Subviral hepatitis B virus filaments are released like infectious viral particles via multivesicular bodies

  • In addition to infectious viral particles, hepatitis B virus-replicating cells secrete high amounts of SVPs, which are ssembled by HBsAg in the shape of spheres and filaments but lack any capsid and genome. Filaments are characterized by a much higher amount of the surface protein LHBs as compared to spheres. Spheres are released via the constitutive secretory pathway, while viral particles are ESCRT-dependently released via MVBs. The interaction of virions with the ESCRT machinery is mediated by α-taxilin that connects the PreS1 domain of LHBs with the ESCRT-component tsg101. Since viral particles and filaments contain a significant amount of LHBs, it is unclear whether filaments are secreted as spheres or released like viral particles. To study the release pathways of HBV filaments in the absence of viral particles, A core-deficient HBV mutant (1.2×HBVΔCore) was generated by site-directed mutagenesis based on wt1.2x HBV. The start codon of core protein was mutated into stop codon, which was confirmed by DNA sequencing. Data from HBsAg ELISA, Western blot, immunofluorescence microscopy and immunoelectron microscopy showed that the lack of core protein did neither affect the production nor the secretion of HBV SVPs. The intracellular distribution of LHBs and SHBs showed no difference between wtHBV and the core-deficient mutant expressing cells. Therefore, this system is suitable to investigate the release pathway of HBV filaments in the absence of viral particles. Confocal microscopy analysis of cells cotransfected core-deficient mutants with peYFPRab7 as marker for the endosomal/MVB pathway or with pGalT-eGFP as marker for the trans Golgi apparatus showed that YFP-Rab7, but not GalT-GFP, partially colocalized with LHBs. Furthermore, LHBs could be found in dilated MVBs by immune electron microscopy of ultrathin sections. This was confirmed by isolation of MVBs by cell fractionation using discontinuous sucrose gradient ultracentrifugation and percoll-based linear gradient ultracentrifugation, indicating that filaments enter MVBs in the absence of virion formation. Moreover, inhibition of MVB biogenesis by the small molecular inhibitor U18666A significantly abolished the release of filaments in a dose-dependent manner, but no inhibition could be observed in the production. In contrast, no inhibition on the secretion and production of spheres could be detected. Inhibition of ESCRT-functionality by coexpression of transdominant negative mutants (Vps4A, Vps4B, CHMP3) abolished the release of filaments while secretion of spheres was not affected. These data indicate that in contrast Abstract 73 to spheres while are secreted via the secretory pathway, filaments are released via ESCRT/MVB pathway like infectious viral particles.
  • Bei dem humanen Hepatitis-B-Virus (HBV) handelt es sich um einen sphärischen Partikel mit einem Durchmesser von 42 nm. Dieser besteht aus einer äußeren Hülle und einem inneren Nukleokapsid in ikosaedrischer Form. Das Nukleokapsid wird von den Kernproteinen gebildet und enthält das virale Genom. Das virale Genom enthält mindestens vier verschiedene offene Leserahmen, die für die virale Polymerase, das Kern- und e-Antigen (HBcAg, HBeAg), das regulatorische X-Protein (HBx) und die drei Oberflächenproteine kodieren (HBsAg). Bei den drei Oberflächenproteinen handelt es sich um das große HBV-Oberflächenprotein (LHBs), das mittlere Oberflächenprotein (MHBs) und das kleine Oberflächenprotein (SHBs) [71]. LHBs umfasst die PreS1-Domäne, PreS2-Domäne und die S-Domäne; MHBs enthält die PreS2- und S-Domäne; SHBs besteht aus der S-Domäne. Diese Oberflächenproteine sind nicht nur grundlegende Komponenten der Hülle von viralen Partikeln, sondern assemblieren ebenfalls zu sog. subviralen Partikeln, die weder ein Kapsid noch virale DNA enthalten. Subvirale Partikel kommen in filamentöser oder sphärischer Form vor [253] und werden im 1.000-100.000-fachen Überschuss verglichen und mit infektiösen Partikeln sezerniert. SHBs ist der vorherrschende Bestandteil subviraler Partikel und kann sich zu sphärischen Partikeln („Sphären“) mit einem Durchmesser von 22 nm zusammenlagern. Bei Zusammenlagerung mit höherem LHBs-Anteil bilden sich hingegen filamentöse Strukturen („Filamente“) mit 22 nm Durchmesser und einer variablen Länge [59,60]. Die sphärischen subviralen Partikel mit einem Durchmesser von 22 nm enthalten etwa 100 SHBs Polypeptid-Monomere und besitzen ein Molekulargewicht zwischen 2 ~ 4 x 106 [225,226]. Nach der Synthese von neuen Monomeren werden diese in das ER-Lumen transloziert. Dort werden mithilfe der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) durch Disulfidbrücken verknüpfte Dimere gebildet. Diese Dimere werden anschließend in das ERGolgi-intermediäre-Kompartiment (ERGIC) transportiert. Im ERGIC bildet SHBs höhere Oligomere und assembliert durch Disulfidbrücken zu stark vernetzten Partikeln [227-229,193]. Die reifen Partikel werden über den konstitutiven Sekretionsweg sezerniert, sie durchwandern somit den GolgiKomplex...

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Metadaten
Author:Bingfu Jiang
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-423635
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Rolf MarschalekORCiDGND, Eberhard HildtORCiDGND
Advisor:Rolf Marschalek, Eberhard Hildt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/12/01
Year of first Publication:2015
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Release Date:2016/12/01
Tag:Hepatitis B
Page Number:115
Last Page:110
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:397090099
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
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