Open Access

Michael Schleicher

• Dank intensiver Forschung konnte Stickstoffmonoxid (NO) innerhalb der letzten Jahrzehnte als ein gasförmiges Signalmolekül (second messenger) identifiziert werden, das innerhalb der Zelle verschiedene Signalkaskaden beeinflusst. Dabei spielt sowohl der Syntheseort als auch die synthetisierte NO-Menge eine entscheidende Rolle für die Spezifität des über NO vermittelten Signals. Dies spiegelt sich unter Anderem in den zahlreichen regulatorischen Mechanismen, denen die NO-Synthasen unterliegen, wider. In jüngster Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass nicht nur der Aktivitätsstatus der NO-Synthasen, sondern ebenfalls deren subzelluläre Lokalisation durch solche Mechanismen entscheidend beeinflusst werden. Von besonderer Bedeutung scheinen dabei mit den NO-Synthasen interagierende Proteine zu sein. So resultiert beispielsweise eine Überexpression von NOSIP – einem eNOS interagierenden Protein – in CHO-NOS-Zellen in einer Umverteilung von eNOS von der Plasmamembran hin zu intrazellulären Kompartimenten. Diese Umverteilung führt zu einem signifikanten Aktivitätsverlust der eNOS. Die physiologische Relevanz dieser Interaktion wird sowohl durch den Interaktionsnachweis der endogenen Proteine in Endothelzellen als auch durch eine weitreichende Co-Expression in Gastro-Intestinaltrakt, Leber und Bauchspeicheldrüse der Ratte gestützt. Eine nähere Charakterisierung dieser Interaktion war bisher jedoch noch nicht erfolgt. Auch blieben die biochemischen Eigenschaften von endogenem NOSIP bisher unerforscht. Daher war es Ziel dieser Arbeit, endogenes NOSIP näher zu charakterisieren und dadurch die Voraussetzungen für eine physiologische Interaktion zwischen NOSIP und eNOS aufzuklären. Dabei konnte festgestellt werden, dass es sich bei NOSIP um ein überwiegend nukleär lokalisiertes Protein handelt. Diese nukleäre Lokalisation wird über ein zweiteiliges Kernlokalisationssignal (NLS = nuclear localisation signal) vermittelt. Sukzessive Mutation dieses Signals resultiert in einer zytoplasmatischen Akkumulation von NOSIP. Ferner ist das NLS nach Fusion an heterologe Proteine in der Lage, deren Lokalisation in Richtung Zellkern zu verschieben. In Heterokaryon-Assays konnte gezeigt werden, dass NOSIP zusätzlich aus dem Kern exportiert wird und daher ein zwischen Kern und Zytoplasma wanderndes Protein ist. Dieses „trafficking“ wird über ein dynamisches Gleichgewicht aus Kernimport und Kernexport reguliert. Der Kernexport von NOSIP wird durch einen ungewöhnlichen - nicht durch Leptomycin B inhibierbaren - Mechanismus bewerkstelligt. Entsprechend findet sich innerhalb der NOSIP-Sequenz kein typisches, leucinreiches Exportsignal, durch welches gewöhnlich Kernexport über Bindung an Crm1 (chromosome region maintenance 1) vermittelt wird. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Kernimport und Kernexport, verschiebt sich in Abhängigkeit vom Zellzyklus in der G2-Phase in Richtung Export, was in einer zytoplasmatischen Akkumulation von NOSIP resultiert. Beeinflusst wird das dynamische Gleichgewicht dabei möglicherweise von einer Interaktion zwischen NOSIP und der Zellzyklus-regulatorischen Kinase CDK1 (cyclin dependent kinase 1). In Bezug auf eNOS ist diese zytoplasmatische Lokalisation von NOSIP von entscheidender Bedeutung, wie in vergleichenden Transfektionsexperimenten mit zytoplasmatischen NOSIP-Mutanten in CHO-NOS-Zellen gezeigt werden konnte. Danach vermittelt ausschließlich Transfektion dieser Mutanten eine Translokation von eNOS an das Aktin-Zytoskelett, während natives, primär nukleär lokalisiertes NOSIP keinen Einfluss auf die eNOS-Lokalisation hat. Analog dazu resultiert die zytoplasmatische Akkumulation von endogenem NOSIP in der G2-Phase des Zellzyklus ebenfalls in einer Translokation von eNOS an das Aktin-Zytoskelett, welche eine signifikante Aktivitätsminderung der NO-Synthase zur Folge hat. Diese zellzyklusspezifischen, eNOS-regulativen Effekte erfolgen in Abhängigkeit von endogenem zytoplasmatischem NOSIP, wie mittels RNA-Interferenzexperimente belegt werden konnte. Danach können sowohl die Umverteilung von eNOS als auch die daraus resultierende Aktivitätsminderung durch eine Expressionsunterdrückung von NOSIP vollständig inhibiert werden. Die innerhalb dieser Arbeit erhobenen Daten stellen den ersten Bericht über eine Zellzyklusabhängige Regulation einer NOS-Isoform dar. Diese negative Regulation wird durch eine Umverteilung von eNOS an ein inaktives Kompartiment erreicht, welche wiederum über eine zellzyklusabhängige Lokalisationsänderung von NOSIP bewerkstelligt wird. In der Literatur finden sich zahlreiche Berichte über die Auswirkungen von exogen verabreichtem NO auf Zellzyklus-gesteuerte Ereignisse, wie Apoptose oder Proliferation. In diesem Zusammenhang zeigen die hier erhobenen Daten, dass die endogene NO-Menge tatsächlich zellzyklusspezifisch reguliert wird. Diese Regulation könnte möglicherweise ein Teil eines endogenen, NO-abhängigen Mechanismus darstellen, der die Apoptose und/oder die Proliferation beeinflusst.
• Within the last decades nitric oxide (NO) has been identified to play a pivotal role as a second messenger in signaling cascades of many different cell types. Both the diversity and specificity of the biological actions of NO are achieved by a tight temporal and spatial control of NO biosynthesis. This is reflected by multiple regulatory mechanisms governing NO synthase (NOS) activity. For instance, eNOS activity is mainly controlled by interactions with activating and inhibitory proteins but also by subcellular targeting, yet the mechanisms underlying vectorial transport of eNOS remain elusive. Recently, a novel NOS interacting protein NOSIP has been discovered as a candidate protein involved in the regulation of these subcellular trafficking processes. Overexpression of NOSIP results in translocation of eNOS from the plasma membrane to intracellular compartments, concomitant with a significant decrease in eNOS activity. Though the interaction of the endogenous proteins in endothelial cells as well as a broad co-expression in a variety of rat tissues have been successfully demonstrated, the physiological relevance of this interaction remains to be defined. Against this background a major aim of this work was to characterise the subcellular distribution and trafficking of NOSIP which both critically influence the interaction between NOSIP and eNOS. NOSIP was characterised as a protein with predominant nuclear localisation, dependent on a bipartite nuclear localisation sequence (NLS). Progressive ablation of the NLS reduced the nuclear import of NOSIP resulting in a cytoplasmic accumulation. Fusion proteins between the NLS and heterologous cytoplasmic proteins were directed to the nucleus indicating that the NLS of NOSIP is functional per se. Heterokaryonassay revealed that NOSIP is additionally exported from the nucleus, thus gaining the ability of nucleocytoplasmic shuttling. Nuclear export of NOSIP occurs in an, leptomycin B insensitive and therefore possibly Crm1 (chromosome region maintenance 1) independent manner, characterising NOSIP as a member of a recently defined heterologous group of proteins lacking conventional nuclear export signals. As a consequence, subcellular distribution of NOSIP is the result of a constant dynamic nucleocytoplasmic shuttling. This dynamic shuttling of NOSIP is regulated in a cell cycle-dependent manner with cytoplasmic accumulation of NOSIP in the G2 phase, possibly influenced by the interaction between NOSIP and the cell cycle regulatory kinase CDK1. Regarding eNOS translocation, the cytoplasmic accumulation of NOSIP is crucial for acting on eNOS as shown by transfection experiments, where NLS-deficient cytoplasmic NOSIP results in a translocation of eNOS to the actin cytoskeleton in CHO cells, while nuclear wtNOSIP failed to do so. Furthermore, cytoplasmic accumulation of endogenous NOSIP in G2 phase resulted in an association of eNOS with the actin cytoskeleton. This cell cycledependent redistribution was accompanied by a G2 phase specific reduction of eNOS enzymatic capacity. The observed cell cycle-dependent effects on eNOS were completely reversed by knock-down of endogenous NOSIP through RNA-interference. Thus eNOS trafficking and activity are regulated by the cell cycle, dependent on the nucleocytoplasmic shuttling of NOSIP. The data collected herein provide the first evidence for a cell cycle-dependent regulation of a NOS isoform. This negative regulation is accomplished by a redistribution of eNOS to an inactive compartment through cell cycle-dependent translocation of NOSIP to the cytoplasm. Given the controversial effects observed for exogenously applied NO on cell cycle-related effects as apoptosis or proliferation, these findings provide initial evidence for cell cycledependent regulation of endogenous NO biosynthesis. This regulation might influence NOdependent effects on apoptosis and proliferation.