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Nithya Raman

• Ribosomes are the central cellular assembly lines for protein synthesis. To cope with the translational needs, a proliferating mammalian cell can produce up to 7500-ribosomes per minute. However, under growth limiting conditions, such as nutrient depletion, ribosome synthesis is rapidly shut down exemplifying the importance of a tight coordination between ribosome supply and cellular energy status. In addition to the quantitative regulation, a strict quality control of ribosome synthesis is equally important, because alterations in the composition or function of ribosomes can lead to a variety of pathologies. To cope with these challenges a highly regulated, multi-step pathway of ribosome biogenesis has evolved. In mammals this pathway generates the mature 80S ribosomes that comprise the large 60S and the small 40S subunits. Together they contain around 80 ribosomal proteins and the 28S, 18S, 5.8S and 5S rRNAs. The 28S, 5.8S and 5S rRNAs are assembled into the large subunit, while the 18S rRNA is part of the small subunit. The pathway of ribosome biogenesis is a multi-step cellular process, where specific stages occur in distinct subcellular compartments. Transcription of the 47S rRNA, which is the precursor for the 28S, 18S and 5.8S species, occurs in the nucleolus. Modification of distinct bases and early processing of this precursor also take place in the nucleolus. Subsequently, the 40S and 60S pre-ribosomes take separate maturation routes through the nucleoplasm before their export and final assembly in the cytoplasm. The various stages of preribosomal maturation require the constant and sequential action of a large number of non-ribosomal proteins, known as trans-acting factors. These factors coordinate the delicate remodeling of the pre-ribosomal intermediates and thereby ensure proper progression of the maturation process. The remodeling events largely depend on the dynamics of post-translational modifications, such as phosphorylation or SUMOylation. This requires that the enzymes controlling these modifications are properly targeted to their sites of activity as they fulfill their functions within specific compartments. Here we studied the regulatory principles that govern the subcellular partitioning of the SUMO-specific isopeptidase SENP3 and its associated factor PELP1. Previous work from our laboratory has delineated the importance of the SUMO system for proper ribosome biogenesis in mammalian cells. In particular, we have shown that SENP3 is critically involved in 28S rRNA formation, which is a key step for pre-60S subunit maturation. A critical involvement of SENP3 at this stage of the maturation process is in agreement with the observed enrichment of SENP3 in the nucleolus, since 28S rRNA processing is considered to occur in the nucleolus. Our subsequent work identified the nucleolar scaffold protein NPM1 and the ribosomal trans-acting factor PELP1 as bona fide substrates of SENP3. For both proteins we could demonstrate modification by SUMO2/3 and define SENP3 as the demodifying enzyme. Depletion of SENP3 enhanced the conjugation of SUMO to both proteins and concomitantly reduced conversion of the 32S pre-rRNA to the mature 28S rRNA. PELP1 is part of a larger protein complex consisting of the core components PELP1, TEX10 and WDR18. We could show that the balanced SUMOylation/deSUMOylation of PELP1 controls the nucleolar/nucleoplasmic distribution of this complex. Enhanced SUMOylation, which is observed in the absence of SENP3, triggers the nucleolar release of the complex suggesting that SENP3-mediated deSUMOylation controls the dynamics of nucleolar trans-acting factors. Based on these findings we first wanted to understand, in which cellular compartment(s) SENP3 exerts its function on 28S maturation. Next, we wanted to tackle the question how the subcellular distribution of SENP3 is controlled. Finally we addressed the question how the SUMOylation of PELP1 determines the subnuclear distribution of the PELP1 complex. This work initially revealed that the nucleolar localization of SENP3 is crucial for proper 28S rRNA formation and 60S ribosome maturation. Importantly, we could demonstrate that the nucleolar compartmentalization of SENP3 depends on its direct physical interaction with NPM1. Further, we could show that the amino-terminal region of SENP3 is necessary for its binding to NPM1 and nucleolar recruitment. Strikingly, this interaction requires the phosphorylation of SENP3, which is brought about by the mTOR kinase. By in-vitro kinase assays and mass-spectrometric approaches we identified five serine/threonine residues within the amino-terminal region of SENP3 that are targeted by mTOR (S/T 25, 26, 141, 142, 143). We could further demonstrate by mutagenesis that these sites in SENP3 are in fact critical for the phospho-dependent binding of SENP3 to NPM1 and its nucleolar recruitment. Consistent with these data, we found that chemical inhibitors of the mTOR kinase trigger the nucleolar release of SENP3 and impair its interaction with NPM1. Strikingly, this goes along with severe 28S rRNA maturation defects demonstrating the physiological importance of mTOR signaling in the regulation SENP3 function and rRNA processing. By specifically depleting components of the either mTORC1 or mTORC2, we could attribute the observed effects to signaling by mTORC1 rather than mTORC2. In an attempt to find the negative regulators of SENP3 phosphorylation, we identified PP1-γ as the candidate phosphatase in this pathway. We found a strong physical interaction of SENP3 with PP1-γ and observed a loss of SENP3 nucleolar localization upon ectopic expression of PP1-γ. Thus we could define mTOR/PP1-γ mediated phosphorylation/dephosphorylation of SENP3 as an important mechanism in the control of ribosome maturation. Given that mTOR activity is controlled by nutrient availability, SENP3 functions as a sensor that couples ribosome synthesis with nutrient availability. The second part of this work delineated the role of SUMOylated PELP1 in nucleoplasmic partitioning of the SENP3-PELP1 complex. It was revealed that the AAA-ATPase MDN1 binds preferentially to SUMO modified PELP1 and likely segregates SUMOylated PELP1 from nucleolar pre-60S particles. We initially found that the PELP1 complex associates with MDN1, a factor known to be involved in the 28S rRNA maturation. Notably, depletion of MDN1 led to an enhanced accumulation of the PELP1 complex in the nucleolus and a strong association of PELP1 with pre-60S particles, suggesting that MDN1 is required for the release of this complex from the pre-ribosomes. Intriguingly, the interaction of PELP1 with MDN1 requires SUMO2/3 and SUMOylated PELP1 shows enhanced binding to MDN1 when compared to unmodified PELP1. Taken together this work provides new insights in the control of the SENP3-PELP1 complex dynamics. We could define several layers for the coordinated spatial regulation of SENP3 and the PELP1 complex. This work therefore underscores the crucial importance of dynamic post-translational modifications for the control of ribosome maturation.
• Ribosomen sind ein zentraler Bestandteil der zellulären Maschinerie zur Proteinbiosynthese. Um die hohe Proteinsyntheserate in proliferierenden Säugerzellen sicherzustellen, können bis zu 7500 Ribosomen pro Minute produziert werden. Unter wachstumslimitierenden Bedingungen, wie beispielweise Nährstoffmangel, wird die Synthese von Ribosomen dagegen schnell abgeschaltet. Dies belegt, dass die Neusynthese von Ribosomen eng mit dem zellulären Metabolismus und der Stoffwechsellage gekoppelt sein muss. Neben der strengen quantitativen Kontrolle ist auch eine engmaschige Qualitätskontrolle bei der Herstellung von Ribosomen erforderlich, da eine fehlerhafte Zusammensetzung von Ribosomen durch Störungen der Proteinbiosynthese verschiedene schwerwiegende Erkrankungen nach sich ziehen kann. Um sowohl den quantitativen und qualitativen Erfordernissen Rechnung zu tragen, hat sich ein komplexer, mehrstufiger Prozess der Ribosomenbiogenese herausgebildet. Eukaryotische Ribosomen bestehen aus einer großen 60S und einer kleinen 40S Untereinheit, die nach ihrer Assemblierung zu Beginn der Proteinbiosynthese zusammen das vollständige 80S Ribosom bilden. Reife 80S Ribosomen bestehen aus etwa 80 sogenannten ribosomalen Proteinen, sowie vier verschiedenen ribosomalen RNA (rRNA) Molekülen. Die kleine Untereinheit enthält die 18S rRNA, die große Untereinheit die 5S, 5.8S und 28S rRNA. Im Verlauf der Ribosomenbiogenese, die auch als Ribosomenreifung bezeichnet wird, werden diese rRNA Moleküle schrittweise unter Beteiligung von mehr als 200 regulatorischen Faktoren mit den ribosomalen Proteinen zusammengefügt. Charakteristisch für den Prozess der Ribosomenreifung ist die Beteiligung verschiedener zellulärer Kompartimente. Ausgangspunkt ist die Synthese einer 47S Vorläufer-rRNA durch RNA Polymerase I im Nukleolus. Die 47S rRNA ist das Vorläufermolekül für die 28S, 18S und 5.8S rRNA Formen, die durch schrittweise Prozessierung aus der 47S rRNA generiert werden. Hierzu wird die 47S Vorläufer-rRNA zunächst in nukleoläre Ribonukleotidpartikel verpackt, in denen es zur Modifizierung einzelner Basen und der initialen Prozessierung der rRNA kommt. Die nachfolgende Assemblierung und weitere Reifung der Vorstufen für die 60S und 40S Untereinheiten erfolgt auf getrennten Wegen. Die als Prä-40S bezeichneten Vorstufen der kleinen Untereinheit werden relativ schnell durch das Nukleoplasma geschleust und von dort ins Zytoplasma exportiert. Die Prä-60S genannten Vorläufermoleküle der großen Untereinheit unterliegen dagegen einem komplexeren Reifungsprozess, der im Nukleolus beginnt, im Nukleoplasma fortgesetzt wird und schließlich durch letzte zytoplasmatische Reifungsschritte abgeschlossen wird. Erst dann kann die produktive Zusammenlagerung mit der kleinen Untereinheit erfolgen. Die Reifung der 60S Untereinheit verläuft unter Beteiligung einer Vielzahl von regulatorischen Proteinen, die unter dem Begriff trans-acting Faktoren zusammengefasst werden. Aufgabe dieser Faktoren ist es im Verlauf des Reifungsprozesses die geordnete Prozessierung und nachfolgende Assemblierung der rRNA Moleküle mit ribosomalen Proteinen zu steuern. Durch den schrittweisen Umbau der ribosomalen Zwischenstufen wird hierbei das Fortschreiten der Ribosomenbiogenese gewährleistet. Von zentraler Bedeutung im Verlauf dieses Prozesses ist demnach die zeitlich und räumlich koordinierte Assemblierung und Auflösung von 60S-assoziierten regulatorischen Proteinkomplexen. Diese Umbauprozesse werden insbesondere durch posttranslationale Modifikationen der beteiligten Proteine, z.B. durch Phosphorylierung oder Modifikation mit dem Ubiquitin-verwandten SUMO (small ubiquitin-like modifier) Molekül, gesteuert. Dies erfordert, dass sich die enzymatische Maschinerie, die diese Modifikationen vermittelt, jeweils in den zellulären Kompartimenten befindet, in denen sie benötigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Regulationsmechanismen untersucht, die die subzelluläre Verteilung der SUMO-spezifischen Isopeptidase SENP3 und des assoziierten trans-acting Faktors PELP1 bestimmen. Frühere Arbeiten aus unserer Arbeitsgruppe konnten die Bedeutung des SUMO Systems bei der Ribosomenbiogenese in Säugerzellen belegen. Wir konnten insbesondere eine Schlüsselrolle von SENP3 bei der Reifung der 28S rRNA und somit der Bildung der 60S Untereinheit zeigen. Die 28S rRNA entsteht durch die Prozessierung eines 32S rRNA Vorläufermoleküls im Nukleolus. Eine Beteiligung von SENP3 bei diesem Reifungsschritt ist somit im Einklang mit der beobachteten nukleolären Lokalisierung von SENP3. Als kritische Substrate von SENP3 wurden das nukleoläre Gerüstprotein Nucleophosmin (NPM1) und PELP1 identifiziert. Für beide Proteine konnte Modifikation durch SUMO2/3 gezeigt werden und SENP3 als demodifizierendes Enzym charakterisiert werden. Beim Fehlen von SENP3 kommt es dementsprechend zu einer verstärkten SUMOylierung von NPM1 und PELP1 sowie zu einer reduzierten Prozessierung der 32S Vorläufer-rRNA zur reifen 28S rRNA. PELP1 ist Teil eines Proteinkomplexes der aus den Kernkomponenten PELP1, TEX10 und WDR18 besteht. Es zeigte sich, dass die SUMOylierung von PELP1 die Verteilung dieses Komplexes zwischen Nukleoplasma und Nukleolus bestimmt. Die gesteigerte SUMOylierung von PELP1 in Abwesenheit von SENP3 führt zum Verlust der nukleolären Lokalisierung von PELP1, TEX10 und WDR18. Diese Ergebnisse belegen, dass SENP3-vermittelte DeSUMOylierung die Lokalisierung nukleolärer trans-acting Faktoren bestimmt und darüber Ribosomenreifung kontrolliert. Basierend auf diesen Vorarbeiten war ein erstes Ziel der vorliegenden Arbeit zu klären, in welchem subzellulären Kompartiment SENP3 seine Funktion bei der Ribosomenbiogenese ausübt. Ein zweites zentrales Ziel war es, zu verstehen über welche Mechanismen die subzelluläre Verteilung von SENP3 kontrolliert wird. Schließlich sollte die Frage adressiert werden, wie die SUMOylierung von PELP1 die Verteilung des PELP1 Komplexes bestimmt. Es konnte zunächst geklärt werden, dass die nukleoläre Lokalisierung von SENP3 für seine Funktion bei der Bildung der 28S rRNA und der Reifung der 60S Untereinheit unerlässlich ist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die nukleoläre Kompartmentalisierung von SENP3 seine direkte Bindung an NPM1 erfordert. Verantwortlich für die Bindung an NPM1 und die nukleoläre Rekrutierung von SENP3 ist der amino-terminale Bereich des Proteins. Die Bindung von SENP3 an NPM1 benötigt außerdem die Phosphorylierung verschiedener Serin- und Threoninreste in dieser amino-terminalen Region von SENP3. Hierbei wird die Phosphorylierung durch die Serine/Threonin Kinase mTOR vermittelt. Durch in vitro Kinase Experimente und massenspektrometrische Analysen konnten fünf Serin/Threoninreste (S/T 25, 26, 141, 142, 143) im amino-terminalen Bereich von SENP3 als Zielsequenzen der mTOR-abhängigen Phosphorylierung identifiziert werden. Ein Austausch dieser Aminosäurereste verhindert die Bindung von SENP3 an NPM1 und damit auch die Rekrutierung von SENP3 in den Nukleolus. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen führt die Inhibierung von mTOR mittels chemischer Inhibitoren zur Freisetzung von SENP3 aus dem Nukleolus und zum weitgehenden Verlust seiner Interaktion mit NPM1. Dies geht einher mit einem Reifungsdefekt der 28S rRNA. Zusammengenommen unterstreicht dies die Bedeutung der mTOR-abhängigen Phosphorylierung für die Funktion von SENP3 bei der Ribosomenbiogenese. Weitere Experimente, bei denen spezifische Komponenten des mTORC1 oder mTORC2 Komplexes inhibiert wurden, ergaben, dass der mTORC1 Komplex für die Phosphorylierung von SENP3 verantwortlich ist. Schließlich konnte als Gegenspieler der mTOR-vermittelten Phosphorylierung die Proteinphosphatase PP1-γ identifiziert werden. PP1-γ, für das eine nukleoläre Lokalisierung beschrieben wurde, zeigt eine starke Bindung an SENP3. Außerdem führt die zelluläre Expression von PP1-γ zum Verlust der nukleolären Lokalisierung von SENP3. Zusammengenommen konnte damit die mTOR/PP1-γ-vermittelte Phosphorylierung/Dephosphorylierung von SENP3 als ein wichtiger Mechanismus zur Kontrolle der Ribosomenbiogenese definiert werden. Da die Aktivität von mTOR unter anderem von der Verfügbarkeit von Energie und Nahrungsstoffen abhängt, fungiert SENP3 somit als wichtiger molekularer Schalter, über den die Synthese von Ribosomen an das zelluläre Energieangebot angepasst werden kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht die Rolle der SUMOylierung von PELP1 bei der Kontrolle der subnukleären Verteilung des PELP1-TEX10-WDR18 Komplexes zu entschlüsseln. Es konnte gezeigt werden, dass die AAA-ATPase Midasin (MDN1) bevorzugt an die SUMO-modifizierte Form von PELP1 bindet und dadurch den PELP1 Komplex von nukleolären Prä-60S Partikeln entfernt. MDN1, für das bereits eine Funktion bei der 28S Reifung beschrieben war, wurde zunächst als Komponente des PELP1 Komplexes identifiziert. Nach siRNA-vermittelter Depletierung von MDN1 beobachtet man eine starke Anreicherung von PELP1 im Nukleolus und eine verstärkte Assoziierung von PELP1 mit nukleolären 60S Präribosomen. Dies deutet darauf hin, dass MDN1 an der Freisetzung des PELP1 Komplexes von 60S Präribosomen beteiligt ist um die weiteren Reifungsstufen einzuleiten. Interessanterweise erfordert die Bindung von MDN1 an PELP1 die Anwesenheit von SUMO2/3. Außerdem bindet die SUMO-modifizierte Form von PELP1 stärker an MDN1 als unmodifiziertes PELP1. Basierend auf diesen Ergebnissen schlagen wir vor, dass die SUMOylierung von PELP1 die MDN1- vermittelte Trennung des PELP1 Komplexes von 60S Präribosomen erleichtert. Zusammengenommen konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Mechanismen bei der Regulation des SENP3-PELP1 Komplexes entschlüsselt werden. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung post-translationaler Modifikationen bei der Kontrolle des SENP3-PELP1 Komplexes. Über reversible Phosphorylierung und SUMOylierung werden hierbei spezifische Protein-Protein Wechselwirkungen reguliert, welche die subzelluläre Verteilung von SENP3 und des PELP1 Komplexes bestimmen.