Open Access

Sarah Kehr

• Cancer is amongst the leading causes of death in childhood. Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most frequently occurring soft tissue sarcoma in children and adolescents. It presumably arises from mesenchymal progenitors of skeletal muscle cells and presents with different subtypes that differ both histologically and genetically. Osteosarcoma (OS) and Ewing sarcoma (ES) are the most frequently diagnosed pediatric bone tumors. Even though the prognosis of these cancer entities improved significantly during recent decades, the survival rates are currently stagnating. Especially, dismal prognosis of relapsed and metastasizing cases of these malignancies urgently call for novel treatment options. BCL-2 proteins are vital guardians that control intrinsic apoptosis. Furthermore, it was shown that BCL-2 proteins critically regulate apoptosis in pediatric solid tumors. BH3 mimetics are small molecules that bind and inhibit anti-apoptotic BCL-2 proteins. They have already been investigated as cancer therapeutics for several years and show first encouraging clinical results. Therefore, we hypothesized that targeting BCL-2, MCL-1 and BCL-XL might be a promising approach to treat RMS, OS and ES. In this study, we aimed to comprehensively evaluate the potential of anti-apoptotic BCL-2 family proteins as therapeutic targets for pediatric solid tumors such as RMS, OS and ES. Notably, RMS, OS and ES cells largely expressed the most relevant BCL-2 family protein members. However, cells were widely insensitive to single pharmacological inhibition of either BCL-XL, BCL-2 or MCL-1 by A-1331852, ABT-199 and S63845, respectively. This finding was independent of their BCL-2 family protein expression levels. Significantly, co-administration of A-1331852 and S63845 induced cell death in RMS, OS and ES cell lines in a highly synergistic manner. Transient silencing of MCL-1 and/or BCL-XL verified the co-dependency of RMS cells on these proteins for survival. Importantly, A-1331852/S63845 co-treatment was more efficient in causing cell death in RMS, OS and ES cells than either inhibitor combined with ABT-199. Efficacy of A-1331852/S63845 co-treatment could be additionally demonstrated in a primary sample of pediatric malignant epithelioid mesothelioma. Mechanistically, concomitant A-1331852/S63845 treatment mediated rapid intrinsic apoptosis involving swift loss of the mitochondrial outer membrane potential as well as activation of caspases-3, -8 and -9. An observed caspase dependent loss of MCL-1 might further amplify the A-1331852/S63845 triggered pro-death signaling. Furthermore, we identified BAX and BAK as key mediators of apoptosis caused by dual inhibition of MCL-1 and BCL-XL. A-1331852/S63845 induced cell death was relying on BAX and/or BAK in a cell line dependent manner. Interestingly, treatment with A-1331852 and S63845 liberated BAK from its interaction with MCL-1 and BCL-XL. Moreover, BAX and BAK were activated and interacted with each other to form a pore in the outer mitochondrial membrane. Further, in RD cells BIM and NOXA partially contributed to A-1331852/S63845 mediated cell death. Consistently, in this cell line BIM and NOXA were disrupted from their binding to BCL-XL and MCL-1 by A-1331852 and S63845, respectively. However, BH3 only proteins were not involved in A-1331852/S63845 induced cell death in Kym-1 cells. Therefore, we concluded that BH3 only proteins played only a marginal and cell line dependent role in mediating cell death caused by MCL-1 and BCL-XL co-repression. Notably, A-1331852/S63845 co-treatment spared non-malignant fibroblasts, myoblasts and peripheral blood mononuclear cells, which suggests a therapeutic window for its application in vivo. Besides, we could demonstrate that sequential BH3 mimetic treatment still significantly induced cell death, albeit to minor extents compared to its dual administration. Importantly, we successfully evaluated concomitant treatment with A-1331852 and S63845 in multicellular RMS spheroids and in an in vivo embryonic chicken model of RMS. These findings stress the high transcriptional relevance of A-1331852/S63845 as an emerging novel cancer regimen. Collectively, the thesis at hand explored the great potential of co-treatment with A-1331852 and S63845 in pediatric solid tumors and unveiled the underlying molecular mechanisms of cell death in RMS. Together, the current investigations support further preclinical and clinical studies to evaluate the effect of dual MCL-1 and BCL-XL targeting in pediatric solid tumors.
• Krebserkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen während der Kindheit. Das Rhabdomyosarkom (RMS) ist der am häufigsten auftretende maligne Weichgewebstumor in Kindern und Jugendlichen. Er entsteht vermutlich aus mesenchymalen Vorläuferzellen des Skelettmuskels, welche sich nicht ausdifferenziert haben. RMS kann verschiedene Subtypen ausbilden, die sich nicht nur histologisch, sondern auch genetisch unterscheiden. Beim Osteosarkom (OS) und Ewing Sarkom (ES) handelt es sich um die beiden am meisten diagnostizierten malignen Knochenkrebserkrankungen in Kindern und Jugendlichen. Obwohl die Überlebenschancen für Kinder mit RMS, ES und OS in den letzten Jahren gestiegen sind, bleibt die Prognose für Patienten, die Metastasen ausbilden oder einen Rückfall erleiden, weiterhin schlecht. Nach wie vor besteht somit ein hoher Bedarf an verbesserten Behandlungsmöglichkeiten dieser Tumore. BCL-2 Proteine sind die zentralen Akteure, welche die Initiierung der Apoptose regulieren. Es wurde gezeigt, dass BCL-2 Proteine auch im RMS, OS und ES wichtige Regulatoren der Apoptoseinduktion sind. Daher stellten wir die Vermutung auf, dass eine Inhibition der anti-apoptotischen Proteine BCL-2, MCL-1 und BCL-XL eine vielversprechende Strategie zur Bekämpfung von soliden pädiatrischen Tumoren sein könnte. BH3 mimetics sind kleine Moleküle, welche die oben genannten anti-apoptotischen Proteine binden und somit inhibieren. Sie werden seit einigen Jahren in der Krebstherapie eingesetzt und zeigen dort bereits erste klinische Erfolge. Ziel dieser Arbeit war eine umfassende Evaluation der anti-apoptotischen BCL-2 Proteine als therapeutischer Angriffspunkt in der Behandlung von pädiatrischen soliden Tumoren wie beispielsweise RMS, OS und ES. Die untersuchten RMS, OS und ES Zelllinien exprimierten nahezu alle getesteten relevanten BCL-2 Proteine in unterschiedlichen Mengen. Der Großteil dieser Zelllinien war resistent gegenüber einer Einzelbehandlung mit BH3 mimetics, die spezifisch MCL-1, BCL-2 oder BCL-XL inhibierten. Diese Beobachtung war unabhängig vom Expressionslevel der BCL-2 Proteine. Die BH3 mimetics A-1331852 und S63845 blockieren jeweils selektiv BCL-XL oder MCL-1. Interessanterweise führte eine kombinierte Behandlung mit diesen Substanzen zu einer hoch synergistischen Zelltodinduktion in allen RMS, OS und ES Zelllinien. Zudem bestätigte eine transiente Reduktion der MCL-1- und/oder BCL-XL-Level mittels siRNA, dass diese Proteine essentiell für das Überleben der RMS Zellen waren. Des Weiteren stellten wir fest, dass Kombinationsbehandlungen mit ABT-199/A-1331852 oder ABT-199/S63845 weniger effizient waren als eine Behandlung mit A-1331852/S63845. Ferner demonstrierten wir, dass die A-1331852/S63845 Kombinationstherapie ebenfalls in einer klinischen Probe eines pädiatrischen malignen epitheloiden Mesotheliom Wirkung zeigte. Weiterhin konnten wir den A-1331852/S63845 vermittelten Zelltod als mitochondriale intrinsische Apoptose identifizieren. Diese folgte einer schnellen Kinetik und führte zu einer Aktivierung der Caspasen-3, -8 und -9. Darüber hinaus löste die A-1331852/S63845 Kombinationstherapie einen Caspasen abhängigen Verlust von MCL-1 aus, der vermutlich das durch die Behandlung ausgelöste pro-apoptotische Signal weiter verstärkte. Außerdem stellten wir fest, dass BAX und BAK eine tragende Rolle im Mechanismus des A-1331852/S63845 induzierten Zelltods zukommt. Dieser zeigte eine Abhängigkeit von BAX und BAK, welche je nach Zelllinie variierte. In RMS Zellen war BAK basal an BCL-XL oder MCL-1 gebunden. Die A-1331852/S63845 Kombinationsbehandlung inhibierte diese Interaktion, was im Folgenden zu einer Freisetzung von BAK führte. Des Weiteren aktivierte die A-1331852/S63845 Behandlung BAX und BAK. Diese interagierten miteinander, was letztlich in der Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran resultierte. Überdies demonstrierten BIM und NOXA eine partielle Beteiligung am A-1331852/S63845 stimulierten Zelltod in RD Zellen. Diese Ergebnisse passten zu der Beobachtung, dass die A-1331852/S63845 Kombinationstherapie die jeweilige Bindung dieser beiden Proteine an BCL-XL und MCL-1 löste. In den Kym-1 Zellen waren BH3 only Proteine allerdings nicht in den A-1331852/S63845 vermittelten Zelltod involviert. Zusammenfassend kann daher festgehalten werden, dass die BH3 only Proteine keine oder nur eine untergeordnete Rolle in der Vermittlung des Zelltods durch A-1331852/S63845 spielen. Abschließend konnten wir anhand von Experimenten mit humanen Fibroblasten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes sowie murinen Myoblasten zeigen, dass eine Behandlung mit A-1331852/S63845 in Konzentrationen, welche in Krebszellen den Zelltod bewirkte, weder eine nennenswerte Caspasenaktivierung noch Zelltod in nicht-malignen Zellen auslöste. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es ein therapeutisches Fenster geben könnte, in dessen Rahmen eine Behandlung mit diesen Agenzien möglich ist. Zudem konnten wir demonstrieren, dass auch eine sequenziell erfolgende A-1331852/S63845 Behandlung signifikant Zelltod auslöste, obgleich der Effekt im Vergleich zur gleichzeitigen Behandlung schwächer war. Interessanterweise führte eine A-1331852/S63845 Behandlung in einem multizellulären Spheroidmodell dosis abhängig zur Reduktion der Zellviabilität sowie zu massivem Zelltod in drei verschiedenen RMS Zelllinien. Schließlich konnte der Effekt einer gemeinsamen MCL-1 und BCL-XL Inhibition mittels eines in vivo Versuchs am embryonalen Huhn belegt werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die translationale Relevanz dieser Arbeit. Insgesamt konnten wir das große Potenzial einer A-1331852/S63845 Kombinationsbehandlung in pädiatrischen soliden Tumoren aufzeigen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen im RMS entschlüsseln. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit leisten einen wertvollen Beitrag im Hinblick auf eine weitere (prä)klinische Evaluation von BH3 mimetics in pädiatrischen soliden Tumoren.