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Alexander Hahn

• The TolC protein of E. coli is a versatile OMF which is involved in secretion of antibiotics, heavy metal ions, secondary metabolites and proteins. These individual tasks are accomplished by a dynamic formation of different secretion complexes which comprising a plasma membrane transporter, a Membrane Fusion Protein and TolC as the outer membrane channel-tunnel. The TolC-like protein HgdD of the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 was previously described as an indispensable OMF involved in formation of the heterocyst-specific glycolipid layer which is needed to sustain the microoxic environment that allows nitrogen fixation in heterocysts of filamentous cyanobacteria. Here I show that HgdD is involved in macrolide antibiotic resistance and ethidium efflux, which is used as a model substrate for cytotoxic compounds and secondary metabolites. It can be shown that ethidium uptake is a passive and porin-dependent process, while multidrug efflux is performed together with the RND efflux pump All3143 (and the MFP All3144). In contrast to HgdD, All3143 can complement the function of its homologue AcrB in E. coli and was suggested to be named anaAcrB. Multidrug efflux is assisted by SmsA and SchE, two secondary transporters of the MFS-type, which facilitate the transport of cytoplasmatic ethidium to the periplasmic space prior to the All3143- and HgdD-dependent efflux. Moreover, it can be demonstrated that SchE and HgdD are involved in secretion of the metal ion-chelating siderophore schizokinin, which functions in iron(III) acquisition. However, a physical interaction of SchE and HgdD is unlikely since SchE does not possess an OMF interacting domain. In addition, both RND efflux pumps All3143 and Alr1656 are needed for the homeostasis of the photosystems during diazotrophic growth. Although a direct involvement in heterocyst development or metabolism cannot be discounted at this stage, it is speculated that both RND transporters are involved in detoxification of reactive nitrogen species, similar to the function of MexF and MdtF of P. aeruginosa and E. coli respectively. In addition to its function in multidrug efflux, HgdD has been shown to be involved in protein secretion. By comparative analysis of the Anabaena sp. wild type and hgdD mutant secretome it was possible to identify eight putative HgdD protein substrates. The localization of four proteins was exemplary demonstrated by secretome isolation and cell fractionation of hemagglutinin-tagged mutant strains. The absence of detectable protein in the hgdD mutant strain suggests a highly efficient secretion system which is quality controlled by proteolysis of mislocalized proteins.
• Anabaena sp. PCC 7120 (im Folgenden. Anabaena sp.) ist ein filamentöses Cyanobacterium der Ordnung Nostocales und stellt ein Modellorganismus zur Untersuchung von bakterieller Photosynthese, Zelldifferenzierung und Stofffixierung dar. In Abwesenheit einer gebundenen Stickstoffquelle wie Ammonium oder Nitrat ist Anabaena sp. in der Lage etwa jede zehnte Zelle des Filaments in spezielle, Luftstickstoff fixiende Heterozyste zu differenzieren. Heterozysten stellen einen anaeroben Reaktionsraum dar, indem der Enzymkomplex Nitrogenase Stickstoff zu Ammonium reduziert. Nitrogenase ist ein extrem sauerstoffsensitives Enzym und wird bereits durch geringfügen Mengen Sauerstoff irreversibel inaktiviert. Zur Erzeugung und Aufrechterhaltung einer sauerstoffarmen Umgebung besitzen Heterozysten ein reduziertes Photosystem, haben durch Expression zusätzlicher „Alternativer Terminaler Oxidasen“ (ARTO1 und ARTO2) eine gesteigerte Atmungsaktivität und besitzen zusätzliche Zellwandschichten welche aus heterozystenspezifischen Glycolipiden (HGL), sowie heterozystenspezifischen Polysacchariden (HEP) aufgebaut sind. Während die HEP-Schicht der Zelle Stabilität verleiht, verhindert die HGL-Schicht den Gasaustausch mit der Umgebung und trägt so zur Erhaltung der sauerstoffarmen Umgebung in Heterozysten filamentöser Cyanobakterien bei. Das TolC-ähnliche Protein HgdD („Heterocyst glycolipid deposition protein D“) aus Anabaena sp. PCC 7120 spielt dabei eine entscheidende Rolle in der Ausbildung der HGL-Schicht. Die Deletion von hgdD verhindert eine vollständige Heterozystendifferenzierung und damit die Fixierung von Stickstoff in Gegenwart von Sauerstoff (Fox-). Dies ist zusätzlich durch eine erhöhte Fragmentierung der Zellfilamente gekennzeichnet. TolC ist ein vielseitiges, äußeres Membranprotein in E. coli, welches zur Gruppe der OMF („Outer Membrane Factor“) gehört. Drei TolC Protomere bilden einen homotrimeren Sekretionskanal der aus einem membranständigen „-barrel“ und einem periplasmatischen, „-barrel“ besteht. Zusammen mit einem plasmamembranlokalisierten Transporter und einem periplasmatischen, plasmamembranassozierten Membranfusionsprotein (MFP) bildet TolC verschiedene Sekretionskomplexe, welche für den unspezifischen Anitibotikaexport (MDE) und der Sekretion von sekundären Metaboliten sowie Proteinsubstraten verantwortlich sind. Der Plasmamembrantransporter und das spezifische MFP werden dabei meist in unmittelbarer, genomischer Nachbarscharschaft kodiert und zusammen als funktionale Einheit exprimiert. Durch Arbeiten von S. Moslavac und P. Staron konnte gezeigt werden, dass Anabaena sp. HgdD, zusammen mit dem ABC Transporter DevBCA für den Export von heterozysten spezifischen Glycolipiden und somit für die Assemblierung der HGL-Schicht verantwortlich ist (Moslavac et al., 2007a; Staron et al., 2011). Initiale Untersuchungen deuten ebenfalls auf eine Funktion in der Sekretion von Proteinsubstraten hin. Unter Verwendung von Ethidium Bromid als Modellsubstrat zur Untersuchung des Transports von Antibiotika und Sekundärmetaboliten konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass HgdD einen essentiellen und nicht-redundanten Sekretionskanal darstellt, welcher für denExport von Ethidium und Macrolide-Antibiotika verantwortlich ist. Die Deletion von hgdD führt zu einer deutlich erhöhten Ethidium- und Erythromycinsensitivität, welche mittels Transportanalysen auf eine gestörte Exportfunktion zurückzuführen war. Dabei ließ sich ein Model erstellen, mit dem sich einzelne Schritte in Aufnahme und Export enzymkinetsch beschreiben lassen. Die Aufnahme von Ethidium ist ein passiver, konzentrationsabhäniger Prozess, der sehr wahrscheinlich durch porinähnlich Proteine der äußeren Membrane ermöglicht wird. Bisher wurden neun Gene im Genom von Anabaena sp. identifiziert, welche für porinähnliche Proteine codieren. Drei dieser Proteine konnten bereits in früheren Arbeiten durch S. Moslavac in der äußeren Membran von vegetativen Zellen und Heterozysten nachgewiesen werden (Moslavac et al., 2005 und 2007b). Durch Entkoppelung der oxidativen Phosphorylierung mittels CCCP konnte gezeigt werden, dass der HgdD-abhängige Ethidiumexport durch den Protonengradienten der Plasmamembran energetisiert und somit durch eine Protonenpumpe, ähnlich AcrB in E. coli, angetrieben wird. AcrB gehört zur Familie der „Resistance-Nodulation and Cell-Division“ (RND) Transporter und bildet zusammen mit dem MFP AcrA und TolC einen tripartiten Proteinkomplex, der für den Export von Antibiotika, Gallensäuren, Tensiden und organischen Verbindungen verantwortlich ist. Durch Homologieuntersuchungen konnten insgesamt sechs Transporter der RND Familie im Proteom von Anabaena sp. identifiziert werden. Dabei ist All3143 der einzige Transporter, der mit Hilfe von CLANS mit einem für MDE beschriebennen RND (MexF) gruppiert wurde. Vier dieser Gene, darunter auch all3143, werden mit zunehmender Zellkulturdichte konstitutive exprimiert. Durch Wachstums- und Transportanalysen konnte gezeigte werden, dass All3143 der dominante RND Transporter mit Funktion in Ethidium- und Erythromycinexport darstellt, auch wenn wahrscheinlich ein zweiter, HgdD-abhängiger, Transporter in Ethidiumexport involviert ist. Darüber hinaus war es möglich den Ethidiumexportdefekt einer E. coli acrAB Mutante durch die heterologe Expression von All3143-All3144 teilweise zu komplementieren. Aufgrund dieser Ergebnisse wird vorgeschlagen All3143 und All3144 entsprechend als anaAcrAB zu benennen. Ein zweiter RND Transporter mit Funktion in Ethidiumexport ist wohlmöglich Alr4267, da die Insertionsmutante ebenfalls eine, wenn auch geringfügig, reduzierte Exportrate aufweist. Interessanterweise ist Alr4267 nicht in direkter Nachbarschaft zu einem MFP kodiert. Darauf hin wurde spekuliert, dass Alr4267 möglicherweise einen unspezifischen RND Transporter darstellt, welcher Proteinkomplexe mit anderen MFP bilden kann. Mit Hilfe von Strukturuntersuchungen durch S. Murakami sowie Exportanalysen mittels plasmamembran impermeabler Lactamantibiotika durch X. Z. Li wurde gezeigt, dass RND Transporter ihre Substrate direkt aus dem Periplasma aufnehmen und TolC-abhängig aus der Zelle transportieren (Li et al., 1994; Murakami et al., 2002). Dies setzt einen zweistufigen Exportmechanismus vorraus, bei dem toxische Substanzen, welche im Zytoplasma entstehen oder dorthin aufgenommen wurden, zunächst mit Hilfe von Sekundärtransportern ins Periplasma transportiert werden. Transporter des „Major Facilitator Superfamily“-Typs (MFS) stellen eine der größten Gruppen von Sekundärtransporter dar, für die MdfA aus E. coli bereits mit einer Funktion in MDE beschrieben wurde. Durch Homologieuntersuchungen konnten 22 MFS Transporter im Genom von Anabaena sp. Identifiziert werden. Darunter befindend sich SchE, welcher bereits durch K. Nicolaisen als Siderophore Exporter charakterisiert wurde. Durch Transportuntersuchungen von SchE- und SmsA (All2215)-Mutanten konnte gezeigt werden, dass beide Transporter in MDE von Anabaena sp. involviert sind. Interessanterweise zeigte sich, dass der Exportdefekt erst bei höheren Ethidium Konzentrationen ersichtlich wird, dann jedoch den Phenotyp der HgdD Mutante überschreitet. Während bei geringeren Ethidium Konzentrationen die Geschwindigkeit des All3143-HgdD abhänigen Exports ausreicht um eine Aufnahme ins Zytoplasma zu verhindern, wird bei höheren Konzentrationen die Kapazität von All3143-HgdD überschritten und Ethidium gelangt ins Zytoplasma. Der Ethidium Import wird aufgrund der positiven Ladung durch den Protonengradienten begünstigt und bedingt die erhöhte Aufnahmerate beider MFS Mutanten im Vergleich zur HgdD Mutante. Diese und weitere Ergebnisse unterstützen die allgemeingültige Vorstellung eines zweistufigen Exportprozesses, bei dem toxische Substanzen zunächt mittels Sekundärtransporter aus dem Zytoplasma ins Perplasma transportiert werden, von wo aus sie durch ein RND-TolC-System in den extrazellulären Raum expotiert werden können. Einem ähnlichlichen Mechanismuss liegt wahrscheinlich die Sekretion von Sekundärmetaboliten wie Siderophore zu Grunde. Siderophore sind kleine, peptidähnliche Chelatormoleküle welche zur Bindung und Aufnahme von Metallionen sekretiert werden. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HgdD für die Sekretion des Eisen(III) bindenden Siderophores Schizokinin verantwortlich ist. Wie bereits erwähnt wird diese Funktion in Zusammenarbeit mit dem MFS Transporter SchE ausgeführt. Da SchE jedoch keine TolC Interaktionsdomäne besitzt, ist eine direkte Interaktion zur Bildung eines SchE-TolC Sekretonskanals unwahrscheinlich. Auch wenn ein intermediärer Transport von Schizokinin ins Periplasma für einen RND-anhängigen Mechanismus spricht, konnte bisher kein RND Transporter mit einer spezifischen Funktion in Schizokinin Export Identifiziert werden. Dennoch ist nicht auszuschließen, dass solch eine Funktion möglicherweise von mehreren RND Transportern übernommen werden kann. Des weiteren spielen die beiden RND Transporter All3143 und Alr1656 eine Rolle bei der Proteinhomöostase der Photosysteme während der Fixierung von atmosphärischem Stickstoff. Die Photosysteme unterliegen aufgrund ihrer Photochemie einem hohen oxidativen Stress und müssen permanent ersetzt werden. Dieser Prozess wird durch erhöhtes Aufkommen von reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies behindert. Die erhöhte Atmungsaktivität in der anaeroben Umgebung von Heterozysten während der Stickstofffixierung führt zu einem erhöhten Aufkommen von Reaktiven Stickstoffspezies (RNS). Durch Arbeiten von Nishiyama und Fetar konnte gezeigt werden, dass die RND Transporter MdtF und MexF für den Export von RNS verantwortlich sind. Auch wenn eine direkte Verbindung zur Heterozystendifferenzierung oder Stickstoffmetabolismus nicht ausgeschlossen werden kann, wird spekuliert, dass Alr1656 und All3143 eine Rolle im Export von RNS spielen; ähnlich der Funktion von MdtF in E. coli und MexF in Pseudomonas aeruginosa. Dies bedarf jedoch jedoch weiterer experimenteller Evidenz. Zusätzlich zur Funktion in MDE konnte gezeigt werden, dass HgdD eine Rolle in der Sekretion von Proteinen spielt. Für E. coli wurde gezeigt, dass TolC, zusammen mit verschiedenen Transportern des ABC-Typs („ATP-binding cassette“), verantwortlich für die Sekretion großer Proteinsubstrate ist. Substrate dieses, als Type I bezeichneten, Sekretionswegs sind u. a. durch glycinreiche Sequenzmotieve („RTX repeats“) gekennzeichnet. Das am besten beschriebene System ist HlyBD/TolC, welches für die Sekretion von Hämolysin (HlyA) verantwortlich ist. Zur Untersuchung des Anabaena sp. Sekretomes, sowie einer möglichen Funktion von HgdD in Proteinsekretion wurde ein „in vivo“ System zur zeitaufgelösten und nativen Isolation von sekretierten Proteinen von Anabaena sp. entwickelt und etabliert. Damit war es möglich das Sekreome von Anabaena sp. zu isolieren und mit Hilfe von Prof. Karas (Frankfurt), 51 Proteine mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie zu identifizieren. Durch vergleichende Untersuchungen des Anabaena sp. Wildtyp und I-hgdD Sekretoms gelang es acht putative HgdD Substrate zu indentifizieren. Durch die „in silco“ Analyse putativer Sekretionssignale unter Verwendung mehrerer Vorhersagealgorythmen konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Darüber hinaus weisen drei der putativen HgdD Substrate eine deutlich erhöte Anzahl an Glycin-reichen Sequenzmotiven auf. Die HgdD-abhängige Lokalisierung wurde exemplarisch an vier ausgewählten Kandidaten durch die Isolation sekretierter Proteine und der Zellfraktionierung von Mutantenstämmen gezeigt, bei denen putative HgdD Substrate mit einem Hämagglutinin (HA)-Epitop fusioniert wurden. Wie erwartet konnte für alle HA-fusionierten Mutanten, welche ein funktionsfähiges HgdD exprimieren, eine extrazellulare Lokalisierung nachgewiesen werden. Die Abwesenheit eines HA-Signals in der unlöslichen und löslichen Zellfraktion läst auf einen hocheffizienten Sekretionsprozess schließen. Interessanterweise konnte für alle HA-Stämme, bei denen hgdD nicht exprimiert wird, kein signal detektiert werden, auch wenngleich die Expression aller rekombinanten Gene durch eine HA-spezifisch PCR-Analyse an isolierter cDNA nachgewiesen wurde. Die Abwesenheit detektierbarer Proteinmengen deutet auf ein hocheffizientes Sekretionssystem hin, welches die Akkumulation falsch lokalisierter Proteine durch proteolytischer Qualitätskontrolle verhindert.