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Devrishi Goswami

• Genes coding for membrane proteins make up 25%-30% of the genome in most organisms. Membrane proteins play an important role in cell functioning and their importance is enhanced by the fact that a large number of drugs are targeted at membrane proteins. Paradoxically, experimentally determined structures of membrane protein correspond to only about 1.7% of protein structures deposited in the protein data bank (PDB). This is largely due to the fact that membrane proteins are difficult to deal with owing to their amphipathic nature. The low abundance of membrane proteins in native tissue makes heterologous overexpression of these genes a necessity. This thesis work aimed at heterologous production of several secondary active transporter proteins for structural and functional characterizations and establishing alternative strategies to overcome the obstacles associated with heterologous overproduction. Four members of the heavy metal transporting cation diffusion facilitator (CDF) family from S. typhimurium and A. aeolicus were heterologously overproduced in E. coli and functionally characterized by an in vivo complementation assay using the zinc transport deficient E. coli GG48 strain. Out of these four, Aq_2073 from A. aeolicus was produced in large scale with substantial yield and purity sufficient to carry out structural studies. After extensive stability studies with different detergents, pHs and temperatures, the protein was subjected to 3D and 2D crystallization trials. Several C- terminal truncated constructs were made and the simultaneous crystallization screenings were carried out. These resulted in initial needle like crystals in 3D crystallization trials or optimum sized vesicles with crystalline patches in 2D crystallization trials but no obvious crystal. The protein showed significant increase in melting temperature in the presence of cadmium, when tested by differential scanning calorimetry. Another transporter, STM3880 of the potassium uptake permease (KUP) family from S. typhimurium, was heterologously overproduced in E. coli, purified by affinity chromatography, reconstituted into artificial liposome and functionally characterized by solid supported membrane based electrophysiology. In order to establish alternative expression strategies, continuous exchange cell free expression (CECF) of proteins from four different families was carried out. This method found to be aptly complementing the cell-based production approach. Targets from resistance to homoserine/threonine (RhtB) family not expressing in vivo could be expressed and purified using CECF. STM1781 of the sulfate permease (SulP) family was expressed, purified and characterized for stability while the cell-based production resulted in extensive degradation. PF0780 of multidrug/oligosaccharidyllipid/polysaccharide flippase (MOP) family was also purified to homogeneity and the stability was comparable to in vivo produced protein. Moreover, the effect of maltose binding protein (MBP) fusion at N-terminus on production and membrane integration was tested with three selected targets. The analysis revealed decreased yields in the presence of MBP if the protein had both termini in the cytoplasm. This work succeed in heterologously overproducing and establishing purification protocols for several secondary active transporters aiming at structural and functional characterization in a structural genomics framework. It also showed that integration of alternative strategies, like employing both cell-based and cell-free heterologous expression systems, expands the overall expression space coverage and in turn increases the chance of success of a structural genomics styled project.
• In den meisten Organismen kodieren 25%-30% des Genoms für Membranproteine. Sie spielen eine wichtige Rolle für die Zellfunktion, und ihre Bedeutung wird verstärkt durch die Tatsache, dass viele Medikamente an Membranproteinen angreifen. Paradoxerweise entfallen lediglich 1,7% der hinterlegten Proteinstrukturen in der protein databank (PDB) auf experimentell ermittelte Strukturen von Membranproteinen. Dies ist hauptsächlich auf die schwierige Handhabung, bedingt durch ihren amphipathischen Charakter, zurückzuführen. Das geringe Vorkommen in natürlichen Geweben macht die heterologe Überexpression dieser Gene zu einer Notwendigkeit. Diese Arbeit zielte darauf ab, verschiedene sekundär aktive Transportproteine für strukturelle und funktionelle Untersuchungen heterolog zu produzieren und alternative Strategien zu etablieren, um die Hürden im Zusammenhang mit der heterologen Überexpression zu überwinden. Vier Mitglieder der Schwermetall-transportierenden cation diffusion facilitator (CDF) Familie aus S. typhimurium und A. aeolicus wurden heterolog in E. coli produziert und durch einen in vivo Komplementationsassay unter Zuhilfenahme des Zink-Transport defizienten E. coli Stammes GG48 funktionell charakterisiert. Von diesen vier Proteinen konnte Aq_2073 aus A. aeolicus im präparativen Maßstab mit einer beachtlichen Ausbeute und Reinheit hergestellt werden, um strukturelle Untersuchungen durchzuführen. Nach umfangreichen Stabilitätsuntersuchungen mit verschiedenen Detergenzien, pH-Werten und Temperaturen wurden 2D sowie 3D-Kristallisationsversuche unternommen. Zusätzlich wurden mehrere C-terminal verkürzte Konstrukte hergestellt, welche ebenfalls für Kristallisationsversuche genutzt wurden. Diese ergaben in 3D-Kristallisationsversuchen erste nadelähnliche Kristalle oder in 2D-Kristallisationsversuchen Vesikel mit kristallinen Stellen, aber keine offensichtlichen Kristalle. Das Protein besaß eine signifikant höhere Schmelztemperatur in Gegenwart von Cadmiumionen wie durch differential scanning calorimetry (DSC) gezeigt wurde. Ein weiterer Transporter, STM3880 aus der potassium uptake permease (KUP) Familie aus S. typhimurium, wurde in E. coli heterolog exprimiert, durch Affinitätschromatographie gereinigt, in künstliche Liposomen rekonstituiert und durch elektrophysiologische Untersuchungen mit Festphasen-gestützten Membranen (solid supported membranes; SSM) funktionell charakterisiert. Um alternative Expressionsstrategien zu etablieren, wurden Proteine von vier verschiedenen Familien zellfrei unter kontinuierlichem Austausch (continuous exchange cell free expression; CECF) produziert. Diese Methode schien geeignet, um den zellbasierten Ansatz zu komplementieren. Zielproteine der resistence to homoserine/threonine (RhtB) Familie, die in vivo keine Expression zeigten, konnten so hergestellt und gereinigt werden. STM1781 aus der sulfate permease (SulP) Familie konnte zellfrei hergestellt, gereinigt und hinsichtlich seiner Stabilität charakterisiert werden, wohingegen die zellbasierte Produktion in starkem Abbau resultierte. PF0780 der multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide flippase (MOP) Familie wurde ebenfalls zur Homogenität gereinigt und zeigte eine vergleichbare Stabilität zum in vivo produzierten Protein. Des Weiteren wurde der Effekt einer Fusion des Maltose bindenden Proteins (MBP) am N-Terminus auf die Produktion und Membranintegration bei drei verschiedenen Proteinen untersucht. Die Analyse ergab eine verringerte Ausbeute in Anwesenheit des MBPs, wenn sich beide Termini des Proteins im Cytoplasma befanden. In dieser Arbeit konnten verschiedene sekundär aktive Transporter erfolgreich hergestellt und entsprechende Reinigungsprotokolle etabliert werden, die darauf abzielen strukturelle und funktionelle Untersuchungen im Rahmen eines structural genomics Projektes durchzuführen. Es zeigte sich, dass die Einbindung alternativer Strategien wie die Anwendung zellbasierter und zellfreier Expressionssysteme, die Gesamtanzahl herstellbarer Proteine steigert und damit die Erfolgsaussichten derart angelegter Projekte verbessert.