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Sequenzselektive, metallfreie DNA-Spalter auf der Basis von Bisguanidiniumalkoholen

  • Die Aufklärung der dreidimensionalen Helix-Struktur der DNA, des Trägermoleküls der genetischen Information aller Lebewesen, durch Watson und Crick im Jahre 1953 ermöglichte eine ganz neue Sichtweise auf ihre Eigenschaften und viele zelluläre Prozesse. Von besonderem Interesse sind hier u.a. Mechanismen, bei denen die DNA an den Phosphaten nucleophil substituiert wird, wie dies beispielsweise bei der Rekombination oder der Transkription geschieht. Dies ist daher interessant, weil sich die DNA gegenüber nucleophilen Angriffen in verschiedenen Experimenten als überaus stabil und reaktionsträge gezeigt hat. Spezialisierte Enzyme wie die Staphylokokkennuklease oder Restriktionsendonukleasen nutzen u.a. Metall-Ionen, um Phosphoryltransfer-Reaktionen zu katalysieren und in eine akzeptable Zeitskala zu verschieben. Die Topoisomerase vom Typ I zeigt eindrucksvoll, dass Katalyse solcher Reaktionen auch ohne Metall-Ion möglich ist, womit auch gleichzeitig die Quelle für eine potentielle oxidative Schädigung der DNA entfernt ist. Leider ist die Palette der natürlich vorkommenden Enzyme begrenzt. Die Erforschung und Entwicklung von künstlichen Nukleasen ermöglicht daher potentiell den zukünftigen Einsatz neuer, maßgeschneiderter Werkzeuge für die Biochemie und die Biotechnologie, sowie langfristig die Bereitstellung neuartiger Chemotherapeutika. Vom aktiven Zentrum der Staphylokokkennuklease abgeleitete Moleküle auf Bisguanidinium-Naphthol-Basis bzw. deren Derivate zeigten in der Vergangenheit deutliche Aktivität als metallfreie, unspezifische Spalter von Plasmid-DNA. Die vorliegende Arbeit beschreibt die weitere Entwicklung und Charakterisierung neuer unspezifischer und potentiell sequenzselektiver Bisguanidinium-Naphthol-Derivate. Hierbei wurde eine neue, zuverlässige Synthesestrategie für Bisguanidinium-Naphthole und parallel dazu ein neuer und flexibler Weg der Flüssigphasen-Synthese von DNA-bindenden Polyamiden ausgearbeitet, um daraus DNA-bindende Konjugate herzustellen. Vier unspezifische Moleküle (45, 94, 95, 97) und zwei Konjugate (46 und 140) wurden dann bei physiologischen Bedingungen auf ihre Spaltaktivität gegenüber Plasmid-DNA und linearer Duplex-DNA untersucht. Bei allen oben genannten Verbindungen konnte - verglichen mit der Stamm-Verbindung 36 aus Vorgängerarbeiten - eine erhöhte Aktivität gegenüber Plasmid-DNA bestimmt werden, die im Falle der Konjugate zwischen 4000- und 8000-fach liegt. Zur weiteren Charakterisierung wurden Experimente in Anwesenheit von EDTA oder Mg2+, zur pH-Abhängigkeit und zur Kinetik der Spalt-Reaktion durchgeführt. Erste Testreihen zum Nachweis sequenzselektiver DNA-Spaltung lieferten kein abschließendes Ergebnis, gaben jedoch erste Hinweise auf Selektivität, welche zur Zeit näher untersucht und überprüft werden.
  • The structural elucidation of the three-dimensional helix-structure of DNA, the carrier molecule of the genetic information of all living beings, by Watson and Crick in 1953 allowed for a completely new view on properties of various cellular processes. Mechanisms, in which DNA is substituted nucleophilically on its phosphates, e.g. in transcription or recombination, are of particular interest. DNA showed to be extremely resistant and chemically inert towards nucleophilic attacks in various experiments, hence specialized enzymes like Staphylococcal nuclease or Restriction endonucleases are needed to catalyze this reaction. These biocatalysts use, amongst others, metal-ions to catalyze the Phosphoryl-transfer reaction and to shift it to an acceptable time-scale. The metal-free catalysis of such a reaction is impressively demonstrated by Topoisomerase type I, whereby the risk of potential oxidative damage of DNA is removed. Unfortunately, the repertory of naturally occurring enzymes is limited. Research and development of artificial nucleases potentially enables the future application of new tailor-made tools for biochemistry and biotechnology, as well as the preparation of novel chemotherapeutics on the long term. Molecules derived from the active site of Staphylococcal nuclease and based on Bisguanidinium-alcohols showed considerable activity as metal-free and unspecific cleavers of plasmid-DNA in the past. The present thesis describes the further development and characterization of new unspecific as well as potentially sequence-selective Bisguanidiniumalcohol derivatives. Here, a new and reliable synthesis for Bisguanidinium-alcohols and in parallel, a new and flexible way of liquid-phase synthesis of DNA-binding polyamides was elaborated to yield DNA-binding conjugates. Then four unspecific molecules (45, 94, 95, 97) and two conjugates (46 and 140) were examined for their cleavage activity towards plasmid-DNA and linear duplex-DNA. All of the mentioned compounds exhibited a higher activity compared to the initial compound 36, and reached between 4000- and 8000-fold in case of the conjugates. For further characterization experiments were carried out to determine kinetical data, the pH-dependency of the cleavage-reaction, and the influence of EDTA or Mg2+. Preliminary tests to verify sequence-selective DNA-cleavage did not deliver a final result, but showed a first hint of selective cleavage, which is currently investigated in more detail.

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Metadaten
Author:Stefan Ullrich
URN:urn:nbn:de:hebis:30-67594
Referee:Michael W. Göbel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/06/30
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/05/13
Release Date:2009/06/30
HeBIS-PPN:213468174
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht