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Deniz Streit

• The production of ribosomes is a complicated multistep, that is susceptible to changes occurring within the cell and its environment. The process itself requires many proteins, known as ribosome biogenesis factors (RBFs) and many non-coding RNAs like the small nucleolar RNAs (snoRNAs). While RBFs are required for the accurate processing of the pre-rRNA into mature rRNAs, the snoRNAs act to coordinate and guide enzymes for post-transcriptional modifications, chiefly 2´-O-ribose methylation and pseudouridylation. While ribosome biogenesis is mostly described in human and yeast model eucaryotes, similar detailed studies in the model plant Arabidopsis thaliana are far less explored and understood. Furthermore, for many experimentally confirmed modification sites the according snoRNAs and for many pre-rRNA processing steps the responsible RBFs are missing. Therefore, it is expected that a high number of snoRNAs and RBFs are not identified till yet. For this reason, RNA-deep sequencing was performed in order to identify novel snoRNAs and MS analysis data of nucleoli and nuclei of A. thaliana from a former PhD student were used in order to find new proteins involved in pre-rRNA processing. In here, it is shown that with RNA deep-sequencing still new snoRNAs and snRNAs can be identified and that detection of predicted snoRNAs can be fulfilled with a) antisense oligonucleotides tagged with fluorescence dyes and b) with radioactive labeled antisense probes. Furthermore, a secondary structure map of the 60S and 40S subunit highlighting the predicted and moreover verified modification sites in 5.8S, 25S and 18S rRNA was created. Especially, the correlation between the modification sites and the guiding snoRNA is highlighted further shedding light on overview about current pre-rRNA modification sites and corresponding guiding snoRNAs. The next chapter reveals the complex and multi-layered existence of the 5.8S rRNA and its numerous precursors. The mutant prp24 (also known as seap1) encoding AtPRP24, is recognized as factor being important for splicing as it is promoting the recruitment of the U4 and U6 snRNAs to the spliceosome. In here, it was found that AtPRP24 is involved in processing of 5.8S rRNA precursors, recognizable by precursors that are over accumulating in the mutant. Moreover, it could be shown for the first time that the plant-specific precursor 5´-5.8S is exported to the cytoplasm, where final cleavage steps of 5.8S rRNA takes place. In the prp24.2 mutant, this precursor is exported at an increased rate to the cytoplasm, where it can be detected in the actively translating ribosomes (polysomes). A lower sensitivity of the mutant seeds to cycloheximide (CHX) suggests that due to the extension at the 5´-end of 5.8S, the structure of the 60S subunit has altered CHX binding. In conclusion, this work highlights the importance and complexity of 5.8S rRNA and its precursors for ribosome biogenesis and displays new insights into pre-rRNA processing in A. thaliana.
• Ribosomen sind hochkomplexe makromolekulare Maschinen, die notwendig sind für jede lebende Zelle. Ribosomen werden im Zytoplasma benötigt, um dort aus Messenger-RNA (mRNA) Proteine zu synthetisieren. Eukaryotische cytosolische Ribosomen bestehen aus einer 60S und 40S Untereinheit. Die pflanzliche 60S Untereinheit besteht aus der 25S, 5.8S und 5S rRNA zusammen mit 49 ribosomalen Proteinen und die 40S Untereinheit aus der 18S rRNA mit 30 ribosomalen Proteinen. Zusammen bilden sie das zytosolische 80S Ribosom. Die Ribosomenbiogenese ist ein hoch komplexer Vorgang, der viele Proteine und RNAs benötigt. Die Proteine, die für die Herstellung funktionaler Ribosomen benötigt werden sind als Ribosomenbiogenesefaktoren (RBFs) bekannt. Es gibt ca. 250 verschiedene RBFs, die u.a. für die Modifizierung und der exo- und endonukleolytischen Trennung der pre-ribosomalen RNA (pre-rRNA) benötigt werden. Der Anfang einer jeden Ribosomenbiogenese findet im Nukleolus statt, wo die ribosomale DNA (rDNA) mithilfe der RNA-Polymerase I in die pre-rRNA transkribiert wird. Die pre-rRNA enthält nur drei der 4 rRNAs nämlich die 18S, 5.8S und die 25S. Die 5S wird unabhängig davon im Nukleus durch die RNA-Polymerase III transkribiert. Nach der Transkription findet in der Regel die posttranskriptionelle Modifizierung der pre-rRNAs mithilfe der ,,kleinen nukleolären Ribonukleinsäuren´´ (engl. small nucleolar RNAs; snoRNAs) statt. Dabei fungieren die snoRNAs als Leitelemente, um katalytisch aktive Proteine an die richtige Stelle an der rRNA zu bringen. Bisher sind über 200 verschiedene snoRNAs in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) identifiziert. Nach der Modifizierung der pre-rRNA, werden enzymatische Proteine benötigt, deren Funktion es ist die pre-rRNA in einem hochkomplexen mehrstufigen Vorgang zu zerschneiden und in seine drei rRNA-Bestandteile aufzuteilen. Im Nukleus angekommen, fügt sich dann die 5S in die pre-60S Untereinheit ein und die Vorstufen beider Untereinheiten werden in das Zytosol exportiert. Im Zytosol findet dann die finale Reifung der rRNAs statt und ribosomale Proteine, die für die Reifung und Translation benötigt werden, stoßen in den letzten Schritten zu den Untereinheiten. Die Prozessierung der pre-rRNA in die reifen rRNAs ist sehr komplex und erfordert daher das perfekte Zusammenspiel von snoRNAs, ribosomalen Proteinen und Ribosomenbiogenesefaktoren. Ein Teil dieser Dissertation handelt aus diesem Grund über die snoRNAs. Anlehnend an die snoRNAs wird im zweiten Teil eine umfangreiche Analyse der snoRNAs durchgeführt, indem Next-Generationen Sequenzierung und in-vitro Experimente zur Entdeckung und Verifizierung neuer snoRNAs geführt haben und im letzten Teil werden putative Ribosomenbiogenesefaktoren untersucht, die eine direkte bzw. indirekte Funktion in der pre-rRNA Prozessierung haben. Die snoRNAs werden in zwei Klassen unterteilt, die auf konservierten Sequenzen innerhalb der snoRNAs basieren. Die C/D Box snoRNAs besitzen eine C Box (RUGAUGA) und eine D Box (CUGA) und manchmal zwei weniger konservierte C´ und D´ Boxen. Während die C Box nahe am 5´ Ende der snoRNA vorliegt, ist die D Box in etwa mittig lokalisiert. Zwischen der C und B Box befindet sich eine 10-21 nt lange Sequenz, die komplementär zur rRNA-Position ist, die modifiziert werden soll. Etwa 5 nt vor der D Box findet dann die Modifizierung statt. Zur zweiten Klasse gehören die H/ACA Box snoRNAs. Hier findet sich eine H-Box (ANANNA) und eine ACA-Box, die zumeist am 3´-Ende der snoRNA zu finden ist. Die Stelle der Modifizierung findet hierbei etwa 15 nt vor der ACA-Box statt. Während C/D box snoRNAs die 2´-O-Ribose Methylierung anleiten, leiten die H/ACA Box snoRNAs die Konversion von Uridin zu Pseudouridin an. Beide snoRNA Klassen arbeiten in Kooperation mit Proteinen, die u.a. für die enzymatische Reaktion benötigt werden oder den Protein-snoRNA-Komplex stabilisieren. Dabei werden die C/D Box snoRNAs von den Proteinen Fibrillarin (Methyltransferase), Nop58, Nop56 und Snu13 unterstützt und die H/ACA Box snoRNAs von Nap57 (Hefe Cbf5), Nhp2, Nop10 und Gar1.