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Philipp Graab

• Eukaryotische Zellen sind durch, aus Lipiddoppelschichten bestehenden, Membranen in Kompartimente mit unterschiedlichen Funktionen eingeteilt. Um einen Transport von Molekülen über die Membranen hinweg zu gewährleisten, werden Kanälen und Transporter benötigt. Eine Familie von Transportern sind die ATP-binding cassette (ABC) Transporter, die in allen Lebewesen, von Bakterien bis zum Menschen, vorkommen. Ein Mitglied dieser Familie ist der transporter associated with antigen processing-like (TAPL oder ABCB9). TAPL ist ein lysosomaler Polypeptidtransporter der per ATP-Hydrolyse Peptide von 6 – 59 Aminosäuren Länge vom Zytosol in das Lumen der Lysosomen transportiert. Hierbei kann TAPL, das ein Homodimer ist, in zwei funktionale Domänen geteilt werden. Der Teil des Komplexes, der für den Transport zuständig ist, wird als coreTAPL bezeichnet. Dieser beinhaltet die zytosolischen nucleotide binding domains (NBDs), die ATP binden und hydrolysieren können, und die Transmembrandomänen (TMDs), die Peptide binden und sie durch konformationelle Änderungen auf der anderen Membranseite freilassen. Die zweite Domäne ist eine N-terminale TMD, die als TMD0 bezeichnet wird. Dieser, aus vier Transmembranhelices (TMHs) bestehende Teil des Proteins, ist für die Lokalisation von TAPL in der lysosomalen Membran verantwortlich, sowie für die Interaktion mit den dort lokalisierten Membranproteinen LAMP-1 und LAMP-2. CoreTAPL ohne die TMD0s erreicht nicht die Lysosomen, sondern liegt in der Plasmamembran (PM) der Zelle vor. Die TMD0 hingegen benötigt coreTAPL nicht um korrekt in der lysosomalen Membran lokalisiert zu sein. Die korrekte Lokalisation in der Zelle ist ein kritischer Punkt für ein Protein, um seine Funktion ausüben zu können. Die Transportprozesse vom Ort der Synthese des Proteins, dem Endoplasmatischem Reticulum (ER), zum Organell wo es seine Funktion ausüben soll, umfassen dutzende Proteine und Proteinkomplexe und ein komplexes Zusammenspiel zwischen Proteinen und den einzigartigen Lipidzusammensetzungen der Membranen verschiedener Organellen. Auf das Einfachste heruntergebrochen benötigt ein Transmembranprotein eine kurze Aminosäuresequenz auf der zytosolischen Seite, die Signalsequenz. Diese Sequenz wird von sogenannten Adapterproteinen erkannt, die wiederum andere Bestandteile der zellulären Maschinerie rekrutieren, die letztlich Vesikelbildung, Transport und Fusion mit der Zielorganelle vermitteln. Allerdings weisen nicht alle lysosomalen Transmembranproteine eine solche Signalsequenz auf, sondern besitzen unkonventionelle Zieldeterminanten, wie posttranslationale Modifikationen, oder sie interagieren mit anderen Proteinen, die wiederum die Interaktion mit den Adapterproteinen vermitteln.
• Membrane proteins need to be trafficked from the place of their synthesis, the endoplasmic reticulum (ER), to the place where they fulfill their function. This process is termed protein trafficking and is often mediated by short targeting motifs. For the homodimeric lysosomal ABC transporter TAPL/ABCB9, it is unknown how targeting is mediated. TAPL can be dissected into two functional domains. While the core-domain, coreTAPL, is fully functional in ATP-dependent peptide transport, it is mislocalized to the plasma membrane (PM). The N-terminal transmembrane domain (TMD) is termed TMD0. It consists of four transmembrane helices (TMHs), and is by itself correctly localized to lysosomes. Additionally, TMD0 acts as interaction platform for other transmembrane proteins, as demonstrated for LAMP-1 and -2. Three central topics of lysosomal trafficking of TAPL were investigated in this study: Does TAPL take the direct route from the Golgi to endosomes or the indirect route via the PM? What sequences or residues in TMD0 are responsible for lysosomal targeting, thus being the targeting determinants? Which proteins interact with TAPL during trafficking, mediating individual steps? The intracellular route was investigated by the retention using selective hooks (RUSH) assay, which enables synchronization and therefore visualization of individual trafficking steps. Using this assay, TAPL localization during trafficking in ER, Golgi, early endosomes and lysosomes was observed by fluorescence microscopy. To exclude a short-lived PM localization, representing the indirect route to lysosomes, the dynamin inhibitor Dyngo-4a was applied. However, the inhibitor, while completely blocking uptake of transferrin by endocytosis, did not accumulate TAPL at the PM. Therefore, TAPL takes the direct route from Golgi via early endosomes to lysosomes. To identify the targeting determinant of TAPL, the stable, inducible Flp-In T-REx system for TAPL in HeLa cells was established. The advantage over transient transfections is that protein concentrations can be fine-tuned by adjusting inducer concentrations, avoiding overloading of the trafficking machinery. Cytosolic and luminal loop areas of TMD0 were exchanged against corresponding sequences of ER localized TAP1. Exchange of cytosolic loop 2 (CTL2) did lower the amount of lysosomal localized TAPL and exchange of luminal loop 1 (LL1) did abolish lysosomal localization as visualized by immunofluorescence microscopy. However, additional mutation analysis of LL1 did also not provide any essential amino acid. Conventional targeting motifs can therefore be ruled out for TAPL....