Open Access

Sabine Heidmeier

• Life-attenuated measles virus (MV) vaccines have revealed their capacity to routinely induce life-long immunity against MV after just a single or two low-dose injections. Moreover, MV vaccines have been shown to be extensively safe and well tolerated, in general. Thus, MV is a prime candidate for a recombinant vaccine platform to protect also against other pathogens after vaccination. For this purpose, foreign genes can be inserted into additional transcription units (ATU) in recombinant MV genomes so that the encoded foreign proteins are co-expressed with MV proteins in infected cells. These so-called bivalent MV should protect against infection by MV or the pathogen, which the encoded foreign protein had been derived from. Bivalent MVs have already been shown to be effective vaccines against e.g. dengue virus or hepatitis B virus infections by inducing humoral and sometimes also cellular immune responses. In most of these studies, soluble or soluble versions of the pathogens' antigens were used for generation of bivalent MVs. We hypothesized that the form of the antigen expressed by bivalent MVs is crucial for the potency and constitution of the induced immune responses. Therefore, three different forms of an antigen expressed by bivalent MVs were analyzed, here. The model antigen chosen for this purpose has been the envelope protein (Env) of SIVsmmPBj1.9. In its natural mature form, Env is composed of the surface unit gp120 and the transmembrane unit gp41, which stay non-covalently linked after proteolytic processing of the common precursor protein gp160. However, gp120 can be shed by infected cells or virus particles. Therefore, natural gp160 antigen was used as shedding form. Furthermore, stabilized covalently-linked gp160 variants and soluble gp140 variants were used in this thesis. These different antigen forms were inserted either behind the P or behind the H expression cassettes into the MV genome. The respective bivalent MVs were rescued and characterized. Expression of SIVsmmPBj1.9 Env variants by the bivalent MVs was confirmed by immuno blot and in situ immunoperoxidase assays. Replication curves of bivalent MV showed that growth of MVs expressing the different Env variants was slightly delayed by approximately 24 h compared to control viruses. For immunization of transgenic, MV-susceptible IFNAR-/--CD46Ge mice, which are the current standard to analyze MV vaccines in a small animal model, an optimal dose of 1x105 TCID50 was determined. For the evaluation of humoral immune responses in transgenic mice, two ELISA systems for the detection of total α-MV and α-SIV antibodies and neutralization assays for detection of neutralizing antibodies against MV and SIV in sera of immunized mice were established. Mice immunized with any of the bivalent MVs showed significant humoral immune responses against MV comparable to those elicited by the parental MV vaccine strain without further genetic modifications. Mice immunized with MVvac2-gp140(P) expressing the soluble gp140 variant revealed highest α-SIV titers with a maximal OD of up to 0.4. Second highest levels of α-SIV antibodies were detected in mice that were immunized with the shedding variants or soluble Env in other positions. MVs expressing the stabilized variants induced only very low α-SIV antibody titers. Neutralizing antibodies directed against SIV could be detected in sera of mice immunized with MVs expressing the soluble or shedding variants, but not in sera of mice immunized with MVs expressing the stabilized variants. In sera of control mice immunized with PBS no antibodies could be detected, as expected. Thus, soluble and shedding antigens induced humoral immune responses, whereas stabilized antigens induced only weak humoral immune responses but no neutralizing antibodies. Analysis of cellular immune responses is still ongoing. Besides Env, further SIV antigens could be tested for their potency to induce humoral as well as cellular immune responses. Besides being used as a vaccine platform, recombinant MVs are evaluated as future agent for cancer therapy due to their significant inherent tumor-lytic, so-called oncolytic activity. Currently, the anti-tumoral activity of MV is analyzed in clinical phase I trials. MV strains with high fusion activity are used as oncolytic agents. The fusion protein F of MV strain NSe is highly fusogenic, in contrast to e.g. F of MVwt323, a clone of the pathogenic strain IC-B. Sequence analysis of these two proteins identified one coding nucleotide difference at aa 94 in the F2 domain: a valine (V) in FNSe and a methionine (M) in Fwt323. To evaluate impact of this difference, residues at aa 94 were exchanged. After transient-transfection of MV F and H expression plasmids in receptor-positive cells, V94 in the F2 subunit of FNSe or Fwt323 led to about 6-fold higher fusion activity compared to F proteins with M94. The co-expressed H protein (HNSe or Hwt323) did not influence fusion activity, indicating that the receptor (CD46 or SLAM) bound by H does not quantitatively affect the F proteins' activation. Analysis of F and H showed that formation and transport of MV glycoprotein complexes are not altered by substitution in aa 94 of FNSe or Fwt323. Furthermore, recombinant MVNSe, MVNSe-F-M94, MVwt323, or MVwt323-F-V94 were rescued. Viral replication revealed slightly higher titers for recombinant MVs expressing M94 in F after 96 h of replication, compared to MVs expressing V94. MVs expressing V94 in F2 showed 2.5-fold higher fusion activity on CD46- and SLAM-positive Vero-hSLAM cells and 2-fold higher fusion activity on B95a cells expressing only SLAM compared to MVs expressing F with M94. Fusion activity of recombinant MVs can thus be modulated by substituting a single aa. V94 in the F protein results in highly fusion active MVs with possibly increased direct cytotoxicity in infected tumors, whereas M94 in F could be associated with decreased fusion activity for therapies, where higher virus titers are required.
• Attenuierte Masernvirus (MV) Lebendimpfstoffe werden seit Jahren erfolgreich zur Impfung gegen die Masern eingesetzt. Diese Impfstoffe sind sehr effizient und werden in der Regel sehr gut vertragen. Aufgrund dieser Eigenschaft sind MV eine interessante Vakzin-Plattform auch zur Immunisierung gegen andere Pathogene. Antigene anderer Pathogene können in zusätzliche Transkriptionseinheiten (ATUs) des MV-Genoms kloniert werden, so dass diese Antigene parallel zu den MV Proteinen exprimiert werden. Diese so genannten bivalenten MVs können dann sowohl für eine Immunisierung gegen MV als auch gegen andere Pathogene verwendet werden. In entsprechenden Studien wurden bisher v.a. humorale, teilweise aber auch zelluläre Immunantworten sowohl gegen MV als auch gegen das jeweilige Pathogen induziert. In den meisten dieser Studien wurden zur Generierung bivalenter MVs lösliche Formen der Antigene der fremden Pathogene verwendet. Die hier vorliegende Arbeit basiert auf der Hypothese, dass die Form des Antigens, welches von bivalenten MVs exprimiert wird, eine wichtige Rolle für die Qualität und Stärke der induzierten Immunantwort spielt. Deshalb wurden drei verschiedene Formen des Hüllproteins (Env) von SIVsmmPBj1.9 als Modelantigen in dieser Arbeit analysiert. Normalerweise besteht Env aus der Oberflächenuntereinheit gp120 und dem Transmembranprotein gp41, die aus einem gemeinsamen Oberflächenprotein (gp160) proteolytisch gespalten werden, aber nicht-kovalent verbunden bleiben. Das gp120 Protein kann in den Überstand abgespalten werden („Shedding“). Außer dem scherenden gp160 wurden noch stabilisierte gp160 Varianten mit kovalenter Bindung zwischen gp120 und gp41 sowie lösliche gp140 Varianten als Modellantigene verwendet. Die verschiedenen Env Varianten wurden entweder hinter die P- oder hinter die H-Genkassette in das MV Genom kloniert. Mithilfe dieser Genomplasmide wurden rekombinante MVs generiert. Die Expression der Env Proteine durch die bivalenten MVs wurde mittels Immunblot und Immunhistochemie nachgewiesen. Das Wachstum der bivalenten MVs war im Vergleich zu den Kontrollviren um 24 h verzögert. Zur Evaluation der humoralen Immunantwort wurden in dieser Arbeit zwei ELISA Systeme sowie Neutralisationsassays etabliert, um sowohl bindende als auch neutralisierende Antikörper gegen MV sowie SIV in Seren von immunisierten Tieren nachzuweisen. Für die Immunisierung der IFNAR-/--CD46Ge Mäuse in einem Prime-Boost-Schema wurde eine optimale Dosis von 1x105 TCID50 ermittelt. Die Mäuse zeigten nach Immunisierung mit den bivalenten MVs eine deutliche humorale Immunantwort gegen MV unabhängig vom zusätzlich exprimierten Fremdantigen. Tiere, die mit MVvac2-gp140(P) immunisiert wurden, hatten die höchsten α-SIV Titer. Außerdem induzierte die Immunisierung mit MVs, die lösliche oder scherende Env Varianten exprimieren, sowohl bindende als auch neutralisierende Antikörper gegen SIV, während MV mit stabilisierten Antigen-Varianten nur geringe Titer an bindenden Antikörpern und keine nachweisbaren neutralisierenden Antikörper induzierten. Somit konnten die löslichen und scherende Antigene signifikante humorale Immunantworten induzieren, während die Immunisierung mit stabilisierten Antigenen nur schwache humorale Immunantworten indizierte. Die zelluläre Immunantwort wurde in dieser Arbeit nicht abschließend untersucht, ist aber Bestandteil laufender Projekte. Außerdem beeinflusste neben der Form des Antigens auch die Position im MV Genom die Stärke der humoralen Immunantwort, da Viren mit dem Antigen-Gen in post-P Position höhere Antikörpertiter induzierten als Viren mit der gleichen Antigenvariante in der ATU post-H. Damit ist neben der Form des Antigens auch die Position im MV Genom entscheidend für die Stärke der humoralen Immunantwort. Rekombinante MVs werden aber nicht nur als neue Vakzin-Plattform, sondern auch für die Anwendung in Krebstherapien entwickelt. Eine MV Infektion induziert in infizierten Zellen Zell-Zell-Fusion, was zu einer Ausbildung vielkerniger Riesenzellen, sogenannter Synzytien, und schließlich zur Lyse der infizierten Zellen führt. Aufgrund dieser zytotoxischen Aktivität können Tumorzellen von MVs lysiert werden. Zurzeit wird die anti-tumorale Aktivität von rekombinanten MVs in klinischen Phase I-Studien untersucht. Als onkolytisches Virus wird der Impfstoff-abgeleitete Stamm MVNse verwendet. Das Fusions-Protein F von MVNse ist hochgradig fusogen, im Gegensatz z.B. zum F des wt Stammes IC-B. Eine Sequenzanalyse beider F Proteine zeigte nur einen Unterschied an Position 94 in F2: ein Valin (V) in FNSe und ein Methionin (M) in Fwt323. Die jeweiligen F Varianten mit einer Aminosäure-Substitution an Position 94 wurden in dieser Arbeit erzeugt. V94 in FNse oder Fwt323 führte nach transienter Ko-Expression mit MV-Hämagglutinin (H) zu einer 6-fach höheren Fusionaktivität im Vergleich zu F Proteinen mit M94 bei gleicher Expressionsstärke und Glykosylierungsmustern. Das ko-exprimierte H Protein (HNSe oder Hwt323) hatte keinen Einfluss auf die Fusionsaktiviät. Das bedeutet, dass die Aminosäure an Position 94 weder die Bildung des Glykoproteinkomplexes, dessen Transport zur Zelloberfläche, noch die Rezeptorbindung des Glykoproteinkomplexes moduliert. Um diese Daten auch im Virus zu verifizieren, wurden rekombinante MVNSe- sowie MVwt323-Varianten mit M94 bzw. V94 in F2 generiert. MVs mit M94 hatten höhere Titer im Vergleich zu MVs mit V94. MVs mit V94 zeigten eine 2,5-fach höhere Fusionsaktivität auf Vero-hSLAM Zellen und eine 2-fach höhere Fusionsaktivität auf B95a Zellen als MVs mit M94 in F2. Die Fusionsaktivität rekombinanter MVs kann somit durch Mutation einer einzigen AS in F2 moduliert werden. MVs mit erhöhter Fusionsaktivität könnten in Krebstherapien, für die eine erhöhte Zytoxizität notwendig ist, Anwendung finden. Rekombinante MVs mit geringer Fusionsaktivität könnten für Therapien, in denen v.a. ein hoher Titer erwünscht ist, verwendet werden.