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Daniela Kern-Michler

• To gain a better understanding of complex mechanisms in biological systems, simultaneous control over multiple processes is key. To this purpose selective photouncaging has been developed. Photo-uncaging is an experimental scheme in which a molecule of interest has been inactivated synthetically and is activated by light. Usually a bond is cleaved and a leaving group is set free. The molecule which inactivates the molecule of interest and sets the leaving group free is called (photo-)cage. In a selective photo-uncaging scheme a number of leaving groups can be released independently, usually by irradiation with light of different wavelengths. This approach is, however, seriously limited in its applicability due to the properties of the involved cages and irradiation schemes. A major drawback is the usually quite broad UV-Vis absorption of the cages. This makes a selective activation by light difficult and limits the maximal number of independent cages severely. Therefore, the aim of this thesis is to introduce the Vibrationally Promoted Electronic Resonance (VIPER) 2D-IR pulse sequence in a alternative selective uncaging scheme. The VIPER 2D-IR pulse sequence is a spectroscopic tool which allows to generate 2D-IR signals whose lifetime are independent of the vibrational relaxation lifetime. It has been first used to monitor chemical exchange. It consists of a narrowband infared pump pulse, a subsequent UV-Vis pump pulse and a broadband infrared probe pulse. The UV-Vis pump pulse is off-resonant with regard to the UV-Vis absorption band. Electronic excitation becomes only possible, if the infrared pump pulse modulates the UV-Vis transition of the IR-excited molecule. This modulation brings the UV-Vis transition in resonance with the UV-Vis pump pulse. Thereby, only the molecules which were pre-excited with the infrared pulse can be excited into the electronically excited state. A computational prediction of the modulation was carried out by Jan von Cosel in the Burghardt group. The narrowband infrared pump pulse can be used to selectively excite a subensemble of molecules in a mixture into an electronically excited state even if the UV-Vis spectra of all molecules are virtually identical. For this the sub-ensemble needs to exhibit an identifiable infrared spectrum. Combined with the introduction of isotope labels, which lead to changes in the infrared absorption spectra, the larger selectivity in the infrared region can be exploited for an alternative selective uncaging approach. In VIPER uncaging the infrared pump pulse selects the species and the subsequent UV-Vis pulse provides the energy needed for electronic excitation upon which the photo cleavage can occur. After an introduction of the principle idea of uncaging and VIPER spectroscopy, the concept of VIPER uncaging is introduced and its limits and requirements are discussed. Some examples for possible VIPER cages are reviewed. A coumarin molecule (7-diethylamino coumarin) which can release an azide group was chosen as a first test molecule for VIPER uncaging. Its isotopomers were characterized to determine suitable spectroscopic markers for successful uncaging and to find fitting experimental conditions. The chosen coumarin cage has an UV-Vis absorption band at approximately 380 nm and a steep flank on the high wavelength side of the band. The quantum yield for the azide compound is between 10-20 % depending on the solvent’s water content. The release was found to be on a picosecond timescale which is among the fastest known photo reactions, but the photo reaction mechanism has proven to be not straightforward. For the VIPER experiment on the mixture two isotopomers were chosen with a 13C atom at different positions. In one species a ring mode of the coumarin is changed by the 13C atom. In the other isotopomer the carbonyl stretching mode is influenced. The change in the ring mode region allows to select one species or the other with the infrared pre-excitation. Because of experimental difficulties only isotopomers with the same leaving group could be used. The successful selective electronic excitation of the individual isotopomers in a mixture was monitored by probing the carbonyl region. As a second VIPER cage, para-hydroxyphenacyl (pHP) was chosen. A thiocyanate group was selected as leaving group. pHP cages have their electronic transition in the UV, with a maximum absorption at 290 nm. The shape of the spectrum is suitable and the quantum yield is very high, with values in the literature of up to 90 %. Also the photo reaction is well studied and the expected byproducts are well characterized. The chosen isotopologues were characterized spectroscopically. The resulting data on the photo reaction were in agreement with the mechanism proposed in the literature. The mixture for the VIPER experiment consisted of two isotopologues, where for one species all the C atoms in the ring were labelled and for the other the C-atom in the thiocyanate leaving group was labelled. Here the release of the different leaving groups, labelled and unlabelled thiocyanate, could be monitored selectively. This shows that it is possible to selectively release a molecule in a mixture of caged molecules by applying the VIPER pulse sequence. The samples were synthesized by Matiss Reinfelds from the Heckel group and the VIPER experiments were done together with Carsten Neumann and with support of the Bredenbeck group. The leaving groups were chosen because of their infrared absorption which allowed to directly monitor the successful cleavage by spectroscopy. This was needed for the proof-of-concept experiment and to allow direct optimization of the experimental parameters but is not necessarily a requirement for VIPER uncaging. Concerning the selectivity of the VIPER uncaging, the approach is at the moment mainly limited by the infrared pulse energy. The selective VIPER excitation is competing with unselective excitation directly by just the UV-Vis pulse. A more intense infrared pump pulse would increase only the selective VIPER excitation and thereby improve the contrast to the unspecific background. To address this issue, the first steps towards an alternative infrared light generation are undertaken. In this alternative approach the infrared light for preexcitation is directly generated by difference frequency generation of the laser output, i.e. the high energy 800 nm fundamental, and the output of a non-collinear optical parametric amplifier (NOPA). To achieve a narrowband pump pulse the pulses are chirped before mixing. In the scope of this thesis a NOPA has been installed and the mixing has been tested with available test crystal medium. While infrared wavelength region and power were not in the aspired range with this alternative crystal the feasibility of mixing between a NOPA output and the fundamental could be shown. Other possibilities to increase the contrast to the unspecific background excitation by the UV-Vis pump pulse are discussed. For most applications of selective VIPER uncaging the detection by fs-laser spectroscopy will not be needed and could be replaced by other methods e.g. chromatography. This will allow the experimental parameters of the VIPER pulse sequence to be changed in a way which reduces unspecific excitation i.e. reducing the UV-Vis-pump energy and result in much better contrast. In conclusion, the experimental data in this thesis shows the VIPER pulse sequence to be applicable to selective uncaging schemes and indicates measures to arrive at the specificity necessary for uncaging applications. This thesis was focused on uncaging photo reactions with isotopomers and isotopologues, but other types of photo reactions could in principle be controlled in the same way. It should be possible to address different isomers in mixtures or different ground states of proteins selectively. The discussed experiments are a significant step towards control over photo reactions in mixtures.
• Um ein besseres Verständnis für die komplexen Vorgänge in biologischen Systemen erlangen zu können, ist die gleichzeitige Kontrolle über mehrere parallel ablaufende Prozesse entscheidend. Zu diesem Zweck wurde selektives Uncaging entwickelt. Bei einem Uncaging Experiment wird ein Molekül synthetisch inaktiviert und durch die Bestrahlung mit Licht wieder aktiviert. Bei selektivem Uncaging werden mehrere Moleküle inaktiviert und können unabhängig voneinander, normalerweise durch Licht verschiedener Wellenlänge, freigesetzt werden. Es gibt jedoch ernstzunehmende Einschränkungen in der Umsetzung dieser Idee. Eine große Herausforderung ist die spektrale Breite der UV-Vis Absorptionen der üblicherweise verwendeten Moleküle. Die Banden sind so breit, dass sie außer in wenigen Ausnahmen, überlappen und durch die Beleuchtung fast immer mehrere simultan angeregt werden. Dies limitieren auch die Anzahl der unabhängigen Cages stark. Deshalb ist es das Ziel dieser Dokotorarbeit die Vibrationally Promoted Electronic Resonance (VIPER) 2D-IR Pulssequenz als eine Alternative für selektives Uncaging einzuführen. Die VIPER 2D-IR Pulssequenz ist ein spektroskopisches Werkzeug, welches erlaubt 2D-IR Signale zu erzeugen, deren Lebensdauer unabhängig von der Schwingungslebensdauer ist. Die Pulsesequenz besteht aus einem schmalbandigen infraroten Anregepuls, einem darauffolgenden UV-Vis Anregepuls und einem breitbandigen infraroten Abfragepuls. Der UV-Vis Anregepuls ist nicht resonant mit der UVVis Absorptionsbande. Die elektronische Anregung wird nur möglich, wenn der infrarote Anregepuls den UV-Vis Übergang der schwingungsangeregten Moleküle moduliert. Diese Modulation bringt den UV-Vis Übergang in Resonanz mit dem UV-Vis Anregepuls. Auf diese Weise können nur die Moleküle, die mit dem infraroten Anregepulse vorangeregt wurden, elektronisch angeregt werden. Der schmalbandige infrarote Anregepuls kann verwendet werden, um selektiv ein Subensemble von Molekülen in einen elektronisch angeregten Zustand zu bringen. In Kombination mit der gezielten Einführung von Isotopmarkierungen, die zu Veränderungen im Infrarotspektrum führen, kann die größere Selektivität des Infrarotbereichs für die Entwicklung eines alternativen selektiven Uncagingansatzes verwendet werden. In diesem sogenannten VIPER Uncaging selektiert der infrarote Anregepuls die Spezies und der darauffolgende UV-Vis Anregepuls liefert die Energie für die elektronische Anregung, die die Grundlage für eine Photoreaktion ist. Ein Coumarinmolekül (7-Diethylaminocoumarin), welches eine Azidgruppe freisetzen kann, wurde als erstes Testmolekül für VIPER Uncaging ausgewählt. Ausgewählte Isotopomere wurden charakterisiert, um geeignete spektroskopische Marker für die erfolgreiche Freisetzung der Abgangsgruppen zu bestimmen. Außerdem wurden geeignete experimentelle Bedingungen, wie etwa eine geeignete UV-Vis Wellenlänge oder ein passendes Abfragefenster, gesucht. Für das VIPER Uncaging Experiment in einer Mischung wurden zwei Isotopomere mit jeweils einem 13C-Atom an verschiedenen Positionen ausgewählt. In einer der beiden Spezies ist die Infrarotabsorption der Ringmode des Coumarins durch das 13C Atom verändert. Im anderen Isotopomer wird die Carbonylstreckschwindung beeinflusst. Die Veränderung im Ringmodenbereich erlaubt die Selektion einer Spezies mit der infraroten Voranregung. Aufgrund von experimentellen Schwierigkeiten konnten nur Isotopomere mit der gleichen Abgangsgruppe verwendet werden. Die erfolgreiche selektive elektronische Anregung der einzelnen Isotopomere in der Mischung konnte durch die Abfrage in der Carbonylregion verfolgt werden. Als zweiter VIPER Cage wurde para-hydroxyphenacyl (pHP) ausgewählt. Die Abgangsgruppe ist eine Thiocyanatgruppe. Die ausgewählten pHP Isotopologe wurden charakterisiert. Die Mischung für das VIPER Experiment besteht aus zwei Isotopologen. Für eine Spezies sind alle Kohlenstoffatome im Ring durch 13C Atome ersetzt. Für die andere ist die Thiocyanatabgangsgruppe isotopenmarkiert. In diesem Fall konnte die Freisetzung der unterschiedlichen Abgangsgruppen, markiert und nicht markiert, selektiv beobachtet werden. Das zeigt, dass es möglich ist, selektiv ein Molekül in einer Mischung freizusetzen indem die VIPER Pulssequenz eingesetzt wird. Die in der Arbeit gezeigten Experimente sind ein wichtiger Schritt zum Erlangen der Kontrolle über Photoreaktionen in Mischungen. Neben dem selektiven Uncaging von Isotopomeren und Isotopologuen, sollte es möglich sein zu entscheiden welches Isomer in einer Mischung reagieren soll oder selektiv verschiedene Grundzustände in einem Protein anzuregen. Betrachtet man die Selektivität des VIPER Uncaging Ansatzes, so ist diese im Moment hauptsächlich durch die Intensität des infraroten Anregepulses beschränkt. Um diese zu steigern, wurden die ersten Schritte zu einer alternativen Infrarotlichterzeugung unternommen. In diesem Ansatz wird das Infrarotlicht direkt durch eine Differenzfrequenzgeneration zwischen dem Laseroutput, d.h. der intensiven 800 nm Fundamentalen, und dem Output eines nicht-linearen optischen parametrischen Verstärkers (NOPA) erzeugt. Der NOPA ist aufgebaut und das Mischen wurde in einem vorläufigen Kristallmedium getestet. Andere Möglichkeiten, um den Kontrast zum unspezifischen Hintergrund durch die direkte Anregung durch das UV-Vis Licht zu verbessern, werden diskutiert. Für die Anwendung von VIPER Uncaging könnte zum Beispiel auf die Detektion mittels fs-Laserspektroskopie verzichtet werden.