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Jennifer Christina Hartel

• Sphingolipids are not only structural components of cell membranes but can also act as signalling molecules in different pathways. Sphingolipid precursors, Ceramides (Cer), are synthesized de novo by six different synthases (CerS1-6) which generate Cer of different chain lengths. Cer can be further synthesized to glycosphingolipids and sphingomyelin. Cell membrane parts that are enriched in glycosphingolipids are so-called lipid rafts and can function as signalling platforms for different receptors, such like the T cell receptor (TCR). CD4+ T cells play a crucial role in the development of ulcerative colitis, a chronic inflammatory disease of the colon. As CerS3 expression was increased in the white blood cells of human colitis patients, the role of CerS3 in the TCR signalling and colitis was investigated in this dissertation. By lenti-viral transduction of a CerS3-shRNA into a CD4+ Jurkat cell line, it was shown that CerS3 has an impact on activated T cells. A decrease of different sphingolipids after T cell activation via CD2/3/28 activation beads and IL2 treatment was observed that was accompanied by an inhibition of Zap70 phosphorylation, an important protein of the TCR signalling. The impaired TCR signalling led to a diminished NFAT1 translocation into the nucleus which subsequently led to a reduced NFAT1- dependent TNFα release. Downregulation of CerS3 in primary CD4+ T cells, obtained from the blood of healthy volunteers, also showed a reduced release of pro-inflammatory cytokines after activation. This dissertation demonstrates a pivotal role for CerS3 in T cell function and highlights CerS3 as potential new target for T cell driven colitis.
• Kolitis Ulzerosa ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung des Kolons, die mehr als 170000 Menschen in Deutschland betrifft. Patienten leiden an Symptomen wie Durchfall, rektalen Blutungen, blutigem Stuhl, abdominalen Schmerzen und Krämpfen, Fieber und Erschöpfung. Bisher ist Kolitis Ulzerosa zwar behandelbar, aber nicht heilbar. Im gesunden Zustand ist das Darmepithel mit einer Mukusschicht benetzt, die nicht nur eine physische Barriere darstellt, sondern auch eine antimikrobielle Funktion aufweist. In Kolitis Patienten ist die Mukusproduktion stark beeinträchtigt und dies führt zu einer erhöhten Permeabilität und dem verstärkten Eintreten von Pathogenen, die das Immunsystem aktivieren. Die Pathophysiologie der Kolitis Ulzerosa ist sehr komplex und kann nicht auf einen einzigen Mechanismus zurückgeführt werden. Pathogene, die die erste Barriere des Darms durchbrochen haben, werden von dendritischen Zellen (DCs), aber auch von Makrophagen und T Zellen durch Toll Like Rezeptoren (TLR) erkannt. TLR Signalwege aktivieren Transkriptionsfaktoren, die die Ausschüttung von Interleukinen wie IL12 und 23 oder Tumor Necrosis Factor (TNF) α fördern. Aktivierte T Zellen schütten Zytokine aus, um weitere Immunzellen zu rekrutieren. Die Infiltration des bereits entzündeten Gewebes durch neue Immunzellen führt zur Entwicklung einer chronischen Entzündung, die immer weiter gefördert wird. T Zellen sind Teil des adaptiven Immunsystems und werden über den T Zell Rezeptor (TZR) aktiviert. Dieser erkennt Antigene, die von Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) präsentiert werden. Der TZR wird ebenfalls durch Co-Rezeptoren stimuliert, wie Cluster of Differentiation (CD) 4 und 8. Diese Co-Rezeptoren sorgen für eine räumliche Nähe der Proteine, um die Signaltransduktion der TZR Aktivierung weiterzuleiten. Ein wichtiger Schritt bei der Aktivierung des TZR ist die Phosphorylierung der Zeta-Chain-Associated-Protein Kinase 70 (Zap70), die zur Aktivierung mehrere Transkriptionsfaktoren wie Nuclear Factor Kappa B (NFκB), Activating Protein (AP-1) oder Nuclear Factor of activated T Cells (NFAT) führt. Die Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren führt zu einer Translokation in den Nukleus und daraufhin werden Gene angeschaltet, die Proliferation, Überleben, Differenzierung und Effektorfunktion der Zelle steuern. Den größten Beitrag zur Kolitis leisten T Helfer (TH) Zellen. Sie sind definiert durch die Expression des CD4 Rezeptors und nehmen eine unterstützende Rolle ein, in der sie Zytokine zur Rekrutierung und Regulierung anderer Immunzellen ausschütten. Die Anzahl der aktivierten T Zellen ist in Kolitis Patienten erhöht, sowie die Menge der Zytokine, die sie ausschütten. Dementsprechend ist es wichtig, verschiedene Faktoren zu untersuchen, die die Aktivierung von T Zellen beeinflussen. Sphingolipide sind nicht nur strukturgebende Elemente der Zellmembran, sondern sind auch in verschiedene Signalwege involviert und können als aktive Biomoleküle verschiedene Signalwege in der Zelle aktivieren. Die einfachsten Sphingolipide und das Grundgerüst für komplexere Sphingolipide sind die Ceramide (Cer), die aus einem Sphingosin und einer über N-Acylierung angehängten Fettsäure variierender Kettenlänge (C6-32) bestehen. Sie werden entweder de novo im Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert oder über den Salvage Pathway aus Sphingomyelin (SM) zu Cer abgebaut. Die Schlüsselenzyme für die de novo Synthese sind die Ceramidsynthasen (CerS). Diese binden durch N-Acylierung verschieden langkettige Fettsäuren kovalent an ein Sphinganin oder Sphingosin und bilden somit DihydroCer bzw. Cer. Es gibt sechs verschiedene Isoformen der CerS, die Spezifität gegenüber Fettsäuren verschiedener Kettenlängen aufweisen. CerS1 etwa weist eine Spezifität gegenüber C18 auf, während CerS3 Fettsäuren der Kettenlänge C18-C32 favorisiert. CerS werden nicht in jedem Gewebe gleich exprimiert. CerS3 ist vor allem in der Haut, in Prostata und Hoden exprimiert, während CerS1 am meisten in Hirngewebe nachgewiesen wird. Cer können direkt in die Zellmembran eingebaut werden oder sie werden zu komplexeren Sphingolipiden wie Sphingomyelin oder Glykosphingolipde verstoffwechselt und in die Zellmembranen eingebaut. Bereiche der Plasmamembran, die eine hohe Konzentration an Cholesterol und Glykosphingolipiden aufweisen, nennt man Lipid rafts. Lipid rafts dienen als Signalplattformen für verschiedene Rezeptoren, darunter auch der TZR, dessen Aktivierung nur dann stattfinden kann, wenn er in Lipid Rafts lokalisiert ist. Durch Vorarbeiten wurde bereits ein Einfluss von CerS auf die T Zell Funktion nachgewiesen. CerS4 Knockdown in CD4+ Jurkatzellen führte zu einer Aktivierung der Zellen ohne externen Stimulus und CerS5 Knockdown in Jurkat Zellen inhibierte die TZR Aktivierung.