Open Access

Christian Feißt

• Inflammation is a complex pathophysiological event that can be triggered by activation of a number of distinct activation pathways eventually leading to the release of pro-inflammatory molecules and enzymes. Among all cells involved in inflammatory processes, neutrophils, monocytes and platelets are of major relevance. Activation of leukocytes occurs via binding of agonists to distinct GPCRs leading to activation of G proteins and proximate signaling cascades. In short, GPCR activation by pro-inflammatory agonists such as fMLP, PAF or LTB4 leads to activation of G proteins that are associated with the receptor at the cytosolic side of the plasma membrane. G proteins consist of a Gα- and a Gβγ-subunit which are associated in the inactive state. In this state, G proteins bind GDP. Upon activation, GDP is replaced by GTP that results in the dissociation of the Gα- from the Gβγ-subunit. Both subunits are capable of activating distinct PLC-β isoenzymes that catalyze the turnover of PtdIns(4,5)P2 into the second messengers Ins(1,4,5)P3 and DAG. Every GPCR holds a distinct pattern of associated G proteins which preferentially activate distinct PLC-β isoenzymes. Ca2+ channels within the SR/ER-membrane function as specific receptors for Ins(1,4,5)P3. Ligation of Ins(1,4,5)P3 to this receptor causes a release of Ca2+ from intracellular stores into the cytosol that is subsequently followed by the influx of Ca2+ e through channels in the plasma membrane. Ca2+ represents an important signaling molecule, involved in the regulation of cellular processes and enzymes that mediate inflammatory events such as ROS formation and the release of degradative enzymes. 5-LO and COXs are involved in the biosynthesis of pro-inflammatory eicosanoids and catalyze the turnover of AA into LTs and PGs, respectively. Both enzymes play pivotal roles in the initiation and maintenance of allergic diseases and inflammatory processes. LTB4 is regarded as a potent chemotactic and chemokinetic substance, whereas the cysteinyl-LTs cause smooth muscle contraction and increased vascular permeability. Therefore, 5-LO inhibitors are assumed to possess therapeutic potential for the treatment of diseases related to inflammation. Besides the intervention with 5-LO activity, inhibition of COX-activity is an effective way to suppress inflammatory reactions. The two COX isoenzymes, namely COX-1 and COX-2 show different patterns in terms of tissue expression and sensitivity towards inhibitors. COX-1 is supposed to be constantly expressed whereas COX-2 expression is upregulated at sites of inflammation. The extract of H. perforatum is commonly used for the treatment of mild to moderate depressive disorders, accompanied by a moderate profile of side effects. The extract´s efficacy as an antidepressant can be traced back to the content of the phloroglucinol hyperforin which represents the most abundant lipophilic constituent. However, in folk medicine hypericum extracts are additionally used for the treatment of inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis or inflammatory skin diseases. In fact, it was shown that hypericum extracts and hyperforin possess anti-inflammatory potential. Hyperforin was described as a dual inhibitor of 5-LO and COX-1. The phloroglucinols MC and S-MC from M. communis significantly differ from the molecular structure of hyperforin. Hyperforin represents a monomeric prenylated derivative whereas MS and S-MC are non-prenylated oligomeric compounds. To date, the anti-inflammatory potential of SM and S-MC has not been investigated in detail. So far, solely antioxidant activity was attributed to MC and S-MC that indeed might qualify them as anti-inflammatory drugs. The phloroglucinols MC, S-MC and hyperforin are potent inhibitors of ROS formation and HLE release. However, any inhibitory potential of these compounds was only observed when cells were activated by GPCR agonists such as fMLP or PAF. In contrast, when cells were stimulated under circumvention of G protein-associated signaling cascades, the abovementioned inhibitors were not effective at all. In leukocytes, [Ca2+]i plays a pivotal role in signal transduction and regulation of the indicated pro-inflammatory cellular functions. We were able to show that MC, S-MC and hyperforin inhibited GPCR-mediated Ca2+ mobilization with approximately the same potency as the above-mentioned leukocyte responses. However, all of the indicated phloroglucinols were ineffective when cells were stimulated with ionomycin. Since ionomycin as well as GPCR agonists exert their effects by mobilizing Ca2+ i, it seems conceivable that MC, S-MC and hyperforin somehow interfere with G protein-associated signaling pathways. In order to investigate PLC as a potential target of hyperforin, the effects of hyperforin were compared to those of the broad spectrum PLC inhibitor U-73122. We found that both inhibitors acted in a comparable manner in terms of agonist-induced Ca2+ mobilization and in regard of the manipulation of basal Ca2+ levels in unstimulated cells. In this respect, significant differences between hyperforin and U-73122 were obvious for inhibition of total PLC activity in vitro. Thus, U-73122 blocked PLC activity whereas hyperforin was ineffective in this respect. This might indicate that only certain PLC isoenzymes are affected by hyperforin. Alternatively, other components within G protein-associated signaling pathways such as G proteins itself or the Ins(1,4,5)P3 receptor must be taken into account as putative targets of hyperforin. We were able to introduce MC and S-MC as novel dual inhibitors of 5-LO and COX-1. Interestingly, such a pattern was also described for hyperforin. MC and S-MC turned out to be direct inhibitors of 5-LO, based on the fact that they inhibit 5-LO not only in intact cells but also as purified enzyme in vitro. For MC and S-MC, great discrepancies were observed between the IC50 values concerning 5-LO inhibition and the concentrations that exert the antioxidative effects. It seems probable that 5-LO inhibition is not related to reduction of the active site iron as a result of the antioxidant activity of MC and S-MC but rather to direct interference with the 5-LO enzyme. The capability of MC and S-MC to suppress COX-1 activity seems not to be a unique effect of these phloroglucinols because for COX-1, the IBPC, present in both MC and S-MC, turned out to be the most active compound. ....
• Entzündungen sind komplexe pathophysiologische Ereignisse, die durch die Bildung von proinflammatorischen Mediatoren und/oder Enzymen hervorgerufen werden können. An der Aktivierung und Aufrechterhaltung dieser Vorgänge spielen neutrophile Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten eine zentrale Rolle. Ein initialer Schritt in der Aktivierung von Leukozyten ist die Bindung von spezifischen proinflammatorischen Agonisten (fMLP, PAF oder LTB4) an G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Diesen Rezeptoren sind auf der Innenseite der Plasmamembran sogenannte G Proteine angelagert, die aus einer Gα- und einer Gβγ-Untereinheit bestehen. Im inaktiven Zustand sind beide Untereinheiten miteinander assoziiert und an GDP gebunden. Als Folge einer Aktivierung wird GDP durch GTP ersetzt, woraufhin die Gα- von der Gβγ- Untereinheit dissoziiert. Beide Untereinheiten sind wiederum in der Lage, spezifisch bestimmte PLC-β-Isoenzyme zu aktivieren. PLC-β-Isoenzyme katalysieren den Umsatz von PtdIns(4,5)P2 in die beiden Second Messenger Ins(1,4,5)P3 und DAG. Somit verfügt jeder GPCR über ein individuelles Muster an assoziierten G Proteinen, die wiederum selektiv bestimmte PLC-β-Isoenzyme aktivieren. Ca2+-Kanäle innerhalb der Membran des SR/ER fungieren als selektive Rezeptoren für Ins(1,4,5)P3. Die Bindung von Ins(1,4,5)P3 an diesem Rezeptor führt zu einer Ausschüttung von Ca2+ aus internen Speichern ins Zytosol, gefolgt von einem sich anschließenden Einstrom von extrazellulärem Ca2+ durch Kanäle in der Plasmamembran. Im Rahmen der Regulation von zellulären Prozessen und Proteinen stellt Ca2+ ein wichtiges Signalmolekül dar und ist u.a. an der Regulation Sauerstoffradikalproduktion und der Freisetzung von degradativen Enzymen beteiligt. 5-LO und COX spielen in der Biosynthese von proinflammatorischen Eikosanoiden eine wichtige Rolle. 5-LO katalysiert die Bildung von Leukotrienen, wohingegen Cyclooxygenasen u.a. an der Synthese von Prostaglandinen beteiligt sind. Sowohl den Leukotrienen als auch den Prostaglandinen kommt bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Entzündungsprozessen eine zentrale Rolle zu. Beispielsweise besitzt LTB4 eine starke chemotaktische und chemokinetische Wirkung, wohingegen Cysteinyl-Leukotriene in der Lage sind, Kontraktionen der glatten Muskulatur auszulösen und die vaskuläre Permeabilität zu erhöhen. Aus diesem Grund wird 5-LO Inhibitoren großes therapeutisches Potential in der Therapie von entzündlichen Erkrankungen zugeschrieben. Neben der Inhibierung der Leukotrien-Biosynthese ist die Hemmung der Cyclooxygenase ein effektiver Weg, um Entzündungsreaktionen zu unterdrücken. Beide Isoenzyme, COX-1 und COX-2 zeigen unterschiedliche Muster bezüglich ihrer Gewebeexpression und Sensitivität gegenüber verschiedenen Inhibitoren. Von COX-1 wird angenommen, daß diese in konstanten Mengen exprimiert wird wohingegen die Expression von COX-2 an Entzündungsherden lokal stark erhöht ist. Johanniskrautextrakt wird häufig zur Behandlung von leichten bis mittelschweren Depressionen eingesetzt und verursacht gleichzeitig nur geringe Nebenwirkungen. Die antidepressive Wirkung des Extrakts ist direkt auf den Gehalt des Phloroglucinolderivats Hyperforin zurückzuführen, das zu den wichtigsten lipophilen Inhaltsstoffen des Extrakts zählt. Interessanterweise werden Johanniskrautextrakte in der Volksmedizin u.a. auch zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis oder entzündlichen Hauterkrankungen eingesetzt. Es existieren diesbezüglich auch wissenschaftliche Hinweise. Es wurde z.B. gezeigt, daß Hyperforin einen dualen Inhibitor von 5-LO und COX-1 darstellt. Die Phloroglucinole MC und S-MC (M. communis.) weichen stark von der molekularen Struktur des Hyperforins ab. Hyperforin stellt ein monomeres prenyliertes Phloroglucinolderivat dar, wohingegen MC und S-MC nicht prenyliert sind und eine oligomere Struktur besitzen. Bis zum heutigen Tag gibt es keine detaillierten Untersuchungen über MC und S-MC hinsichtlich ihres entzündungshemmenden Potentials. Es konnte lediglich gezeigt werden, dass MC und S-MC antioxidativen Eigenschaften besitzen, die eine antiinflammatorische Wirkung dieser Stoffe ermöglichen könnten. Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung der Phloroglucinole Hyperforin, MC und S-MC hinsichtlich ihres Potentials, entzündungsrelevante Leukozytenfunktionen wie die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und die Freisetzung von Leukozyten-Elastase zu unterdrücken. In diesem Zusammenhang war die Untersuchung von Struktur-Wirkungsbeziehungen verschiedener Hyperforinanaloga bezüglich ihres Potentials zur 5-LO Hemmung und die Aufklärung des molekularen Wirkmechanismus, der dieser Hemmung zugrunde liegt, von besonderem Interesse. Darüber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit U-73122 als neuer 5-LO Inhibitor identifiziert werden. Auch für U-73122 war die Aufklärung des zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismusses ein Ziel dieser Arbeit. Die Phloroglucinole MC, S-MC und Hyperforin stellen potente Inhibitoren der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und der Freisetzung von Leukozytenelastase dar. Jedoch war diese Wirkung nur zu beobachten, wenn die Zellen zuvor durch Aktivatoren von G Protein gekoppelten Rezeptoren wie fMLP oder PAF stimuliert wurden. Im Gegensatz hierzu zeigten alle drei Phloroglucinole keine Wirkung, wenn die Zellen unter Umgehung von G Proteingekoppelten Signalwegen (z.B. Ionomycin) aktiviert wurden....