Open Access

Laura Tesmer

• Finding new drugs is a difficult, time-consuming, and costly challenge, with only a small success rate along the drug discovery pipeline of far less than 10%. The high failure rate of drug discovery projects motivates the integration of computational tools throughout the whole drug discovery pipeline, from target identification to clinical trials. Target identification is the first step in the process. A biological target, e.g., a protein that plays a role in disease, is identified and its molecular mechanism in the disease is studied. Further, a potential binding site on the target, where therapeutic molecules can bind and modulate the target’s activity, needs to be characterized. Computational tools can contribute to improving the initial molecular target elucidation and assessment. In this thesis, I use computational, physics-based approaches to characterize binding sites of drug targets and to decipher enzyme-substrate interactions, which play a role in disease mechanisms. Molecular dynamics (MD) simulations were applied to study the dynamics of molecules in solution at high temporal and spatial resolution. The method generates time-resolved trajectories of the particles in a system of interest by integrating Newton’s equations of motion numerically, starting from a set of coordinates and velocities. In MD simulations, all atoms of a chosen system, including solvent, are represented explicitly. Atomistic simulations are especially well-suited to study detailed interactions that depend on intermolecular interactions, such as hydration effects, hydrogen bonding, hydrophobic interactions, or subtle chemical differences. System properties are inferred from the trajectories, provided that the force fields, describing the interactions between the particles in the system, have a high accuracy. The bonded and non-bonded interactions are parametrized on experimental and quantum chemical data. The purpose of MD simulations can be to gain insight into the behavior of complex biological systems at molecular level, which often cannot be observed in experiments at the same resolution. With recent advances in computer hardware and simulation software, molecular systems of increasing size and simulation length can be investigated. In the first part of the thesis, I investigated the conformational ensemble of various protein drug targets. Proteins are dynamic biomacromolecules that can have diverse and nearly isoenergetic conformational states. Ligand binding can shift the equilibrium of this conformational ensemble and can uncover binding sites, called cryptic sites. Cryptic sites only emerge upon small molecule binding and are often flat and featureless, and thus not easily recognized in crystal structures without bound ligands. If new binding sites including cryptic sites are detected, they can potentially be exploited for binding to ligands and enable a druggable target. Druggability is the ability of a protein to bind small, drug-like molecules, which is the basis for rational drug design. In this thesis, I used state-of-the-art physics-based, computational approaches to investigate the conformational ensembles of binding sites. In all studied systems, it is known from experiment that a specific group of ligands can induce conformational changes. The aim is to sample the conformational space made accessible upon ligand binding, yet without using the specific ligand structures or details about their interactions. We are interested in sampling the pocket conformational states and identifying the respective pocket opening mechanism. For some cases, I additionally assessed whether the observed flexibility is a feature of the protein family, or specific to the protein under consideration. The first studied system is factor VIIa (FVIIa). FVIIa is an essential part of the coagulation cascade and hence a potential drug target for thrombotic diseases. In addition, I investigated various other trypsin-like serine proteases from the same protein family. The binding pocket of trypsin-like serine proteases is called S1 pocket. An X-ray crystal structure solved by our collaborators reveals that a b-sheet structure in the S1 pocket is distorted by a bound ligand. I resolved the conformational change with MD simulations, starting from the unbound protein structure solvated in water and ions. I observed multiple spontaneous transition events. In 7 out of 22 simulations with the b-sheet as starting structure, the S1 pocket eventually rearranged into a distorted loop structure. These transitions occurred spontaneously and were mediated by water molecules probing the backbone hydrogen bonds. The conformational change studied here controls the onset of substrate binding and catalysis. Furthermore, I used metadynamics simulation, an enhanced-sampling method, to estimate the free energy barrier of this conformational change..
• Die Suche nach neuen Arzneimitteln ist eine schwierige, zeitaufwändige und kostenintensive Aufgabe mit einer geringen Erfolgsquote von weit unter 10%. Die hohe Misserfolgsquote in der Arzneimittelforschung regt dazu an, mehr computergestützte Methoden in dem gesamten Arzneimittelforschungsprozess, von der Target-Identifizierung bis hin zu klinischen Versuchen, zu verwenden. Die Target-Identifizierung ist der erste Schritt in diesem Prozess. Dieser beschreibt die Suche nach einem biologischen Target, beispielsweise einem Protein, das funktionale Relevanz bei einem Krankheitsbild hat, auch genannt Zielprotein. In dieser Forschungsphase ist wichtig, dass der molekulare Mechanismus des Zielproteins in einem Krankheitsbild verstanden werden muss. Zudem muss eine potenzielle Bindungsstelle des Zielproteins, an der therapeutische Moleküle binden und somit die Aktivität des Zielproteins modulieren können, charakterisiert werden. Computergestützte Methoden können dazu beitragen, die molekulare Zielproteinermittlung und -bewertung zu verbessern. In dieser Arbeit verwende ich computergestützte, physikbasierte Ansätze, um die Bindungsstellen von Zielproteinen zu charakterisieren und die Wechselwirkungen zwischen Enzymen und Substraten zu entschlüsseln, die bei Krankheitsmechanismen eine Rolle spielen. Mit Hilfe von Molekulardynamiksimulationen (MD-Simulationen) wurde die Dynamik von Molekülen in Lösung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung untersucht. Ausgehend von einem Satz von Koordinaten und Geschwindigkeiten erzeugt die Methode zeitaufgelöste Trajektorien der Teilchen des untersuchten Systems durch numerische Integration der Newtonschen Bewegungsgleichungen. Bei MD-Simulationen werden alle Atome eines ausgewählten Systems, einschließlich des Lösungsmittels, explizit dargestellt. Atomistische Simulationen eignen sich besonders gut für die Untersuchung detaillierter Wechselwirkungen, die von intermolekularen Wechselwirkungen abhängen, wie Hydratationseffekte, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen oder subtile chemische Unterschiede. Die Analyse der Trajektorien ermöglicht die Vorhersage von Systemeigenschaften, sofern die Kraftfelder, die die Wechselwirkungen zwischen den Teilchen im System beschreiben, eine hohe Genauigkeit aufweisen. Die gebundenen und nicht gebundenen Wechselwirkungen werden anhand experimenteller und quantenchemischer Daten parametrisiert. Der Zweck von MD-Simulationen kann darin bestehen, Einblicke in das Verhalten komplexer biologischer Systeme auf molekularer Ebene zu gewinnen, die in Experimenten oft nicht mit der gleichen Auflösung beobachtet werden können. Mit der jüngsten Entwicklung von Computerhardware und Simulationssoftware können molekulare Systeme mit zunehmender Größe und Simulationsdauer untersucht werden. Im ersten Teil der Arbeit habe ich das Konformationsensemble verschiedener Zielproteine für Arzneimittel untersucht. Proteine sind dynamische Biomakromoleküle, die verschiedene und nahezu isoenergetische Konformationszustände aufweisen können. Eine Ligandenbindung kann das Gleichgewicht dieses Konformationsensembles verschieben und Bindungsstellen, sogenannte kryptische Taschen, aufdecken. Kryptische Bindungsstellen entstehen nur bei der Bindung kleiner Moleküle und sind oft flach und strukturlos, so dass sie in Kristallstrukturen ohne gebundene Liganden nicht leicht zu erkennen sind. Wenn neue Bindungsstellen, einschließlich kryptischer Taschen, entdeckt werden, könnten sie potenziell für die Bindung an Liganden genutzt werden und die druggability verbessern. Druggability ist die Fähigkeit eines Proteins, kleine, arzneimittelähnliche Moleküle zu binden, und bildet die Grundlage für das Design von Medikamenten. In dieser Arbeit verwende ich physikalisch basierte, rechnerische Ansätze, um die Konformationsensembles von Bindungsstellen zu untersuchen. In allen untersuchten Systemen ist aufgrund von experimentell gelösten Strukturen bekannt, dass eine bestimmte Gruppe von Liganden Konformationsänderungen hervorrufen kann. Das Ziel ist es, den Konformationsraum, der durch die Bindung eines Liganden zugänglich wird, zu untersuchen, ohne dabei die spezifischen Ligandenstrukturen oder Details über deren Wechselwirkungen zu verwenden. Wir sind daran interessiert, das Ensemble der Taschenkonformationen zu erfassen und den jeweiligen Mechanismus der Taschenöffnung zu identifizieren. In einigen Fällen bewerten wir zusätzlich, ob die beobachtete Flexibilität ein Merkmal der Proteinfamilie oder spezifisch für das betrachtete Protein ist. Das erste untersuchte System ist Faktor VIIa (FVIIa). FVIIa ist ein wesentlicher Bestandteil der Gerinnungskaskade und daher ein potenzieller Angriffspunkt für Medikamente für thrombotische Erkrankungen. Zusätzlich habe ich verschiedene andere Trypsin-ähnliche Serinproteasen aus derselben Proteinfamilie untersucht. Die Bindungstasche von Trypsin-ähnlichen Serinproteasen wird als S1-Tasche bezeichnet...