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Molecular signaling networks, organized in discrete subsets of proteins in space and time, represent the major principle by which the cell achieves its functional specificity and homeostasis. Complex network organization is preserved by numerous mechanisms, including sequestration of proteins into specific subcellular compartments (eg. organelles), post-translational modifications and most importantly by balanced timing of their biosynthesis and turnover. Two routes of protein degradation, which are fundamentally quite different, are proteasomal and lysosomal-mediated destruction. The latter not only governs degradation of molecules that passed through endocytic or secretory process (trafficking from plasma membrane or Golgi compartment), but also the degradation of cytoplasmic molecules that have been sequestered by a process called macroautophagy (henceforth autophagy). Recently our understanding of autophagic regulatory mechanisms has increased significantly, as molecular details of how autophagy contributes to the degradation of proteins (old, misfolded or aggregated), damaged organelles or pathogens have been deciphered. Initially described as bulk, nonspecific membrane sequestration process induced primarily by nutrient deprivation, autophagy is now known to be selective in terms of cargo recognition and integration into dynamic cellular membrane trafficking system.
My work has addressed the fundamental question of how small ubiquitin-like modifiers LC3/GABARAP, that are conjugated to the autophagic membranes, function within the process of cargo selection and crosstalk between autophagic and endocytic membrane trafficking events. We have employed an initial yeast twohybrid screen to identify LC3/GABARAP interacting partners. Using this technique, we have identified several novel autophagy receptor proteins, mitochondrial protein Nix (BNIP3L), and adaptor proteins, including Rab GTPase activating proteins (TBC family of proteins). Through a conserved LC3 interacting region (LIR), Nix, Rab GAPs and other autophagy adaptor/receptor molecules share a common mode of binding to LC3/GABARAP. However, in contrast to Nix, which specifically facilitates removal of mitochondria in maturing erythrocytes, Rab GAP proteins preferably regulate the dynamics of autophagosome formation and maturation as well as sorting of cargo. Fourteen out of 36 screened Rab GAPs interacted with LC3/GABARAPs. Importantly, identified Rab GAPs are clustered in different regulatory nodes according to the conservation of their GAP domain hence they impact various cellular membrane compartments and organelles, marked by specific subsets of small Rab GTPases. Identification of Rab GAPs that are directly involved in autophagy via binding to LC3 was the first report that clearly pointed to a broader implication of autophagy in all aspects of cellular membrane trafficking. Currently, only few of Rab GAPs are studied in context of autophagy regulation, while large number of them requires further functional characterization.
I have identified two LIR motifs in TBC1D5, Rab7 GAP. LIR1 has also the ability to interact with retromer complex subunit, Vps29. Using several functional assays I have shown that this motif, as well as catalytic Arg within GAP domain are particularly important for function of TBC1D5 in retrograde transport of CI-M6PR from endosomes to the trans-Golgi network (TGN). I have also shown that TBC1D5 binds to LC3 and Vps29 in mutually exclusive way and that Thr at the position 1 and Phe at position 5 of LIR1 motif are both required for TBC1D5 interaction with Vps29. Upon autophagy induction TBC1D5 dissociates from retromer, and associates with autophagic vesicles, while silencing of TBC1D5 significantly impairs autophagic flux. These findings led to the hypothesis that LIR interacting surface on TBC1D5 acts as molecular switch for dual function of TBC1D5. This also indicated that similar surfaces for LIR interaction (similarly to ubiquitin-like domains) are present on proteins other than LC3, and pointed to a dual functionality of the LIR sequence within both endocytic and autophagic pathways.
Following these initial studies, I have also shown that TBC1D5 interacts with AP2 complex subunit AP2M1, and that this interaction plays critical role in TBC1D5-dependent trafficking of Atg9. It is known that Atg9, the only trans-membrane autophagic protein, plays essential role in initiation of autophagy and growth of nascent phagophore membranes. However, machinery that specifically recruits Atg9 traffic carriers to the site of autophagosomes was not known. I subsequently demonstrated that TBC1D5 associates not only with LC3, but also with Atg9 traffic carriers and major initiatory kinase ULK1 during autophagy, while retromer failed to do so. Association of TBC1D5 with Atg9 was dependent on presence of AP2 complex, and on functional clathrin-mediated endocytosis (CME). Based on these and previous findings, model was proposed, that upon induction of autophagy TBC1D5 re-routes Atg9-containing clathrin vesicles from plasma membrane to the site of autophagosome. This led us to the better understanding of TBC1D5 function, but also to the first molecular cue that Atg9 traffics within clathrin-coated vesicles (CCVs). In fact, mutation of Leu-Leu motif within N terminus of Atg9, that potentially mediates interaction with adaptor protein complexes, led to enrichment of Atg9 on plasma membrane and in TGN. This suggested that the sorting motif could be important for interaction of Atg9 with AP2 and AP1 complex, as well. More importantly, TBC1D5 and Atg9 could be directly involved in dynamic regulation of growth factor receptor sorting during autophagy, thus explaining vital role of autophagy in organism development and pathogenesis.
In summary, the work contained within my thesis provides data on the mechanism by which autophagy adaptor proteins participate in cargo selection and regulation of trafficking during autophagy. Firstly, the LIR motif can target proteins or organelles for autophagic degradation (eg. Nix). Secondly, specific LIR motifs can play essential function in recruiting membrane trafficking regulatory proteins that subsequently facilitate phagophore expansion (eg. TBC1D5). Thirdly, by means of reorganization of different protein assemblies (eg. TBC1D5-VPS29 vs. TBC1D5-LC3-Atg9), dynamics of membrane remodeling mediated by Rab GTPases is kept in control during autophagy, thus keeping the organelle integrity and balance within cellular lipid sources unaffected.
In der vorliegenden Arbeit galt es, stabile, lumineszente, tetrakoordinierte Organoborane unter Verwendung eines Bor-funktionalisierten ditopen Grundbausteins und unterschiedlicher π- konjugierter Ligandensysteme zu synthetisieren. Die Bifunktionalität sollte die gleichzeitige Einführung von zwei Lewis-Basen erlauben, um eine mögliche elektronische Kommunikation oder einen Energietransfer zwischen den Chromophoren zu gewährleisten.
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Zusammenfassend war es möglich unter Einsatz eines Bor-haltigen Grundsystems (DBA) durch die Variation der chelatisierenden bzw. verbrückenden π-konjugierten Liganden stabile und effiziente Fluorophore mit nützlichen optischen Eigenschaften zu realisieren.
During the last decade of the 20th century, the field of mass spectrometry has seen a revolutionary change in its application and scope. The introduction of soft ionization methods for the analysis of biological molecules has expanded the area of mass spectrometry from its early roots in the analysis of inorganic and organic species into the fields of biology and medicine.
Today, the use of the mass spectrometry is extended to a wide range of applications in biotechnology and pharmaceutical industry, in geological, environmental and clinical research. In biochemistry, the principles of mass spectrometry are, however, broadly applicable in accurate molecular weight determination, reaction monitoring, amino acid sequencing, oligonucleotide sequencing and protein structure.
In order to carry out their biological activities, proteins interact most often to each other and form transient or stable complexes. In addition, some proteins specifically interact also with other proteins or with non-protein molecules, such as DNA, RNA or metabolites, these interactions being critical for their function. Hence, defining the composition of protein complexes, as well as understanding how protein complexes are assembled and regulated yield invaluable insights into protein function. Coupled with an isolation technique to purify a specific protein complex of interest, mass spectrometry can rapidly and reliably identify the components of complexes. In addition, quantitative MS techniques offer the possibility of studying dynamically regulated interactions....
Since Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are frequently dysregulated in different cancer entities and contribute to apoptosis resistance, pharmacological IAP antagonists are considered to be promising agents for the future development of cancer treatment strategies. IAP antagonists are small-molecule drugs that have been designed to mimic the interaction site of IAP proteins with their endogenous inhibitor Second mitochondrial activator of caspases (SMAC). Thus, they are frequently referred to as SMAC mimetics. Treatment with SMAC mimetics engages an apoptotic program in cancers by affecting different components of the apoptotic machinery. Besides disinhibition of caspases, SMAC mimetics trigger non-canonical nuclear factor-κB (NF-κB) signaling, which induces upregulation of tumor necrosis factor (TNF) α and other NF-κB target genes. In particular, TNFα production has been closely linked to the induction of SMAC mimetic-mediated cell death. The TNFα-dependent para/autocrine loop facilitates the formation of a cytosolic complex consisting of caspase-8, Fas-associated death domain (FADD) and Receptor-interacting protein (RIP) 1, which serves as caspase-8 activation platform and ultimately triggers induction of apoptosis. In the present study, we use the small-molecule bivalent SMAC mimetic BV6 to analyze SMAC-stimulated NF-κB signaling in cancer cell lines of different entities. Interestingly, we identify two novel NF-κB-regulated factors that are both required for SMAC mimetic-induced apoptosis in a context-dependent manner. First, we show that NF-κB-dependent upregulation of death receptor 5 (DR5) can serve as an alternative mechanism of BV6-mediated cell death. We demonstrate that BV6 treatment induces NF-κB-dependent but largely TNFα -independent apoptosis in A172 glioblastoma cells. By using an unbiased whole genome expression analysis approach, we identify DR5 as a critical NF-κB target gene, which substitutes TNFα and is indispensable for BV6-initated cell death in A172 cells. Second, we demonstrate that Interferon regulatory factor (IRF) 1 is required for BV6-induced TNFα production and apoptosis. Our study provides evidence that IRF1 closely cooperates with the NF-κB network in BV6-mediated cell death and additionally alters expression of selective SMAC mimetic-induced target genes. Furthermore, we show that BV6 treatment triggers secretion of a set of proinflammatory cytokines and increases attraction of monocytes to BV6-treated tumor cells in an IRF1-dependent manner. In summary, our work supports the notion that NF-κB-regulated factors are critically required for SMAC mimetic-initiated apoptosis. We show that IRF1 is indispensable for TNFα production and cell death in BV6-sensitive cell lines and that also DR5 can serve as a proapoptotic NF-κB-controlled factor in BV6-induced apoptosis besides TNFα. Furthermore, this study contributes to an improved understanding on non-apoptotic functions of SMAC mimetics, as IRF1 additionally influences expression levels of proinflammatory cytokines and attraction of immune cells. Thus, our work provides novel insights into the regulation of SMAC mimetic-induced signaling events, which is crucial for the translation of SMAC mimetics for use in clinical application.
In mitochondria, biogenesis of oxidase is a crucial process involving the participation of an array of assembly factors. Studying the process of biogenesis in eukaryotes is highly complicated due to the presence and partaking of two genetic systems. Employing a bacterial model such as Paracoccus denitrificans that utilizes only one genetic system enables easy studying of the assembly process. The aa3 cytochrome c oxidase of P. denitrificans shows high structural and functional homology to its mitochondrial counterpart despite its simple subunit composition. The assembly of the core subunits I and II that house the active redox centers (heme a, and heme a3.CuB centre in subunit I; and the binuclear CuA centre in subunit II) along with the chaperons responsibly for their incorporation form the crux of this work. This work concentrates particularly on CtaG, a chaperone previously speculated to be involved in the delivery of copper to the CuB center in subunit I. As the full length structure of CtaG or its structural homologues have not been solved, attempts were made to obtain high-diffracting crystals of CtaG by heterologously expressing it in E. coli. Growth media, expression strains and induction parameters were some of the conditions screened in order to obtain optimal yield. Additives, pH and detergent were screened to yield a homogeneous preparation of CtaG. Crystallization trials were conducted by employing the sitting drop, vapour diffusion, method and later the bicelles were employed. Preliminary crystals obtained were further optimized employing seeding, detergent and additives, to improve diffraction. The diffraction improved from 30 Å to 15 Å. BN PAGE (Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis) analysis and cross-linking studies were undertaken to decipher the oligomeric condition of CtaG. Both the methods indicate that the protein is a dimer under native conditions. To study the importance of CtaG in the process of oxidase assembly, two deletion mutants were obtained from the lab; one with only ctaG deleted and the other with ctaG and most of the upstream ORF. The effect of the deletion was assayed on the assembly and activity of oxidase. The deletion mutants showed residual activity of approx. 20 %, while displaying a very low heme signal (both in membranes and in purified COX). In order to exclude polar effects arising due to gene manipulation, complementation strains were prepared, reintroducing ctaG alone into both the deletion strains. Complementation strains, where only ctaG was deleted and re-introduced assayed for COX activity showed a restoration in activity to approx. 70 %. Further, calculating the heme:protein ratio, the deletion strains displayed a value of 7 nmol/mg of oxidase which was increased to wild type levels of 16 nmol/mg in the complementation strains. To further confirm the absence of the copper in subunit I, total reflection X-ray fluorescence spectroscopy analysis was carried out, which showed a decrease in the copper content in the deletion strain, restored on complementation. The strain lacking in the ORF and ctaG when complemented with ctaG alone illustrated no increase in activity or heme signal in comparison to that of the deletion strain. These point at a possible role for ORF in the assembly of COX, which is still absent in the complementation strains. To further characterize the ORF, a series of bioinformatical analysis was carried out, the results from which were insufficient to characterize the ORF conclusively. In order to enlist the proteins involved in the biosynthesis of COX, two independent approaches were employed. Two-dimensional gel examinations of solubilised membranes from untreated and cross-linked cells were analyzed by Western blotting. The CtaG-COX interaction was observed in untreated membranes, which was additionally strengthened by cross-linking. To further confirm this association, pull-down assays were done employing protein A coated magnetic beads coated with different antibodies and incubated with solubilised membranes derived from untreated or cross-linked cells. The elutions were assayed by Western blotting and confirmed for the CtaG-COX interaction. These fractions were further analysed by mass spectrometry to identify other chaperons involved in biogenesis of oxidase. Along with CtaG, I also noticed Sco, Surf1c and other factors involved in the recruitment and transport of heme (CtaB, CtaA, and Ccm proteins). Interestingly, protein components of both ribosomal subunits and protein translocation factors were observed, which indicated a co-translational approach for co-factor insertion into COX.
To overcome poor treatment response of pediatric high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL), novel treatment strategies are required to reactivate programmed cell death in this malignancy. Therefore, we take advantage of using small-molecule antagonists of Inhibitor of apoptosis (IAP) proteins, so called Smac mimetics such as BV6, which are described to overcome apoptosis resistance and thereby sensitize tumor cells for several apoptotic stimuli. To address the question whether redox alterations can sensitize leukemic cells for Smac mimetic-mediated cell death, we interfered with the cellular redox status in different ALL cell lines. Here, we show for the first time that redox alterations, mediated by the glutathione depleting agent Buthioninesulfoximine (BSO), prime ALL cells for BV6-induced apoptosis. Besides ALL cell lines, BV6/BSO cotreatment similarly synergizes in cell death induction in patient-derived primary leukemic samples. In contrast, the combination treatment does not exert any cytotoxicity against peripheral blood lymphocytes (PBLs) or mesenchymal stroma cells (MSCs) from healthy donors, suggesting some tumor selectivity of this treatment. We also identify the underlying molecular mechanism of the novel synergistic drug interaction of BSO and BV6. We demonstrate that both agents act in concert to increase reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation and finally apoptotic cell death. Enhanced ROS levels in the combination treatment account for cell death induction, since several ROS scavengers, like NAC, MnTBAP and Trolox attenuate BSO/BV6-induced apoptosis. BSO/BV6-induced ROS can be mainly classified as lipid peroxides, since the vitamin E derivate α-Tocopherol as well as Glutathione peroxidase 4 (GPX4), which both specifically reduce lipid-membrane peroxides, prevent lipid peroxidation, caspase activation and cell death induction. Vice versa, GPX4 knockdown and pharmacological inhibition of GPX4 by RSL3 or Erastin enhance BV6-induced cell death. Importantly, cell death induction critically depends on the formation of a complex consisting of RIP1/FADD/Caspase-8, since all complex components are required for ROS production, lipid peroxidation and cell death induction. Taken together, we demonstrate that BSO and BV6 cooperate to induce ROS production and lipid peroxidation which are eventually required for caspase activation and cell death execution. Collectively, findings of this study indicate that BV6-induced apoptosis is mediated via redox alterations offering promising new treatment strategy to overcome apoptosis resistance in ALL.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis.
HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC.
Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development.
Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures.
HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo
In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
Azulen: Für die Orientierungsfehlordnung im Azulen werden mit Kraftfeld-Methoden sowie mit quantenmechanischen Methoden an einem Satz geordneter Kristallstrukturmodelle Gitterenergieminimierung durchgeführt. Die Modelle zeigen sehr ähnliche Gitterenergien. Keine signifikante Nahordnung ist zu erkennen. Es liegt eine statistische Orientierungsfehlordnung vor. Die Auslenkungsparameter in der experimentellen Kristallstruktur werden durch die Überlagerung der berechneten Atompositionen gut reproduziert.
Perinon-Pigmente P.R. 194, P.O. 43 und V.R. 14: Für das cis-Isomer (P.R. 194), das trans-Isomer (P.O. 43) und den Mischkristall (V.R. 14) der Perinone werden geordnete Kristallstrukturmodelle aufgestellt und Gitterenergieminimierung mit Kraftfeld-Methoden sowie quantenmechanischen Methoden durchgeführt.
In der Orientierungsfehlordnung von P.R. 194 zeigen sich kurze Korrelationsreichweiten für alle Richtungen. Die Lokalstruktur wird über Variationen der exakten Positionen und Orientierungen der Moleküle beschrieben. Die experimentellen Auslenkungsparameter werden durch Überlagerung berechneter Atompositionen reproduziert.
Für trans-Perinon sind keine Hinweise auf eine Fehlordnung zu erkennen.
Im Mischkristall der beiden Isomere (Küpenfarbstoff V.R. 14) liegen eine Positions- und eine Orientierungsfehlordnung vor. Quantenmechanische Gitterenergieoptimierungen zeigen zwei Bandbreiten der Gitterenergie für geordnete Kristallstrukturmodelle, getrennt anhand der Orientierung der Moleküle des trans-Isomers. Die ungewöhnlichen experimentellen Auslenkungsparameter und Positionen der Atome werden ebenfalls durch die Überlagerung berechneter Atompositionen gut reproduziert.
Die Nachbarschaftswahrscheinlichkeiten werden über eine statistische Auswertung der Häufigkeiten einzelner Nachbarschaften genähert beschrieben und zeigen stark anisotrope Präferenzen. Die intermolekularen Wechselwirkungen werden mit Kraftfeldmethoden qualitativ charakterisiert und zeigen eine zu den Nachbarschaftswahrscheinlichkeiten sehr ähnliche Anisotropie.
PTCBI: Im cis-Isomer von PTCBI beobachtet man eine dem P.R. 194 ähnliche Orientierungsfehlordnung. Anhand der Ergebnisse der Gitterenergieminimierungen wird eine statistische Fehlordnung angenommen.
Für das trans-Isomer von PTCBI findet man durch Gitterenergieminimierungen ein theoretisches energetisch ungünstiges Polymorph in der Raumgruppe P 21/c.
Für den PTCBI-Mischkristall wird aus der Auswertung von Röntgenpulverdiagrammen eine zum cis-Isomer isotype Struktur abgeleitet. Für diese Struktur wird eine dem V.R. 14 ähnliche Positions- und Orientierungsfehlordnung untersucht. In der statistischen Auswertung der Gitterenergien zeigen alle Modelle vergleichbare und gleichzeitig sehr niedrige relative Wahrscheinlichkeiten. Für die Lokalstruktur sind keine klaren Präferenzen für bestimmte Motive erkennbar. Im PTCBI-Mischkristall wird eine nahezu statistische Fehlordnung erwartet. Die Wechselwirkungen der geordneten zentralen Kohlenstoffgerüste der Perylen-Tetracarbonsäure bestimmen die Packung in cis-PTCBI und im PTCBI-Mischkristall.
P.R. 170: Die Struktur der β-Phase von Pigment Rot 170 besteht aus geordneten Schichten. Die Komponente des Translationsvektors zwischen den Schichten in b-Richtung beträgt entweder ty = +0,421 oder ty = -0,421. Die Abfolge der Translationsvektoren ist weder periodisch noch völlig zufällig.
Gitterenergieminimierungen an kombinatorisch vollständigen Sätzen geordneter Modelle mit einem maßgeschneiderten Kraftfeld werden durchgeführt. Erhaltene Gitterenergien erlauben die Beschreibung der Lokalstruktur durch bevorzugte Stapelsequenzen. Darin beeinflussen die nächsten und übernächsten Nachbarn die Energie und die Geometrie einer einzelnen Schicht.
Relative Wahrscheinlichkeiten (respektive der Entartungen) für endliche lokale Motive werden mit der Boltzmann-Statistik berechnet. So tritt das Motiv + + − mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 61,4% auf, während das Motiv − + − mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 23,3% wesentlich seltener erscheint. Das Motiv + + + ist mit der Wahrscheinlichkeit von ca. 15,3% am seltensten. Mit diesen relativen Wahrscheinlichkeiten werden Strukturmodelle in Superzellen mit bis zu 100 aufeinanderfolgenden Schichten aufgebaut und zur Simulation der Röntgenbeugungsdaten verwendet. Damit werden Pulver- wie Einkristalldaten gut reproduziert, inklusive der diffusen Streuung.
Septulen: Für Septulen werden Unterschiede in der Konformation der Moleküle zwischen der Gasphase und dem Festkörper beobachtet. Berechnungen der Einzelmolekülenergien sowie Gitterenergieminimierungen werden mit rigiden sowie flexiblen Molekülen für beide Konformationen durchgeführt. Die Konformationsänderung zwischen Gasphase und Festkörper bedeutet einen Verlust an Energie, welcher durch die günstigere Packung und durch den Gewinn an Gitterenergie wettgemacht wird. Ähnlich günstige Gitterenergien wurden für die Gasphasen-Konformation nicht gefunden.
In Reaktion auf zellulären Stress wie etwa Schädigungen der DNA oder die vermehrte Aktivität von Onkogenen aktivieren vorgeschaltete Signalkaskaden den Transkriptionsfaktor (TF) p53. Dieser kann über die Aktivierung der Expression von Zielgenen wiederum die Zellteilung stoppen, die Reparatur von DNA Schäden initiieren oder in schweren Fällen die Eliminierung der Zelle durch Apoptose einleiten. Ist p53 durch Mutationen deaktiviert, können sich entartete somatische Zellen vermehren und in der Folge Krebs entstehen.
In Wirbeltieren finden sich neben p53 mit p63 und p73 zwei weitere TFs, welche während der Evolution aus dem gleichen gemeinsamen Vorläufer durch Genduplikationen hervorgegangen sind. Die drei TFs sind modular aufgebaut und alle Isoformen verfügen jeweils minimal über eine DNA Bindungsdomäne (DBD) und eine Tetramerisierungsdomäne (TD). Werden die p53 ähnlichen TFs aktiviert, lagern sie sich über die TD vermittelt zu Tetrameren zusammen, wodurch ihre DBDs kooperativ an DNA Sequenzmotive binden können. Die DBD ist auch über große phylogenetische Abstände hinweg hoch konserviert, wodurch bereits gezeigt werden konnte, dass auch primitive vielzellige Tiere bereits Homologe dieser TF Familie besitzen. Im Vergleich zur DBD variiert die Proteinsequenz der TD deutlich stärker, was andeutet, dass deren Struktur im Laufe der Evolution erhebliche Veränderungen durchlaufen hat. Diese Veränderungen aufzuklären ist das übergeordnete Forschungsvorhaben zu dem diese Dissertationsschrift beiträgt.
Ciona intestinalis (C.int.) ist eine Spezies aus dem Unterstamm der Manteltiere. Diese sind die engsten lebenden Verwandten der Wirbeltiere und C.int. ist ein populärer Modelorganismus für die Erforschung der Embryonalentwicklung. Sein Genom kodiert für zwei p53 ähnliche TFs, welche mit p53/p73-a und p53/p73-b bezeichnet werden. Die Struktur ihrer TDs wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie untersucht.
Die TD von menschlichem p53 (hp53) ist ein Dimer aus Dimeren. Jedes Monomer formt einen beta-Strang und eine alpha-Helix. Im primären Dimer lagern diese sich so zusammen, dass ein beta-Faltblatt entsteht und die alpha-Helices mit entgegen gesetzter Orientierung der Länge nach aneinander packen. Zwei dieser Dimer lagern sich dann so zum Tetramer zusammen, dass zwischen pol-ständigen beta-Faltblättern ein Bündel aus vier Helices entsteht. Dieses Motiv ist auch in den TDs der Ciona Proteine hochkonserviert und wird im Folgenden als Kern?TD bezeichnet. In den TDs von menschlichem p63 und p73 (hp63 und hp73) verfügt jedes Monomer an seinem C-terminus noch über eine zweite Helix. Die zweiten Helices eines jeden Dimers greifen wie Klammern um das jeweils andere primäre Dimer und stabilisieren so das Tetramer. Entscheidend für die stabile Anbindung an die Kern?TD ist dabei ein charakteristisches Tyrosin-Arginin (YR) Motiv in der zweiten Helix, welches sich auch in der Sequenz der TD von C.int. p53/p73-a wiederfindet. Analysen der Sekundärstruktur auf Basis von NMR Experimenten ergaben jedoch, dass die TD von C.int. p53/p73-a bei 25°C keine zweite Helix ausbildet. Mit Hilfe von chimären TD Peptiden, in denen Teile der Ciona Sequenz gegen die entsprechenden Abschnitte von hp73 ausgetauscht wurden, konnte gezeigt werden, dass die Kern TD von C.int. p53/p73-a fähig ist eine zweite Helix zu stabilisieren und hierfür neben dem YR Motiv auch der Sequenzabschnitt zwischen erster und zweiter Helix entscheidend ist. Stabilisierende Substitutionen in diesem Bereich bewirkten ebenso wie ein Absenken der Temperatur die Ausbildung einer zweiten Helix, welche jedoch im Gegensatz zu jener in hp73 nur transient faltet und auch nicht essentiell für die Bildung des Tetramers ist, wohl aber dessen Stabilität erhöht.
Spezifisch in der Entwicklungslinie von Ciona kam es dazu, dass eine, für eine entsprechende Vorläuferversion von C.int. p53/p73-a kodierende, mRNA spontan zurück in DNA übersetzt und ins Genom eingefügt wurde. Die durch diese Retrotransposition erzeugte neue Genkopie C.int. p53/p73-b muss demnach ursprünglich einmal für die gleiche Proteinsequenz kodiert haben, innerhalb der TD finden sich konservierte Reste jedoch nur im Bereich der Kern TD.
Von der TD von C.int. p53/p73-b wurde die molekulare Struktur in freier Lösung mittels NMR ermittelt. Diese zeigte, dass interessanterweise in der TD von C.int. p53/p73-b jedes Monomer am C-terminus eine stabil gefaltete, zweite Helix besitzt. Obwohl diese zweite Helix sich aus einer Sequenz faltet, die keinerlei Sequenzhomologie zu homologen Proteinen aus Wirbeltieren aufweist, lagert sie sich in einer Position auf die Kern TD, welche der in hp73 sehr nahe kommt. Da die primären Dimere der Kern TD aber anders als in hp63 und hp73 durch Salzbrücken miteinander verbunden sind, ist die zweite Helix jedoch nicht essentiell, um das Tetramer zu stabilisieren. Vermutlich kommt der zweiten Helix von C.int. p53/p73-b vielmehr u.a. die Aufgabe zu die Bildung von Heterotetrameren aus C.int. p53/p73-a und –b zu unterbinden.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die Architektur der TD mit zweiter Helix bereits der Prototyp für die TDs aller p53 ähnlichen Proteine der Wirbel- und Manteltiere war und die als eine Art Klammer das Tetramer stabilisierende zweite Helix sich nicht erst während der Evolution der Wirbeltiere entwickelt hat.
Funktionalisierung mikro- und nanostrukturierter Oberflächen zur spezifischen Proteinimmobilisierung
(2014)
Die vollständige Sequenzierung des humanen Genoms zu Beginn dieses Jahrtausends leitete einen Boom der Genomik ein, in deren Anfangszeiten man sich jedoch vor einer großen Herausforderung sah. Aufgrund der selbst bei einfachen Organismen großen Anzahl kodierender Gene und auch vor dem Hintergrund ständig wachsender Datenbanken mit immer neuen vollständig sequenzierten Arten, stellten sich genetische Analysen mit klassischen Methoden als zu zeit- und kostenaufwändig heraus. Die Entwicklung sog. DNA-Chips – feste Substrate, die mehre zehn- bis hunderttausend verschiedene Oligonukleotide tragen und die parallele Durchführung einer großen Anzahl von genetischen Analysen in sehr kurzer Zeit bei vergleichsweise geringen Kosten erlaubten – lösten dieses Problem. Analog hierzu werden Protein-Chips ähnlich gute Erfolgsaussichten in der Proteomik beschieden. Der Aufbau eines Protein-Chips ist dem eines DNA-Chips sehr ähnlich, allerdings sind die Anforderungen, die für eine funktionale Immobilisierung von Proteinen an eine Substratoberfläche gestellt werden, ungleich höher. Es muss gewährleistet sein, dass durch die Verankerung auf dem Substrat die native Struktur der Proteine nicht zerstört wird, dass die immobilisierten Proteine in einer Orientierung vorliegen, in der wichtige Merkmale, wie Bindungsmotive, aktive Zentren usw. weiterhin zugänglich sind und dass unspezifische Proteinadsorptionen auf ein Minimum reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, ein Konzept für eine Protein-Chip-Plattform zu entwickeln, welches diese Voraussetzungen erfüllt.
Einleitend wird die Erarbeitung eines Assays zur Analyse einer Antikörper-Antigenwechselwirkung mittels Oberflächenplasmonresonanz-(SPR)-spektroskopie dargestellt. Da diese Technik ebenfalls eine native Immobilisierung von Proteinen auf einem festen Substrat erfordert, stellt sie eine Vorform der Protein-Chip-gestützten Analyse dar. Dem entsprechend werden an SPR-Oberflächen ähnliche Anforderungen gestellt wie an Protein-Chips. In der Etablierungsphase des SPR-Assays wurden zunächst grundlegende Parameter wie die Immobilisierungs- und Regenerationsbedingungen optimiert. Anschließend wurde überprüft, ob Antigen und Antikörper unter den gewählten Versuchsbedingungen noch miteinander interagieren konnten und die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen nicht beeinträchtig wurde. Hauptziel des SPR-Assays war die Überprüfung der Bindeaktivität verschiedener Chargen des Antikörpers im Vergleich zu einer Referenz-Charge unter Berücksichtigung eines möglichen Einflusses der Lagerzeit. Als Ergebnis konnte zwar eine geringe Abnahme der Bindungsaktivität beobachtet werden, welche eindeutig mit der Lagerzeit korrelierte, ein signifikanter Unterschied zwischen den zu vergleichenden Chargen war jedoch nicht erkennbar.
Der weitaus größere Teil der in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse betrifft die Konzeption neuer Protein-Chip-Architekturen. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe um Armin Gölzhäuser von der Universität Bielefeld wurde eine Protein-Chip-Plattform erarbeitet, für deren Herstellung Nitrobiphenyl-(NBPT)-Monolagen auf Gold mit Hilfe chemischer Lithographie im Mikro bzw. Nanomaßstab strukturiert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mit multivalenten NTA-Verbindungen funktionalisiert, sodass Proteine mit His-Tag spezifisch darauf verankert werden konnten. Die wichtigsten Vorteile dieses Systems sind eine hohe Bindungsstabilität der immobilisierten Proteine, eine aufgrund der weiten Verbreitung des His-NTA-Systems leichte Verfügbarkeit His-getaggter Proteine sowie die Erhaltung ihres nativen Zustandes bei gleichzeitig uniformer Orientierung auf der Substratoberfläche. Nachdem zunächst die grundsätzliche Machbarkeit der Strukturierung und Funktionalisierung gezeigt wurde, folgte eine eingehende Charakterisierung der einzelnen Fertigungsschritte per Rasterkraftmikroskopie (AFM) und SPR-Spektroskopie, um diese anschließend weiter zu optimieren. So konnte die Proteinresistenz in den Bereichen zwischen den Mikro- bzw. Nanostrukturen, in denen keine Proteine binden sollten, deutlich verbessert werden. Zusätzlich wurde die Effizienz der Oberflächenfunktionalisierung gesteigert, sodass eine höhere Immobilisierungsdichte möglich war. Die Funktionalität des verbesserten Protein-Chips wurde mittels AFM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) überprüft. Es konnte eine hochspezifische und stabile, aber gleichzeitig reversible Bindung His-getaggter Proteine auf dem Protein-Chip gezeigt werden. Die bis dahin nass-chemisch durchgeführten Fertigungsschritte wurden in der Folge ins Hochvakuum übertragen, um die Herstellung dieser Protein-Chips mittels Gasphasenabscheidung zu ermöglichen. Als Ergebnis dieser Arbeiten konnten proteinresistente EG3-Monolagen allein durch Gasphasendeposition generiert werden. Bis auf die Funktionalisierung mit trisNTAs konnten im Rahmen dieser Arbeit sämtliche Fertigungsschritte in die Gasphase übertragen werden. Protein-Chips, die auf diese Art hergestellt worden waren, hatten in Hinsicht auf Bindungsspezifität und -stabilität ebenso gute Eigenschaften wie Protein-Chips aus der klassischen nass-chemischen Fertigung. Zusätzlich wurde parallel zu diesen Arbeiten ein neuer Ansatz zur Strukturierung und trisNTA-Funktionalisierung von EG3-SAMs erarbeitet.
Ein zweiter Protein-Chip-Prototyp sollte durch orthogonale Funktionalisierung von nano-strukturierten Glasoberflächen mit Polyenthylenglykol (PEG) und multivalenten Chelatoren hergestellt werden. CLSM-Untersuchten ergaben zunächst, dass dieser Ansatz der orthogonalen Funktionalisierung nicht gelang, da auf den Goldstrukturen nur wenig Protein zu binden schien, während in den vermeintlich proteinresistenten PEG-Bereichen eine vergleichsweise große Menge His-getaggter Proteine adsorbierte. Nach einer Reihe von Versuchen stand fest, dass sich die Verfahren zur Funktionalisierung mit PEG und bisNTA-Thiolen gegenseitig störten. Die PEGylierung verhinderte die anschließende Ausbildung einer dicht-gepackten bisNTA-SAM, was zwar durch vorheriges Aufbringen einer Schutz-SAM aus Undecylthiolen gemildert, aber nicht vollständig verhindert werden konnte. Die anschließende Funktionalisierung der Nanostrukturen mit bisNTA-Thiolen führte wiederum zur Dotierung der PEG-Schicht mit bisNTA-Thiolen, sodass diese Schicht ihre Proteinresistenz verlor. Da dieser ungewollte Prozess seine Ursache in der zweistufigen PEGylierungsreaktion hatte und dieser auch durch verschiedenste Block-Verfahren nicht vollständig verhindert werden konnte, wurde ein alternatives, einstufiges PEGylierungsverfahren getestet. Dieses hatte eine deutliche Verbesserung der Oberflächeneigenschaften zur Folge. Einerseits zeigten die Glasbereiche nun eine sehr gute Proteinresistenz, zum Anderen hatte das neue PEGylierungsverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Ausbildung von bisNTA-SAMs. Mittels CLSM konnte auf Mikrostrukturen eine hochspezifische Proteinbindung beobachtet werden, während die PEGylierten Glasbereiche frei von Proteinen blieben. Interessanterweise konnte auf entsprechend funktionalisierten Nanostrukturen jedoch keine Proteinbindung nachgewiesen werden. Hierfür sind mehrere Ursachen denkbar, zu deren Klärung es weiterer Untersuchungen bedarf.