Structural biology of prion protein using NMR spectroscopy
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Strukturbiologie des Prionproteins
- Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare but fatal neurodegenerative diseases affecting human and animals. The prion protein which is the causative agent, according to “protein-only” hypothesis misfold in to rogue amyloid conformer. Despite several years of studies, the atomic structural details of the rogue conformers have not been clearly understood. This study focused on developing an in-vitro conversion method, which allows us to monitor the transition from unfolded state of prion protein to fibril state. In order to reach maximal unfolded state, we have used 8 M urea as chemical denaturant, pH 2 and prion fragment 90-230 as the model. It has been demonstrated earlier that acidic pH and mild denaturant induce the fibril formation. The mechanism underlying the structural transition from monomeric state to polymeric form is largely unknown. We have confirmed by EM and AFM that fibrils are formed in our conditions, which resemble to naturally occurring fibrils in morphologies observed. The agitation accelerates the rate of fibril formation and, which allow us to do time-resolved NMR on these preparations. The conformational flexibility is inherent to amyloid fibrils and has been observed in our preparations. We aimed to map the important segment of prion protein, which forms the rigid core in its fibrillar structured form. Our time-resolved NMR studies allowed us to monitor the changes happening from unfolded state to fibrillar state. Analysis of data identified the segment between residues 145 to 223 forming the rigid core in these fibrils, which correspond to β strand 2, helix 2 and major part of helix 3 of native prion monomeric structure. Most of the point mutations which are associated with hereditary prion disease are part of rigid core, which undergo a refolding on fibril formation. The C-terminal residues from 224 to 230 displayed peak shifting and therefore, indicate the adaptation to a fibril specific conformation. The major part of N-terminal 90-144 segment, remains dynamic, which can be understood by their accessibility to amyloid specific antibodies. This provides novel structural insight to the amyloid formation from unfolded state of prion protein fragment 90-230, which represents the proteinase-K resistant part naturally occurring prions. Earlier studies have established the core to 160-220 where hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry or site-directed spin labeling EPR spectroscopy was used for analysis. Those studies have been initiated from either native-like or partially unfolded state of recombinant prion protein, and therefore, it is quite striking to find out that fibrils initiated from unfolded monomeric state share the same “amyloid core”. This structural insight has important implications for understanding the molecular basis of prion propagation.
- Die Transmissible Spongiforme Enzephalopathie (TSE) (deutsch „Übertragbares schwammartiges Hirnleiden“) sind seltene aber tödliche neurodegenerative Erkrankungen die sowohl bei Menschen als auch bei Tieren auftreten können. Der Krankheitserreger, das Prionprotein, liegt basierend auf der „protein-only“ Hypothese, in fehlgefalteten entarteten Amyloid-Konformationen vor. Trotz jahrelanger Untersuchungen sind atomar aufgelöste, strukturelle Einzelheiten der entarteten Konformationen bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer in-vitro Konvertierungsmethode, die die Beobachtung des Überganges der ungefalteten Konformation des Prionproteins hin zur Fibrillenbildung ermöglicht. Um die höchstmögliche Effizienz des entfalteten Zustandes zu erreichen, wurden 8 M Harnstoff zum Zwecke der chemischen Denaturierung bei einem pH-Wert von 2 und das Prionenfragment 90-230 als Modellsystem eingesetzt. Wie bereits zuvor gezeigt, induzieren azide pH-Werte und milde Denaturierungsmittel die Ausbildung von Fibrillen. Der Mechanismus, der dem strukturellen Übergang von einem monomerem Zustand hin zu polymeren Konformationen zu Grunde liegt, ist weitestgehend unbekannt. Unter Verwendung der Methoden EM und AFM konnte gezeigt werden, dass unter den hier eingesetzten Bedingungen eine Fibrillenbildung stattfindet, die in der Morphologie den natürlich vorkommenden Fibrillen entsprechen. Die Agitation beschleunigt die Geschwindigkeit der Fibrillenbildung und ermöglichte damit deren Untersuchung mittels zeitaufgelöster NMR-Methoden. Die konformationelle Flexibilität ist Amyloid-Fibrillen inhärent und wurde in den hier durchgeführten Untersuchungen beobachtet. Ziel der hier vorgestellten Arbeit war es, das Segment des Prionproteins zu analysieren, welches in den Fibrillenstrukturen den starren Kern ausbildet. Die zeitaufgelösten NMR Untersuchungen ermöglichten die Aufnahme der Veränderung in der Umwandlung des ungefalteten Zustandes hin zur Fibrillenstruktur. Die Analyse ergab, dass das Segment der Reste 145-223 den starren Kern dieser Fibrillen bildet. Dieses Segment entspricht dem beta-Strang 2, Helix 2 und dem wesentlichen Teil von Helix 3 der nativen monomeren Prionenstruktur. Die meisten Punktmutationen, die mit erblichen Prionen-Krankheiten in Verbindung gebracht werden, befinden sich in diesem starren Kern, der in Folge der Fibrillenausbildung eine Umfaltung eingeht. Die C-terminalen Reste 224-230 weisen chemische Verschiebungsänderungen auf und deuten somit auf eine Anpassung der entsprechenden Struktur auf eine spezifische Fibrillen-Konformation hin. Der wesentliche Teil des N-terminalen Segments 90-144 bleibt dynamisch, was möglicherweise durch deren Zugänglichkeit für Amyloid-spezifische Antikörper erklärt werden kann. Die hier dargestellten Untersuchungen liefern neue strukturelle Einblicke in die Amyloid-Ausbildung ausgehend vom ungefalteten Zustand des Prionenprotein-Fragmentes 90-230, welches den Proteinase-K resistenten Teil natürlich vorkommender Prionen darstellt. Vorangegangene Untersuchungen, die auf Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie oder ortsgerichteten Spinmarkierungstechniken und EPR Spektroskopie basierten, ermittelten, dass die Reste 160-220 diesen Kern ausbilden. Diese Untersuchungen wurden von entweder nativ-ähnlichen oder teilweise ungefalteten Zuständen des rekombinanten Prionenproteins initiiert. Daher ist es durchaus auffällig, dass Fibrillenstrukturen, die ausgehend von einem ungefalteten monomeren Zustand aus initiiert wurden den gleichen „Amyloid-Kern“ aufweisen. Diese strukturellen Erkenntnisse haben bedeutende Auswirkungen auf das molekulare Verständnis der Prionen-Verbreitung.
Author: | Jitendra KumarORCiD |
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URN: | urn:nbn:de:hebis:30-86503 |
Referee: | Harald SchwalbeORCiDGND |
Document Type: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Date of Publication (online): | 2010/12/14 |
Year of first Publication: | 2010 |
Publishing Institution: | Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg |
Granting Institution: | Johann Wolfgang Goethe-Universität |
Date of final exam: | 2010/12/06 |
Release Date: | 2010/12/14 |
Tag: | Amyloidkern; Fibrillen; PrP27-30 Amyloid; Fibrils; NMR Spectroscopy; Prion Protein; TSE |
GND Keyword: | NMR-Spektroskopie; Prionprotein; Amyloid; Harnstoff |
HeBIS-PPN: | 229650759 |
Institutes: | Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie |
Dewey Decimal Classification: | 5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften |
Sammlungen: | Universitätspublikationen |
Licence (German): | Deutsches Urheberrecht |