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Katharina Eydt

• Die mitochondriale Innenmembran (IM) besteht aus zwei Subkompartimenten. Der Cristae Membran (CM) und der inneren Grenzmembran (IBM), welche durch die runden und schlitzartige Strukturen der Christa Junctions (CJs) verbunden werden Der MICOS-Komplex ist an den CJs lokalisiert und besteht aus mindestens 6 Komponenten, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Es ist bekannt, dass der MICOS-Komplex essentiell für die Stabilität der CJs ist. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse, geben Aufschluss darüber, wie sich einzelne MICOS-Komponenten auf die Stabilität von Cristae und CJs im Modellsystem Hefe (S cerevisiae) auswirken. Zu Beginn dieser Arbeit war zum einen bekannt, dass die MICOSKomponente Mic60 essentiell für die Bildung von CJs ist. Zum Anderen wurden im Vorfeld dieser Arbeit Interaktionen von Mic60 mit Proteinen in der mitochondrialen Außenmembran, vor allem Proteinkomplexe mit ȕ-barrel-Proteinen identifiziert. Diese Interaktionen werden über den evolutionär, konservierten C-Terminus von Mic60 vermittelt. ȕ-barrel Proteine besitzen eine charakteristische Peptidsequenz, die ȕ-Sequenz. Diese dient nach dem Import der ȕ-barrel Proteine in die Mitochondrien als Signalpeptid für den SAM-/TOB-Komplex, welcher daraufhin die Proteine in die Außenmembran insertiert. In dieser Arbeit wurde ebenfalls eine ȕ-Sequenz im C-Terminus von Mic60 identifiziert, diese zeigte einen Einfluss auf die Cristae-Stabilität. Zellen die eine Mic60-Variante mit einer Deletion oder Punktmutation der ȕ- Domäne exprimieren, zeigten eine reduzierte Anzahl an CJs. Auch das Verkürzen des C-Terminus von Mic60 hatte diesen Effekt auf die mitochondriale Ultrastruktur. So konnte gezeigt werden, dass die ȕ-Domäne und die Integrität des C-Terminus essentiell für die Stabilität von CJs sind. Der Fokus dieser Arbeit lag in der Charakterisierung der MICOS-Komponenten Mic26 und Mic27. Es konnte bewiesen werden, dass beide Proteine genetisch mit der MICOSKernkomponente Mic60 interagieren. Die Untersuchung der mitochondrialen Ultrastruktur von Δmicβ6- und Δmicβ7-Zellen zeigte, dass eine Deletion vom Mic26 keinen Einfluss auf die Organisation der mitochondrialen Innenmembran hat. Im Gegensatz dazu, ist im Vergleich zum Wildtyp die Anzahl an CJs in Δmicβ7-Zellen um zwei Drittel reduziert. Auch die Innenmembranoberfläche ist in diesen Zellen stark vergrößert. Die Untersuchung der Morphologie der mitochondrialen Innenmembran in Zellen ohne Mic27 durch KryoElektronentomographie isolierter Mitochondrien, veranschaulichte die Struktur der CJs in diesen Zellen genauer. Es zeigten sich hier breitere CJs, und der Übergang von der Cristaemembran in den Bereich der inneren Grenzmembran ist sehr flach und undefiniert. In Wildtyp-Mitochondrien waren die CJs schmal und schlitzartig und haben einen scharfkantigen Übergang von der Cristaemembran zur inneren Grenzmembran. Des Weiteren wies die Cristaemembran in Δmicβ7-Zellen unregelmäßige zackige Strukturelemente auf, was auf eine Anhäufung an Dimeren der F1FO-ATP Synthase hinweist. Diese Beobachtungen in den Kryo-Tomogrammen, wurde durch Analysen des sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert. Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmicβ7-Mitochondrien analysiert. Zum einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmicβ7-Zellen, was darauf hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10 war die einzige MICOS-Komponente die in Δmicβ7-Zellen noch stabile Komplexe im hohen Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOSKomponenten sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase. Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch, mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert. Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines CTerminus mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet. Oligomerisierungszustands der F1FO-ATP Synthase in Δmicβ7-Zellen, bestätigt. Hier fanden sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert. Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmicβ7-Mitochondrien analysiert. Zum einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmicβ7-Zellen, was darauf hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10 war die einzige MICOS-Komponente die in Δmicβ7-Zellen noch stabile Komplexe im hohen Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOSKomponenten sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase. Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch, mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert. Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines CTerminus mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet.
• The inner membrane of mitochondria is composed of two subcompartments, the cristae membrane (CM) and the inner boundary membrane (IBM). These compartments are connected via round, slot-like structures termed cristae junctions (CJs). CJ stability depends among other things on the MICOS-complex, which is localized at the CJs and consists of 6 components, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 and Mic10. The results shown in this study demonstrate how individual MICOS-components affect the stability of cristae and CJs in S. cerevisiae. At the beginning of this study it was known that the MICOS-component Mic60 is essential for CJ formation. Furthermore, Mic60 interacts via its evolutionarily conserved Cterminus with proteins of the mitochondrial outer membrane, especially protein complexes containing ȕ-barrel proteins, which contain a characteristic peptide sequence, the ȕ-sequence. This is sequence serves as a signal peptide for the SAM-/TOB-complex and is important for the insertion of ȕ-barrel proteins into mitochondrial outer membrane. In this study a ȕ-sequence was identified in the C-terminus of Mic60. This motif has an influence on cristae stability. Cells expressing a Mic60 variant with a deletion or point mutation of this ȕ-domain, showed a reduced number of CJs. A Mic60 variant with a shortened C-terminus of Mic60 showed the same effect. It was corroborate that the ȕ-domain and the integrity of the C-terminus are essential for the stability of CJs. The main focus of this study was the characterization of the MICOS-components Mic26 and Mic27. It was demonstrated that both proteins interact genetically with the MICOS corecomponent Mic60. A deletion of Mic27 affects the organization of the mitochondrial inner membrane. In contrast to wildtype, the number of CJs in Δmicβ7-cells is reduced and the inner membrane surface is increased. In Δmicβ6-cells the mitochondrial ultrastructure is unaffected. The investigation of the mitochondrial morphology in isolated Δmicβ7-mitochondria by cryoelectron tomography illustrated broader CJs. The transition from the cristae membrane to the inner boundary membrane is very flat and undefined in contrast to wildtype mitochondria. Furthermore, the cristae membrane in Δmicβ7-cells shows irregular and edgy structures. These structures indicate an accumulation of dimers of F1FO-ATP synthase. These observations were confirmed by the analysis of the oligomerization of F1FO-ATP synthase in Δmicβ7-cells. Here, significantly more dimers of the F1FO-ATP synthase were detected, indicating that Mic27 is important for the stabilization of the (oligomers of) F1FO-ATP synthase. To investigate how the MICOS-complex is connected to the F1FO-ATP synthase, the native complexation was analyzed by 2D-BNE and complexome profiling analysis. The first observation was that Mic27 has a stabilizing effect on the MICOS-complex. In Δmicβ7-cells the high molecular weight MICOS-complex was unstable, indicating that under these conditions the MICOS-components, except Mic10, are not assembled anymore. Interestingly, a comigration of the MICOS core-component Mic10 and the F1FO-ATP synthase was observed. This was confirmed biochemically by chemical crosslinking and co-immunoprecipitation experiments. Mic10 directly interacts with Mic27 and other MICOS-components and the F1FOATP synthase. It can be concluded that Mic10 connects the MICOS-complex with the F1FOATP synthase. Based on the findings of this work a novel model can be postulated: The stability of CJs depends on both, the connection of Mic60 with proteins of the outer membrane and the interaction of Mic10 and the F1FO-ATP synthase. It appears that Mic27 mediates the connection between Mic10 and the F1FO-ATP synthase. Thus, this newly identified interaction is essential for the stability of CJs, by connecting the MICOS complex with the oligomers of F1FO-ATP synthase.