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Isabel Haferland

• Hidradenitis suppurativa ist eine multifaktoriell-bedingte chronisch entzündliche Hauterkrankung, die durch eine Okklusion der Talgdrüseneinheit des Haarfollikels entsteht. Aus der anschließend mit Entzündung einhergehenden Ruptur des Haarfollikels entwickeln sich entzündliche Knoten, Abszesse und Fistelgänge. (39–41) In der weiteren Progression der Erkrankung kommt es zur Störung der Hautarchitektur und fibrotischen Narbenbildungen. (52) Durch Untersuchungen des entzündlichen Infiltrates konnte bereits die Beteiligung einer Reihe von Immunzellen und Entzündungsmediatoren identifiziert werden. Hierzu zählen Makrophagen, neutrophile Granulozyten, Dendritische Zellen, Lymphozyten, IL-1β sowie TNF-α. (41,45,46,51,53) Da die genaue Pathophysiologie der Hidradenitis suppurativa bislang unzureichend aufgeklärt ist, gibt es aktuell keine kausale Therapiemöglichkeit für die Betroffenen. (52) Die Wahl der Therapie wird anhand der Bewertung des Schweregrades nach Hurley getroffen. (25) Obwohl meisten Patientinnen und Patienten von der milden bis mittelschweren Form der Hidradenitis suppurativa (Hurley I und Hurley II) betroffen sind (98), werden die meisten Arzneimittel für die Behandlung von Hurley II und Hurley III von den Leitlinien empfohlen. Zu den empfohlenen Medikamenten gehören u. a. Rifampicin, meist in Kombination mit Clindamycin, sowie der TNF-α-Inhibitor Adalimumab (18,85), welche effektiv und systemisch wirken. Durch die entstehenden Nebenwirkungen wäre die Behandlung der milden bis mittelschweren Hidradenitis suppurativa mit diesen Medikamenten allerdings unverhältnismäßig. Um jedoch den im Verlauf der Krankheit entstehenden Hautdestruktionen vorbeugen zu können, müssten die Medikamente möglichst früh eingesetzt werden. (228) Vor diesem Hintergrund sollte in Kooperation mit dem Institut für Pharmazeutische Technologie der Goethe Universität Frankfurt eine Rifampicin-Nanoformulierung zur Behandlung milder bis mittelschwerer Hidradenitis suppurativa entwickelt und im Labor der dermatologischen Klinik präklinisch validiert werden. Daher wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit ein Epidermismodell aus der Haut betroffener Patientinnen und Patienten generiert, um die Rifampicin-Nanoformulierung validieren zu können. Dieses wies eine mehrschichtige Epidermis mit allen wichtigen Differenzierungsmarkern ähnlich der läsionalen Hidradenitis suppurativa auf und schüttete die proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α aus. Als weiteres Modell wurden ex vivo Explantate aus läsionaler Hidradenitis suppurativa Haut etabliert. Für die Bewertung der Validität der Explantatkulturen wurde die Morphologie und Integrität der Epidermis mittels Hämatoxylin-Eosin sowie der Proliferationsmarker Ki-67 näher beleuchtet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen für die Festlegung eines Konzentrationsbereichs, unter Verwendung von Rifampicin in DMSO gelöst als in vitro Behandlung, durchgeführt. Hierbei wurde gezeigt, dass die eingesetzten Konzentrationen keine negativen Effekte bezüglich Proliferationsfähigkeit der Keratinozyten oder Apoptoseinduktion ausüben. Die Behandlung von nicht entzündlichen Epidermismodellen sowie Explantatkulturen mit der Rifampicin-Nanoformulierung mit einem Wirkstoffgehalt von 0,3 % führte ebenfalls zu keinen Proliferationsverlusten, induzierte keine Apoptose oder Zytotoxizität und hatte keinen Einfluss auf die Differenzierung der Keratinozyten. Im letzten Teil der Arbeit sollte die Wirksamkeit der Rifampicin-Nanoformulierung näher beleuchtet werden. Als Antibiotikum inhibiert Rifampicin die DNA-abhängige RNA-Polymerase von Bakterien (107,108), weshalb es bei der Behandlung der Tuberkulose eingesetzt wird. (111–113) Die Hidradenitis suppurativa ist aber primär keine Infektionskrankheit, sondern eine von Bakterien getriggerte, entzündliche Erkrankung. (19,52,82) Aus diesem Grund ist der positive Effekt der systemischen Rifampicintherapie vermutlich vielmehr auf eine antiphlogistische Wirkung zurückzuführen. Diese Überlegung wird durch mehrere Artikel gestützt, die zeigten, dass Rifampicin die Ausschüttung von IL-1β und TNF-α in unterschiedlichen in vitro und in vivo Modellen hemmt. (89–91,96,97) Die anschließenden Untersuchungen zur Wirksamkeit einer in vitro Rifampicinbehandlung bestätigten die antientzündliche Wirkung in den Explantatkulturen indem es die Sekretion von IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 und TNF-α verminderte. Ebenso senkte die Rifampicin-Nanoformulierung die Ausschüttung von IL-1β in den ex vivo Explantaten, was somit die in der klinischen Praxis beobachteten antiinflammatorischen Wirkung von Rifampicin belegt. Des Weiteren stellte sich in Untersuchungen heraus, dass Rifampicin zu einer reduzierten Zahl CD4(+)-T-Zellen führte, aber auf die CD3(+)-T-Zellen keine Auswirkungen hatte, was auf eine Veränderung des T-Zell Phänotyps hinweist. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse zur Validierung der Rifampicin-Nanoformulierung, spricht nichts gegen die Testung der Rifampicin-Nanoformulierung in einem individuellen Heilversuch am Menschen.
• Hidradenitis suppurativa is a multifactorial chronic inflammatory skin disease caused by occlusion of the sebaceous gland unit of the hair follicle. Inflammatory nodules, abscesses, and fistulous ducts are developed through the subsequent rupture of the hair follicle associated with inflammation. (39–41) Further progression of the disease is followed by disruption of skin architecture and fibrotic scarring. (52) Studies about the inflammatory infiltrate identified the involvement of a number of immune cells and inflammatory mediators. These immune cells and mediators include macrophages, neutrophil granulocytes, dendritic cells, lymphocytes, IL-1β, and TNF-α. (41,45,46,51,53) Since the exact pathophysiology of Hidradenitis suppurativa has been poorly elucidated, there is currently no causal therapeutic possibility for affected patients. (52) The choice of therapy is based on Hurley's scoring of severity. (25) Although most patients are affected by the mild to moderate form of Hidradenitis suppurativa (Hurley I and Hurley II) (98), most drugs are recommended for the treatment of Hurley II and Hurley III. The recommended drugs comprise rifampicin, usually in combination with clindamycin, and the TNF-α inhibitor adalimumab (18,85), which act effectively and systemically. However, due to the development of side effects, treatment of mild to moderate Hidradenitis suppurativa would be disproportionate. In order to prevent the skin destruction that develops during the progress of the disease, the drugs would need to be started as early as possible. (228) In this context, a rifampicin nanoformulation with up to 1% active agent for the treatment of mild to moderate Hidradenitis suppurativa should be developed in cooperation with the Institute of Pharmaceutical Technology of the Goethe University Frankfurt and preclinically validated in the laboratory of the department of dermatology. Therefore, in the first part of the present work, an epidermis model was generated from skin cells of affected patients, to validate the rifampicin nanoformulation. This epidermis model presented a multi-layered epidermis with all important differentiation markers similar to lesional Hidradenitis suppurativa and secreted the proinflammatory cytokines IL-1β and TNF-α. As another model ex vivo explants of lesional Hidradenitis suppurativa skin were established. To evaluate the validity of the explant cultures, the morphology and integrity of the epidermis were further examined using hematoxylin eosin and the proliferation marker Ki-67. In the second part of this dissertation, studies were performed to establish a concentration range using rifampicin dissolved in DMSO as an in vitro treatment. The concentrations used did not exert any toxic effects regarding the proliferative capacity of keratinocytes or induction of apoptosis. Treatment of non-inflammatory epidermis models as well as explant cultures with the rifampicin nanoformulation containing 0.3 % of the active ingredient also resulted in no loss of proliferation, did not induce apoptosis or cytotoxicity, and had no effect on keratinocyte differentiation. In the last part of the work, the efficacy of rifampicin nanoformulation was examined in more detail. Since rifampicin is an antibiotic, it inhibits the DNA-dependent RNA-polymerase of bacteria (107,108), which is why it is used in the treatment of tuberculosis. (111–113) However, Hidradenitis suppurativa is not primarily an infectious disease but rather an inflammatory disease triggered by bacteria. (19,52,82) For this reason, the beneficial effect of systemic rifampicin therapy is probably due to an antiphlogistic effect. This consideration is supported by several articles, which showed, that rifampicin inhibits the release of IL-1β and TNF-α in different in vitro and in vivo models. (89–91,96,97) Subsequent studies on the efficacy of in vitro rifampicin treatment confirmed the anti-inflammatory effect in the explant cultures by decreasing the secretion of IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, and TNF-α. Similarly, rifampicin nanoformulation decreased the secretion of IL-1β in the ex vivo explants, demonstrating the anti-inflammatory effect of rifampicin observed in clinical practice. Furthermore, rifampicin was found to reduce CD4(+) T-cell numbers but had no effect on CD3(+) T-cells, indicating a change in T-cell phenotype. Based on the results for the validation of the rifampicin nanoformulation presented in this thesis, there is no reason why the rifampicin nanoformulation should not be tested in compassionate use/ off-label use in a human trial.