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Kathrin Schunck

• The ubiquitin-related SUMO system represents a versatile post-translational modification pathway controlling a variety of cellular signalling networks. In mammalian cells, lysine residues of target proteins can be covalently modified with three SUMO isoforms (SUMO1, SUMO2 and SUMO3) resulting in conjugation of either single SUMO moieties or formation of poly-SUMO chains. Importantly, SUMO modification is a reversible process, where the deconjugation of SUMO from its substrates is mediated by SUMO proteases. In humans, the best-characterized subfamily is the SENP family of SUMO-specific isopeptidases comprised of SENP1-3 and SENP5-7. For undisturbed cellular signalling events, a proper balance of SUMO conjugation and deconjugation is crucial. SENPs fulfil the important function of counteracting SUMOylation. A key question is how the relatively low number of SENPs specifically controls the SUMOylation status of hundreds of cellular proteins. The aim of this thesis was to uncover the regulation and substrate specificity of distinct SUMO isopeptidases in order to better understand their role in cellular signalling pathways. In the first part of this work, we investigated the influence of hypoxia on SUMO signalling, in particular on the activity of SENPs. Importantly, we found that the catalytic activity of distinct SENPs (especially SENP1 and SENP3) is strongly but reversibly diminished under low oxygen. As a consequence, the SUMO modification of a specific subset of proteins is changed under hypoxia. We specifically identified proteins being hyperSUMOylated after 24 hours of hypoxia by SUMO1 immunoprecipitation followed by mass spectrometry. We further validated the transcriptional co-repressor BHLHE40 as hypoxic SUMO target and confirmed SENP1 as responsible isopeptidase for deconjugation of SUMOylated BHLHE40. We provide evidence that SUMO conjugation to BHLHE40 enhances its repressive functions on the expression of the metabolic master regulator PGC-1α. Therefore we propose a model where inactivation of SENP1 under hypoxia results in SUMOylated BHLHE40, possibly contributing to metabolic reprogramming under hypoxia. To get insight into substrate selectivity of SENP family members, in particular SENP3 and SENP6, we choose a proteomic profiling strategy. For the identification of specific SUMO substrates controlled by SENP3, we applied a large-scale IP-MS approach in SENP3 KO and WT cells. The most strongly induced SUMO targets in the absence of SENP3 were key regulators of ribosome maturation. We identified factors involved in the remodelling of both 90S and 60S pre-ribosomes. SENP3 has already been described as being critically involved in maturation of the pre-60S subunit and 28S rRNA processing. Previously described SENP3-regulated master targets in this process are the ribosome maturation factors PELP1 and Las1L. Importantly, both were also identified as the most significantly regulated SENP3 targets in our unbiased proteomic approach. Importantly, however, enhanced SUMOylation was also detected on 90S-associated regulators, such as BMS1. Altogether, these data strengthen the functional link between SENP3 and ribosome biogenesis and point to a role of SENP3 beyond 60S maturation. In addition to SENP3, we explored the substrate specificity of SENP6, which mainly acts on polymeric SUMO2/3 chains. Applying a proteomic profiling strategy, we were able to identify SENP6-controlled SUMO networks functioning in DNA damage response as well as chromatin organization. We demonstrated that SENP6 reverses polySUMOylation of several subunits of the cohesin complex, thereby regulating the SUMOylation status and chromatin association of this complex. Furthermore, we found a tight interaction of SENP6 with the hPSO4/PRP19 complex, involved in DNA damage response by activation of the ATR-CHK1 signalling cascade. In cells depleted of SENP6, we observe deficient recruitment of the co-activator ATRIP to chromatin which results in diminished CHK1 activation. We therefore illustrate a general role of SENP6 in the control of chromatin-associated protein networks involved in genome integrity and chromatin organization.
• Das Ubiquitin-verwandte SUMO System ist eine vielseitige post-translationale Modifikation, die etliche zelluläre Signalnetzwerke kontrolliert. In humanen Zellen können Lysinreste von Zielproteinen kovalent mit einer der drei SUMO Isoformen (SUMO1, SUMO2 und SUMO3) verknüpft werden, was entweder in Konjugation mit einer einzelnen SUMO Einheit resultiert oder zur poly-SUMO Kettenbildung führt. Die SUMO Modifikation ist zudem ein reversibler Prozess, bei dem die Dekonjugation von SUMO durch spezielle Proteasen durchgeführt wird. Die am besten charakterisierte Untergruppe von SUMO-spezifischen Isopeptidasen ist die SENP Familie, bestehend aus SENP1-3 und SENP5-7. Um fehlerlose zelluläre Kommunikation zu gewährleisten, ist ein fein eingestelltes Gleichgewicht von SUMO Konjugation und Dekonjugation nötig. Die SENPs sind dabei wichtige Gegenspieler der SUMO Konjugation. Eine Schlüsselfrage dabei ist, wie eine kleine Anzahl von SENPs die SUMOylierung hunderter zellulärer Proteine spezifisch kontrolliert. Das Ziel dieser Dissertation war es daher, die Regulation und Substratspezifität bestimmter SUMO Isopeptidasen zu erforschen, um deren Rolle in zellulären Signalwegen besser verstehen zu können. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der Hypoxie auf das SUMO System und im Speziellen auf die Aktivität der SENPs untersucht. Interessanterweise wurde ein erheblicher, aber reversibler Aktivitätsverlust einiger SENPs (vor allem SENP1 und SENP3) unter Sauerstoffmangel beobachtet. Daraus resultiert ein verändertes SUMO-Konjugationsmuster bestimmter Proteine unter Hypoxie. Mittels SUMO1-Immunpräzipitation gefolgt von Massenspektrometrie konnten gezielt diejenigen Proteine identifiziert werden, die nach 24 Stunden unter Hypoxie eine vermehrte SUMOylierung aufwiesen. Weiterhin haben wir den transkriptionellen Regulator BHLHE40 als hypoxisches SUMO Substrat identifiziert und bestätigt, dass SENP1 für die Dekonjugation von SUMOyliertem BHLHE40 zuständig ist. Dies deutet darauf hin, dass die SUMOylierung von BHLHE40 dessen Repression auf die Aktivität des metabolischen Regulators PGC-1α erhöht. Wir schlagen deshalb ein Modell vor, bei dem die Inaktivierung von SENP1 unter Hypoxie und die daraus resultierende SUMOylierung von BHLHE40 zur Anpassung des Metabolismus unter Hypoxie beitragen könnte. Um Einblick in die Substratselektivität insbesondere von SENP3 und SENP6 zu erhalten, wurden IP-MS Experimente in Zellen in Abwesenheit dieser SENPs durchgeführt. Die am stärksten SUMO-modifizierten Substrate beim Fehlen von SENP3 sind Regulatoren der Ribosomenbiogenese. SENP3 ist bekanntlich in die Bildung der 28S rRNA und die Reifung der pre-60S Untereinheit involviert. Schon beschriebene und SENP3-regulierte Schlüsselproteine in diesem Prozess sind PELP1 und Las1L, die beide als höchst signifikante SENP3-regulierte SUMO Substrate in unserem Experiment identifiziert werden konnten. Des Weiteren wurden auch Regulatoren der 90S Untereinheit, wie BMS1, als verstärkt SUMO-modifiziert gefunden. Zusammengefasst unterstreichen diese Daten die Rolle von SENP3 in der Ribosomenbiogenese, deuten aber auch auf SENP3-gesteuerte Prozesse über die Reifung der 60S Untereinheit hinaus. Zusätzlich zu SENP3 untersuchten wir die Substratspezifität von SENP6, das hauptsächlich an SUMO2/3-Ketten agiert. Hier konnten wir SENP6-kontrollierte Proteinnetzwerke identifizieren, die eine Rolle in der DNA Schadensantwort und der Chromatindynamik spielen. Wir konnten zeigen, dass SENP6 die poly-SUMOylierung einiger Cohesinkomplex Komponenten kontrolliert und somit die SUMOylierung und Chromatinassoziierung des Komplexes steuert. Weiterhin konnten wir eine starke Interaktion von SENP6 mit dem hPSO4/PRP19 Komplex nachweisen, welcher in die Aktivierung des ATR-CHK1 Signalweges der DNA Schadensantwort involviert ist. Fehlt SENP6, kommt es zur mangelhaften Rekrutierung des Co-Aktivators ATRIP an Chromatin was eine verminderte CHK1 Aktivierung zur Folge hat. Diese Ergebnisse belegen eine Rolle von SENP6 in der Kontrolle der Chromatinassoziierung von Proteinnetzwerken, die zur Integrität des Genoms und der Chromatinordnung beitragen.