Open Access

Judith Schultheiß

• Größere Knochendefekte, Pseudarthrosen oder verzögerte Frakturheilungen erfordern die Transplantation von autologer Spongiosa mit dem Nachteil schmerzhafter Entnahmedefekte. Die biologische Wertigkeit alternativer und osteokonduktiv wirkender Knochenersatzmaterialien sollte in der vorgelegten Arbeit in vitro beurteilt werden. Hierbei sollten Adhäsion und Funktion mesenchymaler Stammzellen (MSC) und endothelialer Progenitorzellen (EPC) alleine und in Co-Kultur untersucht werden. Während die MSCs auf Scaffolds die Knochenneubildung fördern können, wird angenommen, dass die zusätzliche Verwendung von EPCs die Gefäßeinsprossung zusätzlich fördert. Zur Anwendung kamen Tutoplast® als humaner Knochenersatz, Cerabone® als boviner Knochenersatz, drei verschiedene Tricalciumphophate (ß-TCP: Chronos® und Vitoss®; -TCP BioBase®) und ein mit Silikon-beschichtetes Hydroxylapatit (Actifuse®). Hierzu wurde die Zahl der adhärenten Zellen auf den verschiedenen Matrices fluoreszenzmikroskopisch ermittelt. Außerdem wurde die metabolische Aktivität der Zellen auf den Knochenersatzstoffen mit dem MTT-Test untersucht sowie mittels RT-PCR nachgewiesen, ob sich die Zellen weiter differenzieren und ihre Fähigkeit beibehalten. Darüberhinaus wurden die einzelnen Knochenersatzstoffe in der Zusammenschau mit den adhärenten Zellen elektronenmikroskopisch bewertet. Grundsätzlich konnten erhebliche Unterschiede sowohl zwischen den einzelnen Knochenersatzstoffen als auch zwischen den untersuchten Zellpopulationen festgestellt werden. Bei alleiniger Besiedlung mit MSCs ist festgestellt worden, dass Tutoplast® die höchsten Adhäsionsraten, gekoppelt mit einer guten Stoffwechselaktivität im MTT-Test und bei der Expression der osteogenen Proteine cbfa-1 und Osteocalcin aufweist. Diese Ergebnisse wurden durch die REM bestätigt, die eine fibrillenähnliche Struktur von Tutoplast® zeigt und somit eine fast flächige Adhäsion ermöglicht. Chronos® zeigt als einziges Knochenersatzmaterial ebenfalls eine gute Adhäsion, Funktion und Morphologie, während die anderen Tricalciumphophate, Actifuse® und Cerabone® deutlich abfielen. Interessanterweise findet sich bei der reinen EPC-Gruppe ein ganz anderes Ergebnis. Hier zeigt Actifuse® eine sehr gute Zelladhäsion, gefolgt von Biobase®. Dies bestätigt sich auch im MTT-Test und bei der mRNA-Expression endothelialer Proteine, wie dem von Willebrandt Faktor und VEGF. Die Ergebnisse der Co-Kultur zeigen hingegen wiederum Tutoplast® und Chronos® mit guten Ergebnissen, interessanterweise aber auch Actifuse® und Biobase® mit deutlicher Überlegenheit gegenüber den allseits schlecht abschneidenden Produkten Cerabone® und Vitoss®. Während Tutoplast® und Chronos® in der Co-Kultur höhere Anteile an MSCs aufwiesen, konnte bei Actifuse® und Biobase® ein relativ hoher Anteil an EPCs festgestellt werden. Alleine bei Chronos® konnte ein synergistischer Effekt der Co-Kultur in Bezug auf die adhärenten Zellzahl festgestellt werden, die gegenüber der Einzelkultur über die Zeit stabil blieb. In der Summe sind die Zelladhäsionen, -funktionen und Genexpressionen bei den vier wirksamen Knochenersatzmaterialien in dieser Gruppe statistisch nicht unterschiedlich. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der Verwendung von osteokonduktiven Knochenersatzmaterialien deren spezifische Auswirkungen auf die Zelladhäsion und Funktion berücksichtigt werden muss. Sowohl die Funktion der EPCs im Hinblick auf eine vaskulären Anschluss des neugebildeten Knochens wie auch der MSCs im Hinblick auf eine osteogene Differenzierung sollten optimal sein. Die in dieser Studie festgestellten Effekte konnten bereits in einer in vivo Studie an einem critical size Femurdefektmodell bestätigt werden, indem die kombinierte Anwendung von EPCs und MSCs auf Chronos® die beste Frakturheilung zeigte. Abschließend kann festgehalten werden, dass man bei der Verwendung des richtigen Scaffolds mit den geeigneten Zellen einen adäquaten Knochenersatz induzieren kann, der mittelfristig zu einer Vermeidung der schmerzhaften Entnahme von Spongiosa aus dem Beckenknochen führen kann.
• Autologous cancellous bone grafts, used to treat large bone defects, pseudarthrosis and delayed bone healing are often associated with complications such as painful donor site morbidity. Osteoconductive scaffolds, could serve as an alternative treatment with less associated complications. By adding mesenchymal stem cells (MSC) and/or endothelial progenitor cells (EPC) to these osteoconductive scaffolds sufficient new bone growth could be stimulated to obviate the need for autologous bone grafts. In this study, we evaluate adhesion, functional and morphological properties of mesenchymal stem cells (MSC) and/or endothelial progenitor cells (EPC) in the presence of various different osteoconductive scaffolds in vitro. We tested Tutoplast®, derived from human bone, Cerabone®, a bovine scaffold, three different tricalciumphophates (ß-TCP: Chronos® und Vitoss®; α-TCP:BioBase®), and a silicated hydroxylapatite (Actifuse®). After seeding the scaffolds with MSC and/or EPC the number of adherent cells (adhesion) was determined fluoroscopically. In addition, metabolic activity and differentiation of the cells was measured in a functional assay by RT-PCR, respectively. Finally, surface adhesion of the seeded cells to the scaffolds was confirmed using scanning electron microscopy. MSCs alone were found to adhere best to Tutoplast®, showing a high metabolic activity and expression of osteogenic proteins cbfa-1 and osteocalcin. These results were confirmed by electron microscopy which showed Tutoplast’s® fibrillar structure facilitating widespread cellular adhesion. Similar findings were observed with Chronos®, i.e. good MSC adhesion, function and morphology, while the same measurements performed on the other scaffoldings, tricalciumphosphates Vitoss®, Biobase®, Actifuse® and Cerabone®, showed less function, adhesion and morphology. EPCs alone were found to adhere best to Actifuse®, followed by Biobase®. These results were confirmed in the functional MTT-assay and the mRNA-Expression of endothelium-associated proteins, such as v. Willebrandt Factor and VEGF. Function, adhesion and morphology measurements were found to be significantly lower in the other scaffolds. Co-cultured MSCs and EPCs showed good function, adhesion and morphology in the Tutoplast®, Chronos®, Actifuse® and Biobase® while the Cerabone® and Vitoss® groups were significantly worse. In the Tutoplast® and Chronos® groups the number of MSCs was found to be highest while EPCs was highest in the Actifuse® and Biobase® groups. Overall, cell adhesion, function and morphology measurements were similar in these four scaffolds. The total number of cells remained higher over time in the MSC/EPC coculture groups than in the single cell experiments. Our results indicate varying degrees of adhesion, function and morphology of MSCs and/or EPCs when in the presence of different osteoconductive scaffolds. Of the combinations studied we found MSC/EPC/Chronos® to perform the best. In future studies we will use these results to develop an optimal MSC/EPC/scaffold combination for in vivo experiments using a critical size femur defect model. In conclusion, we found that the combination of given cell populations with an appropriate osteoconductive scaffold can result in an effective new bone formation. Given the right combination this approach could potentially provide a better treatment for large bone defects, pseudarthrosis and delayed bone healing.