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The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic e-proteobacterium Wolinella succinogenes is part of the anaerobic respiratory system of this organism. It couples the reduction of fumarate to succinate to the oxidation of menaquinol to menaquinone. W. succinogenes uses fumarate as terminal electron acceptor and can use various substrates (e.g., formate or molecular hydrogen) as electron donors. The concerted catalytic substrate turnover of either a hydrogenase or a formate dehydrogenase in conjunction with QFR contributes to the generation of an electrochemical potential gradient across the bacterial plasma membrane, which is used for the phosphorylation of ADP with inorganic phosphate, Pi, to ATP. In addition to an FAD (in subunit A) and three iron-sulfur clusters (in subunit B), QFR binds a low- and a high-potential heme b group in its transmembrane subunit C, as was ultimately shown in the crystal structure at 2.2 Å resolution (Lancaster et al., 1999, Nature 402, 377– 385). Both hemes are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of this redox enzyme. The midpoint potentials of the hemes are well established but their assignment to the distal and proximal positions in the structure had not yet been determined. Furthermore, QFR from W. succinogenes has been proposed to exhibit a novel coupling mechanism of transmembrane electron and proton transfer, which has been described in the so-called “E-pathway” hypothesis (Lancaster, 2002, Biochim. Biophys. Acta 1565, 215–231). The aim of this project was to characterize the relationship between structure and function of QFR and to investigate the details of the proposed coupling mechanism (“Epathway”) with the help of computer-based electrostatic calculations on the QFR wild-type (WT) coordinates, and electrochemically induced FTIR and VIS difference spectroscopy on the QFR WT and available variant enzymes (in particular enzyme variant E180Q, in which the glutamic acid at position C180 has been replaced by a glutamine). 1.) It was demonstrated in this study that the diheme-containing QFR exhibits stable and reproducible electrochemically induced FTIR difference bands in the midinfrared range from 1800 cm-1 to 1000 cm-1 that reflect transitions from the reduced to the oxidized state of the enzyme. The spectral features that were observed in the FTIR difference spectra are fully reversible when changing from a reductive to an oxidative reference potential at the working electrode and vice versa. This indicates that the underlying redox reactions of the enzyme at the gold grid working electrode are also fully reversible under the applied experimental conditions. The same reversible spectral redox behavior in the visible range could also be ascertained for the Soret- and a-band of the two heme b groups of QFR. This behavior allowed to reliably determine the heme b midpoint potentials of QFR at various pH values. Analysis of the FTIR difference spectra in the amide I range yields evidence for structural reorganizations of the polypeptide backbone upon the electrochemically induced redox reaction. 2.) The redox titrations of the high- and low-potential heme b of QFR as simulated by multiconformation continuum electrostatics (MCCE) calculations showed a very high level of agreement with respect to the experimentally observed midpoint potentials of the heme b groups at pH 7. As determined with the help of the theoretical calculations, prominent features governing the differences in redox potential between the two hemes are the higher loss of reaction field energy for the proximal heme and the stronger destabilization of the oxidized form of the proximal heme due to several buried and ionized Arg and Lys residues. The explicit incorporation of crystallographically identified water molecules in the calculations had a noticeable effect on the absolute values of the determined midpoint potentials, although the relative difference of the two obtained midpoints did not change significantly. The results of the electrostatic calculations clearly showed that the lowpotential heme corresponds to the distal position bD in the structure, and that the high-potential heme is identical to the proximal heme bP. This assignment could previously not be achieved unequivocally with experimental methods. 3.) In addition, the currently discussed mechanism of coupled electron and proton transfer in the QFR of W. succinogenes (i.e., the “E-pathway” hypothesis) is further supported by the results of this study. The simulations of intermediate states of electron transfer via the heme b groups show that the protonation state of the key amino acid residue Glu C180 depends on the redox states of the heme groups as suggested in the “E-pathway” hypothesis. This result yields a possible mechanism for the coupling of transient transmembrane proton transfer via Glu C180 to the electron transfer via the heme b groups, since Glu C180 could be part of a “proton wire” and its redox-dependent protonation state could serve as the regulatory element of the “E-pathway”. Furthermore, the results of simulated heme reduction indicate that the side chain of Glu C180 also changes its conformation with respect to the redox state of the hemes. Both major results concerning the role of Glu C180, the change of protonation as well as the reorientation of the side chain upon reduction of the heme groups, are consistent with the results from electrochemically induced FTIR difference spectroscopy: Of particular interest was the spectral range above 1710 cm-1, where C=O stretching vibrations of protonated COOH carboxyl groups absorb, because those groups can act as proton donors, respectively acceptors, and can be involved in intra-protein proton transfer reactions. It was possible to observe signals of such protonated carboxyl groups originating from QFR enzyme, which either change their protonation state and/or experience an environmental change in the course of the induced redox reaction. This finding was supported by the fact that the relevant FTIR difference signals are sensitive to an isotopic hydrogen/deuterium (1H/2H) exchange via the buffer solution, since they were shifted towards lower wavenumbers in D2O. Furthermore, it could be shown with the help of site-directed mutagenesis that the acidic residue Glu C180, which is located in the membranespanning, diheme-containing subunit C of QFR, is contributing to the redox dependent signal of protonated carboxyl groups. The observed residual signal in the FTIR double-difference spectrum of QFR wild-type and enzyme variant E180Q (Glu C180 has been replaced with a Gln residue) could be interpreted as a protonation/deprotonation event that is superimposed by an environmental effect on the specific C=O vibration. This result strongly supports the proposed “E-pathway” of coupled transmembrane electron and proton transfer in the QFR enzyme, which states that residue Glu C180 is an essential constituent of a transient redox-controlled transmembrane proton transfer pathway. 4.) As a second possible constituent of the suggested “E-pathway”, the ring C propionate of the distal heme was found to be unusually fully protonated in all simulated redox states, indicating a possible role as a transient proton donor/acceptor in the “E-pathway”. Similarly to Glu C180, experimental evidence from FTIR difference spectroscopy on a modified QFR with 13C-labeled heme propionates was obtained, which indicates an involvement of at least one of the two propionates of heme bD in proton transfer. The observed signals can tentatively be interpreted as a redox-coupled (de)protonation of the ring C propionate of bD, which is possibly xiii superimposed by a conformational or environmental change of the specific propionate. 5.) Also the observation of a strong redox Bohr effect for both heme b groups in QFR is in line with the proposed “E-pathway” hypothesis, as this effect yields a possible and well-established mechanism for the coupling of proton transfer and redox changes of the heme groups. The comparison of the observed effect in QFR WT and E180Q together with the results from FTIR spectroscopy and MCCE calculation indicate that the ring C propionate of the distal heme is dominating the pHdependence of the midpoint potential of bD, and that the corresponding group for bP is Glu C180. The origin of the redox Bohr effect for bP in the enzyme variant E180Q (which is dramatically changed with respect to the WT) could not be identified unequivocally, but the observation of this redox Bohr effect in the variant implies the presence of other protolytic groups, which interact with heme bP and which may be necessary for a functional “E-pathway”.
Transmembrane proteins play crucial roles in biological systems as active or passive channels and receptors. Experimentally only few structures could be determined so far. Gaining structural insights enables besides a general understanding of biological mechanisms also further processing such as in drug design. Due to the lack of experimental data, reliable theoretical predictions would be of high value. However, for the same reason, missing data, the knowledge-based class of prediction methods that is well established for soluble proteins can not be applied. The goal of predicting transmembrane protein structures with ab initio methods demands locating the free energy minimum. Main difficulties here are, first, the computational costs of explicitly calculating all involved interactions and, second, providing an algorithm that is capable of finding the minimum within an extremely complex and rugged energy landscape. We have developed promising energy functions that describe the interactions of amino acids on a residue level, reducing computational costs while still containing most information on the atomistic level. We have also found a way to describe the interaction of the residues with its surrounding in a realistic manner by distinguishing residues exposed to the environment from those buried within helices using a sphere algorithm. The sphere algorithm can also be applied for a different purpose: one can measure how densely sidechains are packed for certain helical conformations, and thereby get an estimate of the sidechain entropy. In addition, overcrowding effects can be identified which are not well-described by the energy functions due to the pairwise calculation. To determine the absolute free energy minimum, we assume the helices to be located on an equidistance grid with slightly larger distances than to be expected. Optimizing the helices on the grid provides a starting point that should enable common minimizing algorithms, gradient-based or not, to find the absolute minimum beyond the grid. To simulate the dynamics of the helices on large time scales, we split them into rigid body dynamics and internal dynamics in terms of the dihedrals. The former one is well-known with its inherent problem of numerical drift and plenty of approaches to it, among which we have chosen the quaternions to represent the rotation of the rigid bodies. The latter one requires a detailed analysis of the torque size exerted on the dihedrals caused by the forces acting on the residues.
Die Infrarotspektroskopie in Verbindung mit photoaktivierbaren Substraten wurde zur Untersuchung von Substrat-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Dabei wurden Konformationsänderungen der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums bei Bindung des Nukleotids, der Phosphorylierung der ATPase und der Hydrolyse des Phosphoenzyms beobachtet. Verwender wurden das native Substrat ATP und seine Analoga ADP, AMPPNP, 2'-deoxyATP, 3'-deoxyATP, ITP, AMP, Pyrophosphat, Ribosetriphosphat und TNP-AMP beobachtet. Diese Analoga waren an spezifischen funktionellen Gruppen des Substrats ATP modifiziert. Modifikation der 2'- und 3'-OH Gruppe des Ribosetriphosphats, der beta- und gamma-Phosphatgruppe und der Aminogruppe des Adenins reduzieren das Ausmaß an bindungsinduzierten Konformationsänderungen. Ein besonders starker Effekt wird für die 3'-OH Gruppe und die Aminogruppe des Adenins beobachtet. Dies zeigt die strukturelle Empfindlichkeit des Nukleotid-ATPase Komplexes auf einzelne Wechselwirkungen zwischen dem Nukleotid und der ATPase. Die Wechselwirkungen einer bestimmten Ligandengruppe mit der ATPase hängen von Wechselwirkungen anderer Ligandengruppen mit die ATPase ab. Die TNP-AMP Bindung verursacht teilweise gegenläufige und kleinere Konformationsänderungen verglichen mit ATP. Die Bindungweise von TNP-AMP ist unterschiedlich zu der von ATP, AMPPNP und anderen Tri- und Diphosphat Nucleotiden. Die Phosphorylierung der ATPase wurde mit ITP und 2'-deoxyATP beobachtet. Ca2E1P wurde in gleichem Ausmaß mit ITP und 2'-deoxyATP wie mit ATP akkumuliert, obwohl das Ausmaß der Konformationsänderungen bei Ca2E1P-Bildung geringer ist. Änderungen der 2'- und 3'-OH des Ribosetriphosphats und der Aminogruppe des Adenins beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphorylierung der ATPase. Es gibt keine direkte Verbindung zwischen dem Ausmaß der Konformationsänderung bei Nukleotid- Bindung und der Rate der Phosphorylierung. Das volle Ausmaß der ATP-induzierten Konformationsänderung ist nicht zwingend für die Phosphorylierung. Die Konformationen von Ca2E1N und Ca2E1P hängen vom Nukleotid ab. Dies weist darauf hin, dass die Struktur von ATPase Zuständen heterogener ist, als bisher erwartet. Die Aussagekraft und der Reichtum an Informationen in den Infrarotspektren zeigen, dass hiermit eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Enzym-Substrat-Wechsel-Wirkungen und das räumliche Abtasten von Bindungstaschen zur Verfügung steht.
Stability, unfolding and refolding of the outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans was investigated using genetic and spectroscopic methods. Structural and functional activity studies on wild type and mutant porins: The site-directed mutants were constructed based on conserved residues and evidences on the role of certain amino acids from previous studies with OmpF. Secondary structure analysis of wild type and mutants E81Q, W74C, E81Q/D148N, E81Q/D148N/W74C by FTIR and CD spectroscopy are in line with the fact that porins are predominantly ß-sheet structure. The functional activity studies by black lipid bilayer techniques showed that the wild type and mutants W74C, E81Q/D148N, E81Q/D148N/W74C have a conductance of 3.25 nS. For mutant E81Q conductance of 1.25nS was more predominant over 3.25 nS. The activity of the mutants was observed to be far less than the wild type. This indicates that structural similarities does not implies similar functional activity. Thermal stability analysis of porin in detergent micelles and reconstituted into liposomes: Thermal stability analysis of wild type and mutants in detergent micelles showed changes in secondary and quaternary structure. It was found that wild type porin unfolds into aggregated structure with a high transition temperature of 86.2 °C. For mutants E81Q, W74C, E81Q/D148N the transition temperature was found to be 84.2 °C, 80.3 °C and 80.2 °C respectively. Functional activity assays at high temperatures revealed that the protein tends to loose its activity on heating up to 50 °C. This shows that structural stability does not imply functionality in the case of porins. Thermal stability analysis of porin reconstituted into liposomes showed that there was no change in the secondary and quaternary structure of the protein up to 100 °C, revealing that the protein becomes more thermostable when it is reconstituted into liposomes. Refolding of aggregated porin: This study shows that disaggregation of ß-sheet membrane protein porin is possible by changing its chemical and thermodynamic parameters. An increase of the solution pH to 12 or above results in opening up of the aggregated protein into unordered structure, as observed by FTIR and CD spectroscopy. This unordered structure could be refolded into native-like structure forming trimers. The secondary structure of the refolded protein deviated slightly from the native one. The thermal stability analysis of the native-like refolded proteins showed that the unfolding pattern is entirely different when compared to the native porins. pH dependent unfolding of porin: Thermal stability of porin at different pH values showed that the protein is stable in a pH range of 1-11. At pH 12 and above the protein unfolds into unordered structure instead of aggregating. The high pH unfolding of porin is a reversible process. The secondary structure of the refolded protein varied slightly from the native-one. Whereas thermal stability was entirely different. This shows that even though the unfolding of porin at high pH is reversible, it results in changes in local interaction between the amino acids resulting in a difference in stability. Unfolding in presence of urea and guanidinium hydrochloride (GuHCl): Denaturation of porin in the presence of chemical denaturants like urea and GuHCl showed that porin unfold into unordered structure. The unfolding is a reversible process. Unfolded protein was refolded into detergent micelles and liposomes. Refolding into detergent micelles was faster compared to refolding into liposomes, as seen by kinetic gel shift assays. The refolding into liposomes showed the presence of intermediates similar to those reported for OmpF. This study shows the difference in thermal stability of the outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans in detergent micelles and native-like liposomes. It suggests various unfolding pathways, which can be further investigated for unfolding and refolding kinetics. This report also suggests that it is possible to refold a heat-aggregated protein.
Biophysikalische Charakterisierung von endogenen Ionenkanälen (P2X7, TRPV) in humanen Mastzellen
(2009)
Die Akupunktur ist zentraler Bestandteil der traditionellen ostasiatischen Medizin, die auch Moxibustion und Kräuterheilkunde (Herbalmedizin) umfasst [Focks et al. 2006]. Akupunkturpunkte sind auch durch eine höhere Konzentration von sensorischen Rezeptoren und Mastzellen charakterisiert [Dung 1984; Heine 1988; Hwang 1992]. So ergaben Untersuchungen, dass die Stimulation (physikalische und chemische Reize) von Akupunkturpunkten auf Rezeptoren und auch Mastzellen einwirkt [Belmonte 1996; Schmidt 2002; Yang et al. 2007; Zhang et al. 2008a; Zhang et al. 2008b; Zhao 2008]. Dabei zeigten auch Pflanzenkomponenten aus der TCM Einflüsse [Lee 2000; Smith et al. 2006]. ...
Fourier-Transform Infrarot Differenz Spektroskopie ist eine Methode. die es erlaubt, selbst kleinste konformelle Änderungen in der Umgebung der katalytischen Zentren in Enzymen selektiv und mit hoher Zeitauflösung zu messen. Diese Technik wurde an Oxidasen von Paracoccus denitrificans, Thermus thermophilus und Escherichia coli angewandt, um einen Einblick in strukturelle und molekulare Prozesse der Bindung und Dynamik von Liganden am binuklearen Zentrum zu erhalten. Die pH- und Temperatur-Abhängigkeit von CO Schwingungsmoden sowie deren Verhalten nach der Photolyse konnten zeitaufgelöst untersucht und miteinander verglichen werden. Bei Temperaturen >180K war die Bestimmung von thermodynamischen Parametern wie Enthalpie-Barrieren und Arrhenius-Vorfaktoren möglich. Aus dem Verlauf der Rückbindungskinetiken ließen sich ferner Rückschlüsse über die konformelle Heterogenität der Bindung ziehen. Für Temperaturen um 140K konnte das Protein im "quasistationären" Zustand vermessen werden, da Rückreaktionen des Liganden an die Bindungsstelle des Häm a3 unterbunden waren. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit und analoger Funktion zeigten diese typischen Oxidasen große Unterschiede sowohl im Reaktionszentrum als auch im kinetischen Verhalten des Liganden. Die kinetischen Parameter für alle untersuchten Oxidasen weichen deutlich voneinander ab und spiegeln unter anderem die Stärke der Bindung am CUB wider. Die Temperaturabhängigkeit der Populationen der CO-Konformere und die äquivalente Rückbindungs-Kinetik der unterschiedlichen Konformere in den Oxidasen aus dem thermophilen System weisen auf ein strukturelles Merkmal in der Nähe des binuklearen Zentrums hin, das den Populations-Austausch in anderen Oxidasen unterbindet. Aufgrund der pH-Abhängigkeit der entsprechenden Oxidasen kann man schließen, daß diese Eigenschaft durch eine oder mehrere protonierbare Gruppen bewirkt wird, die die unterschiedlichen Konformere in bestimmten Positionen fixiert hält. Die Rückbindungsraten des Liganden zeigen für die T. thermophilus Oxidasen eine Rückbindung erster Ordnung. was auf eine homogene Verteilung der zwei Konformer-Populationen im Enzym deutet. Hingegen zeigte die Oxidase aus P. denitrificans für die Rückbindung eine Verteilung der Reaktionsraten. Ursache dafür ist ein sehr heterogenes Ensemble an Proteinen, das minimale strukturelle Unterschiede im Konformationsraum des Reaktionszentrums aufweist. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Beobachtung von Absorptionsbanden der Hämpropionate an Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans nach CO Rückbindung. Sowohl über 13C-isotopenmarkierte Hämpropionate als auch über ortsgerichtete Mutagenese in deren unmittelbarer Umgebung konnten definierte Banden-Zuordnungen im IR-Differenzspektrum erhalten werden. Experimente am Enzym mit Mutationen an der Stelle Asp 399 zeigten, daß die strukturellen Eigenschaften des Häm a3-CuB Zentrums im wesentlichen von dieser Veränderung nicht beeinflußt werden. Jedoch war die pH-Abhängigkeit der CO Konformere hier unterbunden, was auf deren Einfluß auf eine Protonierbarkeit im Wildtyp-Enzym hinweist. Rückschlüsse anhand der Mutante Asp399Asn zeigten (über den Verlust der pH-Abhängigkeit) ganz klar, daß alle unterschiedlichen CO-Konformere funktionell intakt sind. FT-IR Messungen an einem weiteren Enzym, der isolierten Cytochrom bd Oxidase aus E. coli, zeigten bei einer Untersuchung der CO Rückbindungs-Eigenschaften bei 84K die ausschließliche Rückbindung an das Häm d. der möglichen Sauerstoff-Bindungsstelle. Die Bindungsstelle an Häm b, die zu ca. 5% ebenfalls CO bindet, kann bei diesen Temperaturen nicht wiederbesetzt werden. Im typischen Spektralbereich von 1680 bis 1760 cm hoch minus 1 konnten eindeutig die Absorptionsbanden von Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenketten identifiziert werden. Über einen direkten Vergleich der Spektren, die über Redox-Reaktion und CO Rückbindung erhalten wurden, konnten diese Signale als klar in der direkten Umgebung des binuklearen Zentrums lokalisiert zugeordnet werden. Eine Rolle als vorübergehender Protonen-Akzeptor/Donor auf dem Weg zur Sauerstoff-Bindungsstelle ist naheliegend.
This doctoral thesis is concerned with the development of a method that allows to measure in vivo and non-invasively the mid-infrared absorption spectra of human epidermis, using photoacoustic spectroscopy. The main focus is the monitoring of the glucose level in epidermal interstitial fluid and its correlation with the blood glucose level; which is the most important parameter for the diagnosis and treatment of diabetes mellitus. Most publications in this field have only reported measurements in vitro for the absorption spectra of epidermis in the mid-infrared range. Using the approach presented in this work, it was possible to record in vivo and in situ the absorption spectra of skin of volunteers; and with these spectra, the changing glucose concentration could be monitored. The novelty of the photoacoustic method introduced here is that it operates in acoustic resonance in the ultrasound range. This considerably reduces the signal noise due to the external acoustic background. Although the photoacoustic method reported in this work was used to measure glucose in human epidermis, it can also be applied to other solid samples with relevant absorption bands in the mid-infrared. Furthermore, it can be used in other spectral regions if the laser source covers relevant absorption bands of the sample.
Cytochrome c oxidase is the terminal enzyme in the respiratory chain of mitochondria and aerobic bacteria. This enzyme ultimately couples electron transfer from cytochrome c to an oxygen molecule with proton translocation across the inner mitochondrial and bacterial membrane. This reaction requires complicated chemical processes to occur at the catalytic site of the enzyme in coordination with proton translocation, the exact mechanism of which is not known at present. The mechanisms underlying oxygen activation, electron transfer and coupling of electron transfer to proton translocation are the main questions in the field of bioenergetics. The major goal of this work was to investigate the coupling of electron transfer and proton translocation in cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Different theoretical approaches have been used to investigate the coupling of electron and proton transfer. This thesis presents an internal water prediction scheme in the enzyme and a molecular dynamics study of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans in the fully oxidized state, embedded in a fully hydrated dimyristoylphosphatidylcholine lipid bilayer membrane. Two parallel molecular dynamics simulations with different levels of protein hydration, 1.125 ns each in length, were carried out under conditions of constant temperature and pressure using three-dimensional periodic boundary conditions and full electrostatics to investigate the distribution and dynamics of water molecules and their corresponding hydrogen-bonded networks inside cytochrome c oxidase. The average number of solvent sites in the proton conducting K- and D- pathways was determined. The highly fluctuating hydrogen-bonded networks, combined with the significant diffusion of individual water molecules provide a basis for the transfer of protons in cytochrome c oxidase, therefore leading to a better understanding of the mechanism of proton pumping. The importance of the hydrogen bonding network and the possible coupling of local structural changes to larger scale changes in the cytochrome c oxidase during the catalytic cycle have been shown.
Results were presented from Brownian dynamics simulations for cyt c molecules approximated as spherical particles with diameter 2R ' 3.3 nm interacting with a charged planar membrane surface. Using the well-known Ermak-McCammon algorithm of ref. [36, 37] for solving the Langevin equations (see Chapter 2), a new computer program in C++ was developed. An overview of the way it is implemented is given in Chapter 3. The program in its current state is able to compute the trajectories (translation and rotation) of hundreds of spherical particles in systems with typical dimensions of 103 − 1003 nm3 . As explained in the introductory Chapter 1 the motivation for studying the dynamics of cyt c molecules in such systems came from the progress in the research of photosynthetic bacteria, e.g. While the internal processes of energy transduction (light harvesting, channelling to RC, charge separation) are quite well understood, the dynamics of soluble cyt c as an electron transporter in this context is not yet clear. In many textbooks one can find illustrations where a single cyt c is responsible for the electron transport between two integral membrane proteins (the reaction centre RC and the bc1 complex). But as pointed out in publications like refs. [49], [59], [60], [61] or [62] biological cells are crowded with different molecules. Consequently, one can assume that the electron transport between two integral membrane proteins is not simply taken on by one single cyt c molecule. Instead it is likely that many of these particles are located in a cyt c pool above the membrane and that they perform the electron transport in turns. Thus, it is desirable to have a simulation package that is able to compute the trajectories of many proteins. Note that the detailed processes of electron transfer and binding to membrane proteins are not modelled here. The details of these processes are quite complicated so that we refrained from including them in the coarse-grained simulations. Here, the actual binding is simply defined by a particle distance zb from the membrane which marks the beginning of the attractive potential. ...
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer spektroskopischen Methode für die medizinische Diagnostik und zielt auf die Einführung neuer analytischer Methoden in die klinische Praxis, die eine höhere Qualität bei der Behandlung von Patienten sowie eine Kostensenkung versprechen. Es wird eine reagenzienfreie infrarotspektroskopische Messmethode vorgestellt, mit der die Konzentrationen bestimmter Inhaltsstoffe von Körper- und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden können. Dabei kommt das kommerzielle FTIR- (Fourier-Transform Infrarot-) Spektrometer ALPHA der Firma Bruker zum Einsatz, für das eine spezielle ATR- (Abgeschwächte Totalreflexion) Messzelle konstruiert wurde. Diese eignet sich sowohl für Durchflussmessungen bei Volumenströmen von bis zu 1 l/min als auch für diskrete Proben mit einem minimalen Volumen von 10 µl. Die Kombination aus Spektrometer und Messzelle stellt somit ein kompaktes Messgerät dar, das zur Steuerung und Auswertung lediglich einen Computer benötigt und dessen Stabilität ebenfalls Langzeitmessungen erlaubt. Es stellt damit eine Basis für ein neuartiges Medizingerät dar, das auch außerhalb der Laborumgebung und insbesondere in der klinischen Routine von ungeschultem Personal eingesetzt werden kann.
Die quantitative Auswertung der Spektren erfolgt mittels multivariater Kalibrierung und PLS (Partial Least Squares) Regression. Dabei werden für die unterschiedlichen Inhaltsstoffe entsprechende Kalibriermodelle verwendet, die aus einer Reihe sorgfältig ausgewählter Proben erstellt wurden. Die Auswahl bezieht sich dabei vor allem auf einen breiten Konzentrationsbereich und auf möglichst unabhängig voneinander schwankende Konzentrationswerte der Inhaltsstoffe. Es wurden daher sowohl Proben im physiologischen als auch im pathologischen Bereich verwendet. Da die Konzentrationswerte der Kalibrierproben bekannt sein müssen, wurden die Proben mittels konventioneller klinischer Methoden analysiert. Die Genauigkeit dieser Referenzanalytik begrenzt dabei die maximale Genauigkeit der vorgestellten Methode.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Kalibriermodelle für die Inhaltsstoffe Glucose, Harnstoff, Creatinin und Lactat in der Waschlösung bei der Hämodialyse (Dialysat) sowie für die Inhaltsstoffe Glucose, Harnstoff, Cholesterol, Triacylglyceride, Albumin und Gesamtprotein in Vollblut und ebenso für Hämoglobin und Immunglobulin G in hämolysiertem Vollblut erstellt. Im Fall von Dialysat wurden hierfür sowohl künstlich erstellte sowie auch bei realen Dialysebehandlungen von Patienten entnommene Proben verwendet. Für Vollblut wurden bestehende Spektren an das neue Messgerät angepasst und durch Spektren neuer Blutproben erweitert. Die hiermit erreichte Genauigkeit und Präzision genügt in den meisten Fällen bereits klinischen Ansprüchen.
Für Dialysat wird gezeigt, dass mit dem vorgestellten Aufbau bereits kontinuierliche inline-Messungen direkt am Patienten möglich sind und gute Ergebnisse liefern. Dabei wurde sowohl auf eine einfache Anwendbarkeit während der Dialysebehandlung als auch auf eine einfache Bedienung mittels der vorgestellten Software geachtet. Das Gerät lässt sich somit problemlos in den klinischen Alltag integrieren und bietet aufgrund der Reagenzienfreiheit eine kostengünstige Methode zur kontinuierlichen und regelmäßigen Überwachung der Behandlungsverläufe.
Im Fall von Vollblut wird gezeigt, dass Messungen mit einer Probenmenge von 10 µl beispielsweise aus der Fingerbeere prinzipiell möglich sind und ebenfalls reproduzierbare Ergebnisse liefern. Damit steht eine präzise, einfache, kompakte und betriebskostengünstige Methode zur Verfügung, um in kurzer Zeit wichtige Blutparameter quantitativ bestimmen zu können.
Das kompakte und reagenzienfreie Messsystem erlaubt eine Vielzahl von Anwendungen, die insbesondere von den schnellen Analyseergebnissen und den geringen Verbrauchskosten profitieren. Beispielsweise beim Blutspendedienst, beim Hausarzt oder in Seniorenheimen kann die schnelle und einfache Ermittlung der hier untersuchten Blutparameter zur ersten Beurteilung des Patienten dienen und damit die Diagnose erleichtern. Der hohe Probendurchsatz und die vernachlässigbaren Betriebskosten führen in diesem Fall zu einer schnellen Amortisierung der Anschaffungskosten. Auch in Apotheken kann mit einem derartigen System ein erweiterter Service für Kunden angeboten werden.
Aufgrund des geringen Probenvolumens kommt das Messsystem ebenfalls für Anwendungen im Versuchstierbereich in Frage, beispielsweise für die Untersuchung von Mäuseblut in der German Mouse Clinic am Helmholtz Zentrum München. Die der Maus zu entnehmende Blutmenge und damit die Belastung des Tieres kann hierdurch erheblich reduziert werden.
Die Kompaktheit dieses universellen Systems erlaubt es weiterhin, eine Vielzahl anderer Flüssigkeiten zu untersuchen, die bereits erfolgreich infrarotspektroskopisch analysiert wurden. Dazu gehört unter anderem Urin, Bier und Wein.
In der Arbeit wird abschließend ebenfalls gezeigt, dass der Einsatz abstimmbarer Quantenkaskadenlaser zusammen mit der ATR-Technik prinzipiell die Möglichkeit eröffnet, die aufwändigen und teuren FTIR-Spektrometer zu ersetzen. Langfristig ist sowohl mit einer Verkleinerung des Aufbaus als auch mit einem Sinken des derzeit noch sehr hohen Anschaffungspreises zu rechnen. Der bereits verfügbare Abstimmbereich genügt zur Bestimmung der Glucosekonzentration. Eine Erweiterung, beispielsweise durch die Verwendung mehrerer Quantenkaskadenlaser mit unterschiedlichem Abstimmbereich, ermöglicht die Untersuchung weiterer Parameter.