Open Access

Anja Isabel Schollmeier

• The hepatitis B virus is one of the most common causes of virus-related chronic liver disease and remains a major global health problem affecting 296 million people worldwide. Despite an available and highly effective vaccination, hepatitis B infections lead to an annual mortality rate of approximately 0.8 million people. The global prevalence is heterogeneously distributed and reflects a high infections and chronicity, particularly in low-income countries, due to a lack of vaccination strategies, underdiagnosis and low treatment rates. A complete cure remains undiscovered to this day. Based on their genetic makeup, the virus is categorized into nine genotypes with a genetic difference of more than 8% within the sequence. In addition to their geographical distribution, hepatitis B virus genotypes also differ in terms of their clinical outcome, pathogenesis and treatment response. The viral protein HBx is known to interact with several cellular signaling pathways and is thereby accounted as the driving force in the development of hepatitis B virus-associated pathogenesis and progression of hepatocellular carcinoma. In particular, HBx interacts with mitochondria and induces profound alterations in the mitochondrial morphology and function with a severe impact on the liver’s physiology and with an emerging role in liver-related disease progression. This study aims to investigate the genotype-related impact of HBx with regard to their interaction with cellular signaling pathways. A particular focus was placed on mitochondria-dependent interactions and signaling pathways in order to broaden the understanding of the genetic diversity of the genotypes. Differences between genotypes of HBx were examined and compared through in vitro experiments based on a cell culture-based system. Plasmid DNA encoding the HBx protein of the different genotypes was transiently transfected into Huh7 or HepG2 cells and examined for molecular and protein-biochemical effects on the host cell, usually 72 hours after transfection. This study focused on the most common genotypes A, B, C, D, E and G worldwide. Based on initial kinome profiling analyses, it was found that HBx differs greatly within their genetic variants and suggests different effects on overall cell function and in particular on mitochondrial kinases. Furthermore, confocal laser scanning microscopy reveals profound HBx-mediated changes in the mitochondrial network structure, however with major differences among the different genotypes. In particular, HBx of genotypes A and G causes enormous fragmentation of mitochondrial structures, accompanied by emergent changes in mitochondrial function. Due to an increased interaction with the voltage-dependent anion channel 3, a significant loss of mitochondrial membrane potential was also observed, together with an increased radial oxygen stress level and an induction of central mitochondria-dependent inflammatory mediators. In contrast, the contribution of HBx-genotype B and E reveals only moderate effects in these regards. Using a pH-sensitive reporter system, HBx genotypes which previously indicated a strong distribution in the mitochondrial morphology and function, also showed an elevated mitophagy through the PINK1/Parkin-mediated pathway. This study provides direct evidence that HBx-mediated changes in host cell signaling pathways, especially in mitochondrial-associated pathways, fundamentally dependent on the different genotypes. In addition, the results also indicate an important role of HBx in the process of genotype-dependent liver pathogenesis and provide insight into the underlying cellular mechanisms and signaling pathways.
• Das Hepatitis-B-Virus ist eine der häufigsten Ursachen virusbedingter chronischer Lebererkrankungen und stellt nach wie vor ein großes globales Gesundheitsproblem dar, von dem weltweit 296 Millionen Menschen betroffen sind. Trotz einer verfügbaren und hochwirksamen Impfung führen Hepatitis-B-Infektionen zu einer jährlichen Sterblichkeitsrate von etwa 0,8 Millionen Menschen. Die globale Prävalenz ist heterogen verteilt und spiegelt eine hohe Infektionsrate und Chronizität wider, insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen, aufgrund fehlender Impfstrategien, unzureichenden Diagnosen und niedrigen Behandlungsraten. Eine vollständige Heilung ist bis heute unentdeckt. Insgesamt spielen aber auch sozioökonomische Parameter eine entscheidende Rolle für die virale Endemizität. Aufgrund der genetischen Ausstattung wird das Virus in neun Genotypen eingeteilt, die einen genetischen Unterschied von mehr als 8 % innerhalb der Sequenz aufweisen. Zusätzlich zu ihrer geografischen Verteilung unterscheiden sich die Genotypen des Hepatitis-B-Virus auch hinsichtlich klinischer Ergebnisses, Pathogenese und Behandlungserfolge. Hepatitis B Viren haben einen strikten Gewebetropismus und replizieren somit nahezu ausschließlich in Leberzellen. Der klinische Verlauf beginnt mit einer akuten Phase, die meist asymptomatisch ist und innerhalb von 6 Monaten selbstständig ausheilt. In seltenen Fällen jedoch kann es durch eine verstärkte Immunantwort zu einer gravierenden Schädigung der Hepatozyten kommen und eine fulminante Hepatitis mit schlussendlichem Leberversagen induzieren. Persistiert die Infektion mehr als 6 Monate, liegt eine chronische Erkrankung vor. Dies ist charakterisiert durch verschiedene Infektionsstadien und impliziert unterschiedliche Level der serologischen Marker und Entstehung von Fibrosen Leberzirrhose, und hepatozellulären Karzinom. Hierbei gilt das virale Protein HBx als treibende Kraft bei der Entwicklung der Hepatitis-B-Virus-assoziierten Pathogenese und dem Fortschreiten des hepatozellulären Karzinoms. Das Protein umfasst 145 Aminosäuren, verbleibt jedoch bis heute ohne klare Strukturdarstellung. Dabei sind insbesondere die geringe Löslichkeit und das flexible Verhalten, sowie ein geringes Vorkommen während des natürlichen Infektionsverlaufs ausschlaggebend für die fehlenden strukturellen Informationen. Dies bedingt aber auch, dass die genaue Funktion des Proteins bis heute noch nicht vollständig verstanden ist. Dennoch sind verschiedene funktionale und regulatorische Domänen innerhalb von HBx bekannt die mit viralen aber insbesondere auch zelluläre Promotoren interagieren und eine transaktivierende Wirkung, ohne direkte DNA-Bindung verursachen und verschiedene, zelluläre Signalwege beeinflussen. Darüber hinaus interagiert HBx mit Mitochondrien und induziert tiefgreifende Veränderungen in der Morphologie und Funktion der Mitochondrien mit schwerwiegenden Auswirkungen auf die Physiologie der Leber und einer zunehmenden Rolle beim Fortschreiten leberbedingter Erkrankungen. Ziel dieser Studie ist es, den genotyp bezogenen Einfluss von HBx im Hinblick auf ihre Interaktion mit zellulären Signalwegen zu untersuchen. Ein besonderer Fokus wurde auf Mitochondrien-abhängige Interaktionen und Signalwege gelegt, um das Verständnis der genetischen Vielfalt der Genotypen zu erweitern. Unterschiede zwischen HBx-Genotypen wurden durch In-vitro-Experimente auf Basis eines zellkulturbasierten Systems untersucht und verglichen. Plasmid-DNA, die das HBx-Protein der verschiedenen Genotypen kodiert, wurde in Huh7 oder HepG2 Zellen transfiziert und auf molekulare und proteinbiochemische Auswirkungen auf die Wirtszelle untersucht. Für diese Studie wurde sich auf die weltweit häufigsten Genotypen A, B, C, D, E und G konzentriert. Basierend auf Kinom-Profiling-Analysen wurde festgestellt, dass sich HBx innerhalb ihrer genetischen Varianten stark unterscheiden und deutlich unterschiedliche Auswirkungen auf die gesamte Zellfunktion und auf mitochondriale Kinasen haben. Darüber hinaus zeigt die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie tiefgreifende, HBx-vermittelte Veränderungen in der mitochondrialen Netzwerkstruktur, allerdings mit großen Unterschieden zwischen den verschiedenen Genotypen. Insbesondere HBx der Genotypen A und G verursacht eine enorme Fragmentierung der mitochondrialen Strukturen, begleitet von auftretenden Veränderungen der mitochondrialen Funktion. Aufgrund einer verstärkten Interaktion mit dem Spannungs-abhängigen Anionen Kanal 3 wurde ebenso ein signifikanter Verlust des Mitochondrienmembranpotentials beobachtet, zusammen mit einem erhöhten intrazellulären radikalen Sauerstoffstressniveau und einer Induktion zentraler Mitochondrien-abhängiger Entzündungsmediatoren. Im Gegensatz dazu zeigt der Beitrag der HBx-Genotypen B und E diesbezüglich nur geringfügige, die Genotypen C und D moderate Auswirkungen. Mithilfe eines pH-empfindlichen Reportersystems zeigten HBx-Genotypen, die zuvor eine starke Veränderung in der mitochondrialen Morphologie und Funktion anzeigten, auch eine erhöhte Mitophagie über den PINK1/Parkin-vermittelten Weg. Diese Studie liefert direkte Beweise dafür, dass HBx-vermittelte Veränderungen in den Signalwegen der Wirtszelle, insbesondere in mitochondrien-assoziierten Signalwegen, grundsätzlich von den verschiedenen HBV-Genotypen abhängen. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse auch auf eine wichtige Rolle von HBx im Prozess der genotyp abhängigen Leberpathogenese hin und geben Einblick in die zugrundeliegenden zellulären Mechanismen und Signalwege.