine wollte man ein besseres Verständnis dieses Zustandes erzielen. Hierfür wurden Kopplungskonstanten, kreuzkorrelierte und autokorrelierte Raten und chemische Verschiebungen gemessen und mit einem Modell, dem sogenannten Random Coil Modell verglichen. Mit Hilfe dieser experimentellen Daten sieht man erstmals direkt, dass Proteine im denaturiertem Zustand den Winkel zwischen 60° ( -Helix) und 120° ( -Faltblatt) absuchen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen, nicht isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Ziel ist die Aufklärung der Struktur und der biologisch relevanten Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Konkret wird die strukturelle Aufklärung der zweiten KunitzDomäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), TFPI2 beschrieben. Dieses Molekül spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung (Kapitel 2.2) in Säugetieren, in dem es bei kleinsten Verletzungen die Gerinnung unterbindet und so die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des betroffenen Bezirks aufrecht erhält (Kapitel 2.3). Die untersuchte zweite Domäne des TFPI lagert sich direkt und spezifisch an ein zentrales Molekül der Gerinnungskaskade, den Faktor Xa, an. Neben dieser bio logischen Funktion trägt die Entdeckung des TFPI dazu bei, die strikte Trennung der Gerinnung in zwei voneinander unabhängige Reaktionswege bis zur Bildung des Fibrinpolymers aufzuheben. Zur Bestimmung der Struktur des unmarkierten Proteins wurden NMRSpektren aufgenommen. Neben den im Kapitel 3 beschriebenen Standardexperimenten wur den im Rahmen der Untersuchungen das TACSYExperiment in neuer Art und Weise genutzt (Kapitel 4.2), da die Probe ein ungünstige Relaxationseigenschaften auf wies. Mit dem entwickelten Experimenten ist ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Kopplungskonstanten in nichtmarkierten Molekülen nun auch in solchen Proben möglich, da die Güte der abgelesenen Konstanten nicht mehr von der Signalbreite beeinflußt wird. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurde ein neues Experiment zur Bestim mung von 3 J(HNH)Kopplungskonstanten entwickelt. Das SIAMTACSY (Kapitel 4.3), ermöglicht die Bestimmung der Kopplungskonstanten nach der DISCOMe thode, für die bislang die Aufnahme von wenigstens zwei Spektren mit unter schiedlichen Methoden nötig war, mit nur einem einzigen Spektrum. Beide Methoden, SIAM--TACSY als auch die in dieser Arbeit näher beschriebene Me thode, umgehen die Notwendigkeit der Aufnahme verschiedener Spektren mit un terschiedlichen Pulssequenzen und Aufnahmebedingungen. Während SIAM--TACSY mit nur einem Experiment auskommt, dessen Daten durch unterschiedliches Post-Processing alle Kopplungskonstanten liefern, müssen mit der in Kapitel 4.2.2 be schriebenen Methode mehrere Spektren desselben Typs aufgenommen werden. Im Verlauf der Arbeit wurden die Resonanzen von 52 von 58 Aminosäuren eindeu tig und vollständig zugeordnet (Kapitel 3.4). Die Spektren liefern die für die Struk turrechnungen notwendigen Parameter (Kapitel 5). Die berechnete Struktur basiert auf 762 DistanzRestraints, 20 DihedralWinkel des ProteinRückgrats und 15 Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Parameter wurden zunächst in Distance-Geometry-Berechnungen (Kapitel 6.2) eingesetzt. Zur Verfeinerung der Struktur wurde in den späteren Rechnungen das SimulatedAnnealingVerfahren (Kapitel 6.1) genutzt. In einem iterativen Ver fahren werden die gewonnenen Strukturen -- es wurden immer 100 Strukturen gleichzeitig aus einem Parametersatz berechnet -- analysiert und die korrigierten und überprüften Parameter wieder in die Berechnungen eingesetzt (Kapitel 6.3). Die Struktur der zweiten Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor ist durch dieses Verfahren sehr gut definiert, was sich in den Werten der Standardabwei chung für die 10 besten Strukturen für den Backbone (1,4 Å) niederschlägt (Kapitel 6.4). Die so bestimmte Struktur beweist die Annahme, daß es sich bei der zweiten Do mäne des TFPI auch strukturell um einen typischen KunitzInhibitor (Kapitel 2.1) handelt, was durch punktuelle Mutationen im Bereich der reactive site bereits funktionell bewiesen war. Die Stabilität der ProteaseInhibitoren gegenüber Verdau und Entfaltung begründet sich in der kompakten Struktur, die durch 3 Disul fidbrücken stabilisiert wird. Die sechs stets 1 gleichweit voneinander in der Sequenz entfernten Cysteine verbinden N und CTerminus (Cys5 -- Cys55 in der BPTI Numerierung), stabilisieren die reactive site (Cys14 -- Cys38) und binden das zentrale Faltblatt an den Rest des Moleküls. Die für KunitzInhibitoren typische Struktur ist im untersuchten Protein bewahrt; weniger gut definiert ist die in eini gen Inhibitoren dieses Typs zu findenden N-terminale AlphaHelix, sie ist in den Struk turen des TFPI2 lediglich angedeutet. Ein Vergleich der Struktur des TFPI2, so wie es in dieser Arbeit untersucht wurde, und der Struktur eines Homologen findet in Kapitel 6.4.3 statt. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß die strukturelle Untersuchung des kleinen, un markierten Proteins erfolgreich durchgeführt werden kann. Die Struktur des phar makologisch interessanten Moleküls sollte ein Hilfsmittel bei der Auffindung von neuen, den körpereigenen ähnlichen und damit besser verträglichen Gerinnungs inhibitoren sein. Die neuen NMRMethoden bieten ein innovatives Werkzeug zur Gewinnung von skalaren Kopplungskonstanten mit hoher Effizienz und unter Umgehung der Probleme, die in COSYSpektren mit hohen Linienbreiten auftreten.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Obwohl die Kristallstrukturen der CytochromcOxidase aus RinderherzMitochondrien und dem Bodenbakterium P. denitrificans bekannt sind und die Funktionsweise des Enzyms mit Hilfe zahlreicher Methoden bereits intensiv untersucht wurde, wird nach wie vor kontrovers diskutiert, an welcher Stelle im katalytischen Zyklus wieviele Protonen aufgenommen bzw. gepumpt werden und über welchen der beiden Protoneneintrittspfade dies geschieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diesen Fragestellungen mit Hilfe von elektrischen Messungen nachzugehen, um dann ein genaueres Bild von der mechanistischen Funktionsweise des Enzyms zu erhalten. Hierzu wurden Teilschritte des katalytischen Zyklus der CytochromcOxidase aus P. denitrificans genauer untersucht. Dies gelang durch Spannungsmessungen an der schwarzen Lipidmembran mit Ru II (2,2'bipyridyl) 3 Cl 2 (Rubpy) als lichtinduzierbarem Einelektronendonor. Es konnte gezeigt werden, daß ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O nach Lichtanregung ein Elektron von Rubpy auf die Oxidase übertragen und anschließend vom CuA zum Häm a mit einer Zeitkonstanten von » 20 µs transportiert wird. Zeitaufgelöste spektroskopi sche Messungen deuten darauf hin, daß das Elektron auf dem Häm a verbleibt. Die Reduktion dieses Kofaktors führt zu einer Protonenaufnahme über den KWeg mit einer Zeitkonstanten von » 175 µs. Nimmt man an, daß sich Häm a in der Mitte des Dielektrikums befindet (Hinkle und Mitchell, 1970), so deuten die relativen Amplituden der beiden Phasen an, daß etwa 0.8 Protonen aufgenommen werden, in sehr guter Übereinstimmung mit (Capitanio et al., 2000). Aus MehrfachblitzExperimenten unter anaeroben Bedingungen, ausgehend vom OZustand, konnten erste Erkenntnisse über den E ® R Übergang gewonnen werden, nämlich daß hierbei ein Prozeß mit einer Zeitkonstanten von ca. 1.1 ms auftritt und daß sowohl K als auch DWeg an diesem Teilschritt des katalytischen Zyklus beteiligt sind. Da mit der MehrfachblitzMethode aber immer ein Gemisch aus verschiedenen Zuständen entsteht, war es nicht möglich, quantitative Aussagen über die Zahl der transportierten Ladungen zu treffen. Aus diesem Grund wurde eine Möglichkeit gesucht, den EZustand in hoher Ausbeute mit ausreichender Stabilität herzustellen, um dann ein Elektron zu übertragen. Dies gelang durch Darstellung des OxoferrylZustandes F mit Hilfe von H 2 O 2 und anschließende Zweielektronenreduktion durch CO. Die Übertragung von einem Elektron auf den so gebildeten EZustand lieferte 3 Phasen im Spannungssignal mit Zeitkonstanten von » 25 µs, » 200 µs und » 1.5 ms. Die relativen Amplituden dieser Phasen und die Ergebnisse von K und DWegMutanten legen nahe, daß nach Aufnahme des 2. Elektrons vermutlich ein Proton über den KWeg aufgenommen und anschließend 1 Proton über den DWeg gepumpt wird. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, daß bereits während des reduktiven Teils (O ® R) des katalytischen Zyklus ein Proton von der intrazellulären zur extrazellulären Seite transportiert wird und zwar ohne daß unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion stattgefunden haben muß. Erste Experimente zum P ® F Übergang lassen sich so deuten, daß mit Aufnahme des 3. Elektrons ein Proton zum binuklearen Zentrum transportiert und mindestens 1, wenn nicht gar 2 Protonen durch das Enzym gepumpt werden. Hier sind noch weitere Experimente nötig, um die genaue Zahl der transportierten Ladungen und die für die einzelnen Protonenbewegungen verwendeten Protoneneintrittspfade zu bestimmen. Messungen zum F ® O Übergang schließlich zeigten, daß nach dem CuA ® Häm a Elektro nentransfer mit einer Zeitkonstanten von ca. 25 µs vermutlich 1 Proton über den DWeg bis zu den Hämen transportiert (t » 270 µs) und anschließend ein Proton ebenfalls über den DWeg gepumpt wird (t » 1.5 ms). Aus den gewonnenen Daten wurde ein neuer Mechanismus für die Sauerstoffreduktion in der ParacoccusCOX entwickelt. Dieser beruht auf dem von Mitchell und Rich postulierten Elektroneutralitätsprinzip (Mitchell und Rich, 1994) und ist stark an das von Michel vorgeschlagene Modell (Michel, 1998; Michel, 1999) angelehnt. Zur Klärung der Fragen, ob sich bakterielles und RinderzEnzym eventuell in ihrem Mechanismus unterscheiden oder ob nicht eventuell ein Proton während des O ® E Übergangs gepumpt wird (allerdings nur, wenn unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion durchlaufen wurde), sind u.a. noch intensivere Untersuchungen des P ® F Teilschrittes notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 2 verschiedene Kobaltkomplexe auf ihre Eignung als lichtinduzierbare Sauerstoffdonatoren (cagedSauerstoff) für die COX untersucht. Hierbei stellte sich heraus, daß beide Verbindungen ungeeignet sind, da sie entweder instabil sind ((µsuperoxo)bis[pentaammincobalt(III)]) oder Nebenreaktionen mit dem Protein eingehen ((µperoxo)(µhydroxo)bis[bis(bipyridyl)cobalt(III)]). Abschließend wurde der Einfluß von Zn 2 Ionen auf elektrogene Schritte im katalytischen Zyklus genauer erforscht. Es wurde deutlich, daß Zn 2 bakterielle COX von beiden Seiten inhibieren kann, wobei die Bindestelle(n) auf der intrazellulären Seite im Gegensatz zur extrazellulären Seite hochaffin ist/sind. Die elektrischen Messungen deuten darauf hin, daß hierbei sowohl D als auch KWeg blockiert werden, wobei die exakte Position der Metallbindestelle(n) noch zu klären ist.
Zur Untersuchung der Zusammensetzung und Diversität von Bambusameisengemeinschaften (Hymenoptera, Formicidae) sowie ausgewählten Nischenparametern der beteiligten Ameisenarten, wurden auf dem Gelände des Gombak Field Studies Centre (University Malaya, Selangor, Westmalaysia) fünf Haine von Riesenbambusarten (Gigantochloa scortechinii, G. thoii, Bambusoidea) gefällt und abgesammelt. Es wurden Hinweise auf deterministische oder stochastische Strukturierungsmechanismen der Ameisengemeinschaften gesucht. Hierzu wurden verschiedene Fragestellungen anhand der Multiplen Regression untersucht. Zusätzlich wurden Stichproben von Bambusschößlingen und jungen Bambushalmen hinsichtlich der Nutzungsweise und Besiedlung durch Ameisen studiert. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Auswertung auf Hainebene, d. h. der Bambusameisenzönosen als Ganzes betrachtet, vorgestellt. 1. In fünf Bambushainen wurden bisher 66 nistende Ameisenarten aus 21 Gattungen und 6 Unterfamilien identifiziert. Die drei gattungs
Molekulare Charakterisierung und immunologischer Nachweis von porcinen endogenen Retroviren (PERV)
(2001)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Apolipoproteine des Liquors untersucht, um bestehende Zusammenhänge nachzuweisen, die eventuell später bei der Diagnose von Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das ApoE aller Proben wurde phänotypisiert. Die Konzentrationen des ApoJ und Apo(a) wurden mit Hilfe selbst- bzw. in der Arbeitsgruppe entwickelter ELISAs bestimmt. Durch Kombination der existierenden ELISAs konnte der von Borghini et al. 1995 beschriebene LpE-Partikel und ein bisher nicht bekannter Apolipoprotein-Partikel aus Apo(a) und ApoE nachgewiesen werden. Die relative Konzentration dieses Apo(a)/E- und des ApoJ/E-Partikels wurde bestimmt. Mit Hilfe der Kreuzimmunelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die Apolipoproteine Bestandteil eines Partikels sind. Aufgrund der gefundenen Informationen wurde die These postuliert, daß es sich bei diesen Partikeln um einen gemeinsamen Partikel aus ApoE, ApoJ und Apo(a) handelt. Detaillierte Daten über den Aufbau und die Zusammensetzung des Partikels konnten bisher nicht gewonnen werden. Im Liquor wurden die Konzentrationen von ApoE, Apo(a) und ApoJ gemessen. Diese Konzentrationen wurden in Zusammenhang zu dem ApoE-Phänotyp der entsprechenden Probe gesetzt. Wo möglich wurde ApoE und Apo(a) auch im Serum der entsprechenden Patienten bestimmt. Auch diese Konzentrationen wurden in Beziehung zu ihrem ApoE-Phänotyp gesetzt. Zuletzt wurden für die Apolipoproteine E und (a) die Liquor- und Serumkonzentration in Beziehung zueinander gesetzt. Außer für das ApoE und den ApoJ/E-Partikel konnte für keines der untersuchten Apolipoproteine weder im Liquor noch im Serum ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration des Apolipoproteins und dem ApoE-Phänotyp gefunden werden. Zusätzlich zu den Apolipoproteinen des Liquors wurde in Zusammenarbeit mit der Universität Dresden das Tau-Protein gemessen. Die Ergebnisse bestätigen die diagnostische Wertigkeit der Bestimmung von Protein Tau bei degenerativen Erkrankungen des ZNS. Eine Differenzierung zwischen verschiedenen degenerativen Erkrankungen des ZNS ist jedoch nicht möglich. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersuchte die Rolle des ApoE im Gehirn. Dabei zeigte sich, daß die Synthese des ApoE durch die Astrozyten ein sehr komplexer Vorgang sein muß. Eine weitere Untersuchung des ApoE wies die stärkere Glykolisierung im Liquor im Vergleich zum Serum nach.
Die immer länger werdende Verweildauer der türkischen Migranten und die bis vor einigen Jahren ständig ansteigende Anzahl nachgeholter älterer Kinder deuteten schon seit Mitte der achtziger Jahre darauf hin, daß die aufgrund des Anwerbevertrages nach Deutschland eingereisten türkischen Arbeitskräfte nicht mehr zurückkehren werden. Die Hessische Schule reagiert darauf, indem sie die Ziele des MU veränderte und als ein wesentliches Ziel neben der Sprachen und Wissensvermittlung über die Kultur des Herkunftslandes auch das Verstehen der eigenen Situation im Einwanderungsland, die Erschließung des eigenen Umfeldes und die Fähigkeit, darin zu handeln, angibt. (s.a. Kap.IV, 2.) Einer so bedeutsamen Aufgabe gerecht zu werden, ist nur dann möglich, wenn sowohl der Muttersprache der Kinder, als auch dem Lernbereich überhaupt, von Seiten der Administration, den Institutionen und der darin Handelnden, also Schülern und Lehrern, Bedeutung und Wert beigemessen werden und sie Teil der Hessischen Schule sind. Kinder ausländischer Eltern wachsen in der Regel zweisprachig auf. Zweisprachig zu sein, ist ein Faktum, das für das Individuum einen hohen Wert darstellt. In Deutschland wird Zweisprachigkeit nicht immer als etwas Positives gesehen. (Selbst dann nicht, wenn es um eine im eigenen Land gesprochene Sprache geht, wie z.B. das Ostfriesische. Obwohl das Ostfriesische in Ostfriesland die dominierende Sprache ist, sprechen die Eltern mit den Kindern, die in die Schule kommen sollen, zunächst Hochdeutsch, um ihnen den Schulanfang zu erleichtern.) Das Ansehen einer Sprache ist weitgehend davon abhängig, welches 'Prestige' die Sprache hat, aber auch welches soziales Prestige ihre Sprecher haben. Türkisch steht in der Sprachenhierarchie nicht besonders hoch, es gilt als Gastarbeitersprache, ebenso wie das Wort 'Türke' noch immer den typischen 'Gastarbeiter' assoziiert. Dabei wird nicht zur Kenntnis genommen, daß die Zahl derjenigen, die dem Mittelstand zuzurechnen und zu Arbeitgebern auch für Deutsche oder andere Nationen geworden sind, ständig im Steigen begriffen ist. (s.a.Kap.VII, 5.3) Alle Muttersprachlehrer in Hessen sind seit 1970 aus dem Zuwandererpotential eingestellt worden, seit 1972 gibt es keine 'Regierungslehrer' mehr. Der Muttersprachliche Unterricht gewinnt an Wert, wenn seine Bedeutung nicht in Frage gestellt und seine Erteilung als 'normal' angesehen wird. Es war daher wichtig zu erfahren, welchen Wert ihm die Interviewten beimessen. Bei allen Interviewten hat der Muttersprachenunterricht Türkisch einen hohen Stellenwert. Die Anzahl der Schüler, die ihn in Hessen besuchen, übersteigt 70% und liegt damit höher, als in jedem anderen deutschen Bundesland und auch EUStaat. Diese hohe Teilnehmerzahl würde nicht erreicht werden, wenn die Türkei den Unterricht in eigener Verantwortung durchführen müßte, wie es zeitweise im HKM überlegt wird. Die Türkei ist an einer stark nationalbewußten Ethnie in Deutschland interessiert, da diese leichter zu kontrollieren und zu reglementieren ist, und auch weiterhin mit einem Geldtransfer zu rechnen ist. Die türkische Ethnie, so wie der Erziehungsattaché (s.a. Kap.VII, 1.1) sie sich vorstellt, würde Sitten und Bräuche bewahren und durch die soziale Kontrolle würde weniger Zündstoff für die Türkei entstehen. Viele Ereignisse, die die Türkei beunruhigen, haben ihren Ursprung in oder erhalten Unterstützung aus Deutschland. (z.B. das Selbstbewußtsein, das die Kurden und andere Minderheiten entwickelt haben, das Sichbekennen der Aleviten und anderer religiöser Gruppen und das Wiedererwachen unterschiedlicher muslimischer Glaubensrichtungen.) In einer Zeit der Globalisierung und des immer lauter werdenden Rufens nach einem frühen Angebot von Fremdsprachenunterricht, möglichst schon in der Grundschule, ist die Zweisprachigkeit der Kinder ausländischer Eltern neben dem Einfluß, den die Herkunftssprache bei der Identitätsfindung hat, auch eine ökonomische Ressource, die nicht ungenutzt bleiben sollte. Zweisprachigkeit darf allerdings nicht zu einer 'doppelten Halbsprachigkeit' führen, daher müssen die zu erreichenden Ziele in den einzelnen Jahrgängen, klar zu erkennen, die Lehrer kompetent sein, und der Unterricht nicht zur 'Kuschelecke' der Schüler werden. Da der Muttersprachliche Unterricht eine so wichtige Aufgabe hat, muß man sich der Ziele bewußt sein, die vorgegeben werden müssen bei Schülern, die vermehrt deutsche Staatsbürger sein werden. Es kann dann nicht mehr so unterrichtet werden, als sei die Türkei die 'Heimat'. Sie kann nur noch Herkunftsland sein, während das Aufnahmeland zur Heimat werden muß, wenn es das noch nicht ist. Dabei sollen die Bindungen zu dem Teil der Familie, der in der Türkei geblieben ist, erhalten bleiben. Schon jetzt haben die meisten Grundschulkinder ihre Großeltern nicht mehr in der Türkei, sondern in Deutschland. Für die zukünftigen Generationen wird die Türkei zwar immer noch das Land ihrer Herkunft, ein Traumland oder Ferienland sein, aber kaum mehr. Türkische Eltern halten den Besuch des MU für erforderlich, da sie befürchten, daß mit dem Verlorengehen der Sprache auch der Familienzusammenhalt leiden würde, daß Sitten und Gebräuche, auf die sie großen Wert legen, verloren gehen könnten. Sie befürchten, daß durch den Besuch der Schule die Kinder einem gewissen Akkulturationsdruck ausgesetzt sind und daher mehr oder weniger Kulturmuster der Mehrheitsgesellschaft übernehmen. Aus diesem Grunde setzten sich vor allem türkische Mütter für die Einrichtung des Türkischunterrichts auch an Schulen ein, an denen es noch keinen Unterricht gab. (Heute würde es die Aufgabe des Türkischen Elternvereins sein, der sich seit ungefähr vier Jahren gebildet hat.) Diese Sorge führt aber auch dazu, daß türkische Eltern, der zweiten Generation ihre Kinder noch so sozialisieren, wie auch sie selbst sozialisiert worden sind. (s.a. Kap. IV) Sie machen aber insoweit Zugeständnisse, als sie es dulden, daß die Kinder untereinander Deutsch sprechen. Die gleichen Argumente, wie sie von den Eltern für ein Festhalten am MU genannt werden, gelten auch für die Lehrer. Zum einen sind sie selber Eltern und haben damit die gleichen Ängste wie diese, zum anderen ist es ihr Beruf, die Sprache zu lehren und ihrer Meinung nach, die nationale türkische Kultur und damit die entsprechenden Sitten und Bräuche zu vermitteln. Ihre Interessensphäre ist die Erhaltung des Istzustands. Obwohl sie sich bewußt sind, daß nur wenige Schüler in die Türkei zurückkehren werden, vermitteln sie Inhalte in der Regel so, wie sie es gelernt haben und es für die Türkei vielleicht heute noch stimmig ist, jedoch hier nicht ungeprüft weiter gegeben werden sollte. Kultur und Bräuche sind nicht statisch, sondern wandeln sich und passen sich den Gegebenheiten an. "Die Kultur von Migranten unterscheidet sich also von der Kultur des Herkunftslandes, Migranten vollziehen eine kulturelle Transformation, die insgesamt auf die Flexibilität und Veränderbarkeit kultureller Ori entierung hinweist." (Sting,1995: 127) Nur ein einziger Lehrer stellt die Überlegung an, ob es nicht wichtiger sei, sich ab der siebenten Klasse, auf die Sprache Deutsch zu konzentrieren. Wenn Türkisch unbedingt weiter gelernt werden soll, dann im Fremdsprachenunterricht. Während der Erhalt von Sprache, Sitten und Bräuchen immer wieder angesprochen wird, wird die Religion, die bei in der Fremde wohnenden Ethnien meist einen hohen Stellenwert erhält, nur am Rande erwähnt. Nur wenige Lehrer setzen sich für einen Religionsunterricht in der Muttersprache ein, die meisten sind der Meinung, daß man diesen Unterricht auf Deutsch erteilen sollte. Das kann darauf hindeuten, daß man den Unannehmlichkeiten aus dem Wege gehen will, die man beim Erteilen Religionsunterricht in den Vorbereitungsklassen hatte. Denn obwohl der Koran die Grundlage des Glaubens aller Muslime ist, haben doch die verschiedenen sunnitischen Moscheenvereine ihre eigene Ausprägung. Für Aleviten käme ein sunnitischer Religionsunterricht sowieso nicht in Frage. Die Ablehnung des Erteilens könnte aber auch in der laizistischkemalistischen Lehrerausbildung begründet sein, deren Auftrag es ist, die Nation als verbindendes Element darzustellen und nicht den Glauben wie im Osmanischen Reich. (S.a. Schiffbauer, 2000, 47ff) Die Studentin Nurgül stellte erstaunt fest, daß im Muttersprachlichen Unterricht Religionsbücher ausgeteilt wurden. Die hohe Wertschätzung und die Unverzichtbarkeit, die auch auf deutscher Seite der Muttersprache Türkisch zugestanden wird, hat nicht dazu geführt, den MU wie ein 'normales' Fach zu behandeln. Den Schulleitern ist es bisher nur selten gelungen, den Unterricht so in die Stundentafel zu integrieren, daß er nicht als Anhängsel oder gar als eigenständige Schule empfunden wird. Schulleiter und Kollegien haben es auch nicht erreicht, dem türkischen Lehrer das Gefühl von Zweitrangigkeit zu nehmen. Am besten ist die Einbindung der Lehrer noch in den Grundschulen gelungen, wenn versucht wird, den Unterricht der ersten beiden Schuljahre in den Vormittag zu legen. Aber schon im dritten und vierten Jahrgang wandert er in der Regel wieder in den Nachmittag. Es gibt auch immer noch Schulen, in denen nicht einmal die Raumfrage so gelöst worden ist, daß türkische Lehrer sich nicht diskriminiert fühlen müssen. (s.a. Kap. VIII, 5.4) Wiederum ist es die Grundschule, deren Schulleiter die meisten Kenntnisse über die Inhalte haben, die im MU vermittelt werden, z. T. weil an einigen Schulen das Projekt KOALA durchgeführt wird, z.T. durch die Beschwerden von Eltern über die vermittel ten Inhalte. Selbst da, wo deutsche Lehrer zu den am Vormittag unterrichtenden türkischen Kollegen ein freundschaftliches Verhalten entwickelt haben, kennen eher die türkischen Lehrer die im Regelunterricht durchgenommen Inhalte, als umgekehrt. Dabei wäre für beide Lehrergruppen die Informationsbeschaffung mit wenig Mühe verbunden, da es für jedes Fach Rahmenpläne gibt und jeder Lehrer, auch der türkische, daraus den Stoffverteilungsplan in deutscher Sprache für das laufende Schuljahr erstellen muß. Beide Lehrergruppen würden die Effizienz des Unterrichts steigern können und mehr von einander erfahren, was zum Abbau von Vorurteilen und zur besseren Einsicht in die Vorhaben des anderen führen würde und vielleicht zu gemeinsamen Projekten. Aufgrund der Rahmen und Stoffverteilungspläne müßten aber eigentlich auch die Schulleiter wissen, was im MU gelehrt wird, denn sie erhalten diese Pläne. Man braucht also nicht erst bei Prüfungen zu erfahren, daß die Inhalte sehr national sind und somit nicht unserem Verständnis von Unterricht entsprechen. Die meisten Schulen werden zwar von einer Vielzahl ausländischer Nationalitäten besucht, in der Grundschule im Ostend sind es über hundert, nicht alle erhalten aber Muttersprachlichen Unterricht. Nach dem Zerfall von Jugoslawien dürften es inzwischen fünfzehn verschiedene Nationen sein, die Muttersprachlichen Unterricht als Fach erhalten. (Den anderen Ethnien werden nur die Räume zur Verfügung gestellt, für den Unterricht hat die eigene 'community' zu sorgen.) Das heißt, die Klassenlehrerin müßte zu so vielen Muttersprachlehrern Kontakt aufnehmen, wie sie Kinder aus den Anwerbeländern in ihrer Klasse hat. Daher kennt zwar jeder Klassenlehrer die Fachlehrer, die Lehrer des Muttersprachenunterrichts sind an Schulen, die keine Stammschulen sind, aber nur wenig bekannt. Ich habe mit Lehrern des Regelunterrichts gesprochen, die nicht wußten, ob es an ihrer Schule überhaupt Muttersprachenunterricht gibt. Man sieht die Lehrer höchstens bei den Notenkonferenzen, die zweimal im Jahr stattfinden. Dabei sind die Noten des MU versetzungsrelevant, d.h. sie tragen zur Versetzung des Schülers bei. Muttersprachlehrer hingegen unterrichten wiederum mehrere Klassen an verschiedenen Schulen und kennen daher auch nicht alle Klassenlehrer. Die Interviews mit den vierundzwanzig Schülern und Studenten zum Muttersprachlichen Unterricht ergibt, daß die meisten Schüler den Unterricht wie ein Fach unter anderen empfinden, ein bißchen unbequemer, weil er am Nachmittag stattfindet und in einer anderen Schule, aber oft mit dem Vorteil, keine Aufgaben machen zu müssen. Nur die Realschulgruppe empfindet die Atmosphäre des MU anders und angenehmer als diejenige im Regelunterricht. Sie rechnet dies nicht nur der Tatsache zu, daß der MU nur von Schülern gleicher Nationalität und Mentalität besucht wird, sondern findet, daß auch die Gruppengröße dabei eine Rolle spielt. Die interviewten Schüler sind sich dessen bewußt, daß sie, allein aufgrund der anders verlaufenden Familiensozialisation, einen beträchtlichen Anteil mehr an Leistungen erbringen müssen als die anderen Schüler, um den Anforderungen der Schule gerecht zu werden. Es ist ihnen aber auch bewußt, daß sie der sozialen Kontrolle, gleich ob sie von der Familie, den Verwandten oder der eigenen Ethnie ausgeübt wird, am besten durch eine gute Bildung begegnen können. Eine gute Bildung und Ausbildung macht sie in ihrem Verhalten freier und sicherer und die Kontrollorgane toleranter. Sie können leichter selbst bestimmen, was sie tun und wie sie handeln wollen. Eine entscheidende Rolle spielt im Leben eines jeden Kindes der Schulanfang, der daher auch ein Schwerpunkt meiner Befragung war. In jeder Gesellschaft besteht das Leben eines Individuums aus verschiedenen zeitlichen Abschnitten, die durchlaufen werden. Die Übergänge von einem Lebensabschnitt zum anderen werden von besonderen Riten begleitet. Sie kennzeichnen das Verlassen der einen Gruppe, eine Zeit der Diffusion und die Aufnahme in die neue Gruppe. So werden aus den Kindergartenkindern nach dem fünften Lebensjahr die Vorschulkinder, denen besondere Rechte eingeräumt werden. In dieser Zeit dürfen sie schon einmal allein und ohne Aufsicht in einem Raum spielen und besuchen besondere Kurse, an denen die jüngeren Kinder nicht teilnehmen dürfen. Aus den Vorschulkindern werden die Schulkinder, die mit einer Schultüte begrüßt, langsam an das Leben in der Schulgruppe gewöhnt werden. (s.a. v. Gennep,1986) Schulanfänger müssen die eigenen Vorstellungen mit den Ansprüchen, Erwartungen und Forderungen des Lehrers und der gleichaltrigen Gruppe in Einklang bringen. (Petillon, 1984: 3) Die Erfahrung der Außenbestimmung durch eine neue Zeiteinteilung, neue Anforderungen an Konzentration und Feinmotorik ist zwar für alle neu, für Kinder aber, die aus Familien mit anderen Sozialisationsvorstellungen und ohne Kindergartenerfahrung in die Schule kommen, besonders bedeutend. Ich nahm daher an, daß in dieser Phase der Muttersprachliche Unterricht bei der Integration besonders hilfreich sein würde, was nur von ganz wenigen Schülern bejaht wurde.. Obwohl die Gymnasialschüler berichten, daß die türkische Familie nicht auf die Schule vorbereiten würde, sprechen nur zwei Schüler davon, daß sie den MU in dieser Zeit als hilfreich empfunden hätten. Fatime erinnert sich daran, ihn als beschützend und warm, Mohammed als integrierend und anerkennend empfunden zu haben. Die anderen können sich an nichts Besonderes erinnern. Die meisten haben den MU von Anfang an besucht und halten ihn eher für diejenigen türkischen Kinder wichtig, die erst kurz vor Schulbeginn nach Deutschland kommen. Kinder, die in der Türkei mit der Schule begonnen haben und hier die Klasse wiederholen mußten, weil sie kein Deutsch konnten, empfanden diese Maßnahme als diskriminierend. Diejenigen, die hier aufgewachsen sind, halten den Besuch eines Kindergartens für sich persönlich, aber auch für die anderen türkischen Kinder für wesentlich und bringen ihren Schulerfolg damit in Zusammenhang. Dabei erwähnen sie auch die Vorklasse, die bei fehlendem Besuch des Kindergartens, wegen der späten Einreise, besucht werden sollte. (Leider halten türkische Eltern oft nicht viel vom Kindergarten und noch weniger von der Vorklasse. (s.a. Kap. II, 2.5) und wehren sich dagegen. Eine wichtige Funktion haben die im MU vermittelten Inhalte. Vielen Probanden sind neben Liedern und Spielen die gemeinsamen Feiern in Erinnerung geblieben. Es werden vor allem die nationalen türkischen Feste begangen, obwohl im Rahmenplan für die Grundschule nur die religiösen Feiertage: das Opferfest (Kurban Bayrami) und das Zuckerfest (Seker oder Ramazan Bayrami) und als nationaler Feiertag der 23. April, das Kinderfest, vorgesehen sind. Bei den nationalen Feiern haben sich die Eltern sehr engagiert, sowohl die Eltern als auch Schüler erwähnen dies in ihren Interviews. Man schmückte die Klasse und richtete eine AtatürkEcke ein mit Bildern, Sprüchen und Fähnchen. Eine türkische Lehrerin bedauert, daß jetzt an den Feiertagen für die Kinder schulfrei ist und man nicht mehr zusammen feiern kann. Weil die Eltern arbeiten, verlieren die Tage für die Kinder viel von ihrer Bedeutung. An die folgenden nationalen Feiertage erinnern sich alle: An den 23. April, die Eröffnung der Nationalversammlung, diesen Tag hat Atatürk den Kindern zugedacht, den 19. Mai, den Beginn des Widerstands gegen Engländer, Franzosen, Italiener und Griechen und den 29. Oktober, den Tag, an dem die Republik ausgerufen wurde. Analysiert man den Inhalt der Interviews, so stößt man immer wieder auf folgende Aussagen: Wir haben die Geschichte der Republik Türkei kennengelernt (milli tarih) mit den Befreiungskämpfen, den nationalen Feiertagen, die daraus resultieren, die Reformen Atatürks, seine Aussprüche, die Nationalhymne, den Schülereid (s. Fußnote 26) und zwar von der ersten Klasse an. Selbst die Achtung, die dem Lehrer gezollt wird, wird durch die nationale türkische Erziehung verstärkt, denn die Lehrer stehen anstelle von Atatürk, dem Oberlehrer der Nation. Die interviewten, aber auch andere türkische Lehrer, mit denen ich gesprochen habe, unterrichten diese Inhalte ohne zu überlegen, daß sie Schüler unterrichten, deren Eltern zum Teil schon nicht mehr in der Türkei geboren sind und die wahrscheinlich nicht mehr in der Türkei leben werden. Die Lehrer nehmen es den Schulleitern übel, wenn diese sie darauf hinweisen, daß keine Fahne und kein Atatürkbild aufgehängt werden soll, weil dies nicht gewollt und Ähnliches in der Regelklasse auch nicht praktiziert wird. Der Politologiestudent weiß, daß die Deutschen die Verehrung von Atatürk als Personenkult abtun, er versteht es jedoch als etwas anderes und ist stolz auf die türkische Geschichte, die auch ein Teil seiner Geschichte ist und mit der er sich identifiziert, obwohl er, von den Ferien abgesehen, sein Leben in Deutschland verbracht hat. Ähnlich drücken es auch die Realschüler aus, die ebenso stolz auf ihre nationale Geschichte und das türkische Militär sind. Der Student meint zudem, daß deutsche und türkische Lehrer voneinander lernen können. Vor allem sollen die deutschen Lehrer die Achtung der Schüler einfordern, die auch den türkischen Lehrern entgegengebracht wird. Sie hätten ebenso ein Recht darauf, denn sie geben ihr Wissen den Schülern und dafür schulden ihnen die Schüler 'Achtung'. Die Achtung, die die Schüler ihren türkischen Lehrern entgegenbringen, indem sie sich diszipliniert verhalten, fällt der Lehrerin der Integrierten Gesamtschule wie auch dem Realschulrektor auf, der von einem sehr ordentlichen Unterricht spricht und damit auch einen störungsfreien meint. Wie unterschiedlich auch der Unterricht von den einzelnen Schülern empfunden wurde, alle sagen, daß sie ohne ihn nicht ein so gutes Türkisch sprechen und schreiben würden. Das Türkisch, das zu Hause gesprochen wird, beschränkt sich im wesentlichen auf die Alltagssprache und ist dazu oft ein Dialekt. Der Politologiestudent bedauert, daß es ihm trotz MU nicht möglich ist, die Zeitung ohne Wörterbuch zu lesen, und daß er nicht in die neuere Literatur eingeführt worden ist. In der Sekundarstufe I wird kaum zeitgenössische Literatur vermittelt, weil sie nicht mehr unkritisch ist und daher in die türkischen Schulbücher der Oberstufe nur selten Eingang gefunden hat. Bis in den achtziger Jahren sagt Sprache auch etwas über die politische Richtung aus, der man angehört. Wer von den Lehrern als links und progressiv gelten will benutzt vorwiegend den vom 'Türk Dil Kurumu' erarbeiteten Wortschatz, während die Konservativen sich auch der osmanischen Wörter bedienen. So gibt es oft lang anhaltende Streitigkeiten, welches Wort in die Unterrichtsmaterialien Eingang finden soll. Die politischen Richtungskämpfe, die sich in der Türkei abspielten, reichten also bis in den Muttersprachlichen Unterricht in Hessen. Heute gebrauchen die meisten Türken und damit auch die türkischen Lehrer die Sprache viel unbekümmerter und lassen sowohl das eine als auch das andere Wort gelten. Da vor allem die Zeitungen wieder osmanische Wörter verwenden, werden die Angehörigen der jüngeren Schülergeneration sie auch wieder lernen. Den älteren Schülergenerationen aber sind sie nicht so geläufig. Auffallend ist, daß die Schüler nur ganz selten den Ausdruck Muttersprachlicher Unterricht benutzen und eher vom Fach Türkisch spreche, die Gymnasialschüler sogar von der 'Fremdsprache' Türkisch, für die sie genauso hart arbeiten müssen, wie für jede andere Fremdsprache. In den Augen der Schüler hat der Muttersprachliche Unterricht Türkisch den gleichen Stellenwert wie jede andere Fremdsprache. Die IGS Lehrerin spricht davon, daß der MU an Wert gewonnen habe, seitdem der Modellversuch 'Türkisch anstelle der zweiten Fremdsprache' an ihrer Schule eingerichtet wurde. Die Frage, ob im MU auch die Situation der türkischen Eltern und ihrer Kinder in Deutschland angesprochen worden ist, wird nur von einer einzigen Schülerin bejaht. Sie sagt, daß ihr MULehrer auch Vergleiche zwischen der Türkei und Deutschland gezogen habe. Türkische Lehrer meinen, daß es schwierig sei, die hiesigen türkischen Kinder zu unterrichten, weil sie aus den unterschiedlichsten Gegenden der Türkei stammen und damit auch unterschiedliche Sitten und Gebräuche mitbrächten. Sie sprechen aber nicht davon, daß sie im Unterricht auch die hiesigen Sitten und Gebräuche thematisiert haben. Eine Ausnahme bildet dabei der Nikolauskult. Der Hlg. Nikolaus, der im vierten Jahrhundert Bischof von Myra, dem heutigen Demre (Türkei) war, schlägt eine Brücke zwischen der Türkei und dem Christentum und nimmt so heute eine Art Alibifunktion im MU für die deutschen Feste wahr. Dabei gäbe es keine Schwierigkeiten, türkischen Schülern auch andere deutsche Feste vom Koran her zu erklären. Den Berichten der interviewten Lehrer und Schüler zufolge kann darauf geschlossen werden, daß die eingangs zitierte Aufgabenstellung des MU, die Erschließung des Umfeldes, in dem die Schüler leben, das Verstehen der eigenen Situation und die Fähigkeit darin zu handeln, nur ansatzweise oder wenig beachtet wird. Ein weiterer Punkt, der über die Integration Auskunft geben kann, ist die Frage nach Freunden und Freundinnen der Probanden. Nur eine einzige Probandin hat noch und alleinigen Kontakt zu den Mitschülerinnen des MU. Eine andere steht in lockerem Kontakt zu einer ebenfalls studierenden Mitschülerin aus dem MU, wobei die Tatsache, daß beide das Abitur gemacht haben und sie zusammen zum Gymnasium fuhren, eine wesentliche Rolle spielen dürfte. Alle anderen haben keine Verbindung mehr zu ihren früheren Schulkameraden des Muttersprachlichen Unterrichts. Selbst die beiden Brüder, die den MU noch besuchen, haben außerhalb des Unterrichts keinen Kontakt diesen Mitschülern. Aus dem Rahmen fallen nur die Realschüler, sie haben wesentlich mehr Kontakt untereinander, zu ihren türkischen Mitschülern und anderen türkischen Jugendlichen als die anderen Interviewten. Zwei Mädchen haben fast nur türkische Freundinnen, eines bewußt, da sie sich von ihnen am besten verstanden glaubt, während das andere meint, daß es sich 'so' ergibt. Zwei andere dagegen sprechen von 'besten' Freundinnen, die keine Türkinnen sind und die sie schon vom Kindergarten und von der Schule her kennen. Die Interviews haben gezeigt, daß eine Integration der Probanden in die Hessische Schule, zwar unterschiedlich, aber im allgemeinen erfolgt ist. Dies ist allerdings nicht ein besonderes Verdienst des Muttersprachlichen Unterrichts. Am sichtbarsten wird die Integration bei den Gymnasialschülern und Studenten. Der Grad von Integration läßt sich auch aus den Kurzfragebögen erkennen. Von den sechzehn Schülern beider Gruppen bezeichnen sich vierzehn als Türken aus Deutschland, nur zwei bezeichnen sich nur als Türken. Beide Gruppen fühlen sich in ihrer Klasse und Schule wohl. Dabei ist die Aussage der Gymnasialschüler höher zu bewerten als die de Realschüler, da sie aus drei verschiedenen Schulen kommen. Acht von neun Schülern wollen ihre Ausbildung in Deutschland machen, nur einer in der Türkei. Wobei noch zu bedenken ist, daß eine Ausbildung, z.B. ein Studium in der Türkei kürzer und billiger ist. Durch die Neuregelung des Staatsangehörigkeitsrechtes zum 1.1.2000 erhalten alle in Deutschland geborenen ausländischen Kinder zu der Staatsangehörigkeit ihrer Eltern auch die deutsche bis zu ihrer eigenen Entscheidung für eine der beiden, spätestens im 23. Lebensjahr. Bis dahin sind sie Deutschtürken oder türkische Deutsche. Das heißt, in sechs Jahren kommen die Kinder türkischer Eltern, als Deutsche in unsere Schulen. Kann dann der MU oder das Fach Türkisch, von allen als notwendig angesehen und auch gewünscht, in der gleichen Art und unter den gleichen Bedingungen unterrichtet werden wie bisher? Wenn dem nicht so ist, muß damit begonnen werden, Lehrer mit einer anderen Ausbildung einzustellen, bzw. diejenigen, bei denen es möglich ist, weiterzubilden. Die Veränderung der Einstellungspraxis ist bereits überfällig. Zu Beginn der neunziger Jahre, aber spätestens bei Einrichtung des Modellversuchs 'Türkisch anstelle der zweiten Fremdsprache' hätten nur noch türkische Lehrer mit einer Universitätsausbildung eingestellt werden dürfen. Die Lehrer, die das alte Grundschullehrerdiplom der Türkei haben, können in Deutschland nicht an der Universität weitergebildet werden, da ihre Gesamtausbildungszeit kürzer ist, als hier die Zeit bis zum Abitur. Türkische Lehrer mit Universitätsausbildung dagegen könnten ein Zusatzstudium absolvieren. Für die deutschen Schulanfänger türkischer Herkunft braucht man Lehrer, mit einer Ausbildung, die derjenigen der Lehrer im Regelunterricht entspricht, d.h. daß sie mindestens für zwei Fächer ausgebildet sein müssen. Ein Lehrer, der zwei Fächer studiert hat, braucht nicht mehr an verschiedene Schulen zu gehen, da er außer Türkisch das zweite Fach in den Regelklassen unterrichten kann. Die Situation für eine entsprechende Lehrereinstellung ist in der nächsten Zeit recht gut, da im Laufe von zehn Jahren der größte Teil der bis 1980 eingestellten Lehrer in Rente geht. Die Fachberaterin für den MU Türkisch verlangt, daß für das Fach Türkisch gut Deutsch sprechende Lehrer, nach Möglichkeit mit einem Studienabschluß einer deutschen Universität, einzustellen sind. Es gibt bereits jetzt Lehrer und Diplompädagogen türkischer Herkunft, die zweisprachig sind. Beide Gruppen brauchten nur ein relativ kurzes Zusatzstudium, um den oben genannten Bedingungen zu entsprechen. Daneben gibt es seit 1998 die Absolventen der Gesamthochschule Essen, die ein entsprechendes Lehrerstudium mit dem Fach Türkisch durchlaufen haben. Schon jetzt gibt es eine Anzahl von Schulen, die, bedingt durch die Globalisierung, der Forderung nach früher Zweisprachigkeit durch Einführung nach Frühenglisch oder Frühfranzösisch nachgekommen sind. Im Laufe der Zeit wird die Einführung sicherlich flächendeckend erfolgen. In der Grundschule könnte dann die Sprache Türkisch entsprechend dem erteilten Frühenglisch oder Frühfranzösisch im Stundenplan stehen. Lehrerin B. sagt: "Warum sollen diese Kinder Frühenglisch lernen, wenn sie doch schon eine andere Sprache mitbringen". Der Ministerialrat spricht davon, daß die fremde Herkunftssprache auch einen ökonomischen Wert habe, man muß also nur den vorhandenen Wert nutzen. In den Ballungsgebieten ist Frühtürkisch, das die mitgebrachten Sprachkenntnisse berücksichtigt, anstelle des bisherigen MU durchaus denkbar. Unter Umständen muß man dabei auch eine Art Mittelpunktschulen einplanen. An diesen Schulen könnte mit der Alphabetisierung z. B. nach dem KOALAModell (s.a. Kap.VII, 2.) gearbeitet werden. In der Sekundarstufe sollte man schon jetzt überlegen, in welcher Weise auch der Computer für den Muttersprachlichen Unterricht zu nutzen ist. Gerade in Gegenden, in denen nur wenige türkische Kinder wohnen, bietet sich sein Einsatz an. Die in Hessen vorgeschriebene Sprachenfolge, daß Englisch, wenn nicht erste, so doch mindestens zweite Fremdsprache sein muß, wird durch das Frühtürkisch nicht tangiert, denn als nächste Fremdsprache müßte dann Englisch gelernt werden. Es wäre gut, wenn die Institution Schule auf dem Gebiet der Einbeziehung der Minderheitensprache Türkisch feste Vorstellungen hätte, ehe alle Schüler türkischer Abstammung bei Schuleintritt die deutsche Staatsangehörigkeit besitzen. Die dargelegten Überlegungen haben den Vorteil, daß Türkisch als ein den anderen Fächern gleichwertiges Fach der Hessischen Schule angesehen würde, in den Stundenplan integriert und nicht mehr Anhängsel oder Schule des Herkunftslandes. Die Lehrer wären hessische Lehrer, was sie formal schon seit fast 30 Jahren sind, in Deutschland ausgebildet, im Kollegium integriert und als gleichwertig akzeptiert. Mit einem Unterricht in der genannten Form würde der Sprache Türkisch, deren Sprecher zu der größten Minderheit in Deutschland zählen, der Raum und die Bedeutung zuerkannt, die ihr aufgrund ihrer Größe zustehen. Es gibt auch keinen Zweifel daran, daß die Zahl der Einwohner türkischer Abstammung in den nächsten Jahren, vielleicht Jahrzehnten, allein aufgrund der heutigen demographischen Daten noch steigen wird. Wie schon erwähnt, reisen jedes Jahr 30.000 türkische Ehepartner in Deutschland ein, ist die Geburtenrate höher und die Anzahl der jüngeren Frauen im reproduktiven Alter prozentual größer als bei der deutschen Bevölkerung. Mit einem Unterricht, der sich an die Rahmenrichtlinien hält und mit Hilfe der in diesem Sinne ausgebildeten Lehrer werden die Deutschtürken nicht nur von den Verdiensten ihrer Vorfahren in der Türkei erfahren, sondern auch von denen ihrer Elterngeneration, die, sei es als Arbeitnehmer, Arbeitgeber, Künstler, Schriftsteller oder Politiker hierher gekommen sind. Es sollen junge Menschen heranwachsen, die sich "nicht vom türkischen Ministerpräsidenten erklären lassen, wen wir in Deutschland wählen sollen oder nicht". (Özdemir, 1999: 13). Sie werden "Bürgerpflichten und Grundstrukturen und Prinzipien wahrnehmen (Wahlrecht, Zivildienst, Wehrdienst). Erst wenn sich der Einzelne als Teil der Gesellschaft empfindet, können sie angemessen ihren Beitrag leisten."
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ausgewählte Gruppen der Dekapoden (brachyure Krabben, Einsiedler und Porzellankrebse) des PersischArabischen Golfes und des Golfes von Oman taxo nomischfaunistisch zu erfassen, eine Abschätzung des Artenreichtums und der Faunenzusam mensetzung vorzunehmen und die zoogeographischen Beziehungen innerhalb der Golfregion und zu anderen Teilen des westlichen Indischen Ozeans zu analysieren. Die Dekapodenfauna der Golfregion war -- im Gegensatz zur sehr viel besser untersuchten des Roten Meeres -- bislang Gegenstand vergleichsweise weniger wissenschaftlicher Arbeiten, und der faunistischtaxonomische Kenntnisstand stellte sich als entsprechend lückenhaft dar. Dies erwies sich einerseits als Problem bei der Beurteilung des Zustands von Lebensgemeinschaften und Folgeschäden nach der Ölkatastrophe von 1991, andererseits als Hindernis für Faunen vergleiche und zoogeographische Studien. Um vor allem die bislang wenig bearbeiteten eulitoralen Lebensräume wie Watten und Man groven, aber auch Korallenriffe, intensiv zu beproben, wurden Sammelreisen in verschiedene Teile des PersischArabischen Golfes und den Golf von Oman durchgeführt. Daneben wurde umfangreiches Museumsmaterial der bedeutenden Sammlungen aus der Golfregion taxonomisch untersucht, mit Material aus anderen Regionen verglichen und neu bewertet. Insgesamt konnte für den PersischArabischen Golf das Vorkommen von 188 Arten brachy urer Krabben, 20 Pagurideen (Einsiedlerkrebse) und 18 Porcellaniden (Porzellankrebse) eindeutig belegt werden; 43 Arten (37 Brachyuren, 4 Pagurideen und 2 Porcellaniden) wurden erstmals für den Golf nachgewiesen. Bei 11 dieser Neunachweise handelt es sich um bislang unbeschriebene Arten. Ein faunistischer Vergleich zu anderen Teilen des Indischen Ozeans zeigt, daß der Golf für die untersuchten Taxa insgesamt deutlich artenärmer als das Rote Meer oder die ostafrikanische Küste ist. Dies ist vor allem auf die geringere Ausdehnung und schlechtere Entwicklung von Korallenriffen sowie das Fehlen von Tiefwasserhabitaten, aber auch auf das Vorherrschen extre mer ökologischer Bedingungen in weiten Teilen des Golfes zurückzuführen. Zwischen verschie denen systematischen und ökologischen Gruppen bestehen allerdings große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums. Während hartboden und korallenassoziierte Gruppen im Golf deutlich unterrepräsentiert sind, findet sich bei weichbodenbewohnenden Taxa eine vergleichs weise artenreiche Fauna. Besonders auffallend ist dabei der Artenreichtum der eulitoralen Ocypodidae, die mit 23 Arten im Golf eine weitaus höhere Artendiversität erreichen als im Roten Meer oder an der ostafrikanischen Küste und gemeinsam mit den ebenfalls vorwiegend in der Gezeitenzone leben den Grapsiden einen Schwerpunkt der Arbeit bildeten. Innerhalb der Golfregion zeigten sich für diese Familien große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums und der Faunenzusammen setzung. Die Wattgebiete und Mangroven des nördlichen und des südöstlichen PersischArabi schen Golfes sowie des Golfes von Oman fallen dabei durch ihre sehr diverse Fauna auf. Stark verarmt ist dagegen die eulitorale Fauna des südwestlichen und westlichen Teils des Persisch Arabischen Golfes. Der Grund für diese Verarmung ist dabei vor allem im hohen Salzgehalt des küstennahen Wasserkörpers zu sehen. Die Ergebnisse der faunistischtaxonomischen Auswertungen ermöglichten eine zoogeogra phische Analyse, bei der die Dekapodenfauna sowohl auf ihre Homogenität innerhalb der Golf region, als auch auf ihre Beziehungen zu der aus anderen Teilen des Indischen Ozeans untersucht wurde. Hierzu wurden Endemismusraten und Verbreitungsmuster der aus dem Golf nachgewie senen Arten betrachtet sowie Faunenähnlichkeiten mit Hilfe multivariater statistischer Methoden analysiert. Zoogeographisch stellt sich die Dekapodenfauna der Golfregion als Mischung unterschied licher zoogeographischer Elemente dar. Dies reflektiert die Lage des Golfes am Übergang zwischen westlichem Indischen Ozean und indischer bzw. indomalaiischer Region. Die Endemis musraten liegen bei 6 % für Porcellaniden, 7 % für Brachyuren und rund 10 % für Pagurideen. Für keine der Gruppen läßt sich daraus eine Begründung für eine eigene Faunenprovinz oder ein Endemismuszentrum ableiten. Neben den Endemiten beinhaltet die Fauna Arten unterschied licher geographischer Beziehungen. Den größten Anteil stellen weit verbreitete Arten, die je nach Gruppe zwischen der Hälfte und zwei Dritteln der im Golf vorkommenden Arten ausmachen. Für die Einsiedlerkrebse sind daneben vor allem Arten aus dem Roten Meer und dem Golf von Aden von Bedeutung, was auf eine enge Beziehung der Pagurideenfauna zu diesen Gebieten hin weist. Dagegen sind für die Brachyuren indopakistanische und indomalaiische Arten von weit aus größerer Bedeutung, was eine größere Ähnlichkeit der Krabbenfauna zu der Pakistans und Indiens andeutet. Innerhalb der Golfregion ergaben sich für die Brachyurenfauna, insbesondere für Ocypodi den, deutliche Unterschiede hinsichtlich der zoogeographischen Beziehungen. Während der von östlichen Faunenelementen dominierte nördliche und östliche Golf kaum westliche Faunen elemente aufweist, stellen diese im südlichen Golf und vor allem im westlichen Teil des Golfes von Oman einen erheblichen Anteil an der Gesamtfauna. Getrennt werden diese beiden Gebiete durch die Bereiche des südlichen und westlichen Golfes, in denen die extrem hohen Salzgehalte eine wirksame Verbreitungsbarriere darstellen. Zumindest für einige Taxa ist demnach die Golf region nicht als einheitliche faunistischzoogeographische Region zu betrachten. Während der nördliche und östliche Teil des PersischArabischen Golfes zoogeographisch eng mit Pakistan verbunden sind, zeigen sein südlicher Teil und der westliche Golf von Oman engere Beziehungen zum Golf von Aden und dem Roten Meer. Aufgrund der vergleichsweise guten Dokumentation der Faunenzusammensetzung in ver schiedenen Teilen des Indischen Ozeans ließ sich für Ocypodiden und Grapsiden ein überregio naler Faunenvergleich mit Hilfe multivariater Analysenmethoden durchführen und eine zoogeo graphische Unterteilung des Indischen Ozeans vornehmen. Innerhalb des westlichen Teils des Indischen Ozeans lassen sich dabei drei Regionen aufgrund ihrer Faunenähnlichkeit voneinander abgrenzen. Dies sind -- eine ost/südostafrikanische Region, die von der Nordostküste Südafrikas bis nach Somalia reicht -- eine west/südarabische Region bestehend aus Rotem Meer, Golf von Aden, der südarabi schen Küste und dem westlichen Golf von Oman, die auch in den südöstlichen Persisch Arabischen Golf hineinzieht -- eine ostarabischpakistanische oder iranischpakistanische Region, die den nördlichen und östlichen Teil des PersischArabischen Golfes, den östlichen Golf von Oman sowie Pakistan und Nordwestindien umfaßt Hinsichtlich der Besiedlungsgeschichte des PersischArabischen Golfes zeigen die Ergebnisse, daß eine Besiedlung durch eulitorale Krabben zum größten Teil von der indischen Seite aus entlang der iranischen Küste stattgefunden haben muß, während später eingewanderte westliche Elemente aufgrund der massiven Salinitätsbarriere und der Strömungsverhältnisse auf den süd östlichsten Teil beschränkt blieben. Vor allem die Gezeitenzonen des PersischArabischen Golfes weisen teilweise sehr diverse Lebensgemeinschaften auf, deren Artenzusammensetzung in ihrer Mischung unterschiedlicher zoogeographischer Elemente einzigartig ist und den Einfluß verschiedener Wasserkörper auf den Golf anzeigt. Für die Ocypodiden führt dies zu einer hohen regionalen oder gammaDiversität sowie einer über reine Artendiversität hinausgehenden Diversität der Lebensgemeinschaften. Während sich die Folgen des Golfkriegs als weniger gravierend als ursprünglich befürchtet erwiesen haben, könnten Habitatzerstörung und schleichende Verschmutzung die Lebensgemein schaften des PersischArabischen Golfes irreparabel schädigen.
Zyklotronresonanzen von Ionen im hochfrequenz-modulierten magnetisch fokussierten Elektronenstrahl
(2000)
Ein Prototyp einer Kombination aus Penningfalle und EBIS/T wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt. Dazu wurde ein Standard NMRMagnet erfolgreich so umgebaut, daß er in Bezug auf Vakuum, Temperatur und Temperaturbeständigkeit den Erfordernissen einer EBIS/T als Ionenfalle entspricht. Diese Apparatur ermöglicht nun die Untersuchung der in der EBIS/T erzeugten Ionen mit den Methoden der 'Fallenphysik'. Die Anregung der Ionen in der Falle wurde hier erstmals durch Hochfrequenzmodulation des Elektronenstroms über die Wehneltelektrode der Elektronenkanone durchgeführt. Messungen haben gezeigt, daß man in der EBIS/T erzeugte Ionen selektiv nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung mit der Modulation in Resonanz bringen kann, bis sie den Elektronenstrahl verlassen. Die Ionen besitzen auch im dichten Elektronenstrahl eine charakteristische Eigenfrequenz, die zwar von der Raumladung in der Falle abhängt, mit der jedoch trotzdem eine Resonanzanregung durchgeführt werden kann. Im Experiment bestätigte sich die Vorhersage für die Mindestdauer der Anregung in der Größenordnung von Mikrosekunden und für Relaxionszeiten der kohärenten Ionenbewegungen im Bereich von Millisekunden, was eine grundsätzliche Voraussetzung für eine resonante Separation verschiedener Ionensorten darstellt. Die auftretenden Eigenfrequenzen der unterschiedlichen Ionen lassen sich theoretisch und im Einklang mit numerischen Simulationen beschreiben. Die Anregung der Eigenfrequenzen von Ionen über den Elektronenstrahl funktioniert bis zu so hohen Ionendichten, wie sie in einer EBIS vorkommen. Ionenmanipulationen, wie man sie von den Penningfallen her kennt, lassen sich auf ein Ionenensemble mit bis zu 10 10 Ionen pro cm 3 übertragen. Die gemessenen Verschiebungen der Eigenfrequenzen gegenüber der Zyklotronfrequenz geben darüber hinaus Aufschluß über den Kompensationsgrad des Elektronenstrahls in der EBIS/T und können damit als wichtiges Diagnosehilfsmittel für die Optimierung von ElektronenstrahlIonenquellen verwendet werden. Läßt man die Resonanzanregung kontinuierlich einwirken, so tritt überraschenderweise eine Erhöhung des Anteils an hochgeladenen Ionen in der EBIS/T auf. Darüberhinaus konnte experimentell gezeigt werden, daß die hochgeladenen Ionen auf der Achse des Elektronenstrahls konzentriert werden, während niedrig geladene Ionenen dort verschwinden und bevorzugt den äußeren Strahlbereich bevölkern. Die Erklärung dafür ist, daß durch kontinuierliches Entfernen dieser niedrig geladenen Ionen aus dem Elektronenstrahl eine vollständige Kompensation der Raumladung des Elektronenstrahls verhindert wird. Dadurch lassen sich Ionen in der Ionenquelle über einen längeren Zeitraum züchten. Vorteilhafterweise drängt die Anregung über eine Modulation des Elektronenstrahls im Gegensatz zu der normalen Dipolanregung bevorzugt niedrig geladenen Ionen, mit größerer Aufenthaltswahrscheinlichkeit am Rand, aus dem Elektronenstrahl. Dies führt zu einer verstärkten CoulombKühlung der hochgeladenen Ionen und konzentriert diese in der Mitte des Strahls, wo die Anregung fast unwirksam ist. Diese Kühlkraft wirkt als Zusammenspiel der attraktiven radialen Kraft des nicht vollständig raumladungskompensierten Elektronenstrahls und der Coulombstöße der Ionen untereinander. Durch diese Methode der Kühlung der Ionen untereinander können verstärkt Ionen hoher Ladungszustände in der Ionenquelle konzentriert werden. Der Vorgang der Kühlung durch Coulombstöße konnte mit einem Modell beschrieben werden, bei dem die thermische Verteilung aller Ionen im Elektronenstrahl einer Boltzmann Verteilung folgt. Das Modell benutzt vier Kräfte: die magnetische Kraft, die elektrische Haltekraft des Elektronenstrahls, die periodische elektrische Anregungskraft und die Reibung der Ionen proportional zu ihrer Geschwindigkeit und ihres Ladungszustandes bzw. die Stöße der Ionen untereinander. Die Resonanzanregung im Raumladungspotential sowie die Aufenthaltsverteilung der Ionen im Elektronenstrahl konnten damit dargestellt werden. Für Präzisionsexperimente an hochgeladenen Ionen bietet sich die Kombination aus einer EBIS/T mit integrierter Penningfalle an. Die Experimente haben gezeigt, daß es möglich ist, Ionenspektren mit einem eingekoppelten Wechselfeld in dem Ionisationsraum der EBIS/T zu separieren und zu reinigen. Für die Zukunft wünscht man sich aber eine größere Effektivität für das vollständige Entfernen bestimmter Ionensorten. Dies kann man erreichen, indem man den Elektronenstrahl noch dichter mit der Ionisationsröhre umschließt. Durch die kontinuierliche Resonanzanregung profitiert man von einer längeren Einschlußzeit für die stufenweise Ionisierung zu höheren Ladungszuständen und/oder eröffnet ElektronenstrahlIonenquellen neue Einsatzmöglichkeiten unter schlechteren Vakuumbedingungen. Die verstärkte Kühlung und Zentrierung der Ionen auf der Achse während dieses Betriebsmodus verbessert die Emmitanz von ElektronenstrahlIonenquellen. Für die Zukunft kann man sich eine EBIS mit moduliertem Elektronenstrahl auch im Strahlweg niederenergetischer hochgeladener Ionen zum Verbessern deren Emittanz vorstellen. Die im Elektronenstrahl erzeugten und sich selbst kühlenden Ionen wirken durch Coulombstöße als Kühlmedium ohne die Gefahr der Umladung wie bei gasgefüllten hfQuadrupolen.
Für Elektronenstrahlionenquellen sind die Stromdichte und die Energie die ausschlag gebenden Größen zum Erreichen hoher Ladungszustände. Herkömmliche EBIS/T verwenden ein externes magnetisches Feld zur Kompression des Elektronenstrahls. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine ''magnetfeldfreie" EBIS/T realisiert, mit der die Selbstkompression eines teilrelativistischen Elektronenstrahls nachgewiesen werden konnte, womit ein vielversprechender Meilenstein auf dem Weg zu einer SuperEBIS/T mit Energien im Bereich von 300 - 500 keV erreicht wurde. Es wurde eine Apparatur aufgebaut, die es ermöglichte, einen Elektronenstrahl unter verschiedenen Winkeln in die Ionenfalle einzuschießen. Durch numerische Simulationen wurde die Elektronenkanone mit dem Ziel einer möglichst kleinen rückwärtig projizierten Kathode optimiert, um die fokussierbare Stromdichte zu erhöhen. Um sphärische Aberrationen des abbildenden Linsensystems zu korrigieren, wurde die Driftstrecke zwischen Elektronenkanone und Ionenfalle mit ''clearing" Elektroden versehen, die es ermöglichten, einen definierten Kompensationsgrad im Elektronenstrahl einzustellen. Im Anschluß an den Kollektor wurden die Ionen mit einem Sektormagneten analysiert. Zunächst wurde experimentell bestätigt, daß sich sphärische Aberrationen korrigieren lassen, wenn der Elektronenstrahl im Bereich des Linsensystems gezielt partiell kompensiert wird. Mit dem nichtlinearen Kompensationsgrad konnte die defokussierende Kraft der Raumladung gerade so angepaßt werden, daß sie die radial zunehmende Fokussierung der Linse (sphärische Aberration) korrigiert. ''clearing" Elektroden sorgten dafür, daß im Außenbereich des Elektronenstrahls gebildete Ionen den Strahl verließen. Nur der innere Bereich konnte nach Maßgabe der Potentialdifferenz kompensieren. Messungen der Verlustströme an den Elektroden der Ionenfalle zeigten, daß nur mit dieser Kompensation der Elektronenstrahl bei hohen Strahlströmen durch die Ionenfalle transportiert werden konnte. Bei kontinuierlicher Ionenextraktion konnte bei Erhöhung des Gasdrucks in der Ionenquelle ein überproportionales Ansteigen des Ionenstroms gemessen werden. Mit der Annahme konstanter Stromdichte sollte der Ionenstrom lediglich linear steigen. Zusammen mit der gleichzeitigen Reduktion der Verlustströme auf die Fallenelektroden war dies ein erster Hinweis für die Erhöhung der Stromdichte durch zunehmende Kompensation der elektronischen Raumladung im Fallenbereich. Eine genaueres Bild über die Entwicklung der Stromdichte wurde aus Spektren abgeleitet, die bei gepulster Extraktion aufgenommen wurden. In einer Elektronenstrahlionenquelle werden Ionen durch sukzessive Ionisation gebildet. Die Ladungszustandsverteilung der gebildeten Ionen ist proportional zur Dichte der ionisierenden Elektronen und zur Einschlußzeit, der die Ionen dem Elektronenbeschuß ausgesetzt sind. Bei konstanter Stromdichte erreichen aufeinanderfolgende Ladungszustände maximale relative Häufigkeit ungefähr bei einer Verdopplung der Einschlußzeit. Die aufgenommenen Spektren wichen deutlich von diesem Schema ab. Anstelle einer regulären Ladungszustandsentwicklung wiesen die Spektren nach 20ms Einschlußzeit zwei Verteilungen auf. Die erste Verteilung hatte ein Maximum bei Ar 2 , während die zweite ihr Maximum bei Ar 8 hatte. Die höher geladene Verteilung war mit dem Auftreten hoher Ladungszustände bis Ar 12 verbunden. Bei einer weiteren Erhöhung der Einschlußzeit ging die niedrig geladene Verteilung in die hoch geladene über, bis bei 160ms nur noch ein hoch geladenes Spektrum vorhanden war. Ein Vergleich mit Modellrechnungen ergab für niedrig geladene Ionen (3Acm 2 für Ar 2 bei 20ms Einschluß) eine geringe Stromdichte und einen kontinuierlichen Übergang zu hohen Stromdichten (300Acm 2 für Ar 12 bei 20ms Einschluß) bei hoch geladenen Ionen. Aufgrund des ''evaporative cooling" sammeln sich hoch geladene Ionen in der Mitte des Elektronenstrahls. Da der Elektronenstrahl von innen nach außen kompensiert, setzt die Selbstkompression innen ein und führt dort zu hohen Stromdichten. Man erhält eine während der Einschlußzeit variierende Stromdichteverteilung im Elektronenstrahl. Eine Aussage über die Häufigkeitsverteilung der Stromdichtewerte gelang über die Wichtung der berechneten Stromdichte mit der Menge an ionischer Ladung, die in den Ladungszuständen vorhanden war. Mit diesen Werten konnten mittlere Stromdichtewerte für den Elektronenstrahl berechnet werden. Es wurde die mittlere Stromdichte für den gesamten Elektronenstrahl und für die beiden Ladungszustandsverteilungen berechnet. Dabei begann die mittlere Stromdichte des Elektronenstrahls mit der Stromdichte der niedrig geladenen Verteilung (13Acm 2 ; 5ms) und ging bei Erhöhung der Einschlußzeit in die mittlere Stromdichte der hoch geladenen Verteilung über (110Acm 2 ; 80ms). Das Maximum der mittleren Stromdichte für die hoch geladene Verteilung lag bei 170Acm 2 für 40ms Einschlußzeit. Nachdem der Elektronenstrahl bei 40ms kompensiert wurde, sanken die mittleren Stromdichten. Dies lag an der nun dominierenden Heizung durch Coulombstöße der Strahlelektronen an den eingeschlossenen Ionen, wodurch deren Ausbeute verringert wurde. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit numerischen Integrationen der Randstrahlgleichung. Dazu wurden Berechnungen für verschiedene Kompensationsgrade und Elektronenstrahlemittanzen durchgeführt. Für Emittanzwerte um 2×10 3 cm mrad ergab sich eine gute Übereinstimmung mit den gemessenen Stromdichten. Die Rechnungen bestätigten, daß die Emittanz und der Einschuß des Elektronenstrahls in die Ionenfalle die kritischen Größen sind, um eine Selbstkompression des Elektronenstrahls bei einer Energie von 22keV und 30mA Strahlstrom beobachten zu können. Die in dieser Arbeit untersuchte Selbstkompression des Elektronenstrahls kann genutzt werden, um bei einer XEBIS/T mit Elektronenstrahlenergien größer als 200keV deutlich höhere Stromdichten zu erzielen, als bei heute üblichen EBIS/T. Sie eignet sich deshalb besonders für die Erzeugung höchst geladener schwerer Ionen, weil die angewandte Technik bei kommerziellen ElektronenstrahlSchweißanlagen industriell ausgereift ist, wohingegen die herkömmlichen EBIS/T weltweit (Livermore, Dubna, Tokio, Freiburg) die gesetzten Erwartungen hinsichtlich der erreichbaren Elektronenenergien bisher verfehlen. Auch für den stets problematischen Einschuß niedrig geladener Ionen, die außerhalb der EBIS/T erzeugt werden, kann die Selbstkompression genutzt werden. Der Elektronenstrahl weist zu Beginn der Ionisierung einen großen Durchmesser auf, wodurch der Einschuß in den Strahl erleichtert wird. Während der Höherionisierung der eingefangenen Ionen komprimiert sich der Elektronenstrahl zu der zum Erreichen höchster Ladungszustände notwendigen Stromdichte dann von selbst.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Die vorliegende Arbeit gliederte sich in 3 Teilbereiche. Der erste Teilbereich beschäftigte sich mit der antiviralen in vitro Wirkung von EDDS (Ethylendiamindinbernsteinsäure), sowie mit der Wirkung von EDDS, DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) und DFO (Desferrioxamin) im Tiermodell. EDDS zeigte in vitro eine vielversprechende Wirkung gegenüber verschiedenen HCMV Stämmen. Hierunter befanden sich GCV und HPMPCresistente Stämme. Dies ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, da die Therapie von HCMVbedingten Erkrankungen mit hohen Nebenwirkungen verbunden ist und zudem durch vermehrtes Auftreten von Resistenzen gegenüber den etablierten Therapeutika GCV, HPMPC und Foscarnet erschwert wird. Die invitroDaten legen einen ähnlichen antiviralen Wirkmechanismus des EDDS verglichen mit DTPA nahe. Diese Ähnlichkeit wird durch die enge strukturelle Verwandschaft der Stoffe noch unterstrichen. Im Mausmodell zeigte jedoch keiner der 3 untersuchten Chelatoren eine erfolgversprechende protektive Wirkung gegenüber MCMVInfektionen. Damit wurden vorangegangene Untersuchungen im Rattenmodell bestätigt. Trotz vielversprechender anderslautender Ergebnisse, die auf eine invivoWirkung von DFO gegenüber CMVInfektionen hinwiesen, scheint damit der Einsatz der Chelatoren aufgrund ihrer sehr kurzen Halbwertszeit im Körper stark limitiert. Der zweite Teil der Dissertation befaßt sich mit der Entwicklung und Untersuchung von peptidischen Wirkstoffträgersystemen für DTPA. Hierbei ließen sich reproduzierbar lösliche HSADTPA und GelBDTPAKonjugate, sowie HSADTPA und GelBDTPANP herstellen. Die antivirale und die antitumorale Wirkung dieser Konjugate wurde in vitro untersucht. Da für die antitumorale Wirkung von DTPA bisher keine Daten vorlagen, wurde zunächst die Cytotoxizität in einer NBZellinie und in 3 BrustkrebsZellinien bestimmt. Als Vergleich dienten HFF. Es zeigte sich, daß DTPA in unterschiedlichen Konzentrationen gegenüber den untersuchten Zellinien cytotoxisch war, eine Tumorspezifität konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die Cytotoxizität und die antivirale Wirkung des DTPA wurden in vitro durch Bindung an die unterschiedlichen peptidischen Trägersysteme deutlich erhöht. Dies führte jedoch nicht zu einer Erhöhung der therapeutischen Breite, da HFF in gleichem Maße stärker geschädigt wurden. Trotzdem bieten die Trägersystem Zubereitungen im Hinblick auf eine invivoAnwendung einige Vorteile. Es könnten geringere Mengen DTPA eingesetzt werden, was eine verringerte Ausschwemmung von Metallionen zur Folge hätte. Neben einer verlängerten Zirkulationszeit im Organismus könnte die veränderte Körperverteilung zu Verbesserungen führen. Im Falle der antitumoralen Anwendung wäre dies eine Anreicherung im Tumor aufgrund des EPREffektes. Für die antivirale Anwendung wären die Anreicherung in entzündeten Geweben, sowie die Anreicherung in Monozyten und Makrophagen von großem Interesse, da diesen Zellen ein entscheidender Anteil an dem durch CMV verursachten Multiorganbefall zugerechnet wird. Trotzdem bedarf der invivoEinsatz einer eingehenden Evaluierung und erscheint aufgrund der geringen therapeutische Breite insbesondere im Hinblick auf die Therapie von Tumoren stark eingeschränkt. Bezüglich des cytotoxischen Mechanismus weist die Wirkung der DTPAKonjugate darauf hin, daß DTPA den Zellzyklus und die Virusreplikation durch Wechselwirkung mit der Zellmembran und dadurch Veränderung der Signaltransduktion beeinflußt. Da eine geringere DTPAMenge größere Effekte verursacht, erscheint es unwahrscheinlich, daß die Komplexierung von Metallionen für die Wirkungen verantwortlich war. Im dritten Teil dieser Dissertation wurde eine PLANPTrägersystem für das antitumoral wirksame Enzym BSRNase entwickelt. BSRNase zeigte in vitro und bei intratumoraler Applikation sehr vielversprechende, selektive antitumorale Effekte gegenüber proliferierenden und ruhenden Tumorzellen. Die systemische Applikation war jedoch nicht erfolgreich. Dieses Scheitern wurde auf hohe Antigenität, kurze Halbwertszeit der Substanz im Körper und auf eine ungenügende Körperverteilung zurückgeführt. NP sind geeignet die Zirkulation im Körper zu verlängern und reichern sich in Tumoren aufgrund des EPREffektes an. PLANP wurden ausgewählt, da sie BSRNase in ausreichendem Maß binden und da PLA ein bioabbaubares und bioverträgliches Material ist. In vitro unterschied sich die nanopartikuläre Zubereitung bei der Wirkung gegenüber normalen, Lymphom und Leukämiezellen nicht. Beide BSRNaseZubereitungen induzierten Apoptose in parentalen und chemoresistenten Krebszellen. Normale Zellen wurden nicht in ihrer Viabilität beeinträchtigt. Die aspermatogenen und antiembryonalen Wirkungen von BSRNaseZubereitungen weisen auf ihre antitumoralen Eigenschaften hin. In diesen beiden Testsystemen übertraf die nanopartikuläre Zubereitung die Wirkung der BSRNaseLösung. InvivoVersuche müssen nun den tatsächlichen Stellenwert der BSRNasePLANP zeigen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Porcinen Endogenen Retroviren (PERV) erstmals ausführlich biochemisch und biologisch charakterisiert sowie ihr Wirtsspektrum und ihre Expression in vitro näher analysiert. Es wurden sensitive immunologische Nachweismethoden entwickelt, die in experimentellen, präklinischen und ersten klinischen Studien zur Xenotransplantation angewandt wurden. Die Charakterisierung der Viren ergab, daß es sich um TypCRetroviren handelt, wobei ein Teil der Partikel nicht gereift ist. In hoch gereinigten Viruspräparationen aus Überständen produzierender porciner und PERVinfizierter, humaner Zellen konnten alle Strukturproteine identifiziert werden. Dazu wurden neben Elektrophoresen Western BlotAnalysen eingesetzt, wobei kreuzreaktive Antiseren gegen verwandte Viren und neu entwickelte, erstmals gegen PERVProteine gerichtete Antiseren benutzt wurden. Bei der Untersuchung der biologischen Eigenschaften wurde gezeigt, daß PERV in vitro ein mit anderen Retroviren vergleichbares immunsuppressives Potential besitzt. Mit diesen neuen Antiseren und den hoch gereinigten Viruspräparationen wurden sehr sensitive Western BlotVerfahren sowie ELISAs auf der Basis synthetischer Peptide als Nachweissysteme etabliert und validiert. Zuerst wurden Seren gesunder Blutspender mit diesen Tests untersucht. Dann wurden Seren von Schlachtern und von Patienten nach Xenotransplantationen getestet. Erstmals wurden auch Seren von Pavianen, denen u.a. auch ganze Schweineorganen transplantiert wurden und die eine profunde, für zukünftige Anwendungen typische, pharmakologische Immunsuppression erhielten, auf Antikörper gegen PERV untersucht. Bei Seren einiger Patienten und gesunder Blutspendern wurden zwar Kreuzreaktionen mit viralen Proteinen gefunden, es lagen aber keinerlei Anzeichen für eine PERVInfektion vor. Um das Wirtspektrum von PERV zu analysieren, wurden Zellinien und erstmals auch primäre Zellen verschiedener Spezies einschließlich Ratte und Maus mit PERV inokuliert. Dabei wurden erstmals Hinweise auf die Suszeptibilität von humanen Blutzellen erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mitogenstimulierte porcine PBMC PERV freisetzen können, wobei alle drei Subtypen der Hüllproteine nachgewiesen wurden. Eine nähere Analyse ergab daß verschiedene Schweinerassen aber auch einzelne Individuen der gleichen Rasse unterschiedliche Mengen an Virus freisetzen. Unter bestimmten Stimulationsbedingungen wurde PERV von adhärenten Zellen produziert, die nicht näher charakterisiert werden konnten. Eine endgültige Beurteilung des Infektionsrisikos bei Xenotransplantationen ist nach Abschluß dieser Studie noch nicht möglich. Mit der Charakterisierung von PERV und den immunologischen Nachweismethoden wurden die Voraussetzung für die Analyse weiterer experimenteller und klinischer Xenotransplantationen gelegt.
Molekulare Systematik und Phylogeographie der Formengruppe Ancylus fluviatilis O. F. Müller 1774
(2001)
Ziel dieser Dissertation war es, die genetische Variation innerhalb der Formengruppe Ancylus fluviatilis (Gastropoda: Basommatophora) zu untersuchen, und eine auf molekula ren Markern basierende Phylogenie zu erstellen. Die phylogenetischen Untersuchungen beinhalteten auch die Stellung der Familie Ancylidae innerhalb der Basommatophora. Außerdem wurde die geographische Verteilung der genetischen Variation untersucht und die phylogeographischen Prozesse, die zu dieser Verteilung geführt haben, analysiert. Die gefundene genetische Konstitution wurde im Zusammenhang mit bereits vorhandenen Daten über chromosomale und fortpflanzungsbiologische Besonderheiten von A. fluviatilis diskutiert. Für 147 Individuen aus 62 Populationen des gesamten Verbreitungsgebiets von A. fluviatilis wurden mitochondriale 16S rDNASequenzen ermittelt. Es konnten 67 Haplotypen unterschieden werden. Die Haplotypen zeigen eine große genetische Diversität innerhalb der Formengruppe (bis zu 8.2% paarweise Sequenzdivergenz). Es lassen sich neun genetisch stark divergente Linien unterscheiden. In einer Population konnten dynamische dinukleotide Mikrosatelliten in der mtDNASequenz nachgewiesen werden, die eine Längenvariation von vier bis achtfachem Grundmuster aufweisen. Als wahr scheinlicher Mechanismus für diese Längenvariation wird "slippedstrandmispairing" angenommen. Mit Hilfe von nukleären RAPDMarkern wurde die genetische Trennung der mitochon drialen Linien bei syntop vorkommenden Linien auch auf nukleärer Ebene nachgewiesen. Die Formengruppe A. fluviatilis setzt sich somit aus einem Komplex reproduktiv isolierter Linien zusammen. Im Zusammenhang mit der bereits nachgewiesenen allotetraploiden Konstitution zumindest einer Linie und der resultierenden hohen Selbstbefruchtungsrate sind sowohl sympatrische als auch allopatrische Diversifizierungsereignisse für die Differenzierung der Linien verantwortlich. Drei der neun genetischen Linien sind geographisch weitverbreitet und kommen zum Teil syntop vor. Phylogeographische Analysen anhand von "nested clades" zeigten, daß isolation by distance zwar das Grundmuster für die Verbreitung von A. fluviatilis darstellt, daß dieses aber durch Expansionsereignisse, die die Besiedlung über weite Distanzen einschließen, überlagert sein kann. Zeitliche Abschätzungen ergaben für die Formengruppe A. fluviatilis ein Alter von mindestens 20 Millionen Jahren. Die rezent vorkommenden Linien sind schätzungsweise zwischen 8 und 14 Millionen Jahren alt. Für die phylogenetischen Untersuchungen innerhalb der Basommatophora wurde die 16S rDNA von weiteren Gattungen sequenziert. Die resultierende molekulare Phylogenie belegt die monophyletische Entstehung der Formengruppe A. fluviatilis sowie eine gemeinsame Abstammung der Gattungen Ferrissia und Ancylus. Die Familie Ancylidae bildet eine Schwestergruppe zur Familie Planorbidae und läßt sich somit nicht aus dieser ableiten. Die Gattung Burnupia zeigt sich als nahe verwandt zur Gattung Acroloxus (Familie Acroloxidae) und gehört somit nicht, wie bisher angenommen, zu den Ancylidae.
Short tandem repeat (STR) Loci sind ideale Marker für gerichtliche und abstammungs genetische DNAUntersuchungen. Sie bestehen aus sich wiederholenden 26 bp langen Einheiten und sind über das gesamte menschliche Genom verteilt. Aufgrund ihrer geringen Allellängen (100600 bp) lassen sich STRs leicht mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizieren. In der vorliegenden Arbeit sind fünf STRPolymorphismen der Loci D11S488, D18S51, D19S246, HUMFIBRA (FGA) und HUMVWFA31/A auf ihre Populationsgenetik und Sequenzstruktur hin untersucht worden. Die Daten wurden anhand genomischer DNA von 100 gesunden, unverwandten kaukasischen Blutspendern aus der Region Hessen gewonnen. Über ein 6 %iges denaturierendes Polyacrylamidgel wurden die PCRProdukte aufgetrennt und unter Gebrauch fluoreszenzmarkierter Primer mit einem 373A DNASequenzer analysiert. Der Locus D11S488 ist durch eine zusammengesetzte Repeatregion (compound repeat) von AAAG und GAAG Blöcken gekennzeichnet. Mit einer Variationsmöglichkeit an vier unter schiedlichen Positionen kam es zum Auftreten von Mikroheterogenitäten in Allelen gleicher Länge. 29 verschiedene Allele wurden gefunden, die basierend auf ihrer Gesamtrepeatanzahl (YAAG) 2641 (242 bp302 bp), in 15 Allelklassen gruppiert wurden. Bei D19S246 (TGTA und TCTA) liegt ebenfalls ein compound repeat vor. Mikroheterogenitäten führten in 11 Allelgruppen (182230 bp) zu 17 unterschiedlichen Allelen. Der Locus D18S51 (AGAA) ist ein STRPolymorphismus mit einer einfachen Repeatstruktur (simple repeat). 12 unter schiedliche Allele wurden beobachtet, die alle einen regelmäßigen Tetranukleotidrepeat aufwiesen. Die Allelspanne reichte von Allel 11 mit 278 bp bis Allel 22 mit 322 bp. Ebenfalls ein einfacher Repeat bestimmt das HUMFIBRA System (TCTT). Eines der beobachteten 10 Allele differierte allerdings um nur 2 bp. Zusammen mit dem compound repeat HUMVWFA31/A (8 Allele) sind alle untersuchten Marker multiplexfähig. Ein ausgeprägter Polymorphismus der individuellen Loci, die dem HardyWeinberg Equilibrium folgen, sowie eine Übereinstimmungswahrscheinlichkeit (pM) der Merkmale zwischen unverwandten Personen von 3 x 10 7 machen eine Analyse dieser fünf TetranukleotidMarker zu einer sinnvollen Ergänzung in der Bearbeitung abstammungs genetischer Fragestellungen.
Die doppelblinde Pilotstudie ''Wirksamkeit und Verträglichkeit einer Enzym oder Vitamin ATherapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf/Halsbereich" wurde in Zusammenarbeit mit der HNOKlinik in dem Zeitraum von Oktober 1994 bis Juni 1996 mit 25 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen und 15 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Den Patienten wurde neben der konventionellen Therapie entweder VitaminA (Retinolpalmitat, 150,000 IE/d), die Enzympräparation (proteolytische Gesamtaktivität 20,880 F.I.P.E/d) oder Placebo zugeteilt. In regelmäßigen Abständen wurde das Allgemeinbefinden/ Nebenwirkungen protokolliert, Blutbild und Leberwerte bestimmt, die peripheren Lymphozyten phänotypisiert und die NK LAK, bzw. LAKZellAktivität gemessen. Zur Auswertung gelangten 16 Patienten. Statistisch signifikant war eine Erhöhung der CD2 und CD3Werte der EnzymGruppe (41 Messungen) gegenüber den Patienten der Gruppen VitaminA (18 Messungen), Placebo (12 Messungen) und den Ausgangswerten der Patienten (25 Messungen). Auch im Verlauf konnte die Erhöhung der CD3Werte bei der Enzymgruppe gegenüber den anderen Patientengruppen bestätigt werden. Der Anteil der TZellen im peripheren Blut lag im Bereich der gesunden Kontrollen. Um die Wirkungen der Prüfmedikationen auf Leukozyten (PBL, PMNL, Monozyten) in vitro zu untersuchen, wurde ein Panel durchflußzytometrischer Tests entwickelt, bzw. etabliert, die die Messung der Funktionen NKZellaktivität, LAKAktivität, ADCC, Phagozytose und Sauerstoffradikalbildung ermöglichten bzw. vereinfachten. Die untersuchte Enzympräparation enthielt Papain, Trypsin und Chymotrypsin im Verhältnis 2,5:1:1. In vitroVersuche ergaben eine dosisabhängige Stimulierung der NK, NKLAK, CTL bzw. LAKAktivität und der ADCC durch NKZellen durch die Enzympräparation. Es war möglich, die Lymphozyten mehrfach zu stimulieren, eine Enzymdauergabe, bzw. hohe Enzymdosen führten zu einem Aktivitätsrückgang. Die Enzymmischung verbesserte die Phagozytose und den oxidativen Burst bei PMNL und erhöhte die CD18 und CD54 bzw. erniedrigte die CD16Expression auf PMNL. Mit alltransRetinsäure bzw. Retinol konnten die Lymphozytenaktivitäten in vitro mit den gewählten Versuchsbedingungen kaum beeinflußt werden, Änderungen konnten meist 48h bis 72h nach Zugabe beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Beobachtungen zu VitaminAWirkungen auf PMNL waren nicht möglich, da diese nur maximal 24h kultiviert werden konnten.
In der Betrachtung dieser Arbeit werden hauptsächlich die vier Geistesgestalten der ersten Hälfte des 18. Jahrhunderts, nämlich G. W. LEIBNIZ, JOHANN BERNOULLI (I), DANIEL BERNOULLI, und LEONHARD EULER in ihrem Verhältnis zur Gravitation bzw. zu NEW TONS Gravitationstheorie gewürdigt. Die herangezogenen Arbeiten wurden von mir aus dem Lateinischen bzw. dem Französischen übersetzt. Es wird dargestellt, daß sowohl LEIBNIZ als auch JOHANN BERNOULLI Darstellungen gegeben haben, die beanspruchen, die gesamte Himmelsmechanik zu erklären. DANIEL BERNOULLI wird hauptsächlich in bezug auf seine Konkurrenz mit dem Vater in seiner Preisschrift betrachtet, und EULER liefert neben einer fulminanten Kritik an der fehlenden Ursachenerklärung NEWTONS eine Version von Gravitationserklärung, von der er später wieder Abstand nehmen mußte. Allen kontinentalen Gelehrten ist gemeinsam, daß sie auf einer nahwirkenden Ursache als Erklärung der Gravitation bestehen und sich damit deutlich von ISAAC NEWTON absetzen. Fast gemeinsam allerdings ist ihnen auch die Achtung vor NEWTON, insbesondere dadurch, daß sie (bis auf LEIBNIZ) dessen Ergebnisse aus den principia durchaus verwenden. Sie sind nur mit dessen ''Fernwirkungstheorie" nicht einverstanden. LEIBNIZ hebt sich insofernhin ab, als er in seiner Arbeit sich nicht mit der NEWTONS aus einandersetzt, sondern sein eigenes Konzept verfolgt. Er kannte NEWTONS Arbeit nicht und publizierte seine Version ziemlich bald nach Erscheinen der principia. Dabei benutzt er seine neu entwickelte Analysis und leitet aus Prämissen, die er angibt, die Eigenschaften der Plane tenbewegung ab. Zur Erklärung der Schwere dient ihm ein schon von HUYGENS angegebe nes Modell der Schwereerzeugung durch Rückstoß und Verdrängung im Wirbel. Die Plane tenbewegung wird dann bei ihm durch Zentrifugalbewegung und ''parazentrische" Rückstoßbewegung in radialer Richtung und durch ''harmonische" Kreisbewegung in tangentialer Richtung infinitesimal zusammengesetzt. JOHANN BERNOULLI erfindet eine eigene ''Himmelsphysik", indem er nach eigener Äuße rung das Beste aus beiden System, dem von DESCARTES und dem NEWTONS, zusammen führt. Bei ihm wird alles aus Stößen und nach den Stoßgesetzen erklärt. Die gesamte Spekulation verwendet subtile Materie des ersten Elementes, die durch eine Art Siedevorgang aus dem Zentralgestirn (jeweils) austritt, durch Stöße und Anlagerungen im Laufe der Zeit zur Materie des zweiten Elementes verdichtet wird und schließlich als ''Zentralstrom" zurückgestoßen, auf jeden Himmelskörper einwirkend, für alle Phänomene verantwortlich gemacht wird. Seine Spekulationen sind großartig formuliert und aus Alltagsbildern wie Sieden, Destillationen, Weihrauch Wahrnehmung, Lichtausbreitung, Schneelawinen, Flammruß Erscheinungen und ähnlichem entnommen. Seine von der Pariser Akademie preisgekrönte Arbeit teilte sich den Preis mit der Arbeit sei nes Sohnes DANIEL BERNOULLI, der sich aber darauf beschränkt, die spezielle Fragestel lung der Preisaufgabe zu bearbeiten und dabei nur erkennen läßt, was er von den Ursachen der anderen Himmelserscheinungen denkt. Während sein Vater sich als strenger CARTESI ANER gibt und die Preisaufgabe nur dadurch bewältigen kann, daß er sich den Erdglobus als langgestrecktes Ellipsoid, im tragenden Medium schwimmend, vorstellt, benutzt Daniel die Vorstellung einer sich überall erstreckenden Sonnenatmosphäre, um deren Einwirkung für seine Lösung nutzbar zu machen. Aus seinen Bemerkungen über NEWTON und über Wirbel theorien schimmert schon durch, daß er sich als Anhänger NEWTONS eher verstehen kann, denn als Anhänger der Wirbeltheorien. Bei LEONHARD EULER handelt es sich vermutlich um den Menschen, der die Physik, ins besondere die Mechanik, im 19. Jahrhundert am meisten beeinflußt hat. Zwei Schriften von ihm werden betrachtet, von denen die erste anonym erschien und erst 1996 ihrem Verfasser sicher zugeordnet werden konnte. Nach meiner Übersetzung hier und dem Vergleich mit einer posthumen Arbeit, ''Handreichungen zur Naturlehre", kann diese jetzt sicher datiert werden als zu Beginn der vierziger Jahre des 18. Jahrhunderts entstanden. Die anonyme Arbeit, ''De causa gravitatis" enthält in komprimierter Form eine fundamentale Kritik der Fernwirkungs theorie NEWTONS mit zum Teil sehr plastischen Beispielen der Ablehnung dieser Theorie. Daran anschließend wird der Aetherdruck, der in der Nähe der Planetenoberfläche geringer als weiter draußen sei, als Ursache der Gravitation vorgestellt. Es wird sogar eine Formel für die Druckverteilung angegeben. In der zweiten betrachteten Arbeit EULERS zeigt sich, daß LEONHARD EULER von der Erklärung der Ursache der Schwere Abstand nimmt. Allerdings beharrt er darauf, daß eine solche, mechanische Ursache existieren müsse und sie vermutlich im Aether zu suchen sei. Solche Vorsicht erschien ihm angeraten, nachdem LE SAGE ihm gezeigt hatte, daß der Aether als Erklärung für alle Phänomene der Optik, des Elektromagnetismus und der Mecha nik nicht herangezogen werden konnte. So kam es denn dazu, daß man NEWTONS Gesetze zum Rechnen gerne benutzte, seine Wei gerung, Gravitation als Masseeigenschaft zu definieren, einfach nicht mehr zur Kenntnis nahm und LEONHARD EULER folgte, der wohl der erste war, der aus der Definition NEW TONS, Kraft sei die Änderung der ''quantitas motus", die Formulierung Kraft sei gleich Mas se mal Beschleunigung machte. Es brauchte auf dem Kontinent fast ein ganzes Jahrhundert seit NEWTONS Arbeit, bevor, auf diese Art abgeändert, NEWTON als Säule der neuen Wis senschaft ''Physik" installiert war. Es wird mit dieser Arbeit gezeigt, daß die Modellbildung, die Vermittlung einer Vorstellung, auch für die ausgewiesene Elite der Wissenschaft einen hohen Stellenwert hatte. Das Funktionieren eines mathematischen Modells ist zwar wichtig und als Mittel der Arbeit unabdingbar, aber erst ein befriedigendes, vorstellbares, und damit mechanisches, Modell sichert ein Phä nomen als ''verstanden" ab. Unsere Probleme heute mögen zwar andere sein, in dieser Hin sicht aber hat sich die Wissenschaft auch heute noch nicht gewandelt und wird sich auch nicht wandeln. Es bleibt also bei der Frage: ''Was ist ein befriedigendes Modell?"
Membranproteine der renalen Bürstensaumzellen spielen eine wichtige Rolle beim Transport von organischen Kationen in der Niere. Mit der ersten Klonierung eines Transporters für organische Kationen wurden die Grundlagen für eine Aufklärung der Transportvorgänge auf molekularer Ebene gelegt. Der Transportmechanismus und die physiologische Funktion des in den Plasmamembranen von Niere und Gehirn exprimierten Transporters für organische Kationen 2 (OCT2) werden zur Zeit -- teilweise kontrovers -- diskutiert. In dieser Dissertation wurde der aus der Rattenniere klonierte elektrogene Transporter für organische Kationen rOCT2 nach heterologer Expression in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis mit elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Zur Anwendung kam neben der konventionellen ZweiElektrodenSpannungsklemme vor allem die ''giant patch clamp"Technik. Als neue Methode speziell für Transstimulationsexperimente bei geklemmtem Membranpotenzial wurde die amperometrische Spannungsklemme entwickelt, mit der ein Ausstrom von Dopamin aus vorinkubierten Oozyten mittels Oxidation an einer CarbonfaserElektrode bei gleichzeitiger Aufzeichnung des elektrischen Transmembranstromes gemessen werden kann. Die Kontrolle der physiologischen Salzlösungen beiderseits der Membran in ''patch clamp" Experimenten erlaubte eine leichte Unterscheidung wechselwirkender Substanzen in Substrate wie: Cholin, Dopamin, Tetramethylammonium und Tetraethylammonium und Hemmstoffe wie: Chinin und Tetrabutylammonium (TBA). Anhand von substratinduzierten elektrischen Ausströmen konnten erstmalig für einen Transporter für organische Kationen apparente Substrataffinitäten von der zytoplasmatischen Seite bestimmt werden. Sie liegen in derselben Größenordnung wie zuvor auf der extrazellulären Seite bestimmte Affinitäten. Der schon früher vorgeschlagene elektrogene Ausstrom von Substrat auch gegen ein negatives Membranpotenzial wurde damit bestätigt. Es wurde eine Hemmung rOCT2vermittelter Ströme durch Schwermetalle und durch Isobutylmethylxanthin gefunden. Die zytoplasmatische Zugabe der Inhibitoren TBA und Chinin hemmte sowohl substratinduzierte Einwärts als auch Auswärtsströme. Die Inhibierung der Auswärtsströme erfolgte dabei kompetitiv. Von der extrazellulären Seite aus hemmte Chinin im Gegensatz zu TBA Einwärtsströme nichtkompetitiv, was auf eine Transinhibierung nach einer unspezifischen Membranpassage des Chinins hindeutet. Die Analyse von StromSpannungskennlinien zeigte, dass die maximalen Transportraten und apparenten Affinitäten der Substrate spannungsabhängig sind. Umkehrpotenziale, die in Anwesenheit von Substrat beiderseits der Membran gemessen wurden, lagen bei den durch die Nernstgleichung vorhergesagten Werten. Dieses Ergebnis identifiziert das elektrochemische Potenzial als treibende Kraft für den Transport von organischen Kationen bei neutralem pH und schließt die Existenz eines elektroneutralen OrganischeKationen/ProtonenAustauschmodus aus. Die rOCT2spezifische Leitfähigkeit war bei sättigenden Konzentrationen von organischen Kationen beiderseits der Membran im Vergleich zu halbsättigenden reduziert. Diese Beobachtung ist mit einem zyklischen Transportmodell erklärbar, bei dem der Transporter nach erfolgtem Transport eines organischen Kations entweder als leerer Transporter oder mit einem auf der anderen Seite gebundenen Kation in seine Ausgangstellung zurückkehren kann, wobei die Translokation der Bindungsdomäne jeweils mit einer Konformationsänderung des Transporters einhergeht. Der Austausch von organischen Kationen erfolgt dabei elektroneutral. Einen weiteren Beleg für einen elektroneutralen Austauschmodus für organische Kationen liefern amperometrische Messungen an reversibel mit Dopamin beladbaren Oozyten. Es konnte ein rOCT2vermittelter, durch Chinin hemmbarer Dopaminausstrom gemessen werden, der in Abhängigkeit des Membranpotenzials durch extrazelluläres Cholin entweder transstimulierbar oder transinhibierbar war. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen belegen, dass rOCT2 als basolateral lokalisierter Transporter hervorragend dazu geeignet ist, mit der vom elektrochemischen Potenzial getriebenen Substrataufnahme in die Bürstensaumzellen den ersten Schritt der Sekretion von organischen Kationen durch die Niere zu leisten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass rOCT2 bei einem ausreichenden Konzentrationsgradienten von Cholin bei der physiologisch bedeutsamen Reabsorption von Cholin beteiligt sein könnte, indem dieses gegen das negative Membranpotenzial, womöglich im Austausch gegen ein anderes organisches Kation, transportiert wird. Zeitaufgelöste Messungen mit Substrat oder Spannungssprüngen sowie Bindungs und Transportstudien nach gezielter Mutagenese könnten zukünftig einer weiteren Aufklärung des Transportmechanismus dienen. Einige die Charakterisierung von rOCT2 in ''inside out"Patchen betreffende Ergebnisse dieser Dissertation wurden bereits im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht und auf internationalen Konferenzen präsentiert. Andere Ergebnisse sind Teil einer vom American Journal of Physiology zur Veröffentlichung angenommenen Arbeit und eine weitere Veröffentlichung ist in Vorbereitung.
Einen vielversprechenden Ansatz auf dem Gebiet der Entwicklung kolloidaler Arzneiträgersysteme stellen die proteinbasierten Nanopartikel dar, da sie biodegradierbar und nicht toxisch sind und eine Reihe möglicher Angriffspunkte zur kovalenten Bindung von Arzneistoffen und zur Oberflächenmodifikation aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Herstellungsprozeß von HSANanopartikeln und sein Einfluß auf die physikochemischen Eigenschaften des resultierenden Partikelsystems evaluiert. Durch Oberflächenmodifikation wurde eine Kopplung von Proteinen mittels bifunktionaler Crosslinker ermöglicht und die zelladhäsiven Eigenschaften des Trägersystems vermindert. Durch Kopplung funktioneller Proteine wurden die ersten Schritte in Richtung eines ligandenvermittelten DrugTargetings unternommen. Evaluierung des Herstellungsprozesses und Charakterisierung des resultierenden partikulären Systems Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses von HSANanopartikeln ergab eine Abhängigkeit der Partikelgröße und der Partikelanzahl vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Die Quervernetzung des resultierenden Systems beeinflußte die Anzahl der freien Aminogruppen an der Partikeloberfläche: Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto weniger Aminogruppen waren nachweisbar. Die Härtung der Partikel durch Einwirkung hoher Temperaturen führte ebenfalls zu stabilen Partikeln. Die Anzahl der verfügbaren Aminogruppen lag im Vergleich zu den Glutaraldeydquervernetzten höher. Die Art und das Ausmaß der Quervernetzung hatten keinerlei Einfluß auf die mittlere Partikelgröße. Das Zetapotential dagegen zeigte eine Tendenz, mit steigender Quervernetzung negativer zu werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Aminogruppen an der Oberfläche von GelatineA und BNanopartikeln verdeutlichte, daß HSANanopartikel signifikant mehr freie Aminogruppen an der Partikeloberfläche, und damit mehr Angriffspunkte zur kovalenten Kopplung und Oberflächenmodifikation aufweisen, als GelatineNanopartikel, wobei Gelatine ANanopartikel mehr als doppelt so viele Aminogruppen an der Oberfläche besitzen als Gelatine BPartikel. Die höchsten Aminogruppenzahlen zeigten die hitzedenaturierten HSANanopartikel. Einführung von Sulfhydrylgruppen an die Partikeloberfläche Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs Methoden zur Einführung von Thiolgruppen auf die Oberfläche von HSANanopartikeln evaluiert. Die effektivste Methode ergab sich aus der Kopplung von Cystamin mit dem Kopplungsreagenz EDC, gefolgt von einer reduktiven Spaltung der Cystamindisulfidbindungen und der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Bedauerlicherweise zeigte diese Partikelpräparation die höchste Toxizität der untersuchten Zubereitungen in der Zellkultur. Die Kopplung von LCystein mit EDC war aufgrund unerwünschter Nebenreaktionen wesentlich weniger effektiv. Die einfachste Art, Thiolgruppen einzuführen, war die reduktive Spaltung der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Doch Bindungsexperimente zeigten, daß diese Thiolgruppen zwar mit Ellmans Reagenz nachweisbar waren, aber zu Bindungszwecken wahrscheinlich aus sterischen Gründen nur in untergeordnetem Maße zur Verfügung standen. Die Verwendung von 2Iminothiolan (Trauts Reagenz) war eine im Vergleich zur Cystamin/EDCMethode einfache und leicht zu handhabende Methode zur Einführung von SHGruppen, allerdings mit relativ geringer Effizienz. Das Quenchen freier Glutaraldehydreste an der Partikeloberfläche mit Cystamin führte zu einem sehr niedrigen SHGruppengehalt, mit LCystein waren so gut wie keine Thiolgruppen nach der Umsetzung nachweisbar. Die SHGruppen wurden bei einer Lagerung bei 4°C mit einer Halbwertszeit von 28,2 Tagen abgebaut, unabhängig von der Art der SHGruppeneinführung. Die Reaktivität der SHGruppen dagegen nahm wesentlich schneller ab als ihre Nachweisbarkeit: Bereits am dritten Tag nach der SHGruppeneinführung lag die Bindungsrate von mit SHreaktiven Crosslinkern aktivierten Proteinen um 2030 % niedriger, verglichen mit dem ersten Tag. Durch Veränderung der Reaktionsparameter konnte bei allen Methoden die Anzahl der eingeführten Thiolgruppen kontrolliert werden. Durch die Einführung der SHGruppen zeigten die Nanopartikel eine deutlich höhere Mukoadhäsion. Oberflächenmodifikationen Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSANanopartikel war zum einen eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Arzneistoffe wie DNA über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der Partikel mit EDC allein oder mit EDC und Cystamin bzw. Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials in den positiven Bereich. Durch Veränderung der Cholamin bzw. Cystaminkonzentration war die Verschiebung des Zetapotentials steuerbar. Gleiches galt für die Umsetzung der Gelatine APartikel, allerdings waren hier deutlich geringere Konzentrationen zur Erlangung der gleichen positiven Zetapotentiale notwendig. Zum anderen sollte durch die Modifikation der Partikeloberfläche ein verändertes Verhalten hinsichtlich der Zelladhäsion der Partikel erzielt werden. Es zeigte sich eine verstärkte Zelladhäsion nach der Einführung weiterer Aminogruppen und nach der Einführung lipophiler Gruppen. Eine verminderte Zelladhäsion wurde durch eine Maskierung der Aminogruppen erreicht. Die besten Ergebnisse erbrachte hierbei die Umsetzung der HSANanopartikel mit Jodessigsäure. Bindung funktioneller Proteine Um zu überprüfen, ob funktionelle Proteine an das evaluierte Trägersystem unter Erhalt der Funktionalität gebunden werden können, wurden zunächst Enzyme über den bifunktionalen Crosslinker SulfoMBS kovalent gekoppelt. Analysen der Bindungsrate und der tatsächlichen enzymatischen Aktivität differierten zwar, doch ist dies wohl auf eine noch nicht hinreichend optimierte Analytik zurückzuführen. Eine enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase und der bGalaktosidase war nach der Bindung an das Trägersystem eindeutig nachweisbar. Als weiteres funktionelles Protein wurde das Avidinderivat NeutrAvidin(TM) gewählt und mit SulfoMBS an Gelatine ANanopartikel gekoppelt. Durch die Bindung biotinylierter Antikörper konnte der Erhalt der Funktionalität des gebunden NeutrAvidins(TM) gezeigt werden. Die Konjugation eines biotinylierten, humanen CD3 Antikörpers an das NeutrAvidin(TM)konjugierte Partikelsystem führte zu einer selektiven Bindung des Trägersystems an primäre humane Lymphozyten. Auch eine Aufnahme des Trägersystems in die Zellen konnte gezeigt werden. Die Experimente zum Antikörpervermittelten Targeting konnten mit HSANanopartikeln nicht reproduziert werden, da HSAPartikel eine so starke Zelladhäsion zeigten, daß ein Targeting aufgrund des Antikörpers nicht mehr ersichtlich war. Erste Versuche mit oberflächenmodifizierten HSAPräparationen, wie beispielsweise einer Jodessigsäure Umsetzung, führten zu einer deutlich verminderten Zelladhäsion. Weitergehende Experimente zur Evaluierung dieses Effektes sind für die Weiterentwicklung dieses Trägersystems entscheidend.
Bedingt durch den demographischen Wandel in der Bevölkerung erlangen gerontologische Themen immer zentralere Bedeutung. Die Thematik des Dekubitus in der häuslichen Pflege ist durch ihren Bevölkerungsbezug und die Multidisziplinarität der Problemstellung dabei ein wichtiges Praxisfeld. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in drei Teile: 1. Zur Anleitung häuslich Pflegender ist ein Ratgeber für pflegende Angehörige entstanden und wird im Schlüter Verlag, Hannover veröffentlicht. 2. Durch die Befragung möglichst repräsentativer Stichproben von niedergelassenen Allgemeinärzten und praktischen Ärzten werden Maßnahmen zu Prävention, Diagnostik und Therapie des Dekubitus in der allgemeinärztlichen Versorgung erfaßt. Alle vertragsärztlich tätigen Allgemeinmediziner und Praktischen Ärzte der Modellregion Stadt und Landkreis Offenbach (mittelgroße Stadt in Hessen, die die hessische Grundgesamtheit widerspiegelt) werden 1993 (N=165) (Dissertation Silke Nowack) und 1998 (N=196) in ein schriftliches postalisches Interview mit 21 überwiegend offenen Fragen in 2 Wellen einbezogen. Die Antworterquote von jeweils 35% (n=58/69) ist im Vergleich zu anderen Studien in dieser schwierigen Befragtengruppe zufriedenstellend, aber vermutlich zugunsten der am Thema Interessierten verzerrt. Der Vergleich der Datenprofile 1993 und 1998 läßt auf eine weitgehend gleiche Antwortergruppe schließen. Die Ergebnisse können allerdings nur zu Tendenzaussagen herangezogen werden. Von den Allgemeinmedizinern und praktischen Ärzten werden 1993 und 1998 durchschnittlich 4 bis 5 Patienten mit Dekubitus jeweils in Alten und Pflegeheimen und zu Hause betreut (Median = 3). Der Altersgipfel der Patienten liegt bei 71 bis über 80 Jahren. Als Grunderkrankung spielen allgemeine Schwäche und Kachexie sowie der cerebrale Insult, als Begleiterkrankung der Diabetes mellitus die führende Rolle. Während 1993 in erster Linie Felle als Antidekubitushilfsmittel genannt werden, treten diese in der Befragung 1998 in den Hintergrund. Antidekubitusmatratzen werden 1998 am häufigsten genannt (1993: 29 von 58 Ärzten; 1998: 42 von 69 Ärzten, Unterschiede nicht signifikant). Zur Prävention und Behandlung von Druckgeschwüren gibt es zahlreiche Literatur. Ein durchgehend positiver Effekt von Publikationen, Fortbildungen oder den beiden deutschsprachigen Leitlinien auf die tatsächliche Versorgung von Patienten mit Dekubitus im allgemeinärztlichen Bereich im Vergleich von 1993 zu 1998 wird in den vorliegenden Daten allerdings nicht sichtbar. So ist z.B. die Auswahl der von den Hausärzten eingesetzten Lokaltherapeutika und lokalen Maßnahmen polypragmatisch, manchmal konfus und aktionistisch und nicht an den wenigen vorhandenen, in ihrem Nutzen belegten Konzepten orientiert. Im Verordnungsbereich der Dermatika ist ein großes Einsparpotential vorhanden, das zugunsten moderner feuchter Wundverbände zu mobilisieren wäre, wie das Verordnungsverhalten der Vertragsärzte zeigt. Von 1992 zu 1997 weisen die Daten des GKVArzneimittelindex zwar einen Rücklauf der Verordnung von Lokalantibiotika auf, er spiegelt sich aber nicht im Antwortverhalten der hier Befragten wider. Zu beobachten ist weiterhin ein deutlicher Anstieg von allgemeinärztlichen Nennungen bei diagnostischen Maßnahmen im Jahre 1998, von denen einige keinen Stellenwert im Umgang mit Dekubituspatienten haben. 3. Von Mai bis August 1998 werden offene, themenzentrierte, leitfadengestützte, mündliche Interviews mit durch Zufallsstichprobe ermittelten 10 pflegenden Angehörigen (9 Frauen, 1 Mann) von Dekubituspatienten aus Stadt und Landkreis Darmstadt geführt und anhand von Tonbandprotokollen in einem Mehrstufenverfahren ausgewertet. Die Interviews finden im häuslichen Umfeld der pflegenden Angehörigen, in Abwesenheit der Patienten, statt. Die Befragung der pflegenden Angehörigen ergibt als durchschnittliches Lebensalter der Pflegebedürftigen 75 Jahre (Median 79 Jahre), Pflegebedürftigkeit besteht seit durchschnittlich 6 Jahren (Median 3,5 Jahre). Die Dauer der Dekubituserkrankung beträgt durchschnittlich 3 Jahre (Median 2 Jahre). Auch in dieser Befragtengruppe unterstreichen polypragmatische und obsolete Behandlungsmethoden die Forderung nach klaren und einheitlichen Konzepten in der Dekubitusprävention und --therapie. Die Pflegenden sind in der Mehrzahl Töchter/Schwiegertöchter. Soziale und emotionale Belastungssituationen werden thematisiert. Aggressive Verhaltensweisen legen 8 von 10 Befragten dar. Selbsthilfegruppen, Gesprächskreise für pflegende Angehörige oder psychologische Betreuung werden von den pflegenden Angehörigen nicht als Entlastungsmöglichkeit geschätzt und genutzt. Gründe für das Pflegeengagement sind gesellschaftliche Normierung, rollenimmanentes Verhalten, der Generationenvertrag sowie der Gedanke, das Leben des Betroffenen durch die häusliche Pflege erleichtern und verlängern zu können. Mit Einführung der Pflegeversicherung wurde die finanzielle Unterstützung häuslich Pflegender verbessert, die Pflegekompetenz bleibt allerdings weiterhin bei allen befragten Angehörigen autodidaktisch erworben. Häusliche Krankenpflegekurse der Krankenkassen werden nicht besucht, so daß von Seiten der Pflegeversicherung eine Attraktivitätssteigerung der Kurse oder eine eventuelle Einführung einer Teilnahmepflicht wünschenswert ist. Zur systematischen Verhütung und Behandlung eines Dekubitus im hausärztlichen Bereich ist die Entwicklung und Verbreitung einer Leitlinie, entsprechend der amerikanischen Guideline der Agency for Health Care Policy and Research anzustreben. Dem Hausarzt als zentraler Koordinationsstelle zwischen Patient und Pflegenden obliegt ferner die Aufgabe auch auf die Gesundheit der Pflegeperson zu achten, um Überlastungssituationen rechtzeitig diagnostizieren und therapieren zu können.
Osteoarthrose ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die in einem schleichenden Prozeß zur Zerstörung des Knorpels in den gewichttragenden Gelenken insbesondere der Hüfte und des Knies führt. Chronische Behinderungen sind die Folge. Die hohe Prävalenz in der vorwiegend älteren Bevölkerung hat zur Bezeichnung als Volkskrankheit geführt. Die genauen Ursachen der Osteoarthrose sind weitgehend unbekannt, jedoch wird davon ausgegangen, daß eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen anabolen und katabolen Prozessen, die am normalen Knorpelmetabolismus beteiligt sind, zugunsten des Katabolismus stattfindet. Ein Charakteristikum der Krankheit ist die verstärkte Degradation des Proteoglykans Aggrekan, einem der Hauptbestandteile der Knorpelmatrix. Dafür verantwortlich ist besonders im frühen Krankheitsstadium die Enzymaktivität ''Aggrekanase", in späteren Phasen sind auch verschiedene MatrixMetalloproteasen (MMPs) beteiligt. Die Enzymaktivität Aggrekanase blieb lange Zeit unentdeckt und wurde unter den Mitgliedern der MMPFamilie vermutet. Jedoch weisen MMPs und Aggrekanase eine unterschiedliche Spezifität für Aggrekan auf, da MMPs die interglobuläre Domäne des Aggrekans bevorzugt zwischen N 341 und F 342 spalten (MMPSchnittstelle), Aggrekanase dagegen nur zwischen E 373 und A 374 (Aggrekanase Schnittstelle). Daß es sich bei MMPs und Aggrekanase um distinkte Aktivitäten handelt, zeigt die jüngste Klonierung zweier Aggrekanasen, die der Familie der ADAMTSProteasen angehören. Trotz der Identifikation dieser zwei Aggrekanasen, die über eine Metalloprotease, Disintegrin und ThrombospondinDomäne verfügen, sind viele EnzymCharakteristika noch ungeklärt, und auch die Frage, welches dieser beiden Enzyme oder welches noch unentdeckte Enzym in der Pathophysiologie der Osteoarthrose die bedeutendste Rolle spielt, ist noch offen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung der noch weitgehend ungeklärten Substratspezifität der Aggrekanase. Besonderes Interesse bestand in der Frage, welche minimalen Anforderungen ein Substrat erfüllen muß, um von Aggrekanase als solches akzeptiert zu werden, da Hinweise existieren, daß kurze Peptide, die die Schnittstelle in nativem Aggrekan repräsentieren, nicht als AggrekanaseSubstrat erkannt und gespalten werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß tatsächlich Sequenzbereiche des Aggrekans distal zur AggrekanaseSchnittstelle für eine effiziente Spaltung durch Aggrekanase notwendig sind. Durch Mutations und Deletionsstudien mit einem funktionalen rekombinanten Substrat, das die gesamte interglobuläre Domäne des Aggrekans mit der AggrekanaseSchnittstelle beinhaltet, wird gezeigt, daß die Substratregion der MMPSchnittstelle, insbesondere deren N terminale Hälfte, wichtig ist für eine effiziente Spaltung an der AggrekanaseSchnittstelle 32 Aminosäuren weiter Cterminal. Dieses Ergebnis weist auf die Möglichkeit hin, Aggrekanase trete über eine zweite, von der eigentlichen Schnittstelle distinkten Interaktionsstelle mit dem Substrat in Wechselwirkung. Diese Substratspezifität ist in verschiedenen zellulären und nicht zellulären sowie rekombinanten AggrekanaseSystemen reproduzierbar und somit für Aggrekanase charakteristisch. Die membrangebundene MMP14, die unter bestimmten Bedingungen in der Lage ist, eine Proteolyse der AggrekanaseSchnittstelle zu erzeugen, teilt diese Eigenschaft nicht und ist deshalb als Kandidat für die pathologische Aggrekanase Aktivität unwahrscheinlich. Desweiteren wurde die Rolle der Substratglykosylierung für die Degradation durch Aggrekanase untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß die N und OGlykosylierungen des rekombinanten Substrats dessen Spaltung durch Aggrekanase negativ beeinflussen. Einen zusätzlichen Aspekt der AggrekanaseCharakterisierung stellt die Inhibition der Enzymaktivität durch das Mukopolysaccharid Heparin dar. Heparin bindet vermutlich an Enzymdomänen außerhalb der katalytischen Domäne und hemmt so die für eine effiziente Spaltung nötigen Interaktionen zwischen diesen Domänen und dem Substrat. Die Charakterisierung der Enzymaktivität Aggrekanase, die in dieser Arbeit beschrieben ist, führt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Aggrekan Degradation und kann zur Entwicklung neuer Ansätze zur Inhibition des Enzyms im Zuge der Osteoarthrosebekämpfung beitragen.
In den bislang veröffentlichten literaturwissenschaftlichen Arbeiten zum Geldmotiv dominiert zumeist das "Entfremdungsparadigma". Das Geld wird aus soziologischer und philosophischer Perspektive als ein Motor des sozialen Wandels betrachtet, durch den soziale Beziehungen entfremdet, entmenschlicht und versachlicht werden. Bei der Lektüre dieser Arbeiten hat man zumeist den Eindruck, dass das Geld als eine Macht erscheint, die ihre Gestalt im Verlauf des 19. Jahrhunderts nicht verändert hat, die zwar scharf kritisiert worden ist, jedoch nicht im geringsten hat "gebrochen" werden können. Die vorliegende Arbeit geht hingegen davon aus, dass in literarisch gestalteten Geldmotiven nicht nur ein Aufbegehren gegen das Geld gestaltet ist, sondern dass Schriftsteller mit literarischen Werken auch an sozialen Kämpfen um die Aneignung von Geld und um den Wandel seiner Zirkulationsrichtung partizipiert haben. Während des 19. Jahrhunderts entfaltet sich ein Prozeß, der als Desillusionierung des utopischen Liberalismus bezeichnen wird. Unter "utopischer Liberalismus" wird die sich im 18. Jahrhundert formierende Doktrin verstanden, nach der es genüge, das Geld aus seinen feudalen Fesseln zu befreien, um eine sich selbst regulierenden ökonomische und soziale Prosperitätsbewegung in Gang zu setzen. Man schreibt dem ohne Schranken unreguliert zirkulierenden Geld eine soziale Harmonie herstellende gesellschaftsverändernde Kraft zu. Geld erscheint als die Verkörperung der Vernunft. Die in der vorliegenden Arbeit behandelten Autoren und Werke (Balzac, Daumier, Jarry, Vallès, Zola und andere) stellen im 19. Jahrhundert diese Sicht auf das Geld in Frage. Sie stellen dar, welche Auswirkungen die deregulierte Geldzirkulation im 19. Jahrhundert hat. Sie greifen Reformvorschläge ihrer Zeitgenossen auf, die Konzepte zu einer Regulierung der Geldzirkulation entworfen haben und sie entwickeln diese in literarischen Texten weiter. Die Wirtschaftsgeschichte Frankreichs zeigt, dass diese Gegenentwürfe einer Regulierung des Geldes erfolgreich gewesen sind. Die Geldzirkulationsspäre, die Finanzwelt und damit auch das Geld haben ihre Form im 19. Jahrhundert verändert. In der Restauration ist das unproduktive Geldkapital, das vor allem in Staatsrenten angelegt wird, die das politische und ökonomische Leben bestimmende Form des Geldes. Die Gewinne der Kapitalanleger und der Haute Banque, die die Staatsrenten profitabel verwaltet, werden finanziert, indem das Restaurationsregime und auch die Julimonarchie stetig sich verteuernde Steuern auf Konsumgüter erhebt. Den Schaden tragen das produzierende Bürgertum und die unteren Bevölkerungsschichten. Zwischen dem Beginn der Julimonarchie und der Blütephase des Second Empire gelingt es dem industriellen Bürgertum jedoch, die Geldzirkulation in ihrem Interesse zu regulieren. In der Dritten Republik führt dieser Wandel der Geldzirkulation zu einer Überakkumulation von Profiten, die dann in die Epoche des französischen Kapitalexports mündet. Frankreich wird zum Weltbankier, exportiert Geldkapital und importiert ausländische Staatsanleihen mit häufig sehr unsicherer Wertdeckung. Geld wird mehr und mehr zu einem auch fiktiven Wertzeichen. In der Arbeit wird in den unterschiedlichen sozial- und wirtschaftsgeschichtlichen Epochen exemplarisch belegt, welche konkreten Stellungnahmen zur Frage einer notwendigen Regulierung der Macht des Geldes in der Literatur zu finden sind.
Das neue Medium Fernsehen und die soziale Klasse der Arbeiter bis Mitte der 1970er Jahre: Zuwendung, Bedeutung und Auswirkungen Die Nachkriegszeit nach dem Ende des Zweiten Weltkrieges 1945 bis Mitte der 1970er Jahre stellt sich in der Rückschau der Historiker als das ''Goldene Zeitalter" (Hobsbawm) dar. Es ist geprägt von einem ungewöhnlichen wirtschaftlichen Aufschwung, von Vollbeschäftigung und einem zunehmenden Wohlstand auch für Angehörige der sozialen Klasse der Arbeiter. Mit der Ölkrise von 1973 geht diese Zeit der Prosperität zu Ende, es folgen Jahrzehnte der wirtschaftlichen Krise und zunehmend der Umbau der Weltökonomie unter dem Begriff der ''Globalisierung". In dieses ''Goldene Zeitalter" fällt der Aufstieg und die massenhafte Verbreitung eines neuen Mediums des Fernsehens. Innerhalb weniger Jahre erwerben Millionen von Haushalten in den meisten Industrieländern ein Empfangsgerät und spätestens Mitte der 1970er Jahre ist die Vollversorgung erreicht. Ab den 1980er Jahren wandeln sich aufgrund technologischer und ordnungspolitischer Neuerungen die Mediensysteme ein Wandel, dem epochale Qualität zugeschrieben wird. Das neue Medium Fernsehen zeichnet sich durch eine Reihe von sozial relevanten Eigenschaften aus, die es z.B. mit dem Rundfunk teilt und die es z.B. vom Kinofilm unterscheidet: Es ist rezipierbar in der Privatheit der eigenen Wohnung, es ist im Prinzip ständig verfügbar und die Zugangskosten sind nach Anschaffung eines Empfangsgerätes gering. Das neue Medium Fernsehen zeichnet sich aber vor allem mit Meyrowitz durch die Veränderung des Zugangs zu Wissen (hier umfassend verstanden als all die Inhalte menschlichen Denkens) aus. Es führt vormals getrennte Informationswelten zusammen und überwindet somit soziale Barrieren, die bislang den Zugang zu Wissen bzw. Orten verhindert haben. Für die unterprivilegierten Klassen bedeutet dies auch den virtuellen Zugang zu Lebenswelten sozialer Klassen, die ih nen bisher aufgrund ihrer sozialen Lage weitgehend verschlossen blieben. Fernsehen überwindet so virtuell soziale Grenzen. Die Angehörigen von unterprivilegierten Klassen sind es vor allem auch, in deren Leben das Fernsehen eine bedeutende Rolle einnimmt. Die ''Fernsehbedürftigen (Glick/Levy) konzentrieren sich in den mittleren und unteren Regionen des Bourdieuschen Sozialraumes, gemessen an Ausstattung mit ökonomischem und kulturellem Kapital. Differenziert man Fernsehzuwendung unter dem Aspekt der sozialen Lage und der Verortung im Bourdieuschen Sozialraum, so ergibt sich für den Untersuchungszeitraum folgendes Bild: Die ersten Besitzer von Fernsehgeräten in der Anfangsphase des Mediums rekrutieren sich vor allem aus den höheren Regionen des sozialen Raumes. Sie verfügen über ein hohes Einkommen und über hohe Bildung. Nach dieser Anfangsphase verbreitet sich das Fernsehen rasch in den Haushalten von Angestellten und Arbeitern und wird zu einem Massenkonsumgut. Das Einkommen ist bis zur Vollversorgung der Haushalte ein Maß für die Ausstattung mit einem Fernsehgerät. Je geringer das Einkommen, desto geringer der Anteil der Gerätebesitzer. Die meisten Gerätebesitzer finden sich in mittleren und höheren Einkommenslagen. Ab einer gewissen Einkommenshöhe jedoch stagniert der Besitz an Fernsehge räten. Eine Reihe von DetailStudien, die neben dem Einkommen auch Bildung berücksichtigen respektive auf Schichtungsmodelle abheben, zeigen eine inverse Beziehung zwischen hohem sozioökonomischen Status und dem Besitz eines Fernsehgerätes. Wurde das Medium zum Massenkonsumgut, so setzte sich in jenem Segment der Gesellschaft, das sowohl über hohes ökonomisches Kapital als auch hohes kulturelles Kapital verfügte, ein Distinktionsprozess ein, Fernsehen wurde als Zeichen für schlechten Geschmack empfunden. Auf der anderen Seite weist eine Abnahme des Gerätebesitzes mit sinkendem Einkommen nicht unbedingt auf eine geringere Fernsehbedürftigkeit hin: Fernsehen wurde in der Anfangsphase des Mediums von vielen Nichtgerätebesitzern auch in öffentlichen Räumen (Gaststätten) oder bei Freunden und Verwandten rezipiert. Bezüglich der Arbeiterhaushalte in der Bundesrepublik zeigt sich, dass sie ab 1962 geringfügig besser mit Empfangsgeräten ausgestattet sind als Angestelltenhaushalte. Dies gilt auch für untere Einkommen. Dieser Versorgungsgrad stellt für Arbeiter jedoch eine Ausnahme dar: Ansonsten sind sie hinsichtlich der Ausstattung mit langlebigen Gebrauchsgütern schlechter gestellt als Angestelltenhaushalte. Die täglich verbrachte Zeit vor dem Fernseher korrespondiert mit der sozialen Lage: Arbeiter sehen mehr fern als Angestellte. Die Einstellung zum Medium Fernsehen korrespondiert ebenfalls mit der sozialen Lage: Einer geringen Ausstattung mit ökonomischem und kulturellem Kapital entspricht eine eher bejahenden Einstellung, ein hoher sozioökonomischer Status entspricht eher einer kritischen Einstellung. Arbeiter bevorzugen mehr populäre Sendungen. In der Mehrzahl dieser Sendungen kommen Arbeiter als Protagonisten und ihre Lebenswelt kaum vor. Diese Befunde lassen sich sich als eine klassenspezifische Fernsehzuwendung der Arbeiter intepretieren: In der Bundesrepublik sind die Arbeiterhaushalte ab 1962 quer durch alle Einkommensgruppen besser mit Fernsehgeräten ausgestattet als z.B. Angestelltenhaushalte, dafür aber stellen Arbeiter die Anschaffung anderer langlebiger Gebrauchsgüter zurück. Die subjektiv hohe Bedeutung des Fernsehens für Arbeiter scheint in dieser Wahl auf. Arbeiter nutzen auch das Fernsehen zeitlich mehr als Angestellte und sie stehen dem Medium positiver gegenüber. Die Lebensbedingungen der Arbeiter sind im Untersuchungszeitraum von Grenzen bestimmt, die um das zentrale Moment der Lohnarbeit herum gruppiert, den Raum der Lebensmöglichkeiten auf ein spezifisches Maß reduzieren. Dieses Maß äußert sich als eine im Vergleich zu Angestellten, Beamten und Selbständigen mindere Ausstattung mit Ressourcen, mit Kapitalarten im Sinne Bourdieus. So ist ein generelles Merkmal der Lebensbedingungen der Angehörigen der sozialen Klasse der Arbeiter die Minderausstattung mit Wissen. Der Zugang zu formaler höherer Schulbildung ist durch ''unsichtbare" Klassenschranken erschwert. Dazu zählen neben geringen finanziellen Ressourcen auch eine ''soziale und affektive Distanz" zur bürgerlichen Welt jenseits der eigenen Arbeiterexistenz, die kaum bekannt ist und in der der Arbeiterhabitus sich als Hemmnis erweist. So bleibt der Zugang zu höherer Schulbildung, in der Bundesrepublik zumindest bis zur Öffnung des Bildungssystems Ende der 1960er Jahre, nur wenigen vorbehalten. Arbeiterkinder an den Universitäten sind die Außnahme von der Regel und sie sind Grenzgänger zwischen zwei sozialen Welten: ''Die eine seiner Welten ist tot, und doch ist er ohnmächtig, die andere zu gewinnen..." Ein weiteres Merkmal der Arbeiterexistenz ist die Verortung der Arbeiter im physischen Raum als Widerspiegelung der Verortung im sozialen Raum. Die von den Arbeitern sich selbst zugeschriebene soziale Position des ''unten" findet seine Entsprechung in der Positionierung innerhalb der räumlichen Struktur der Produktion: Unten das ist konkret auch die Fabrikhalle, über die sich die Verwaltungsetagen erheben. In der Topographie des öffentlichen Raumes sind die Arbeiter an bestimmte Orte gebunden: Das Arbeiterviertel, Wohnungen des sozialen Wohnungsbaus, bestimmten Freizeiteinrichtungen wie das Fußballstation etc. Diese habituelle und gesellschaftlich konstituierte Gebundenheit läßt den Arbeiter selten aus seinem Verkehrskreis heraus und in gleichgestellten Kontak mit Angehörigen anderer sozialer Klassen treten. In der privaten Sphäre ist die Aneignungsmöglichkeit von Raum durch die finanziellen Ressourcen bestimmt: Arbeiterhaushalte sind, was Wohnfläche und Wohnungsausstattung betrifft, am häufigsten unterversorgt, Arbeiter wohnen in beengteren Verhältnissen. Neben diese spezifische Aneignungsmöglichkeit von Raum tritt die spezifische Aneignungsmöglichkeit von frei verfügbarer Lebenszeit. Die Ausgestaltung und das Maß dieser frei verfügbaren Zeit ist untrennbar gekoppelt an die Bedingungen der Lohnarbeit und dieses ''Reich des Notwendigen" strahlt aus auf die ''Freizeit". Die Arbeitsbedingungen sind gekennzeichnet durch einen Mangel an Autonomie und Selbstbestimmung, die körperliche Arbeit steht im Vordergrund und bringt Belastungen durch Lärm, Staub, Hitze etc. mit sich. Akkord und Schichtarbeit ist weitverbreitet und Arbeiterfrauen sind der Doppelbelastung von Berufstätigkeit und Haushalt ausgesetzt. Trotz aller Arbeitszeitverkürzung bleibt Zeit für Arbeiter und vor allem für Arbeiterfrauen eine knappe Ressource. Die Freizeit ist vor allem geprägt durch ein spezifisches Regenerationsbedürfnis, in dem die Wiederherstellung der Arbeitskraft einen deutlich höheren Stellenwert einnimmt als bei Angehörigen anderer Berufsgruppen. Diese Charakteristika der Arbeiterexistenz bleiben im wesentlichen bis in die 1970er Jahre hinein bestehen, auch wenn sich im ''Goldenen Zeitalter" die Lebensbedingungen der Arbeiter im Vergleich zur Vorkriegszeit deutlich verbessert haben. Auf der Folie dieser Lebensbedingungen lässt sich die Bedeutung der spezifischen Fernsehzuwendung der Arbeiter rekonstruieren. Fernsehen öffnet zum einen (medial) die Grenzen einer sozialen Klasse, in deren Lebenszusammenhang soziale Grenzen eine alltägliche Erfahrung darstellen und diese schwer zu überwinden sind. Fernsehen zeigt die Welt jenseits der eigenen Arbeiterexistenz und überwindet die Perspektive des ''unten", überwindet das Eingeschlossensein in den eigenen Verkehrskreis und den beschränkten (Erfahrungs)Horizont des Arbeiterviertels und der beengten Wohnung. Der Gebrauchswert von Fernsehen für Arbeiter ist so bedingt durch das Bedürfnis, wenn schon nicht die eigene soziale Lage überwinden zu können, so doch zumindest Anteil an der Welt jenseits der eigenen sozialen Grenzen zu nehmen. Der Gebrauchswert von Fernsehen ergibt sich dann aus seiner Eigenschaft als Medium, den Zugang zu Wissen zu ermöglichen und diese Eigenschaft gewinnt in Hinsicht auf den beschränkten Wissenszugang von Arbeitern eine klassenspezifische Relevanz. Via Bildschirm öffnet sich der Blick auf die Welt jenseits der eigenen sozialen Grenzen und ermöglicht damit die Kompensation von auch subjektiv so empfundenen Einschränkungen der Welterfahrung und Weltaneignung. Verbunden mit diesem Gebrauchswert und im Grunde auch nur für analytische Zwecke zu trennen ist zum anderen der Gebrauchswert des Fernsehens für Arbeiter im Kontext ihrer spezifischen Regenerationsbedürfnisse. Die soziale relevanten Eigenschaften des Fernsehens wie die Plazierung innerhalb der privaten Sphäre der Wohnung, die Verfügbarkeit und die geringen Kosten ergänzen sich durch den ''Fluß der Bil der" (Kracauer) und bieten so ein Medium, das ohne zusätzliche weitere Verausgabung wie Ortswechsel oder soziokulturelle Anstrengungen nach den Belastungen der Produktionsarbeit Entspannung und Erholung bietet. Als Äquivalent zu passiven Tätigkeiten auf niedrigem Aktivitätsniveau wie Dösen oder AusdemFensterSchauen fügt es sich optimal in die Regenerationsbedürfnisse von Arbeitern innerhalb der ''Freizeit" ein. Und der kollektiven Erfahrung einer sozialen Lage, die zwischen Fabrik und Familie, zwischen Produktion und Reproduktion wenig Spielraum für Weltaneignung lässt, entspricht die Zuwendung zu den Produkten der Kulturindustrie, die den Glanz einer vielfältigeren Welt jenseits von Betriebstoren und Wohnküchen anbieten. Arbeiter lassen sich kaum für sogenannte ''Arbeiterfilme" begeistern, die Verdoppelung ihrer tagtäglich erlebten Erfahrungswelt auf dem Bildschirm hat für sie keinen Gebrauchswert. Dem entspricht vielmehr, was schon Hofmannsthal über das Kino der Stummfilmzeit schrieb: Die Suche nach Lebensessenz, nach Bildern, die einem das Leben schuldig bleibt. Für die Angehörigen der sozialen Klasse der Arbeiter lassen sich die Gebrauchswerte von Fernsehen in Bezug auf das Mediennutzungsschema als zu dem kompensatorischen Pol hinneigen interpretieren. Was die soziale Lage und die ihr eingschriebenen sozialen Grenzen an Handlungsmöglichkeiten mindert, erfährt virtuelle Kompensation durch das Medium. Auf diesem Hintergrund wird auch verständlich, warum geht die Frage nach den Auswirkungen dieser spezifischen Fernsehzuwendung durch Arbeiter all das rezipierte Wissen z.B. über die Praktiken der Angehörigen anderer sozialer Klassen sich nicht in den Praktiken der Arbeiter niederschlagen. Denn dieses Wissen, dessen Gebrauchswert aus einer anderen sozialen Realität mit anderen Bedürfnissystemen entspringt, macht innerhalb der klassenspezifischen Handlungsmöglichkeiten der Arbeiter und ihrer Bedürfnissysteme schlicht keinen Sinn der Handlungspol bleibt sozusagen blockiert. Der Arbeiterhabitus bleibt wie empirische Studien aus den 1960er Jahren zeigen auch angesichts eines wachsenden, bis dahin nicht gekannten Wohlstandes des ''Goldenen Zeitalters" und auch angesichts der Rezeption von FernsehWissen, wie zu ergänzen ist, bestehen. Die These von der ''Verbürgerlichung der Arbeiterklasse", auch unter dem Einfluss des Fernsehens wie sie in den 1960er Jahren formuliert wurde, war nicht haltbar, von einer Verbürgerlichung im Sinne der Übernahme von Werten, Praktiken und Einstellungen der Mittelklasse konnte keine Rede sein. Arbeiter gingen auch nicht auf in einer großen Masse der Lohnabhängigen, sondern blieben eine unterscheidbare Großgruppe innerhalb einer Gesellschaft, die sehr wohl soziale Unterschiede kannte und von einer ''Nivellierten Gesellschaft" noch weit entfernt war und ist. Allerdings aber setzte zeitgleich mit der Verbreitung des Fernsehens ein Prozess der Privatisierung der Arbeiter ein, der sich im Rückzug auf die private Sphäre das Heim und die Familie äußerte und in der wesentliche Kompensationsmöglichkeiten für die Zumutungen aus der Arbeitswelt gesucht als auch wesentliche Identitätsbedürfnisse in diese Sphäre verlagert wurden. Diese Bindung des Arbeiters an das Heim ist nicht zuletzt den sozial relevanten Eigenschaften des Mediums Fernsehen zuzuschreiben, das innerhalb der ''eigenen vier Wände" die oben angeführten Gebrauchswertansprüche erfüllte. Das Wohnzimmer in den Arbeiterhaushalten und der darin zentral plazierte Fernsehapparat sind ein Symbol für diese neue Privatheit, die durch die Auflösung ehemals proletarischer Wohn und Nachbarschaftsverhältnisse bestärkt wird. Innerhalb dieser privaten Sphäre öffnen sich auch die relativ autonomen Handlungsmöglichkeiten des Arbeiters lassen sich Gebrauchswertansprüche an das Fernsehwissen der handlungsorientierten Funktion zuschreiben in den Bereichen des Körpers, des Konsums, der Familie und ihnen entspricht die Rezeption populärer Sendung vom Sport über Heimwerkertipps bis hin zur Darstellung menschlicher Schicksale. Von einer ideologischen Intergration der Arbeiter durch Fernsehen kann, zumindest was den Habitus anbetrifft, nicht gesprochen werden. Arbeiter bleiben Arbeiter und übernehmen nicht die Werte und Praktiken der Mittelklassen. Die medienzentrierte und ideologiethematisierende Sicht etwa des materialistischen Ansatzes als auch der frühen cultural studies aber auch die Thesen von einer ''nivellierenden" Wirkung des Fernsehens unterschätzen die Macht materieller Strukturen. Für die Integration der sozialen Klasse der Arbeiter in die Nachkriegsgesellschaft spielen die materiellen Verbesserungen der Lebensverhältnisse im ''goldenen Zeitalter" des Klassenkompromisses (relative Vollbeschäftigung über längere Zeiträume hinweg, erhöhtes Lohnniveau über der Schwelle der Existenzerhaltung, soziale Absicherung, schließlich vermehrte Bildungschancen etc.) eine ungleich größere Rolle als die ideologische Integration durch Massenmedien wie dem Fernsehen. Die Dominanz der materiellen Strukturen zeigt auch der Vergleich der möglichen Auswirkungen der Umwälzung des WissensZuganges durch Fernsehen in den beiden deutschen Staaten. Gegeben, dass mit Meyrowitz und somit auch weitgehend unabhängig von den Inhalten, dem Fernsehen in der DDR und in der Bundesrepublik der gleiche Effekt in Bezug auf einen veränderten WissensZugang zuzuschreiben ist, entwickeln sich die Sozialstrukturen der beiden deutschen Staaten unterschiedlich. Während in der Bundesrepublik die Zahl der Arbeiter abnimmt und sich die soziale Klasse in Teilen modernisiert, zeichnet sich die Sozialstruktur der DDR durch einen nach wie vor hohen Anteil an Arbeitern aus. Die ''pluralistische Klassengesellschaft" der Bundesrepublik zeichnet sich gegenüber der ''blockierten Klassengesellschaft" der DDR durch einen ab den 1960er Jahren stattfindenden Modernisierungsprozess bzw. der ''Öffnung des sozialen Raumes" aus. Diese Öffnung des sozialen Raumes meint u.a. auch eine Modernisierung der Erwerbsstruktur, in dessen Verlauf Berufe zunehmen, zu deren Ausübung ein vermehrter Erwerb von Bildung bzw. kulturellem Kapital erforderlich ist. Von den neuen Bildungs und Berufschancen profitieren vor allem die Kinder der (Fach)Arbeiter und unteren Angestellten. Während in der Bundesrepublik durch die Öffnung des sozialen Raumes Handlungsmöglichkeiten entstehen, in denen das FernsehWissen in kulturelles Kapital gewandelt werden konnte, ist die Sozialstruktur der DDR dadurch gekennzeichnet, dass aufgrund des unterbliebenen Modernisierungsprozesses die Entwicklung hin zu modernisierten Fraktionen der einzelnen Klassen und zu einer modernisierten Mitte unterblieb. FernsehWissen blieb somit aufgrund fehlender Handlungsmöglichkeiten auf der materiellen Ebene ohne Bedeutung. Während in der Bundesrepublik sich Kinder aus Arbeiterhaushalten durch Wechsel in andere Berufspositionen auch in andere Positionen des sozialen Raumes begeben konnten, die soziale Klasse der Arbeiter rein zahlenmäßig schrumpfte und sich in Teilen modernisierte und sich das Fernseh-Wissen sozialstrukturell als prinzipielle Unterstützung dieses Bildungsaufstieges niederschlagen konnte, blieb in der DDR die soziale Klasse der Arbeiter bzw. der Anteil der Bevölkerung mit Arbeiterhabitus als Indikator für eine blockierte Klassengesellschaft vergleichsweise groß. Die Auswirkungen von FernsehWissen zeigen sich somit abhängig von der Eröffnung von Handlungsmöglichkeiten auf der materiellen Ebene hier: die Öffnung des sozialen Raumes in der Bundesrepublik seit den 1960er Jahren und lassen sich als eine Verstärkung von Entwicklungstendenzen des sozialstrukturellen Wandels interpretieren.
Schemaevolution in objektorientierten Datenbanksystemen auf der Basis von Versionierungskonzepten
(2000)
Gegenstand dieses Kapitels ist zunächst die Zusammenfassung der in dieser Arbeit erreichten Ergebnisse im Hinblick auf die ursprüngliche Zielsetzung, also die Unterstützung von Schema evolution in objektorientierten Datenbanksystemen. Anschließend folgen Überlegungen, welche der erzielten Ergebnisse zur Lösung von Problemen in anderen Arbeitsbereichen herangezogen werden können und auf welche Weise dies geschehen kann. Die Arbeit schlie?t mit einem Ausblick auf weitere Arbeiten im von uns bearbeiteten Themengebiet. Erreichte Ziele Ausgangspunkt unserer Arbeit war die Beobachtung, dass die Evolution von Datenbankschema ta, welche zur Anpassung an sich ändernde funktionale und nichtfunktionale Anforderungen 130 der Diskurswelt benötigt wird, durch die gegenwärtig verfügbaren Modelle und Systeme nicht adäquat unterstützt wird. Wir stellten daraufhin die Hypothese auf, dass ein Modell auf der Basis der Versionierung von Schemata mit einer entsprechenden Abbildung der Änderungen auf die Objektebene dies leisten kann. Wir konnten in dieser Abhandlung zeigen, dass das nach diesen Gesichtspunkten entworfene COASTModell die daran gestellten Erwartungen erfüllt und Sche maänderungen in Gegenwart existierender Objekte und Applikationen erfolgreich realisierbar sind. Die einzelnen Arbeitsschritte und Ergebnisse ergaben sich dabei wie folgt: - Problemanalyse und grober Modellentwurf: Die Notwendigkeit einer Unterstützung für Schemaevolutionsprozesse ergab sich aus der Beobachtung, dass vor allem moderne An wendungsbereiche eine flexible Anpassung an ständig veränderliche Umstände erfordern. Während des Betriebs einer Datenbank aufkommende Änderungsanforderungen lassen sich zur Entwurfszeit nicht vorhersehen und sind im Rahmen fest vorgegebener Datenbanksche mata nur schwerlich adäquat umsetzbar. Wir konnten in diesem Zusammenhang bei den vorhandenen Systemen zur Unterstützung der Schemaevolution das Fehlen einer Berück sichtigung im Betrieb beøndlicher Datenbankapplikationen feststellen. Gleichzeitig blieben Anforderungen an flexibel koppelbare Datenbankzustände für verschiedene Schemaausprä gungen bisher unberücksichtigt. Das an dieser Stelle grob skizzierte Modell zur Lösung des Problems beruhte folgerichtig auf dem Einsatz von Versionierungskonzepten auf der Ebene der Datenbankschemata. Solche Versionierungskonzepte hatten ihre Fähigkeiten zur Unterstützung von Evolutionsprozessen insbesondere auch im Zusammenhang mit Entwurfsaufgaben bereits zuvor sowohl auf der Ebene kompletter Datenbanken als auch auf der einzelner Objekte nachgewiesen. - Untersuchung bestehender Lösungsansätze: Wir konnten für das Lösungsmodell vier ele mentare Aspekte identiøzieren: Durchführung von Änderungen auf Schemaebene unter Verwendung von Versionierungskonzepten, Erzeugung und Verwaltung der Abhängigkeits beziehungen zwischen den Schemaversionen, Abbildung der Änderungen auf die Objekt ebene sowie flexible Konzepte zur Steuerung und Durchführung der Objektpropagation. Da kein Modell existierte, das all diese Punkte berücksichtigt, mussten wir uns in der Literatur recherche auf Ansätze beschränken, die sich mit einzelnen Aspekten unserer Aufgabenstel lung befassen. Aus dieser Perspektive stellt sich unser Modell zu einem Teil als Integration früherer Arbeiten dar. Zum anderen Teil beruht unser Modell in den grundlegenden Aspek ten der Behandlung von Ableitungsbeziehungen sowie der Steuerung und Durchführung der Objektpropagation auf gänzlich neuen Ansätzen. Die wesentliche Erkenntnis dieses Arbeitsschrittes ist somit die Feststellung, dass einerseits verschiedene Konzepte bestehen der Ansätze übernommen werden konnten, obwohl keine Arbeit alle Anforderungen an unser Modell erfüllte, und andererseits einige Aspekte bislang nahezu vollständig ignoriert wurden. - Detaillierte Modellbildung: Aufgrund der Erkenntnisse über bestehende Arbeiten entwarfen wir in diesem Arbeitsschritt COAST als Modell zur Durchführung von Schemaänderun gen in Anwesenheit von Objekten und Applikationen. Grundbestandteile unseres Ansatzes sind die Schemaversionen, die vergleichbar einer Konøgurationsverwaltung semantisch in Zusammenhang stehende Klassenversionen zu konsistenten Teilstrukturen zusammenset zen. Für die Durchführung von Schemaänderungen haben wir zwei grundsätzlich verschiedene Wege analysiert und resultierende Konsequenzen studiert. Dem internen Ansatz folgend wird eine von dem jeweiligen Einsatzgebiet des Systems unabhängige, fest vorgegebene und konzeptionell vollständige Taxonomie von Schemaänderungsprimitiven bereitgestellt, de ren Semantik a priori bekannt ist und demzufolge bei allen weiteren Schritten auf Schema und Objektebene berücksichtigt werden kann. Der externe Ansatz, als Alternative, erlaubt die Durchführung applikationsspezifischer Schemaänderungen und erhöht damit die Flexi bilität. Der Prozess des Einbringens extern erstellter Schemaversionen in das System kann dabei in vielfältiger Weise unterstützt werden. Bemerkenswerterweise fanden sich die auf Schemaebene angewandten Konzepte analog auf Instanzenebene wieder und zwar bei den Objektversionen, deren Zusammenhang sich in Form von Propagationsgraphen widerspiegelt ähnlich den Ableitungsbeziehungen auf Sche maebene. Die Steuerung der Objektpropagation sowohl zum Zeitpunkt der Schemaände rung als auch später, als Reaktion auf verändernde Datenbankzugrioee ist im behandelten Umfeld mit Sicherheit einzigartig. - Validierung des Modells: Aussagen zur Tauglichkeit des Modells im Hinblick auf seine Kon zeptionsziele konnten wir durch eine Evaluierung anhand unserer sehr detailliert beschrie benen Vorgaben erhalten. Damit ist gleichzeitig ein Vergleich mit bisherigen Lösungswegen insgesamt und mit einzelnen Vertretern davon gegeben. Die Evaluierung konnte in allen Aspekten belegen, dass das COASTModell zur Unterstützung von Schemaänderungen in Benutzung befindlicher Datenbanksysteme gut geeignet ist. Wir möchten an dieser Stelle nochmals betonen, dass COAST in vielerlei Hinsicht einfach erweitert werden kann und im Vergleich zu bisherigen Systemen durch erheblich flexiblere Möglichkeiten der Einflussnahme und eine verbesserte Tauglichkeit ausgezeichnet wird. Zu nächst sind sowohl die hier vorgestellte Schemaänderungstaxonomie als auch die damit ver bundene Propagationssprache vielfältig um komplexe Operationen erweiterbar. Weiterhin kann die Menge verwendbarer Propagationsflags insbesondere mit Blick auf das Verhalten bei komplexen Schemaänderungen hin ergänzt werden. Aber bereits die hier dargestell ten Möglichkeiten der Propagationssteuerung decken das gesamte Spektrum von isolierten Schemaversionen am einen Ende bis hin zur kompletten Propagation am anderen Ende ab. In Erweiterung der Konzepte auf der Basis von Sichtenmechanismen können durch die Objektversionierung beliebige Änderungen des Datenbankzustandes durchgeführt wer den. Damit wird ein erheblicher Beitrag für die Transparenz der Schemaevolution für die Applikationsentwickler geleistet. Die für die Tauglichkeit wichtigste Eigenschaft besteht zweifelsfrei in der Möglichkeit, be stehende Applikationen auch noch nach der Durchführung von Schemaänderungen ohne Anpassung weiterverwenden zu können. Damit erweitert sich der Einsatzbereich von Sche maänderungen auf sehr große, komponentenbasierte Systeme auf der Basis zahlreicher Einzelapplikationen. - Hinweise für den Datenbankentwurf: Um den Schemaversionierungmechanismus adäquat einsetzen zu können, erweisen sich Aussagen über den Schemaänderungsprozess als notwen dig. Daher haben wir diesen Prozess systematisch in Teilschritte zerlegt, die nacheinander betrachtet werden können. Bereits während der Modellbildung haben wir dort, wo sich ei nem Schemaentwickler Alternativen im Umgang mit COAST bieten, diese aufgezeigt und ihre jeweiligen Konsequenzen untersucht. Im Ergebnis resultiert für den Schemaentwick ler im Vergleich zu unversionierten Systemen ein zusätzlicher Spezifikationsaufwand. Dies ist jedoch für die Erreichung unserer Ziele unvermeidbar und der Gesamtaufwand für die Durchführung einer Schemaänderung reduziert sich dem Versionierungskonzept folgend er heblich, nicht zuletzt, weil aus der Sicht der Applikationsentwickler die volle Transparenz gewährleistet wird. - Realisierungsbetrachtungen: Um Erkenntnisse über den Realisierungsaufwand sowie die zu erwartenden Leistungsmerkmale zu erhalten, haben wir zweierlei Ansätze für eine pro totypische Realisierung untersucht. Zum einen haben wir einen Schemaversionierungsme chanismus als Aufsatz auf dem kommerziellen Objektdatenbanksystem O 2 implementiert. Auch wenn sich dies konzeptionell als möglich erwiesen hat, so haben sich dort an mehre ren Stellen erhebliche Einbußen bezüglich der Transparenz gezeigt [Wöh96]. Daher haben wir uns verstärkt mit dem zweiten, deutlich aufwendigeren Weg beschäftigt: die Eigenent wicklung eines kompletten, objektorientierten Datenbankmanagementsystems, bei dem die Konzepte von COAST transparent und von Anfang an im Kern integriert werden konnten. Die Realisierung der verzögerten Propagation kann bei realistischen Zugriffsprofilen mit einer gewissen Lokalität bezüglich der Schemaversionen größenordnungsmäßig mit unver sionierten Systemen vergleichbare Laufzeiten erreichen. Konzeptionell bedingt muss zwar ein größerer Platzbedarf als bei einem statischen System (ohne Schemaänderungen) in Kauf genommen werden. Im Vergleich zu anderen Konzepten der Schemaevolution, etwa den Ansätzen auf der Basis von isolierten Datenbanken oder mit materialisierten Sichten tritt aber kein Mehraufwand auf. In all diesen Varianten wird, ähnlich wie bei Puffern absichtlich Platz zugunsten einer erhöhten Zugriffsgeschwindigkeit investiert. Je ähnlicher sich verschiedene Schemaversionen sind und je intensiver die Propagation zwischen ihnen demnach ausfällt, desto besser sind die Voraussetzungen für platzsparende Mechanismen auf der Basis von mehreren Schemaversionen gemeinsam genutzter Objektversionen. In die sem Zusammenhang konnten wir eine Reihe von Verbesserungsmöglichkeiten identifizieren, die den COASTPrototyp Systemen auf der Basis von Sichtenmechanismen gleichstellen würden. Übertragbarkeit der Ergebnisse Die Tragfähigkeit der Konzepte des COASTModells für die Unterstützung evolutionärer Sche maänderungen haben wir erfolgreich belegen können. Im folgenden sprechen wir noch einige Möglichkeiten an, die in dieser Abhandlung gewonnenen Erkenntnisse auch im Zusammenhang mit anderen Konzepten einzusetzen. - Abschnitt 2.2 hatte allgemeine Versionierungskonzepte vorgestellt, wie sie typischerweise auf Objekte angewendet werden, um deren inhaltliche Evolution abzubilden. Wir haben dieselben Konzepte in der vorliegenden Arbeit auf Schemata als Instanzen der Metaebene angewendet, um deren evolutionäre Entwicklung zu unterstützen. Dabei hat sich die Ver wendung versionierter Datenbankobjekte ebenfalls als sehr hilfreich erwiesen. Die Versio nen eines Objektes bei der Schemaversionierung repräsentieren ein Objekt in verschiedenen Datentypen. Von Situationen abgesehen, in denen das Modifikationsflag abgeschaltet ist und Änderungen daher gewollt nicht propagiert werden, repräsentieren die Versionen eines Objektes denselben logischen Objektwert. Damit unterscheiden sich die hier verwendeten Objektversionen von denen der klassischen Objektversionierung. Letztere stellen nämlich verschiedene logische Objektwerte dar, die allerdings alle demselben Datentyp entsprechen. Die vorangegangene, vergleichende Betrachtung zeigt einerseits, dass die beiden Formen der Versionierung unterschiedliche Ziele verfolgen, und andererseits legt sie die Vermutung nahe, dass es sich um orthogonale und damit gewinnbringend kombinierbare Ansätze han delt. Verschiedene Typen zur Darstellung desselben logischen Objektwertes hier stehen verschiedenen Objektwerten desselben Typs dort gegenüber. Tatsächlich lässt sich unser Ansatz um Mechanismen zur Objektversionierung erweitern, indem jede unserer Objektversionen nun durch verschiedene klassische Objektversionen ersetzt wird. Damit entsteht ein zweidimensionaler Raum von Objektversionen: entlang der einen Dimension liegt jeweils ein logischer Objektwert in verschiedenen Typen, entlang der anderen Dimension liegen jeweils verschiedene logische Zustände eines Objektes, die durch denselben Typ repräsentiert werden. Um die Kombination der beiden Versionierungskonzepte zu erreichen, sind allerdings noch einige Fragen näher zu untersuchen. Diese beschäftigen sich beispielsweise mit dem Zu sammenhang zwischen den Objektversionen entlang der beiden Dimensionen und mit der Propagation versionierter Objekte. Hier ist beispielsweise zu klären, ob alle, oder wenn nicht welche der logischen Objektwerte eines Objektes in andere Schemaversionen zu pro pagieren sind. Schließlich bietet die Realisierung des integrierten Gesamtkonzeptes zahl reiche Ansatzpunkte für technische Optimierungen und erfordert diese auch, um sowohl den Zeitaufwand für die Propagation als auch den Platzbedarf für die Speicherung der zweidimensional versionierten Objekte zu reduzieren. - Wir waren in der Literaturrecherche auf das Sichtenkonzept als Grundlage zur Simulati on von Schemaänderungen eingegangen und hatten dabei einige Deøzite bei der Lösung der hier betrachteten Aufgabenstellung identiøziert. Dies impliziert jedoch keine Aussa ge über die Tragfähigkeit von Sichten in dem Umfeld, für das sie ursprünglich konzipiert worden waren. Aufgrund der mit COAST erzielten Transparenz, die eine Schemaversion nach außen hin wie ein Schema eines unversionierten Systems erscheinen läßt, kann ein Sichtenkonzept auf dem COASTModell aufgesetzt werden. Konzeptionelle Schwierigkei ten sind durch die Kombination von Sichten und Schemaversionen nicht zu erwarten: Beim Ableiten neuer Schemaversionen können auf den Vorgängern definierte Sichten bei Bedarf mitintegriert werden und das Anlegen, Ändern und Löschen von Sichten kann durch die Primitive des Sichtenmechanismus erfolgen. In einem beide Konzepte integrierenden System kann entsprechend der gestellten Anforderungen entschieden werden, ob diese besser durch Anlegen einer neuen Sicht oder durch Ableiten einer neuen Schemaversion erfüllt werden. - Einen Schritt über die Integration eines separaten Sichtensystems hinaus geht die Über legung, ob Sichten nicht sogar durch Schemaversionen simuliert werden können. Damit wäre dann auch eine vollständig homogene Integration beider Konzepte in einem System erreicht. Um diese Überlegung zu verfolgen, betrachten wir die konzeptionellen Kompo nenten eines Sichtensystems und analysieren kurz, wie diese auf die Konzepte von COAST abgebildet werden können. Die für den Schemaentwickler zu verwendende Schnittstelle eines Sichtensystems ist durch die Sichtendefinitionssprache gegeben. Die dort zur Verfügung stehenden Konstrukte die nen zunächst der Definition des Sichtschemas und sind insoweit durch die Primitive der COASTODL abgedeckt. Darüber hinaus bestimmt eine Sichtendefinition die Extension der Sichtklassen durch Angabe je einer Anfrage, wobei das Ergebnis dieser Anfrage dem Schema der definierten Sichtklasse entsprechen muss bzw. dieses implizit erst bestimmt. Um diesen Teil eines Sichtenkonzeptes zu simulieren, sind in COAST zwei Erweiterungen not wendig. Zum einen wird eine Anfragesprache benötigt. Diese wäre für die Vervollständigung von COAST sowieso erforderlich und könnte sich konzeptionell sehr stark an bestehenden objektorientierten Anfragesprachen orientieren. Ein Anfragesystem muss zu jeder Anfrage zunächst das Schema ihres Resultates ermitteln und dieses könnte dann mit den Primiti ven der COASTODL erstellt werden. Daraufhin muss das Anfragesystem die eigentliche Durchführung der Anfrage auf der Datenbank erledigen. Dies beschreibt gleichzeitig die zweite in COAST erforderliche Erweiterung. Für die Durchführung der Anfrage und ins besondere der darin ggf. enthaltenen Selektion von Objekten müsste eine entsprechende Erweiterung der Propagationssprache von COAST vorgenommen werden. Änderungen von Objekten in Sichtklassen sind aufgrund des Sichtenänderungsproblems i.Allg. nicht durchführbar, da in der Sichtendefinitionssprache keine Möglichkeit besteht, die Auswirkungen einer solchen Änderung auf die Objekte des Basisschemas zu spezifi zieren. Daher bieten einige Konzepte Erweiterungen an, die man in COAST durch Ver wendung von Rückwärtskonvertierungsfunktionen bereits hat. Durch die Vorwärts und Rückwärtskonvertierungsfunktionen können beide Richtungen von Abbildungen zwischen (simuliertem) Basisschema und (simuliertem) Sichtschema sogar homogen durch dasselbe Konzept spezifiziert werden. Die Propagationsflags wären zur Simulation alle eingeschaltet und durch die Verwendung der verzögerten Propagationsmechanismen von COAST liefert die Simulation von Sich ten durch Schemaversionen zusätzlich ein optimiertes Konzept der Materialisierung von Sichten. - Das Konzept der direkten Schemaevolution hatte sich bei der Anwendung in dem hier beschriebenen Einsatzgebiet als zu restriktiv erwiesen. Nichtsdestotrotz kann die direkte Schemaevolution in Einzelfällen für die Durchführung von Schemaänderungen genügen, insbesondere solange noch keine Applikationen für eine Schemaversion implementiert sind. Folgerichtig können Situationen entstehen, wo selbst eingefrorene Schemaversionen noch in eingeschränktem Umfang änderbar wären, auch wenn dies i.Allg. nicht der Fall ist. Daher haben wir eine Kombination der direkten Schemaänderung mit dem Versionierungsansatz auf der Basis des Datenmodells von O 2 untersucht [FL96] (siehe Abschnitt 5.4.2). Dort konnten wir durch eine Klassiøkation der Schemaänderungsprimitive feststellen, ob den im Einzelfall gegebenen Umständen zufolge die Ableitung einer neuen Schemaversion erfor derlich ist oder nicht. Auf diesem Wege kann die Zahl entstehender Schemaversionen und damit auch der sich ergebende Verwaltungsaufwand reduziert werden. - Die in Datenbanksystemen benötigten Änderungsoperationen lassen sich drei elementaren Kategorien zuordnen:
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden konformationelle und strukturelle Eigenschaften Biomolekülen Hilfe NMRspektroskopischen und biochemischen Methoden, sowie Synthese Liganden untersucht. Kapitel wurde das Verhalten beiden Hauptkonformere des Dolastatin Gegenwart Tubulin untersucht. wurden sechs neuartige Dolastatin 10Derivate synthetisiert, welche TubulinPolymerisation unterschiedlich inhibieren. Das Protein Tubulin wurde sowohl die vitroBindungsstudien auch für NMR spektroskopischen Experimente isoliert. Verbindungen 35b repräsentieren jeweils und das transKonformer des Dolastatin 10, wobei erstere einen stärke inhibitorischen Effekt der TubulinPolymerisation das lineare Dolastatin Derivat zeigte. Daraus kann man schließen, cisKonformation Dola statin Inhibition der TubulinPolymerisation verantwortlich ist. Durch diese neue Erkenntnis können Dolastatin 10Derivate, welche dem cisKonformer Dolastatin entsprechen, synthetisiert werden und potentielle Krebstherapeutika Anwendung finden. einem zweiten Ansatz wurde das Nmarkierte lineare Dolastatin 10Derivat heteronuclearen zweidimensionalen NMRExperimenten in Gegenwart von DEAE MAPTubulin untersucht. Durch Bestimmung der Korrelationszeiten Konformer Verbindung Gegenwart DEAE und MAPTubulin den beiden Dimensionen gekoppelten 1 H 15 NHSQCSpektren konnte gezeigt werden, cisKonformer von schnellen Austausch gebundenen Form befindet. Gegenwart DEAETubulin stellt man einen erhöhten cisGehalt von fest, welcher auf eine schwache Bindung des Liganden hindeutet. Falle MAP Tubulins der Anteil cisKonformers von Vergleich freien Verbin dung nahezu unverändert. Durch erhöhte Korrelationszeit des cisKonformers Gegenwart von MAPTubulin kann man eine zusätzliche Wechselwirkung mit MAPs annehmen, welche eventuell Bindung betaUntereinheit des Tubulins verstärkt. Außerdem könnte die Wechselwirkung der MAPs mit dem Tubulin durch den Liganden gestört werden. Bei den entsprechenden Messungen mit Cmarkiertem Colchicin in Gegenwart DEAE und MAPTubulin konnte ebenfalls schneller Austausch Liganden gebundenen Form nachgewiesen werden. Hierbei wurde aber kein unterschiedliches Verhalten bei beiden TubulinSorten festgestellt. Die Bindungsstelle Colchicin betaUntereinheit Tubulins unterscheidet sich der Dola statin (Abb. 2.12). Deshalb kann man zusätzliche Wechselwirkungen MAPs ausschließen. Versuche zum Einsatz Vanadat Übergangszustandanalogon Phosphat Spaltreaktion des Hammerhead Ribozyms wurden in Kapitel beschrieben. Zunächst wurden experimentellen Rahmenbedingungen Komplexbildung Vanadat 1,2cisDiolen der Ribose einfachen Nucleosiden und Nucleotiden getestet. konnte gezeigt werden, daß freie Phosphatgruppen Komplexierung Vanadats dem 1,2cisDiol Ribose verhindern. Allerdings stört die Anwesenheit Phosphosäurediestern nicht gewünschte Komplexbildung. Diese Erkenntnisse wurden bei verschiedenen RNAKonstrukten Hammerhead Ribozyms berück sichtigt. Durch Einführung von desoxyRibose den 3'terminalen Nucleosiden konnte Komplexbildung Vanadat den Fällen beobachtet werden, denen erwarten war, wenn sich das Vanadat anstelle Phosphates nach dem A17 Hammerhead Ribozym befindet. konnte gezeigt werden, daß Vanadat Über gangszustandsanalogon Phosphat bei Spaltung Hammerhead Ribozyms gesetzt werden könnte. Bestimmung dreidimensionalen Struktur des Membranproteins Phospholamban CDCl 3 /CD 3 wurde Kapitel 4 beschrieben. Hierbei wurden homo nuclearen zweidimensionalen Spektren gewonnenen Abstandsinformationen NOE Daten Dihedralwinkel aus Kopplungskonstanten verwendet, die Struktur Phospholambans Lösung zu gewinnen. Phospholamban besteht aus zwei alphahelikalen Regionen (Val4Ser16 und Pro21Val49), die über einen betaturn (Typ verbunden sind. Die turnRegion weist eine hohe Flexibilität auf, welche wichtig seine biolo gische Wirkung sein könnte. So könnte hier Annäherung von Enzymen Proteinkinasen oder der ATPase erleichtert werden.
1. Die Membran des SR besitzt mehrere unterscheidbare Transportsysteme für organische und anorganische Anionen. Diese Transportsysteme lassen sich durch Anionenfluxmessungen mit der FilterassayMethode und durch Einzelkanalmessungen mit der Planarmembrantechnik charakterisieren. Der Vergleich der mit beiden Methoden ermittelten Daten ergibt, dass der 35 SO 4 2 Flux unter Standardbedingungen durch den als BCl (Big Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanal bewerkstelligt wird und eine Steigerung der Effluxrate im Vesikelfluxexperiment auf die zusätzliche Aktivierung des als SCl (Small Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanals zurückzuführen ist. 2. Neben Chlorid und Sulfat werden auch andere organische und anorganische Anionen wie Jodid, Pyrophosphat, Oxalat und Nukleotide transportiert. 3. Der stärkste Hemmstoff von 35 SO 4 2 und NukleotidTransport ist der PurinozeptorAntagonist Suramin mit einer I 50 von 0.91.16 µM. 4. Eine Stimulation des 35 SO 4 2 Transports kann durch die Kationen Calcium, Magnesium und Cholin erreicht werden. Ebenso wirken Hemmstoffe des RyR wie Ryanodin und Atractylosid stimulierend bzw. aktivierend. 5. 35 SO 4 2 Influx und Efflux werden durch Nukleotide unterschiedlich beeinflusst. Der Efflux wird in Abhängigkeit von Nukleotidbase, Anzahl der Phosphatreste und der Ladung gehemmt. Unter Magnesiumeinwirkung ist der Hemmeffekt verstärkt und auch das als nicht hydrolysierbar geltende ATP Analogon AMPPNP wirkt inhibierend. Der maximale 35 SO 4 2 Influx hingegen ist in Anwesenheit von ATP erhöht. Die ATPAnaloga AMPPNP und AMP PCP zeigen diesen stimulierenden Effekt nicht. 6. ATP und GTP werden in Anwesenheit von SRProtein schnell ab und umgebaut. Dieser Umbau lässt sich durch Magnesium und verschiedene Hemmstoffe des Anionenfluxes beeinflussen. 7. Der Eintransport von Nukleotiden in das Lumen des SR lässt sich durch Hemmstoffe des Anionenfluxes inhibieren. Die zusätzliche Hemmbarkeit durch Atractylosid, einen Inhibitor des mitochondrialen ATP/ADP Translokators (AAT), impliziert die Möglichkeit einer Beteiligung dieses Transportproteins am Nukleotidtransport. 8. Inhibitoren der Ca 2 ATPase hemmen auch den Anionenflux. Die Vermittlung des Anionentransports durch die Ca 2 ATPase selbst sowie die Hemmung des Ca 2 Eintransports aufgrund der Inhibition der Anionenkanäle sind ausgeschlossen. Vesikel mit rekonstituierter Ca 2 ATPase weisen keinen Anionen transport auf, obwohl der Ca 2 Eintransport durch Anionenkanalhemmstoffe wie Suramin, DIDS und PPANS inhibiert werden kann. 9. Beim Anionenflux eingesetzt zeigen Aktivatoren und Inhibitoren des Ca 2 ReleaseKanals gegenläufige Effekte. Der Ca 2 ReleaseKanal ist nicht der Vermittler des Anionentransports. Anionentransporter sind im RyRfreien longitudinalen SR ebenso häufig wie in den RyRreichen terminalen SR Zisternen.
Organisation und Steuerung des Treiberameisenverhaltens südostasiatischer Ponerinen der Gattung Leptogenys Treiberameisen zeichnen sich durch eine einzigartige Kombination aus Wanderverhalten (häufige Umzüge) und koordinierter Massenjagd (kollektive Raubzüge) aus. Obwohl allgemein angenommen wird, daß die Kommunikation dieser Ameisen zu einem bedeutenden Teil durch Spurpheromone erfolgt, sind bisher in den drei Unterfamilien Ecitoninae, Dorylinae und Aenictinae nur wenige Drüsen bekannt, die derartige Pheromone produzieren. Welche Rolle einzelne Pheromonkomponenten bei der Koordination des komplexen Schwarmverhaltens spielen, wurde bislang noch nicht untersucht. In der Gattung Leptogenys gibt es ein weites Spektrum verschiedener Ökotypen, u.a. auch Arten, die echtes Treiberameisenverhalten zeigen. Bei sieben malaiischen Leptogenys-Arten wurde die Koordination des kollektiven Verhaltens auf Basis der Kommunikation zwischen den Einzelindividuen untersucht. Bei allen Arten wurden mehrere Spurpheromone entdeckt, die in den Gift- und in den Pygidialdrüsen lokalisiert waren. Ökologisch verschiedene Arten wiesen Unterschiede im Kommunikationssystem auf. Die Koordination des Treiberameisenverhaltens von L. distinguenda wurde besonders ausführlich untersucht. Diese Art besitzt ein Mehr-Komponenten-Signalsystem, bei dem die einzelnen Pheromone multiple Funktionen erfüllen. Die Pygidialdrüse enthält eine Pheromonkomponente, die ca. 20 min lang gute Spurfolge bewirkt. Sie dient der Orientierung einzelner Individuen und damit dem Koloniezusammenhalt. Aufgrund konzentrationsabhängiger Spurfolge und durch Modulation der Spurkonzentration kann eine langsame Rekrutierung auf neues Territorium mit diesem Pheromon koordiniert werden. Die Giftdrüse enthält zwei Pheromone. Eine sehr flüchtige Substanz (4-Methyl-3-Heptanon) bewirkt nur 1-2 min lang eine außerordentlich starke Attraktion sowie Erregung, Beschleunigung der Fortbewegung und Aggressivität. Mit dieser Komponente werden Beuterekrutierungen koordiniert. Die starke Wirkung kann das Verhalten zahlreicher Tiere und auf diese Weise sogar die Vorstoßrichtung ganzer Raubzüge beeinflussen. Aufgrund der extremen Flüchtigkeit des Pheromons ist dieser Einfluß jedoch nur momentan, so daß die Raubzugformation außerordentlich dynamisch ist. Eine zweite Komponente der Giftdrüse bewirkt bis zu 5 min lang gute Spurfolge ohne Erregung. Diese Substanz dient ebenfalls dem Koloniezusammenhalt. In den chemischen Spuren können Komponenten gemischt und der Informationsgehalt dadurch variiert werden. Zudem reagieren einzelne Tiere je nach Motivation nur auf bestimmte Komponenten, was situationsspezifisches Verhalten ermöglicht. Beute eintragende Arbeiterinnen folgen selektiv einer Komponente der Pygidialdrüse und ignorieren Komponenten der Giftdrüse. Auf diese Weise steuern sie gezielt das Nest an. In ähnlicher Weise fungieren beim Nestumzug hoch konzentrierte Spuren aus Pygidialdrüsensekret als Leitlinie zum neuen Nest. Umziehende Tiere meiden zudem sehr empfindlich das Sekret der Giftdrüse. Auf diese Weise werden Raubzugspuren klar unterschieden und nicht betreten, so daß beide für Treiberameisen charakteristischen Verhaltensweisen synchron ausgeführt werden können. Der Nestumzug wird mit einem distinkten, mechanischen Signal ausgelöst. Im Notfall kann ein Umzug oder Raubzug mit einer spezifischen Alarmsubstanz aus der Mandibeldrüse abrupt beendet werden. Dies ist z.B. von Bedeutung, wenn sich artgleiche Kolonien begegnen. Das Kommunikationssytem von L. distinguenda zeigt, wie komplexes Verhalten mit einem minimalen Satz an Signalen koordiniert werden kann. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit reicht ein einziges Pheromon bei weitem nicht aus, um treiberameisentypisches Verhalten zu realisieren. Treiberameisen sind besonders reich an Myrmekophilen. Die Integration dieser Ameisengäste vor allem in das Kommunikationssystem ihrer Wirte wurde in der vorliegenden Arbeit ebenfalls untersucht. Dabei wurden unterschiedliche Strategien vorgefunden, mit denen Myrmekophile den häufigen Umzügen ihrer Wirtskolonie folgen. Ein Teil der Arten läßt sich von den Ameisen auf der Brut aufsitzend in das neue Nest tragen. Diese Arten reagieren i.d.R. nicht auf die Pheromonspuren der Ameisen. Ein anderer Teil ist in der Lage, den Pheromonspuren aktiv zu folgen. Diese Fähigkeit ist erstmalig bei einer Spinne (Gamasomorpha maschwitzi) nachgewiesen worden. Einen besonders bemerkenswerten Gast stellt die neu beschriebene Lungenschnecke Allopeas myrmecophilos dar. Sie sondert selektiv bei Kontakt mit L. distinguenda ein spezifisches Attraktionssekret ab, welches die Ameisen dazu veranlaßt, die Schnecke mit den Mandibeln aufzunehmen und ins Nest zu tragen. A. myrmecophilos ist der erste nachgewiesene Fall eines Myrmekophilen aus dem Stamm der Mollusken.
g/d TLymphozyten stellen beim Menschen ca. 15% der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten. Die physiologische Funktion der g/d TZellpopulation ist ungeklärt. Auf grund ihrer Akkumulation in mukosalen Oberflächen scheinen sie eine Komponente der ''ersten Verteidigungslinie" zu bilden. Das d TZell Rezeptor (TCR) Repertoire gesunder Erwachsener ist oligoklonal, streng individuenspezifisch und zeitlich stabil. Zudem besteht eine charakteristische Kompartimentierung, d.h. im Intestinum liegt ein anderes d TCRRepertoire vor als im peripheren Blut. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das intestinale d TCRRepertoire einer entwicklungsabhängi gen Dynamik unterliegt. Hierzu wurde die Diversität der antigenbindenden (CDR3) Domäne intestinaler dKettentranskripte von Feten, Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen mittels denaturierender PAGE und DNASequenzierung molekular biologisch analysiert. Unsere Studien dokumentieren, daß im Verlauf der Reifung vom Fetus zum adulten Individuum gravierende Veränderungen stattfinden. Das fetale d TCRRepertoire ist stark eingeschränkt und zeichnet sich durch niedrige Komplexität der dKettentrans kripte aus was darauf beruht, daß innerhalb der CDR3Domänen kaum matrizen unabhängige ''N"Nukleotide existieren und zudem homologieabhängige Rekombina tionsereignisse stattfinden. Die Tatsache, daß verschiedene Feten teilweise identi sche dKettentranskripte exprimieren kann jedoch nicht allein auf obige Mechanis men zurückgeführt werden. Somit bleibt unklar, ob das fetale d TCRRepertoire vorprogrammiert ist oder Selektionsprozessen unterliegt. Im Gegensatz zu Feten ist das d TCRRepertoire Neugeborener polyklonal. Wie bei Erwachsenen weisen die CDR3Domänen ihrer dKettentranskripte zahlreiche ''N"Nukleotide auf. Da das d TCRRepertoire bereits im Alter von 14 17 Jahren starke Einschränkungen seiner Diversität zeigt und mit demjenigen siebzigjähriger Personen vergleichbar ist wird angenommen, daß die klonalen Expansionen eine Folge kontinuierlicher Selektions prozesse darstellen, die z.B. durch HSP verwandte Eigenantigene vermittelt werden. Vergleichbar dem Intestinaltrakt bildet auch die Haut eine bedeutende Grenzfläche des Organismus zu seiner Umgebung. Möglicherweise spielen kutane g/d TZellen ebenfalls eine Rolle im Rahmen einer ''ersten Verteidigungslinie". Wir wiesen anhand gesunder Erwachsener nach, daß das kutane d TCRRepertoire analog zum Intesti num oligoklonal ist und sich signifikant vom peripheren d TCRRepertoire unter scheidet. Da in multiplen Hautbiopsien identische dKettentranskripte gefunden wer den, sind dominante g/d TZellklone offenbar weiträumig in der Haut verteilt. Weiterhin wurde untersucht, ob spezifisch aktivierte g/d TLymphozyten an der Patho genese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt sind. Im Fall der ange nommenen antigenvermittelten Aktivierung müßten klonale Expansionen einzelner g/d TZellpopulationen zu charakteristischen Verschiebungen des d TCRRepertoires innerhalb entzündlich veränderter Darmareale führen. Vergleichende Analysen der läsionalen und nichtläsionalen Darmabschnitte von M.CrohnPatienten lassen jedoch keine krankheitsassoziierten Repertoireverschiebungen erkennen. Vielmehr weisen entzündliche und nichtentzündliche Areale nahezu identische d TCRRepertoires auf. Da dies auch im Fall der bakteriell verursachten Divertikulitis gilt, werden g/d TLym phozyten vermutlich generell indirekt oder über TCRunabhängige Mechanismen (z.B. Zytokine) aktiviert. Alternativ wird eine Erkennung streßinduzierbarer Eigenanti gene durch intestinale g/d TZellen diskutiert. Beide Vorgänge würden zu keiner Beeinflussung des d TCRRepertoires führen und in Einklang mit den nachgewiese nen Expansionen einzelner weniger Rezeptorspezifitäten stehen. Da vermutlich auch die BLymphozyten der intestinalen Lamina propria an der ''ers ten Verteidigungslinie" beteiligt sind nahmen wir an, daß die Ig H Transkripte IgA bzw. IgM exprimierender BZellen ebenfalls Einschränkungen ihres Rezeptor Repertoires aufweisen. Wir fanden, daß die kleinen V H 5, V H 6 und V H 7Familien intestinaler B Zellen oligoklonale Expansionen zeigen, während das Repertoire der dominierenden V H Familien deutlich diverser ausfällt. Durch Subklonierung lassen sich jedoch bei sämtlichen VH Familien klonal verwandte IgATranskripte in weit voneinander ent fernten Darmabschnitten identifizieren. Zudem stellen ~ 75% aller Basensubstitutio nen stille Mutationen dar oder führen zum Ersatz durch Aminosäuren vergleichbarer Eigenschaften, was auf einen starken Selektionsdruck schließen läßt. Da kaum Hin weise auf Isotypwechsel vorliegen, stellen intestinale IgM und IgAImmunozyten ver mutlich divergente Zellinien dar. Das V H Repertoire peripherer BZellen ist stark limitiert, wobei kaum Überlappungen mit intestinalen IgVH Repertoires bestehen. Aufgrund der partiellen Einschränkung des V H Repertoires ist anzunehmen, daß Teile der humoralen Immunabwehr konservierte Antigene erkennen, wobei es sich im Gegensatz zu TZellen wahrscheinlich nicht um Eigenantigene, sondern um Oberflächenstrukturen symbiontischer Mikroorganismen handelt. Unsere Resultate zeigen, daß die Begrenzung des Rezeptor Repertoires ein Charak teristikum von B und TLymphozyten darstellt. Übereinstimmend hiermit wurden von anderen Arbeitsgruppen klonale Expansionen auch bei a/b TZellen nachgewiesen. Vermutlich wird die Expansion einzelner Zellklone durch permanente Wechselwirkun gen mit ''Schlüsselantigenen" induziert, wobei es sich um invariante Fremdantigene oder konservierte Eigenantigene handeln dürfte.
In der vorliegenden Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur des CaM/C20W Komplexes mit Hilfe von heteronuklearer, mehrdimensionaler NMRSpektroskopie ermittelt. Der stabile CaM/C20WKomplex mit einer Bindungskonstanten KD = 11 nM besteht aus dem Protein CaM und dem Peptid C20W. CaM, ein kleines, saures Protein (16,7 kDa), das in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und hantelförmig mit zwei Domänen aufgebaut ist, übermittelt die Signalwirkung von Calciumionen an eine Reihe von Zielenzymen. Durch die Bindung von CaM an die Plasmamembran Ca 2 ATPase wird das Calciumsignal wieder beendet. Das Peptid C20W entspricht dem Nterminalen Teil der CalmodulinBindungsdomäne der Ca 2 ATPase. Röntgenkleinwinkelstreu experimente an dem CaM/C20WKomplex führten zu der Vermutung, daß das Peptid C20W nur an die Cterminale Domäne von CaM bindet und damit einen unterschiedlichen Bindungsmodus im Gegensatz zu den bekannten Calmodulin bindenden Peptiden zeigt. Zur Strukturbestimmung des CaM/C20WKomplexes wurde eine Probe aus 13 C, 15 Nmarkiertem CaM und unmarkiertem C20W verwendet. Diese unterschiedliche Markierungsweise erlaubt die Unterscheidung beider Komponenten in den NMR Spektren. Für CaM wurden eine Serie von heteronuklearen, dreidimensionalen Tripelresonanzexperimente aufgenommen, die zunächst die Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats und dann auch der der Seitenketten erlaubte. Spezielle NMR Experimente wurden für die Zuordnung der neun Methionine durchgeführt, die bei der Bindung des Peptids eine wichtige Rolle spielen. Durch die Auswertung von NOESY Spektren wurden 1645 Abstandsrestraints für CaM ermittelt, die sich in 794 intraresiduale, 387 sequentielle, 311 mittelreichweitige und 153 langreichweitige restraints aufteilen. Durch die Bestimmung der Temperaturkoeffizienten der Amidprotonen konnten 52 Wasserstoffbrücken von CaM zugeordnet werden. Durch doppeltgefilterte, homonukleare Korrelationsexperimente, bei denen die Protonen resonanzen von 13 C, 15 Nmarkiertem CaM unterdrückt werden, konnten die Resonanzen des unmarkierten Peptids C20W zugeordnet werden. Es wurden 163 NOE restraints ermittelt, wobei 102 intraresidual, 32 sequentiell und 29 mittelreichweitig waren. Schließlich konnten mit Hilfe eines halbgefilterten NOESYExperiments 49 intermolekulare NOE's zwischen CaM und C20W zugeordnet werden. Außerdem wurden neben den Abstandsrestraints für CaM 129 Dihedralwinkelrestraints ermittelt. Die gesamte Zuordnung des CaM/C20WKomplexes wurde in der Datenbank BioMagResBank mit der Nummer 4284 abgelegt (http://www.bmrb.wisc.edu/). Die experimentell gewonnenen restraints wurden in einer MoleküldynamikRechnung mit einem simulated annealingProtokoll verwendet, wobei insgesamt 200 Strukturen berechnet wurden. Die 26 energieärmsten Strukturen wurden als repräsentativ ausgewählt und in der Brookhaven Protein Datenbank mit dem PDB IDCode 1CFF abgelegt (http://www.rcsb.org/). Die 26 Strukturen weisen für die Nterminale Domäne einen RMSDWert von 0.75 Å über die Proteinrückgratatome und für die Cterminale Domäne zusammen mit dem Peptid C20W einen RMSDWert von 0.53 Å über die Proteinrückgratatome auf. Die hohe Konvergenz der Strukturen und gute Werte bei der RamachandranStatistik (73.7% in den erlaubten Bereichen) sprechen für eine gute Qualität der ermittelten Strukturen. Die ermittelte Struktur des CaM/C20WKomplexes zeigte einen neuartigen Bindungsmodus des Peptids. C20W bindet nur an die Cterminale Domäne von CaM, die Nterminale Domäne ist nicht in der Bindung involviert. Diese Struktur steht damit im Gegensatz zu den bisher bekannten CaM/PeptidKomplexen, bei denen das Peptid von beiden Domänen gebunden wird und ein globulärer Komplex entsteht. Der Bindungsmodus des C20Ws wurde zum einen durch chemische Verschiebungs differenzen der Amidprotonen und der Methionine ermittelt. Zum anderen konnten ausgehend von C20W intermolekulare NOE's nur zur Cterminalen Domäne von CaM zugeordnet werden. Die Sekundärstruktur von CaM ändert sich durch die Bindung des Peptids kaum. Beide Domänen, die zueinander homolog sind, bestehen aus vier alphaHelices und einem kurzen antiparallelen betaFaltblatt. Verbunden sind beide Domänen durch eine flexiblen Linkerbereich, wobei die Domänen zueinander keine Orientierung zeigen, da keine NOE's zwischen den Domänen gefunden wurden. Der ungewöhnliche Bindungsmodus des Peptids C20W steht im Einklang mit der Tatsache, daß die Plasmamembran Ca 2 ATPase bereits durch die Cterminale Domäne von CaM aktiviert werden kann. Der CaM/C20WKomplex läßt sich daher als Schnappschuß auf dem Weg der vollständigen Aktivierung der Ca 2 ATPase durch CaM verstehen. Die Ergebnisse der NMRspektroskopischen Untersuchung des CaM/C20WKomplexes wurden in (1999) Biochemistry 38, 1232012332 veröffentlicht. Die Publikation ist im Anhang (Kapitel 6.9) beigefügt. Um die Orientierung der Domänen des CaM/C20WKomplexes zueinander zu untersuchen, sind weiterführende Experimente geplant. Hierzu sollen Messungen an einem CaM/C20WKomplex unternommen werden, der am NTerminus des Peptids einen paramagnetischen Marker trägt, wobei dipolare Kopplungen und Pseudo kontaktshifts ermittelt werden sollen. Weiterhin sind ähnliche Untersuchungen an einem CaM/C20WKomplex geplant, der am NTerminus von CaM einen paramagnetischen Marker trägt. Mit diesen Experimenten sollte es gelingen, die Frage der Domänen orientierung zu klären.
Das TumorSuppressorGen wt1 (Wilms Tumor Gen) kodiert ein ZinkFinger DNA bindendes Protein mit vorwiegend Transkriptionshemmenden Eigenschaften. Da wt1 Expression auch in leukämischen Blasten von Patienten mit akuten Leukämien nachgewiesen werden konnte, war das Ziel der Arbeit, das Expressionsmuster von wt1 mRNA in Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) mittels der PolymeraseKettenreaktion (PCR) zu untersuchen. Dabei war die Expressionsstärke visuell in negativ (), schwach positiv ( ), mittelgradig positiv ( ) und stark positiv ( ) zu unterteilen. Die Ergebnisse, in ausgesuchten Fällen durch eine kompetitive PCR validiert, sollten mit FABKlassifikation, Karyotyp, OberflächenmarkerExpression, Alter, Geschlecht und klinischem Verlauf verglichen werden, um eine Aussage über die Bedeutung der wt1 Expression für Prognose, Verlaufskontrolle und das Erkennen von Minimal Residual Disease (MRD) zu treffen. Es wurden insgesamt mehr als 500 Proben von Patienten (mononukleäre Zellen (MC) aus Knochenmark (KM) und peripherem Blut (PB)) untersucht. Davon wurden insgesamt 129 Patienten bei Erstdiagnose und 32 Patienten bei 1. Rezidiv untersucht. Bei 77 Patienten konnte die wt1 Expression im Verlauf untersucht werden. wt1 mRNA fand sich bei 124 von 161 (77%) der Patienten bei Erstdiagnose und 1.Rezidiv. Die wt1 Expression war unabhängig vom Alter, vorhergehendem myelodysplastischem Syndrom (MDS), Geschlecht und FABSubtyp mit Ausnahme einer signifikant niedrigeren wt1 Expressionshäufigkeit in FAB M5 Leukämien von nur 40% (P=0,0025). Es fand sich keine Korrelation zwischen wt1 mRNA Expressionsstärke und den durch den Karyotyp definierten prognostischen Gruppen. Die Ansprechrate auf Therapie war zwar umso höher, je niedriger die wt1 Expression lag; es fand sich jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den ExpressionsGruppen. Patienten mit hoher wt1 mRNA Expression ( , ) zeigten eine deutlich schlechtere Gesamt Überlebenswahrscheinlichkeit (OS) als solche mit niedriger Expression (, ). Das 3Jahres OS für alle neu diagnostizierten AMLPatienten lag bei 13% bei starker und 38% bei schwacher wt1 Expression (P=0,038); bei Patienten mit de novo AML bei 12% und 43% (P=0,014). Der Unterschied war bei der Patientengruppe unter 60 Jahren noch stärker ausgeprägt. Im Verlauf ließ sich bei allen Patienten, die eine komplette Remission (CR) erreichten, keine wt1 Transkripte mehr nachweisen. Bei Rezidiv trat in den meisten Fällen erneut erhöhte wt1 Expression auf. In einigen Fällen ging dies dem klinischen Befund eines Rezidivs voraus. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß wt1 von der Mehrzahl der AMLPatienten exprimiert wird und mittels PCR nachgewiesen werden kann, ein von Karyotyp und Alter unabhängiger prognostischer Faktor ist und sich mit Einschränkung zur Verlaufskontrolle und Detektion von MRD anbietet.
Das Applikationssystem Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein innovatives System für die Applikation von Pharmaka während elektrophysiologischer Experimente entwickelt und getestet. Das AchtkanalApplikationssystem eignet sich hervorragend für Experimente an Hirnschnitten und kann durch folgende Eigenschaften charakterisiert werden: - Das System ist durch die Verwendung von DruckluftVentilen nahezu frei von elektromagnetischen Störfeldern. - Aufgrund der geringen Dimensionen der Applikationspipette (Spitzendurchmesser = 250 µM) können gezielt unterschiedliche Regionen einer Zellkultur oder eines Hirnschnittes beeinflusst werden. - Die geringen Dimensionen des Systems ermöglichen einen kostengünstigen Betrieb, da nur kleine Mengen an Pharmaka benötigt werden. - Das System schaltet exakt und zuverlässig. Alle 8 Kanäle schalten in guter Übereinstimmung, und zwischen den einzelnen Kanälen kann dank eines zentralen Spülkanals akkurat und sicher gewechselt werden. - Mit dem System können Substanzen auf zwei Arten appliziert werden. Es besteht zum einen die Möglichkeit der sogenannten SpitzenApplikation. Die SpitzenApplikation eignet sich besonders für Experimente an Zellkulturen, isolierten Zellen oder Membranstücken, und zeichnet sich bei dieser Art der Anwendung durch einen schnellen Konzentrationsaufbau (< 1 s) aus. Weiterhin können Substanzen mittels der sogenannten PulsApplikation appliziert werden. Die PulsApplikation bietet einerseits den Vorteil einer kontinuierlichen Applikation ohne Druckschwankungen, und ermöglicht andererseits die schnell aufeinanderfolgende Applikation mehrerer Substanzen. Demgemäß eignet sich die PulsApplikation hervorragend für Experimente an Hirnschnitten. Ionotrope GlutamatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war eine tiefergehende Beschreibung der ionotropen, nonNMDARezeptoren bei Neuronen der LSO des auditorischen Hirnstammes der Ratte. Im Vergleich hierzu wurden entsprechende Untersuchungen auch an MNTBNeuronen durchgeführt. Von besonderem Interesse war dabei der Nachweis funktioneller Kainat Rezeptoren. Im Gegensatz zu RNA oder ProteinNachweisen einzelner Rezeptor Untereinheiten wurden funktionelle Rezeptoren elektrophysiologisch, mit Hilfe der Patch ClampTechnik, charakterisiert. Mit Hilfe von spezifischen Agonisten, Antagonisten und Modulatoren konnten folgende Sachverhalte nachgewiesen werden: - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle AMPARezeptoren. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR2 ist Bestandteil von AMPARezeptoren bei LSONeuronen. - Funktionelle AMPARezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Abschnitt der Entwicklung ist die Größe der AMPA Rezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere. - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle KainatRezeptoren. - Im Hinblick auf die KainatRezeptoren gibt es jeweils zwei Klassen von LSO bzw. MNTBNeuronen. LSONeurone lassen sich in eine Klasse, die sich durch schnelle KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, und eine Klasse, die sich durch langsame KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, unterteilen. Den beiden Klassen liegen sehr wahrscheinlich unterschiedliche Rezeptordichten und / oder Unterschiede in der Untereinheitenzusammensetzung zugrunde. MNTBNeurone lassen sich in Zellen, die KainatRezeptoren besitzen, und Zellen, die diesen Typ von Rezeptor nicht besitzen, unterscheiden. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR5 ist Bestandteil von KainatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen. - Funktionelle KainatRezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Zeitraum ist die Größe der KainatRezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere.
Das Apolipoprotein (Apo) B100 ist der wesentliche Proteinbestandteil der Low Density Li poproteine (LDL). Es spielt als Ligand bei der rezeptorvermittelten Aufnahme der LDL aus dem zirkulierenden Blut in die Leber und andere periphere Gewebe eine wichtige Rolle. Erhöhte Plasmakonzentrationen der LDL gelten als unabhängiger Risikofaktor in der Genese der Koronaren Herzkrankheit (KHK). Eine gestörte Interaktion des LDLRezeptors mit seinem Liganden Apo B100 vermindert die Endozytose der im Blut befindlichen LDL und kann damit eine primäre Hyperlipoproteinämie (HLP) des Typ IIa verursachen. Die Rezeptorbindungsregion des Apo B100, dessen Primärstruktur 4536 Aminosäuren um fasst, ist im carboxyterminalen Bereich des Moleküls lokalisiert. Im Gegensatz zu einer Viel zahl bekannter LDLRezeptormutationen wurden lediglich drei Mutationen am Apo B100 bekannt, die als Auslöser der Typ IIa HLP in Frage kommen. Diese werden in der Literatur als Familiär Defektes Apo B100 (FDB) beschrieben. Bei allen drei FDBVarianten (FDB 3500Q , FDB 3500W , FDB 3531C ) liegen Punktmutationen innerhalb des Exons 26 des Apo B100 Gens vor. In der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, weitere, bisher unbekannte Punktmutationen am Apo B100, die als Ursache bindungsdefekter LDL in Frage kommen, zu finden und zu charakterisieren. Die zunächst durchgeführte Sequenzierung der genomischen DNA einer Pa tientin mit bindungsdefekten LDL, die negativ für FDB war, zeigte keine Abweichungen von der WildtypDNASequenz im Bereich der Rezeptorbindungsregion. Es wurde daraufhin eine genetische ScreeningStrategie für bindungsdefekte Apo B100 entwickelt, die für die Analyse größerer Probenmengen geeignet erschien. Hierzu wurden zunächst parallel zwei Verfahren, der singlestrand conformation polymorphism (SSCP) und die Temperatur Gradienten Gel E lektrophorese (TGGE) getestet. Letztere erwies sich als geeignete Methode. Ein Kollektiv von 297 Typ IIa HLPPatienten, deren LDLCholesterin > 1,55 g/L und Trigly zeridKonzentrationen <2,0 g/l waren, wurde zusammengestellt. Die Blutproben stammten von nicht miteinander verwandten, im Rhein/MainGebiet ansässigen Personen kaukasischer Abstammung. Ein DNA Bereich von 2,8 Kilobasenpaaren korrespondierend zu den Aminosäureresten 3131 3837 und 42694498 des Apo B100 wurde in einzelnen Abschnitten amplifiziert und mit He teroduplexTGGE analysiert. Es wurden neun Substitutionen identifiziert. Diese waren: FDB 3500Q , FDB 3500W , L3350L, Q3405E, R3611Q, I4287V, N4311S, A4454T, und T4457M. Bei 21 Personen (7,1%) wurde FDB 3500Q nachgewiesen. Dies entspricht nach Extrapolation auf die Gesamtbevölkerung einer Mutationshäufigkeit von 1,4% in unserer Region. Es konnte festgestellt werden, dass bei allen Merkmalsträgern die R3500Q Mutation mit einem einheitli chen Haplotypen kosegregiert, so dass eine stammesgeschichtliche Verwandtschaft der Muta tionsträger belegt ist. FDB 3500W wurde bei zwei HLPPatienten diagnostiziert. Dies war insofern überraschend, da diese Mutation zuvor lediglich bei einer Person kaukasischer Abstammung in Großbritannien gefunden worden war. Beide R3500W Mutationen waren mit unterschiedlichen, bisher unbe kannten Haplotypen assoziiert. LDL der beiden heterozygoten Merkmalsträger für FDB 3500W zeigten in einem an normalen humanen Fibroblasten durchgeführten Bindungsassay eine deut lich verminderte Rezeptorbindungsaffinität, jedoch lag diese etwas höher als die der LDL ei ner FDB 3500Q heterozygoten Person. Es ist daher anzunehmen, dass der Austausch eines Argi nins durch Tryptophan an Position 3500 einen geringeren Bindungsverlust der LDL bewirkt als der Austausch von Arginin zu Glutamin. Zwei der in der TGGE identifizierten Punktmutationen stellten bekannte Apo B100 Poly morphismen (MspI 3611 und N4311S) dar, eine weitere stille Mutation an Kodon L3350L wur de bei drei Personen festgestellt. Daneben fand sich ein Merkmalsträger mit einer Punktmuta tion an Kodon 4457 (T4457M). Zwei zuvor beschriebene Substitutionen, Q3405E und A4454T, traten mit einer Prävalenz von 1,3%, bzw. 6,4% im untersuchten Kollektiv auf. LDL eines heterozygoten Merkmalträgers für Q3405E hatten normale Bindungsaffinität an LDL Rezeptoren, zeigten jedoch eine signifikant erniedrigte Internalisation und Degradation im in vitroBindungstest. Schliesslich wurde eine bisher unbekannte Mutation des Apo B100 am Aminosäurerest I4287V, die mit einer Allelfrequenz von 1% im untersuchten Kollektiv auf trat, funktionell überprüft. Dabei zeigte sich sowohl im Fibroblasten Bindungsassay als auch in einem zweiten in vitroTestverfahren, dem U937 Zellen Wachstumsassay keine Assoziati on der I4287V Mutation mit bindungsdefekten LDL in der Familie einer heterozygoten Merkmalsträgerin. Eine funktionelle Relevanz dieses Aminosäureaustausches ist daher un wahrscheinlich. An einem Tryptophanrest an Position 4369 des Apo B100, der bei der Formation der dreidi mensionalen Struktur des Proteins mit Arginin 3500 interagiert, wurden Nukleotidveränderun gen zunächst durch gezielte Mutagenese des Kodon 4369 erzeugt, um sicherzustellen, dass diese Mutationen durch TGGE nachweisbar sind. Nachfolgend wurde bei den Typ IIa HLP Patienten nach Mutationen an dieser Position gesucht. Es konnte festgestellt werden, dass im untersuchten Kollektiv keine Punktmutationen am Aminosäurerest 4369 existierten. Die Vermutung, dass weitere klinisch relevante Apo B100 Mutationen mit einem dem FDB konformen Merkmalsbild bei Typ IIa HLPPatienten vorhanden sind, konnte nicht bestätigt werden. Andererseits wurde eine überraschend hohe Prävalenz (1:72) des FDB 3500Q im Rhein/Main Gebiet festgestellt. Aufgrund der gemeinsamen Abstammung aller Merkmalsträ ger und der hohen Mutationsfrequenz in dieser Region ist es denkbar, dass sich die vermutlich vor ca. 6000 Jahren datierte FounderMutation in diesem Teil Deutschlands ereignete. Da es offensichtlich auch, zwar seltener auftretende, Fälle des FDB 3500W in der hier untersuch ten Region gibt, sind AnalyseMethoden, wie etwa die TGGE, die sich als ein hochsensibles Nachweisverfahren multipler Punktmutationen erwies, bei der differentialdiagnostischen Ab klärung von Fettstoffwechselstörungen solchen Methoden vorzuziehen, die nur auf die Substi tution FDB 3500Q testen.