Open Access

Hannes Reinwald

• Regulatory required, classical toxicity studies for environmental hazard assessment are costly, time consuming, and often lack mechanistic insights about the toxic mode of action induced through a compound. In addition, classical toxicological non-human animal tests raise serious ethical concerns and are not well suited for high throughput screening approaches. Molecular biomarker-based screenings could be a suitable alternative for identifying particular hazardous effects (e.g. endocrine disruption, developmental neurotoxicity) in non-target organisms at the molecular level. This, however, requires a better mechanistic understanding of different toxic modes of action (MoA) to describe characteristic molecular key events and respective markers. Ecotoxicgenomics, which uses modern day omic technologies and systems biology approaches to study toxicological responses at the molecular level, are a promising new way for elucidating the processes through which chemicals cause adverse effects in environmental organisms. In this context, this PhD study was designated to investigate and describe MoA-characteristic ecotoxicogenomic signatures in three ecotoxicologically important aquatic model organisms of different trophic levels (Danio rerio, Daphnia magna and Lemna minor). Applying non-target transcriptomic and proteomic methodologies post chemical exposure, the aim was to identify robust functional profiles and reliable biomarker candidates with potential predictive properties to allow for a differentiation among different MoA in these organisms. For the sublethal exposure studies in the zebrafish embryo model (96 hpf), the acute fish embryo toxicity test guideline (OECD 236) was used as conceptual framework. As different test compounds with known MoA, the thyroid hormone 3,3′,5-triiodothyronine (T3) and the thyrostatic 6-propyl-2-thiouracil (6-PTU), as well as six nerve- and muscle-targeting insecticides (abamectin, carbaryl, chlorpyrifos, fipronil, imidacloprid and methoxychlor) were evaluated. Furthermore, a novel sublethal immune challenge assay in early zebrafish embryos (48 hpf) was evaluated for its potential to assess immuno-suppressive effects at the gene expression level. Therefore, toxicogenomic profiles after an immune response inducing stimulus with and without prior clobetasol propionate (CP) treatment were compared. For the aquatic invertebrate D. magna, the study was performed with previously determined low effect concentrations (EC5 & EC20) of fipronil and imidacloprid according to the acute immobilization test in water flea (OECD 202). The aim was to compare toxicogenomic signatures of the GABA-gated chloride channel blocker (fipronil) and the nAChR agonist (imidacloprid). With similar low effect concentrations, a shortened 3 day version of the growth inhibition test with L. minor (OECD 221) was conducted to find molecular profiles differentiating between photosynthesis and HMG-CoA reductase inhibitory effects. Here, the biological interpretation of the molecular stress response profiles in L. minor due to the lack of functional annotation of the reference genome was particularly challenging. Therefore, an annotation workflow was developed based on protein sequence homology predicted from the genomic reference sequences. With this PhD work, it was shown how transcriptomic, proteomic and computational systems biology approaches can be coupled with aquatic toxicological tests, to gain important mechanistic insights into adverse effects at the molecular level. In general, for the different investigated adverse effects for the different organisms, biomarker candidates were identified, which describe a potential functional link between impaired gene expressions and previously reported apical effects. For the assessed chemicals in the zebrafish embryo model, biomarker candidates for thyroid disruption as well as developmental toxicity targeting the heart and central nervous system were described. The biomarkers derived from nerve- and muscletargeting insecticides were associated with three major affected processes: (1) cardiac muscle cell development and functioning, (2) oxygen transport and hypoxic stress and (3) neuronal development and plasticity. To our knowledge, this is the first study linking neurotoxic insecticide exposure and affected expression of important regulatory genes for heart muscle (tcap, actc2) and forebrain (npas4a) development in a vertebrate model. The proposed immunosuppression assay found CP to affect innate immune induction by attenuating the response of genes involved in antigen processing, TLR signalling, NF-КB signalling, and complement activation ...
• Die Belastung der Umwelt mit toxischen Chemikalien stellt ein erhebliches Risiko für die Gesundheit der dort lebenden Organismen dar und kann weitreichende negative Auswirkungen auf Populationen und ganze Ökosysteme haben. Als moderne Gesellschaft sind wir dennoch tagtäglich abhängig von einer Vielzahl an chemischen Stoffen. Um Umweltorganismen und damit Ökosysteme vor potenziell schädlichen Wirkungen zu schützen, müssen für die Registrierung und Zulassung einer Chemikalie ökotoxikologische Daten zur Umweltrisikobewertung von den Herstellern den Behörden zur Verfügung gestellt werden. Die von der EU-Gesetzgebung vorgeschriebenen Untersuchungen, z.B. im Rahmen von REACh, der Pflanzenschutzmittel-Verordnung, oder der Biozid-Verordnung, zur Bewertung der Umweltwirkung solcher Stoffe auf aquatische Ökosysteme umfassen neben Studien zur Bioakkumulation und Abbaubarkeit auch eine Reihe von Toxizitätstests mit aquatischen Modellorganismen verschiedener Trophiestufen (Algen, Krebstiere, Fische). Standardisierte Toxizitätstests erfassen quantitativ populationsrelevante Endpunkte nach definierten OECD Richtlinien. Diese klassischen ökotoxikologischen Untersuchungen sind jedoch kosten- und zeitintensiv, und nicht darauf ausgelegt, die primäre toxische Wirkungsweise (mode of action; MoA) eines Stoffes zu charakterisieren. In Bezug auf die Umweltrisikobewertung und Regulierung einer Chemikalie ist jedoch deren ökotoxikologische Wirkungsweise von entscheidender Bedeutung. So kann die Marktzulassung eines Wirkstoffes von z.B. Pflanzenschutzmitteln und Bioziden in der EU abgelehnt werden, wenn die primäre Wirkungsweise der Verbindung mutagene, fortpflanzungs-gefährdende oder endokrine Wirkungen auf Organismen zeigen. Darüber hinaus werfen klassische toxikologische Tierversuche ethische Bedenken auf und eignen sich schlecht für automatisierte Screening-Ansätze mit hohem Durchsatz. Die stetig steigende Zahl an neuen chemischen Substanzen und deren Bewertung stellt daher eine zunehmende Herausforderung für die Forschung als auch einen immer größer werdenden Kostenfaktor für die Industrie dar. Die Entwicklung neuer Verfahren ist daher erforderlich. Eine mögliche neuartige Alternative zu klassischen Toxizitätstest stellen dabei auf molekularen Biomarkerprofilen basierende Screenings dar. Unter der Annahme, dass sich verschiedene toxische Wirkungsweisen (MoA) auf z.B. der Genexpressions-Ebene auflösen lassen, ließen sich mittels solcher Verfahren gefährliche Nebenwirkungen von Substanzen bereits auf molekularer Ebene vorhersagen und bewerten. Durch die regulatorischen Vorgaben und eine daraus resultierende mögliche Restriktion einer Substanz, ist es bereits während der Chemikalien-Entwicklung von großem Interesse toxische Wirkungsweisen auf Organismen in der Umwelt frühzeitig zu identifizieren und zu verstehen. So ließen sich bereits frühzeitig eine funktionsbasierte Priorisierung von sichereren Vorläufersubstanzen etablieren. Allerdings erfordert die Entwicklung eines solchen Verfahrens ein besseres mechanistisches Verständnis verschiedener toxischer Wirkmechanismen, um charakteristische molekulare Schlüsselereignisse und zuverlässige Biomarker zu identifizieren ...